一种用于运载抗肿瘤药物的核酸纳米结构及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于运载抗肿瘤药物的核酸纳米结构及其制备方法和应用。所述核酸纳米结构是通过DNA折纸技术构建的任意二维和/或三维纳米结构，具体是脚手架链与辅助折叠的订书钉链通过碱基互补配对原则进行杂交完成自组装而形成的核酸纳米结构。所述核酸纳米结构作为抗肿瘤药物的载体不但能够保证其运载的抗肿瘤药物的抗肿瘤活性，而且能够提高抗肿瘤药物的靶向性，使抗肿瘤药物在肿瘤组织中富集，显著降低抗肿瘤药物由于非特异性而产生的全身毒性。其制备方法工艺简单、成本低且方便易行。
【专利说明】-种用于运载抗肿瘤药物的核酸纳米结构及其制备方法和 应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物载体【技术领域】，具体而言，本发明涉及一种用于运载抗肿瘤药物 的核酸纳米结构及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是一种严重危害人类健康的重要疾病。小分子抗肿瘤药物缺乏特异性， 致使化学治疗过程产生极大的副作用，常导致化疗失败。应用纳米技术发展抗肿瘤药物靶 向运输和可控释放的药物运载系统是解决该问题的关键，已成为当前肿瘤治疗研究领域的 执占。
[0003] 以纳米颗粒作为抗肿瘤药物载体进行抗肿瘤治疗的研究始于上世纪50年代，研 究较多的如高分子纳米材料，脂质体或金纳米粒子等。大量纳米颗粒已被成功用于药物转 运和抗肿瘤研究与治疗之中，如美国FDA批准的脂质体内包阿霉素（Doxorubicin)和聚乙 二醇（PEG)干扰素 -a 2a (Pegasys) (Nature Reviews Drug Discovery, 2010, 9, 615-627; Nature Reviews Drug Discovery, 2005, 4, 145 - 160 ；J.Drug Target. 2006, 14, 301 - 310 ； Nature Review Cancer2006, 6, 688 - 701.)。基于纳米技术，虽然有很多药物运载体系已经 成功应用，但是要进一步解决抗肿瘤药物缺乏特异性和高毒性的问题，在靶向运输和可控 释放抗肿瘤药物研究领域仍然存在许多关键问题尚未解决。因此，探索新的制备方法，获得 新型纳米材料作为抗肿瘤药物载体并进行细胞及动物水平的抗肿瘤实验具有重要的理论 意义和潜在的应用价值。要解决上述问题，其核心是构建高效、低毒、靶向、可控的生物大分 子微米或纳米结构作为药物运输和释放系统，该药载系统需满足形态和粒径容易控制、化 学结构容易修饰从而实现功能化、生物相容性较好等必要条件。
[0004] 在自然界的各种生命体中，生物大分子脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA)是遗传信息的载体。而在结构DNA技术（structural DNA nanotechnology)中，DNA 不再作为遗传信息的载体，而是通过预先进行特定的设计，形成纳米结构的基元。DNA折纸 技术（DNA origami)是一种新颖而独特的DNA自组装纳米技术，即利用长的单链核苷酸序 列与若干条短的寡核苷酸序列通过碱基互补配对进行杂交形成预先设计的结构，现在被广 泛用来从DNA自下而上（Bottom-up)地制作各种纳米尺度的二维和/或三维的DNA图案和 形状（Nature, 2006, 440, 297-302.)。利用DNA折纸技术构造的纳米结构具有结构可控、易 于修饰的特点，具有成为小分子抗肿瘤药物载体的可能，在药物运载方面有非常广阔的潜 在应用前景。