Talen在制备靶向干预乙肝病毒的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属医药领域，涉及TALEN技术在靶向乙肝病毒基因组即cccDNA及治疗慢性乙肝病毒感染中的应用。本发明提供了转录激活因子样效应因子核酸酶在制备靶向干预乙肝病毒的药物中的应用，其中靶向干预乙肝病毒的药物中的活性成分为针对乙肝病毒基因组的转录激活因子样效应因子核酸酶。本发明还提供了一种针对乙肝病毒基因组的转录激活因子样效应因子核酸酶，以及利用其抑制体外培养细胞中的乙肝病毒的方法。本发明采用TALEN技术在细胞系中可通过特异性靶向乙肝病毒cccDNA显著抑制乙肝病毒基因组的转录活性并导致乙肝病毒基因组DNA含量的下降。
【专利说明】TALEN在制备靶向干预乙肝病毒的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属医药领域，涉及TALEN技术在靶向乙肝病毒基因组及治疗慢性乙肝病毒感染中的应用。
【背景技术】
[0002]乙肝病毒(HBV)是一种肝嗜性小DNA病毒，其引起的慢性肝炎、肝纤维化和肝癌严重危害着人类的健康。全球约3.5亿人慢性感染有乙肝，其中亚洲占约3/4。
[0003]乙肝病毒病毒核衣壳内的乙肝病毒基因组是含有不完全双链的DNA (rcDNA),在病毒感染人肝细胞后，随着核衣壳脱去，rcDNA会入核并经由修补机制形成共价闭合环状的DNA (cccDNA)。cccDNA可经由宿主RNA聚合酶II转录出包括乙肝病毒病毒前基因组RNA(PgRNA)在内的多条长短不一的乙肝病毒RNA，病毒蛋白即以此些RNA作为模板进行翻译，其中PgRNA还可以作为模板通过逆转录生成rcDNA，进而包装入病毒核衣壳蛋白而进入新的一轮复制周期。此外，研究表明cccDNA可以结合宿主组蛋白以形成微小染色体结构，该结构非常稳定以致cccDNA的最终消失可能要伴随其所在肝细胞的死亡。正是由于cccDNA在乙肝病毒复制过程中作为DNA-RNA-DNA模板以及cccDNA很难彻底于肝内清除的特性，cccDNA在乙肝病毒感染慢性化、再发及治疗停止耐药中扮演重要角色。
[0004]当前用于治疗慢性乙肝病毒感染的药物有干扰素α (IFN-α )或阻断病毒RNA或DNA合成的核苷类似物，但是IFN- α治疗应答率仅30%而核苷类似物的长期使用易导致乙肝病毒耐药，同时这两种药物但都不直接靶向cccDNA，这也是目前的治疗手段应用于许多慢性乙肝病毒感染患者中效果不佳且易引起复发的原因之一。发明一种特异性靶向cccDNA的治疗方法对于乙肝病毒治疗乃至根治乙肝病毒慢性感染有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供转录激活因子样效应因子(Transcript1nactivator-1ikeeffectors, TALE)核酸酶在制备祀向干预乙肝病毒的药物中的应用。
[0006]本发明的另一个目的是提供一种针对乙肝病毒的转录激活因子样效应因子核酸酶。
[0007]本发明的再一个目的是提供一种利用转录激活因子样效应因子核酸酶抑制体外培养细胞中乙肝病毒的方法。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明首先设计了两对针对乙肝病毒基因组的特异性TALEN,在设计过程除考虑TALEN识别长度(12_19bp)及左右臂间隔长度(14_19bp)外还额外考虑了以下两点以保证TALEN对乙肝病毒的有效性:
[0009]1、根据NCBI公布的已有乙肝病毒A型、B型、C型序列(其中我国主要是B型和C型)，下载并比对了各型别代表株的序列，确定了各型别乙肝病毒基因组的保守序列区段，进而针对这些区段设计TALEN，以利于设计出的TALEN可以广谱靶向各型别的乙肝病毒。
[0010]2、设计TLANE时避开了根据文献报道可能结合有宿主组蛋白的cccDNA区段，以利于TALEN结合至cccDNA。
[0011]本发明最终设计并构建完成的TALEN分别针对在cccDNA序列中转录pgRNA相关的片段的头尾，其中头部设计在与Core、Po 1、HBeAg和pgRNA转录密切相关的区段；尾部设计在HBx启动子区域，其亦为乙肝病毒其他各条病毒RNA转录所共有的区域。
[0012]利用细胞和小鼠模型，经过无数次试验摸索以及反复优化条件，本发明最终获得了一种TALEN,其不仅可以抑制乙肝病毒抗原标志物HBsAg和HBeAg的产生,并且可以部分降低cccDNA的含量及可以使cccDNA特定位点发生突变进而导致转录失活；此外,在合适时间加入IFN- α ( α干扰素)等乙肝治疗药物可以进一步降低pgRNA转录水平和cccDNA的含量，显示联用TALEN和其他抗病毒及免疫调节药物在治疗乃至根治乙肝病毒感染中的可能性。
[0013]本发明提供了一种转录激活因子样效应因子核酸酶在制备抑制乙肝病毒药物中的应用。
[0014]所述的抑制乙肝病毒药物的活性成分是针对乙肝病毒的转录激活因子样效应因子核酸酶。