基于核酸序列的特性进行分析，可以发现与传统抗肿瘤药物运输载体相比，核 酸纳米结构的优势十分明显：1)能够生物降解，具有其它载体不可比拟的良好的生物相容 性；2)没有明显的细胞毒性和免疫原性；3)结构具有高度可预测性；4)可以构造出所需要 的图形结构，进一步构建复杂可控的纳米级图案和形状；5)可以利用其结构本身直接装载 与DNA分子相互作用的抗肿瘤药物，也可利用其形成的纳米结构包载药物；6)内部可以进 行功能化修饰，因此能够有效装载多种药物或成像试剂，从而实现载体的多功能性，以达到 多种药物联合给药、治疗与检测同时完成的功能；7)具有良好的稳定性，对于内部装载的药 物将起到很好的保护作用；8)可在选择的部位进行靶向性功能基团的修饰，增强载药系统 的靶向性；9)可通过修饰使得结构在特定条件下能够可控的开启和关闭，从而达到控制药 物释放的目的。
[0005] 虽然，通过分析可知核酸纳米结构具有上述优势，但是目前尚无将核酸纳米结构 作为抗肿瘤药物的载体应用于人或动物肿瘤治疗的报道。主要是因为核酸纳米结构作为抗 肿瘤药物的载体对抗肿瘤药物的动物水平上的特异性及全身毒性的影响还缺乏认识。换句 话说，目前还没有研究能够证明核酸纳米结构作为抗肿瘤药物的载体是否能够促进抗肿瘤 药物在肿瘤组织中的富集以及是否能够显著降低抗肿瘤药物对动物的全身毒性。
[0006] 因此，本领域亟需相关研究以证明核酸纳米结构作为抗肿瘤药物载体的价值的大 小。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术的缺陷，本发明人经过大量试验和创造性的劳动，预料不到地发现 核酸纳米结构作为抗肿瘤药物的载体不但能够保证其运载的抗肿瘤药物的抗肿瘤活性，而 且能够提高抗肿瘤药物的靶向性，使抗肿瘤药物在肿瘤组织中富集，显著降低抗肿瘤药物 由于非特异性而产生的全身毒性。因此，本发明的目的在于提供一种用于运载抗肿瘤药物 的核酸纳米结构及其制备方法和应用。
[0008] 为实现本发明的目的，采用以下技术方案：
[0009] 在第一方面，本发明提供一种用于运载抗肿瘤药物的核酸纳米结构，所述核酸纳 米结构是通过DNA折纸技术（DNA origami)构建的任意二维和/或三维纳米结构，具体是 脚手架链（scaffold chains)与辅助折叠的订书钉链（staple strands)通过碱基互补配对 原则进行杂交完成自组装而形成的核酸纳米结构；优选地，所述抗肿瘤药物为顺钼、环磷酰 胺、紫杉醇和阿霉素中的一种或多种，优选阿霉素。
[0010] 在本发明一个具体实施方案中，发明人研究了阿霉素作为抗肿瘤药物由本发明的 核酸纳米结构运载进入动物细胞及动物体后的药理学或毒理学方面的效果。本领域的技术 人员能够知晓，目前的抗肿瘤药物及以后研发出来的抗肿瘤药物均可以本发明的核酸纳米 结构作为载体。
[0011] 本发明的核酸纳米结构可以是M13噬菌体基因组DNA、基于M13噬菌体基因组DNA 进行改造的各种单链环状DNA、Lambda噬菌体基因组DNA、通过PCR得到的M13噬菌体基因 组DNA片段或Lambda噬菌体基因组DNA片段和/或利用体外转录得到的RNA片段与人工 合成的寡核苷酸序列通过碱基互补配对原则进行杂交完成自组装而形成的，优选M13噬菌 体基因组DNA与人工合成的寡核苷酸序列通过碱基互补配对原则进行杂交完成自组装而 形成的。
[0012] 本发明对脚手架链和辅助折叠的订书钉链的序列没有特别要求，只要满足特定位 点上的碱基互补配对，使得订书钉链能够辅助脚手架链进行折叠自组装形成核酸纳米结构 即可。
[0013] 本发明的核酸纳米结构形状可以是三角形、长方形、纳米管状、四面体、巴基球形、 纳米片状、带状或笼状，优选为三角形。
[0014] 在第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的核酸纳米结构的制备方法，将辅 助折叠的订书钉链加入到脚手架链溶液中，混匀后，从温度90?100°C、优选92?98°C、更 优选95°C开始，逐渐降温退火至温度15?25°C、优选18?22°C、更优选20°C，降温退火即 孵育时间为8?28h、优选10?26h、更优选12?24h，得到所述核酸纳米结构；优选地，所 述脚手架链与所述订书钉链的摩尔比为1:2?1:50,优选1:5?1:30,更优选1:10?1:25， 特别优选1:20。
[0015] 在本发明的核酸纳米结构的制备方法中，所述脚手架链与所述订书钉链的摩尔比 可以是 1:2、1:3、1:4、1:5、1:8、1:10、1:12、1:15、1:18、1:20、1:22、1:28、1:32、1:35、1:38、 1:40、1:42、1:45、1:48 或 1:49。
[0016] 在本发明的核酸纳米结构的制备方法中，降温起始温度可以是90°C、91°C、92°C、 93°C、94°C、95t：、96t：、97t：、98t：、99t：*l(KrC。
[0017] 在本发明的核酸纳米结构的制备方法中，降温终止温度可以是15°C、16°C、17°C、 18°C、19°C、2(rC、2rC、22t：、23t：、24t：*25t：。
[0018] 在本发明的核酸纳米结构的制备方法中，孵育时间可以是9h、llh、13h、14h、15h、 18h、20h、21h、22h、23h、25h 或 27h。
[0019] 在第三方面，本发明提供一种载药核酸纳米结构，所述载药核酸纳米结构包括如 第一方面所述的核酸纳米结构及嵌入所述核酸纳米结构中的抗肿瘤药物；优选地，所述抗 肿瘤药物为顺钼、环磷酰胺、紫杉醇和阿霉素中的一种或多种，优选阿霉素。
[0020] 在第四方面，本发明提供一种如第三方面所述的载药核酸纳米结构的制备方法， 将所述核酸纳米结构与所述抗肿瘤药物接触形成所述载药核酸纳米结构；优选地，将所述 核酸纳米结构的溶液与所述抗肿瘤药物的溶液混合，振荡孵育，离心，弃上清，得到所述载 药核酸纳米结构；更优选地，将所述核酸纳米结构与所述抗肿瘤药物按照摩尔比为1: IO7? I: IO5数量级、优选I: IO6数量级混合于溶液中，在温度20?30°C、优选22?28°C、更优选 24?26°C，转速30?120rpm、优选60?90rpm条件下，振荡孵育20?50h、优选24?48h， 然后在温度20?30°C、优选22?28°C、更优选24?26°C条件下，转速5000?lOOOOrpm、 优选7000?8000rpm离心5?20min、优选10?15min，弃上清，得到所述载药核酸纳米结 构。
[0021] 在本发明的载药核酸纳米结构的制备方法中，所述核酸纳米结构与所述抗肿瘤 药物按照摩尔比可以是 1: 1〇7、1:2 X 107、1:4 X 107、1:5 X 107、1:8 X 107、1:9 X 107、1:106、 1:2 X 106、1:4 X 106、1:5 X 106、1:8 X 106、1:9 X IO6 或 1:105。
[0022] 在本发明的载药核酸纳米结构的制备方法中，振荡孵育的温度可以是20°C、21°C、 22°C、23°C、24t：、25t：、26t：、27t：、28t：、29t：*3(rC。
[0023] 在本发明的载药核酸纳米结构的制备方法中，振荡孵育的转速可以是30rpm、 40rpm、50rpm、60rpm、70rpm、80rpm、90rpm、100rpm、IlOrpm 或 120rpm〇
[0024] 在本发明的载药核酸纳米结构的制备方法中，振荡孵育的时间可以是20h、22h、 24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h、38h、40h、42h、44h、46h、48h 或 50h。
[0025] 在本发明的载药核酸纳米结构的制备方法中，离心的温度可以是2 (TC、21°C、 22°C、23°C、24t：、25t：、26t：、27t：、28t：、29t：*3(rC。