[0015]本发明提供了一种抑制体外培养细胞中乙肝病毒的方法，将针对乙肝病毒基因组的转录激活因子样效应因子核酸酶转入含有乙肝病毒的体外培养细胞。
[0016]所述的体外培养细胞源自肝细胞。
[0017]所述的体外培养细胞是肝癌细胞。
[0018]所述的抑制体外培养细胞中乙肝病毒是指抑制乙肝病毒的病毒蛋白转录和cccDNA 活性。
[0019]本发明提供的种抑制体外培养细胞中乙肝病毒的方法，包括如下步骤:
[0020](I)设计并预处理针对乙肝病毒基因组的转录激活因子样效应因子核酸酶；
[0021](2)将步骤(I)所得的针对乙肝病毒基因组的转录激活因子样效应因子核酸酶转染入体外培养细胞。
[0022]针对乙肝病毒基因组的转录激活因子样效应因子核酸酶转染入细胞后继续培养1-4天，能够达到较好的抑制乙肝病毒的效果。
[0023]较好的，针对乙肝病毒基因组的转录激活因子样效应因子核酸酶转染入细胞后，继续培养1-2天，然后加入IFN-α，从而达到更好的抑制乙肝病毒的效果。
[0024]另一方面，本发明提供了一种转录激活因子样效应因子核酸酶，所述的转录激活因子样效应因子核酸酶特异性针对乙肝病毒基因组。
[0025]所述的转录激活因子样效应因子核酸酶包括针对在cccDNA序列中转录pgRNA片段的头部和尾部；其中头部设计在与Core、Po 1、HBeAg和pgRNA的转录密切相关的区段，尾部设计在HBx启动子区域。
[0026]另一方面，本发明提供了所述的方法的应用，即利用乙肝病毒基因组的转录激活因子样效应因子核酸酶加入收到乙肝病毒感染的细胞中，抑制乙肝病毒HbeAg、HbsAg,HBcAg病毒蛋白的产生，抑制cccDNA转录活性，或者抑制pgRNA、cccDNA的含量。
[0027]本发明提供了 TALEN在靶向乙肝病毒cccDNA及治疗慢性乙肝中的作用，并为TALEN最终应用于乙肝慢性感染的治疗展示了非常好的前景并提供了实验理论基础。
[0028]本发明经由细胞和动物模型水平的实验证实，针对乙肝病毒cccDNA所设计的TALEN对乙肝病毒编码蛋白的产生、基因组的转录活性、及cccDNA含量均有显著抑制作用；同时，TALEN与IFN等药物联用具有更强的抗病毒效果。本发明将TALEN技术用于靶向乙肝病毒cccDNA，为TALEN最终应用于乙肝慢性感染的治疗及根治展示了非常好的前景并提供了实验理论基础，同时为优化治疗乙肝病毒慢性感染提供了新的思路。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1.乙肝病毒的cccDNA结构以及TALEN设计。
[0030]图2.TALEN 对 HBsAg，HBeAg, pgRNA 和 cccDNA 含量等的影响。
[0031]图3.小鼠高压尾静脉注射模型验证TALEN抗乙肝病毒作用。
[0032]图4.TALEN和IFN联用显示出更强的抑制乙肝病毒效应。
【具体实施方式】
[0033]本发明设计了特异性靶向乙肝病毒cccDNA的TALEN。该发明为人们靶向cccDNA并进而调控cccDNA转录活性提供了实用的手段，更为有效治疗甚至根治慢性乙肝病毒感染提供了新的策略。
[0034]有报道显示，锌指蛋白(ZNPs)可以直接结合鸭乙肝病毒的cccDNA，而针对乙肝病毒的锌指蛋白偶联的核酸酶(ZFNs)可以显著降低pgRNA的水平，为人们控制乙肝病毒感染提供了新的思路。转录激活因子样效应因子(Transcript1nactivator-likeeffectors,TALE)技术是一种薪新的分子生物学工具。科学家发现,来自植物细菌Xanthomonassp.的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的。基于TALE技术的TALE核酸酶(TALEnuclease，TALEN)技术可构建针对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点打断目标基因DNA，进而调控该位点所在基因的转录和功能。TALEN技术克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性，且细胞毒性低、脱靶率低，是一种简单便捷的基因靶向技术。
[0035]本发明的TALEN技术在干预乙肝病毒感染中，是一种全新的靶向乙肝病毒基因组DNA (即cccDNA)及治疗和根治慢性乙肝病毒感染的策略和手段。
[0036]TALEN技术可以应用于革巴向乙肝病毒cccDNA。
[0037]TALEN技术可以应用于抑制乙肝病毒感染。
[0038]TALEN技术可以和其他抗病毒及免疫调节药物联用用于治疗乙肝病毒感染。
[0039]TALEN技术对乙肝病毒HBeAg，HBsAg, HBcAg等病毒蛋白的产生，cccDNA转录活性，及pgRNA和cccDNA含量的抑制作用。
[0040]为便于理解，以下将通过具体的实施例和附图对本发明的TALEN设计及应用进行详细地描述。需要特别指出的是，该附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出修改，这些修改也纳入本发明的范围内。
[0041 ] 实施例1、HBV复制型细胞系模型实施方式