[0026] 在本发明的载药核酸纳米结构的制备方法中，离心的转速可以是5100rpm、 5200rpm、5500rpm、5800rpm、6200rpm、6500rpm、6800rpm、7000rpm、7500rpm、8000rpm、 8200rpm、8500rpm、8900rpm、9100rpm、9500rpm 或 9800rpm〇
[0027] 在本发明的载药核酸纳米结构的制备方法中，离心的时间可以是5min、6min、 7min、8min、9min、lOmin、llmin、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min 或 20min〇
[0028] 本领域的技术人员将会理解，本发明载药核酸纳米结构的制备方法并不必然依赖 于上述详细工艺及参数，此处给出的仅仅是较优的技术方案。本领域技术人员可以根据其 经验将所述核酸纳米结构与所述抗肿瘤药物接触形成所述载药核酸纳米结构。
[0029] 在本发明一个具体实施方案中，载药核酸纳米结构的制备方法包括以下步骤：
[0030] (1)将M13噬菌体基因组DNA与所述人工合成的寡核苷酸序列按摩尔比为1:2? 1:50、优选1:5?1:30、更优选1:10?1:25、特别优选1:20混合于溶液中，从90?100°C、 优选92?98 °C、更优选95 °C开始，逐渐降温退火至15?25 °C、优选18?22 °C、更优选 20°C，降温退火即孵育时间为8?28h、优选10?26h、更优选12?24h，得到核酸纳米结 构；
[0031] (2)将步骤（1)得到的核酸纳米结构与阿霉素按照摩尔比为I: IO7?I: IO5数量级、 优选I: IO6数量级混合于溶液中，在20?30°C、优选22?28 °C、更优选24?26 °C，30? 120rpm、优选60?90rpm条件下，振荡孵育20?50h、优选24?48h ;
[0032] (3)将步骤（2)得到的溶液在20?30°C、优选22?28°C、更优选24?26°C条件 下，5000?lOOOOrpm、优选7000?8000rpm离心5?20min、优选10?15min，弃上清，得 到所述载药核酸纳米结构。
[0033] 在第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如第三方面所述 的载药核酸纳米结构，任选地，还包括药学上可接受的载体；优选地，所述药物组合物的活 性成分为所述载药核酸纳米结构或其在药学上可接受的盐、酯或溶剂合物，用于治疗和/ 或预防肿瘤，或者抑制肿瘤细胞增殖。
[0034] 在第六方面，本发明提供一种如第一方面所述的核酸纳米结构作为抗肿瘤药物的 载体的应用，优选地，所述肿瘤为卵巢癌、乳腺癌、非小细胞癌、头颈癌、食管癌、肝癌、肺腺 细胞癌、前列腺癌和非何金氏淋巴瘤中的至少一种。
[0035] 在第七方面，本发明提供一种如第一方面所述的核酸纳米结构或如第三方面所述 的载药核酸纳米结构在制备用于治疗和/或预防肿瘤或者抑制肿瘤细胞增殖的药物中的 应用，优选地，所述肿瘤为卵巢癌、乳腺癌、非小细胞癌、头颈癌、食管癌、肝癌、肺腺细胞癌、 前列腺癌和非何金氏淋巴瘤中的至少一种。
[0036] 本发明中，术语"订书钉链"、"寡核苷酸序列"和"短链核苷酸序列"虽然是不同 的名词，但其含义和其所指对象的功能是相同的，即均指通过碱基互补配对原则对脚手架 链起到辅助折叠作用以使其自组装形成特定二维和/或三维结构的短的核苷酸序列，称为 "订书钉链"是一种形象的表达，意指其像订书钉一样将脚手架链的不同位点钉在一起。
[0037] 本发明中，术语"脚手架链"是指长的DNA或RNA序列，尤其是指单链DNA序列，其 是形成核酸纳米结构的主体原料，在订书钉链的辅助折叠作用下自组装形成特定二维和/ 或三维结构。
[0038] 本发明中，术语"核酸纳米结构"是指脚手架链在订书钉链的辅助折叠作用下自组 装形成的特定二维和/或三维结构，需要说明的是，该名称虽然含有"纳米"一词，但其实际 所指的对象并不一定要限定为纳米级别，本领域的技术人员将会理解，虽然纳米级别的颗 粒作为药物载体是常见的，但也有些药物载体能够达到微米的级别，因此，本发明纳米只是 一个统称，核酸纳米结构实际上代表纳米或微米级别的具备本发明技术特征的结构。
[0039] 本发明中，术语"载药核酸纳米结构"是指核酸纳米结构负载和/或嵌入相应药物 (本发明特指抗肿瘤药物）或其活性成分形成的结构复合体。
[0040] 本发明的有益效果为：本发明通过DNA折纸技术，即脚手架链与辅助折叠的订书 钉链通过碱基互补配对原则进行杂交完成自组装而形成核酸纳米结构，该核酸纳米结构可 作为抗肿瘤药物的载体，细胞水平和动物水平的实验证明其不但能够保证其运载的抗肿瘤 药物的抗肿瘤活性，而且能够提高抗肿瘤药物的靶向性，使抗肿瘤药物在肿瘤组织中富集， 显著降低抗肿瘤药物由于非特异性而产生的全身毒性。本发明制备所述核酸纳米结构的方 法，只需要按照合适的比例将辅助折叠的订书钉链加入到脚手架链溶液中，混匀后，在适宜 的温度范围内降温以实现自组装，不需要太多的人为干预，因此工艺简单、成本低且方便易 行。本发明制备的核酸纳米结构嵌入抗肿瘤药物可以制成载药核酸纳米结构，作为抗肿瘤 药物组合物的活性成分，用于治疗和/或预防肿瘤或者抑制肿瘤细胞增殖。
【专利附图】
【附图说明】
[0041] 图1为三角形的未装载阿霉素的核酸纳米结构及装载阿霉素的载药核酸纳米结 构的原子力显微镜照片，标尺为lOOnm。
[0042] 图2为阿霉素组及装载阿霉素的载药核酸纳米结构组对MDA-MB-231细胞增殖的 抑制效果的对比图，其中药物浓度均指阿霉素的浓度。
[0043] 图3为阿霉素组及装载阿霉素的载药核酸纳米结构组在移植瘤中汇聚的对比图， 标尺为50 μ m。
[0044] 图4为对照组(生理盐水组)、阿霉素组及装载阿霉素的载药核酸纳米结构组的荷 瘤鼠肿瘤体积的对比图。
[0045] 图5为对照组、阿霉素组、核酸纳米结构组及装载阿霉素的载药核酸纳米结构组 的荷瘤鼠体重的对比图。
【具体实施方式】
[0046] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理 解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本 发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂厂商购买得到的。下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结 果取平均值。
[0047] 本发明所用的器材和材料：
[0048] 器材：Mastercycler Pro 梯度 PCR 仪（Eppendorf，德国），5810R 小型高速离心机 (Eppendorf，德国)，UV-2450紫外-可见分光光度计（岛津，日本)，全波长酶标仪（TECAN，瑞 士)，Veeco MultiMode8原子力显微镜（Veeco,美国），突光显微镜（Olympus,日本)。
[0049] 原料：短链核苷酸序列（订书钉链，Nature，2006,440, 297-302)购自上海英潍捷基 生物技术有限公司，M13噬菌体基因组DNA购自New England Biolabs公司，阿霉素购自北 京华奉联博科技有限公司。
[0050] 试剂：实验中所用的缓冲溶液有TAE/Mg2+缓冲溶液（pH8. 0 )和PBS缓冲溶液 (ρΗ7·4)。其中，ΙΧΤΑΕ/Mg2+缓冲溶液（ρΗ8·0)的组分为：4Xl(T 2mol I^TrisJXK^mol 171乙酸，2.0父10-3111〇117屯0了4和1.25\10-2111〇117 1醋酸镁；1\?85缓冲溶液化!17.4)的组 成为：136.9Xl(T3mol 1^(8. OOg ONaCU 68Xl(T3mol rHOJOg Οκα,ΙΤδΧΚΓ^ιοΙ Γ1 (L 56g Γ1) Na2HPO4 ·Η20 和 L 47 X l(T3mol Γ1 ((λ 20g Γ1) KH2PO4 ;这些缓冲溶液所用的试 剂均为分析纯，购自Sigma-Aldrich公司。细胞活力实验所使用的细胞计数试剂盒购自日 本同仁化学。