[0042]将具有靶向乙肝病毒cccDNA功能的TALEN转染入乙肝病毒复制的细胞，乙肝病毒的病毒蛋白转录和cccDNA活性均受显著抑制。
[0043](I)肝癌细胞系Huh7的培养:采用DMEM培养液(Gibco公司，加10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和400mg/mlG418)在5%C02饱和水蒸气环境下37°C恒温培养；
[0044](2)采用罗氏公司生产的转染试剂将乙肝病毒复制型质粒:体外酶切线性化了的乙肝病毒基因组质粒(A基因型)，P乙肝病毒1.3 (B基因型)，P乙肝病毒1.3 (C基因型)或pCMV-乙肝病毒(D基因型)等导入Huh7细胞；
[0045](3)将编码TALEN (特异靶向cccDNA)的质粒或空白对照质粒同样以转染试剂导入细胞；
[0046](4)细胞培养72小时后，确认转染效率平衡的基础上，收集细胞上清检测病毒抗原标志物HBeAg，HBsAg ;固定或裂解细胞，检测胞浆中HBcAg，及pgRNA和cccDNA等的含量；
[0047](5)结果显示TALEN处理组相较空白处理组，乙肝病毒病毒蛋白和pgRNA及cccDNA水平全面下调，其中HBeAg下调可达70%，pgRNA和cccDNA下调50%左右，另表达有TALENs的细胞中鲜见HBcAg表达。
[0048](6)若在转染TALEN后36小时加入1000IU/mlIFN-α，在72小时时所检测得到的抑制效果比单独使用TALEN或IFN- α进一步增强近一倍，提示TALEN和IFN等其他抗病毒药物具有协同作用。
[0049]上述实例说明，本发明采用TALEN技术在细胞系中可通过特异性靶向乙肝病毒cccDNA显著抑制乙肝病毒基因组的转录活性并导致乙肝病毒基因组DNA含量的下降。
[0050]实施例2、小鼠模型实施方式
[0051](1)7周龄C3H/HeN雄性小鼠饲养于SPF环境中；
[0052](2)高压尾静脉注射以PBS稀释的乙肝病毒线性化质粒和TALEN或对照质粒；
[0053](3)注射后3天取血检测血清中HBsAg和HBeAg含量，注射后6天老鼠取材，其中血清用于检测HBsAg，HBeAg和乙肝病毒DNA，肝脏用于检测肝内pgRNA和cccDNA ；
[0054](4)结果显示，TALEN组血清和肝脏中病毒蛋白和核酸含量均显著低于对照组。其中HBsAg和HBeAg含量下降约50%，血清病毒DNA及肝内pgRNA和cccDNA下降约60_80%。
[0055]上述实例说明本发明采用TALEN技术在小鼠体内通过特异性靶向乙肝病毒cccDNA，对乙肝病毒病毒蛋白的产生、基因组的转录活性、及乙肝病毒基因组DNA含量均有显著抑制作用。
【权利要求】
1.转录激活因子样效应因子核酸酶在制备靶向干预乙肝病毒的药物中的应用，其特征在于，靶向干预乙肝病毒的药物中的活性成分为针对乙肝病毒基因组的转录激活因子样效应因子核酸酶。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的干预乙肝病毒是指抑制乙肝病毒的病毒蛋白转录和⑶⑶嫩活性。
3.一种抑制体外培养细胞中乙肝病毒的方法，其特征在于，所述的方法是将针对乙肝病毒的转录激活因子样核酸酶加入体外培养细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的体外培养细胞源自肝细胞。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的体外培养细胞是肝癌细胞。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤: (1)设计并预处理针对乙肝病毒基因组的转录激活因子样效应因子核酸酶； (2)将步骤(1)所得的针对乙肝病毒基因组的转录激活因子样效应因子核酸酶转染入体外培养细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，针对乙肝病毒基因组的转录激活因子样效应因子核酸酶转染入细胞后继续培养1-4天。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，针对乙肝病毒基因组的转录激活因子样效应因子核酸酶转染入细胞后继续培养1-2天，然后加入11^-0。
9.一种转录激活因子样效应因子核酸酶，其特征在于，所述的转录激活因子样效应因子核酸酶特异性针对乙肝病毒基因组。
10.如权利要求9所述的转录激活因子样效应因子核酸酶，其特征在于，所述的转录激活因子样效应因子核酸酶包括针对在⑶⑶嫩序列中转录？成嫩片段的头部和尾部；其中头部设计在与001*6、？01、耶6^和的转录密切相关的区段，尾部设计在启动子区域。
【文档编号】A61P31/20GK104367994SQ201310354673
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月14日 优先权日:2013年8月14日
【发明者】袁正宏, 陈捷亮 申请人:复旦大学