[0051] 细胞：人乳腺癌MDA-MB-231细胞系购自中国协和医科大学基础医学研究所细胞 中心。
[0052] 培养基：DMEM高糖培养基，添加10%胎牛血清，细胞接种于IOOmm2培养皿中，置于 5%C0 2培养箱，37°C培养，当细胞生长至融合度80%左右时传代；所用培养基和胎牛血清购 自 ThermoFisher Scientific 公司。
[0053] BALB/c裸鼠：购自北京大学医学部。
[0054] 实施例1制备核酸纳米结构和载药核酸纳米结构
[0055] 将50 μ L终浓度为5nM的M13噬菌体基因组DNA与100 μ L终浓度为50nM的订书 钉链混合溶液充分混匀在ImL I XTAE/Mg2+ (pH=8. 0)溶液中，从95°C开始，逐渐降温退火 至20°C，退火孵育时间为12?24h，制备得到具有预先设计几何外形的核酸纳米结构。
[0056] 取5mM的阿霉素溶液ImL加入到5nM的核酸纳米结构溶液ImL中，混合均勻，在 22?28°C，70rpm的条件下，振荡孵育24h装载阿霉素。
[0057] 将上述装载阿霉素的混合溶液在22?28°C条件下，7000?8000rpm离心10? 15min，以去除上清液中未装载的阿霉素，得到装载阿霉素核酸纳米结构，同时通过测定上 清液中未装载的阿霉素含量，利用如下计算式计算确定已装载阿霉素的浓度。
[0058] DOX装载量=DOX总投入量-DOX未装载量，（D0X为阿霉素）。
[0059] 使用原子力显微镜观察并拍摄上述核酸纳米结构和载药核酸纳米结构的照片，由 图1可见装载阿霉素的过程对于核酸纳米结构没有明显的影响。
[0060] 实施例2载药核酸纳米结构对MDA-MB-231细胞增殖的抑制效果
[0061] 培养MDA-MB-231细胞至对数生长期，胰蛋白酶消化，收集细胞，调整细胞悬液浓 度为5 X IO4个/mL，接种96孔板，每孔100 μ L。将96孔板置于二氧化碳培养箱中培养过夜， 吸出培养液，加入不同浓度（阿霉素0. 01，0. 1，1，10,100 μ Μ)的载药核酸纳米结构，每个浓 度组5个复孔,另选5组分别加入不同浓度（0. 01,0. 1,1,10,100 μ Μ)阿霉素。另设一组为 空白对照组(接种细胞，不加药)。将已加药处理的MDA-MB-231细胞继续置于培养箱中培养 24h，吸弃含药培养基，每孔加入0. 5mg/mL的CCK-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基）-3-(4-硝 苯基）-5-(2, 4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐）溶液100 μ L，继续孵育2h，用酶标仪（450nm) 检测每孔的OD值。根据OD值计算出肿瘤细胞抑制率，计算公式为
[0062] 抑制率=(对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值。
[0063] 由图2可见核酸纳米结构能够运载抗肿瘤药物阿霉素，在细胞水平上具有抑制肿 瘤细胞增殖的作用，在相同阿霉素浓度条件下，其抑制效果与单独阿霉素的抑制效果相当。
[0064] 实施例3载药核酸纳米结构在肿瘤组织中的靶向性富集
[0065] 培养MDA-MB-231细胞至对数生长期，胰蛋白酶消化，收集细胞，调整细胞悬液浓 度为I X IO7个/mL，取100 μ L原位接种于5-6周雌性BALB/c裸鼠右下乳房，进行原位乳 腺移植瘤建模。建模1周后，分为3组进行给药处理，分别为生理盐水组，阿霉素组(阿霉素 6mg/kg/天)，载药核酸纳米结构组（即装载阿霉素的核酸纳米结构，给药含量相当于阿霉素 6mg/kg/天，核酸纳米结构0. 071mg/kg/天)，静脉注射药物。24小时后，摘取肿瘤进行冰冻 切片，在荧光显微镜绿光激发（450?520nm激发，优选激发波长为480nm)下，观察肿瘤组 织切片中药物的红色荧光。
[0066] 通过冰冻切片的荧光照片（图3)，可见阿霉素在肿瘤部分有很弱的荧光信号，说明 小分子药物本身基本对于肿瘤组织没有靶向性，载药核酸纳米结构在肿瘤部分有很强的荧 光信号，说明载药核酸纳米结构具有明显的肿瘤靶向性。
[0067] 实施例4载药核酸纳米结构对荷瘤鼠肿瘤治疗的药效及毒性研究 [0068] 培养MDA-MB-231细胞至对数生长期，胰蛋白酶消化，收集细胞，调整细胞悬液浓 度为I X IO7个/mL，取100 μ L原位接种于5-6周雌性BALB/c裸鼠右下乳房，进行原位乳 腺移植瘤建模。建模1周后，分为4组进行给药处理，分别为生理盐水组，阿霉素组(阿霉素 6mg/kg/天)，核酸纳米结构组(核酸纳米结构0. 071mg/kg/天)，载药核酸纳米结构组（即装 载阿霉素的核酸纳米结构组，给药含量相当于阿霉素6mg/kg/天，核酸纳米结构0. 071mg/ kg/天)，连续静脉注射12天。隔日称量荷瘤鼠体重，使用游标卡尺测量肿瘤长度和宽度，计 算肿瘤大小，计算公式为：
[0069] 肿瘤大小=Π XaXb2/6, Π 为圆周率，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。
[0070] 由图4可见，对照组(生理盐水组)荷瘤鼠的肿瘤体积随时间延长持续增大，单独阿 霉素组和载药核酸纳米结构组荷瘤鼠的肿瘤体积随给药时间延长而缩小，但阿霉素组荷瘤 鼠未能完成全部给药周期而死亡(实验平行作3次均是相同结果)，反应出单独阿霉素严重 的副作用。该结果进一步证明载药核酸纳米结构具有良好的抗肿瘤作用，而且能够降低抗 肿瘤药物(阿霉素）由于非特异性而产生的全身毒性。
[0071] 实验结束时，进一步检测每组荷瘤鼠的血常规指标(表1 )。
[0072] 表1荷瘤鼠血常规指标
[0073]
【权利要求】
1. 一种用于运载抗肿瘤药物的核酸纳米结构，其特征在于，所述核酸纳米结构是通过 DNA折纸技术构建的任意二维和/或三维纳米结构，具体是脚手架链与辅助折叠的订书钉 链通过碱基互补配对原则进行杂交完成自组装而形成的核酸纳米结构；优选地，所述抗肿 瘤药物为顺钼、环磷酰胺、紫杉醇和阿霉素中的一种或多种，优选阿霉素。
2. 根据权利要求1所述的核酸纳米结构，其特征在于，所述核酸纳米结构是M13噬菌 体基因组DNA、基于M13噬菌体基因组DNA进行改造的各种单链环状DNA、Lambda噬菌体基 因组DNA、通过PCR得到的M13噬菌体基因组DNA片段或Lambda噬菌体基因组DNA片段和 /或利用体外转录得到的RNA片段与人工合成的寡核苷酸序列通过碱基互补配对原则进行 杂交完成自组装而形成的，优选M13噬菌体基因组DNA与人工合成的寡核苷酸序列通过碱 基互补配对原则进行杂交完成自组装而形成的。
3. 根据权利要求1或2所述的核酸纳米结构，其特征在于，所述核酸纳米结构形状呈三 角形、长方形、纳米管状、四面体、巴基球形、纳米片状、带状或笼状，优选为三角形。
4. 如权利要求1至3中任一项所述的核酸纳米结构的制备方法，其特征在于，将辅助折 叠的订书钉链加入到脚手架链溶液中，混匀后，从温度90?100°C、优选92?98°C、更优选 95°C开始，逐渐降温退火至温度15?25°C、优选18?22°C、更优选20°C，降温退火即孵育 时间为8?28h、优选10?26h、更优选12?24h，得到所述核酸纳米结构；优选地，所述脚 手架链与所述订书钉链的摩尔比为1:2?1:50,优选1:5?1:30,更优选1:10?1:25,特 别优选1:20。
5. -种载药核酸纳米结构，其特征在于，所述载药核酸纳米结构包括如权利要求1至3 中任一项所述的核酸纳米结构及嵌入所述核酸纳米结构中的抗肿瘤药物；优选地，所述抗 肿瘤药物为顺钼、环磷酰胺、紫杉醇和阿霉素中的一种或多种，优选阿霉素。
6. 如权利要求5所述的载药核酸纳米结构的制备方法，其特征在于，将所述核酸纳米 结构与所述抗肿瘤药物接触形成所述载药核酸纳米结构；优选地，将所述核酸纳米结构的 溶液与所述抗肿瘤药物的溶液混合，振荡孵育，离心，弃上清，得到所述载药核酸纳米结构； 更优选地，将所述核酸纳米结构与所述抗肿瘤药物按照摩尔比为1: 1〇7?1: 1〇5数量级、优 选1:106数量级混合于溶液中，在温度20?30°C、优选22?28°C、更优选24?26°C，转 速30?120rpm、优选60?90rpm条件下，振荡孵育20?50h、优选24?48h，然后在温度 20?30°C、优选22?28°C、更优选24?26°C条件下，转速5000?lOOOOrpm、优选7000? 8000rpm离心5?20min、优选10?15min，弃上清，得到所述载药核酸纳米结构。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 将M13噬菌体基因组DNA与所述人工合成的寡核苷酸序列按摩尔比为1:2?1:50、 优选1:5?1:30、更优选1:10?1:25、特别优选1:20混合于溶液中，从温度90?100°C、 优选92?98 °C、更优选95 °C开始，逐渐降温退火至温度15?25 °C、优选18?22 °C、更优 选20°C，降温退火即孵育时间为8?28h、优选10?26h、更优选12?24h，得到核酸纳米 结构； (2) 将步骤（1)得到的核酸纳米结构与阿霉素按照摩尔比为1:107?1:105数量级、优 选1:106数量级混合于溶液中，在温度20?30°C、优选22?28°C、更优选24?26°C，转速 30?120rpm、优选60?90rpm条件下，振荡鮮育20?50h、优选24?48h ; (3) 将步骤（2)得到的溶液在温度20?30°C、优选22?28°C、更优选24?26°C条件 下，转速5000?lOOOOrpm、优选7000?8000rpm离心5?20min、优选10?15min，弃上 清，得到所述载药核酸纳米结构。
8. -种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求5所述的载药核酸 纳米结构，任选地，还包括药学上可接受的载体；优选地，所述药物组合物的活性成分为所 述载药核酸纳米结构或其在药学上可接受的盐、酯或溶剂合物，用于治疗和/或预防肿瘤， 或者抑制肿瘤细胞增殖。
9. 如权利要求1至3中任一项所述的核酸纳米结构作为抗肿瘤药物的载体的应用，优 选地，所述肿瘤为卵巢癌、乳腺癌、非小细胞癌、头颈癌、食管癌、肝癌、肺腺细胞癌、前列腺 癌和非何金氏淋巴瘤中的至少一种。
10. 如权利要求1至3中任一项所述的核酸纳米结构或如权利要求5所述的载药核 酸纳米结构在制备用于治疗和/或预防肿瘤或者抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用，优选 地，所述肿瘤为卵巢癌、乳腺癌、非小细胞癌、头颈癌、食管癌、肝癌、肺腺细胞癌、前列腺癌 和非何金氏淋巴瘤中的至少一种。
【文档编号】A61P35/00GK104368004SQ201310351835
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月13日 优先权日:2013年8月13日
【发明者】丁宝全, 蒋乔, 王金业, 杜洋, 张倩 申请人:国家纳米科学中心, 中国科学院自动化研究所