介孔二氧化硅纳米制剂及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种介孔二氧化硅纳米制剂，该制剂包含：多西紫杉醇或8-羟基喹啉、介孔二氧化硅纳米粒、脂质双分子层，所述介孔二氧化硅纳米粒负载多西紫杉醇或8-羟基喹啉，所述脂质双分子层包裹在该载有多西紫杉醇或8-羟基喹啉的介孔二氧化硅纳米粒表面。本发明还公开了该介孔二氧化硅纳米制剂的制备方法和应用。本发明载多西紫杉醇或8-羟基喹啉的介孔二氧化硅纳米制剂，不仅能显著提高药物抗肿瘤活性，而且能有效降低肿瘤的复发和非特异性毒性，应用前景非常广阔。
【专利说明】介孔二氧化硅纳米制剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药【技术领域】，具体涉及一种载8-羟基喹啉(8-HQ)或多西紫杉醇(DTX)的介孔二氧化硅纳米制剂，以及该纳米制剂的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]目前大量事实证明乳腺肿瘤是由肿瘤干细胞所引发，乳腺肿瘤的治愈需要彻底消除肿瘤干细胞。因为肿瘤干细胞对常规化疗药物的耐药性和对放射疗法的抵抗性，以及治疗后残余肿瘤干细胞的增殖，使得肿瘤干细胞在肿瘤治疗和复发中起着关键作用。
[0003]8-羟基喹啉是一种选择性针对肿瘤干细胞或起始细胞的化合物，与常规化疗药物联合使用可以显著提高肿瘤的治疗效果同时降低肿瘤的复发。多西紫杉醇为半合成紫杉醇类抗肿瘤药，通过干扰细胞有丝分裂和分裂间期细胞功能所必需的微管网络起到抗肿瘤作用，是临床常规化疗药物之一，但由于其难溶性和缺少靶向至肿瘤部位的能力，极大地限制了其临床应用。
[0004]纳米给药系统可以显著提高药物的稳定性，能够维持较长的血液循环时间及必需的血药浓度。8-羟基喹啉由于自身的物理性质，常规纳米粒的制备方法不能达到理想的载药量和包封效果，因此国内外至今未见8-羟基喹啉纳米制剂的报道。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种载8-羟基喹啉的介孔二氧化硅纳米制剂，该制剂以介孔二氧化硅纳米粒作为8-羟基喹啉的载体材料，在载有8-羟基喹啉的介孔二氧化硅纳米粒表面包覆有脂质膜，该制剂不仅能达到理想的载药量和包封效果，而且还可以修饰有靶头，实现靶向肿瘤干细胞的作用。
[0006]此外，还需要提供一种载多西紫杉醇的介孔二氧化硅纳米制剂，该制剂以介孔二氧化硅纳米粒作为多西紫杉醇的载体材料，在载有多西紫杉醇的介孔二氧化硅纳米粒表面包覆有脂质膜，该制剂不仅能充分发挥多西紫杉醇的药效，而且还具有靶向肿瘤细胞的功倉泛。
[0007]为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
[0008]在本发明的一个方面，提供了一种介孔二氧化硅纳米制剂，该制剂包含:抗肿瘤细胞药物多西紫杉醇、介孔二氧化硅纳米粒、脂质双分子层，所述介孔二氧化硅纳米粒负载多西紫杉醇，所述脂质双分子层包裹在该载有多西紫杉醇的介孔二氧化硅纳米粒表面。
[0009]所述介孔二氧化硅纳米粒为氨基化介孔二氧化硅纳米粒。
[0010]在本发明的另一方面，提供了一种介孔二氧化硅纳米制剂，该制剂包含:抗肿瘤干细胞药物8-羟基喹啉、介孔二氧化娃纳米粒、脂质双分子层,所述介孔二氧化娃纳米粒负载8-羟基喹啉，所述脂质双分子层包裹在该载有8-羟基喹啉的介孔二氧化硅纳米粒表面。[0011 ] 本发明的介孔二氧化硅纳米制剂，其结构包含介孔二氧化硅纳米粒核心和脂质双分子外层。其中，介孔二氧化硅纳米粒具有有序排列的介孔结构，用于吸附药物；脂质双分子层包覆后使药物释放行为得到控制，使其在体液PH值条件下基本无释放量，而在细胞内PH环境下快速释放。
[0012]所述介孔二氧化硅纳米粒为氨基化介孔二氧化硅纳米粒。
[0013]所述脂质双分子层表面还修饰有透明质酸。本发明选择透明质酸(HA)修饰脂质双分子层，是因为HA是一种糖胺聚糖，对肿瘤细胞上的CD44受体有很强的亲和性，HA作为载体系统的靶头，可以将药物特异性靶向肿瘤细胞。同时，HA也是肿瘤干细胞的理想靶头。
[0014]在本发明的另一方面，还提供了一种介孔二氧化硅纳米制剂的制备方法，包括以下步骤:
[0015]将十六烷基三 甲基溴化铵溶于碱性溶液后，加入正硅酸四乙酯反应，得空白介孔二氧化硅纳米粒；
[0016]将介孔二氧化硅纳米粒氨基化处理后，加入多西紫杉醇或8-羟基喹啉溶液，经搅拌、离心，得载多西紫杉醇或8-羟基喹啉的介孔二氧化硅纳米粒；
[0017]将DOPC、DOPE、胆固醇、18:0PEG2000-PE用氯仿溶解后旋蒸，得脂质膜，再将该脂质膜水化后，用薄膜挤出器过膜多次，得脂质体；
[0018]将上述制备的脂质体，加入到载多西紫杉醇或8-羟基喹啉的介孔二氧化硅纳米粒的混悬液中，孵育，离心，得脂质双分子层包裹的载多西紫杉醇或8-羟基喹啉介孔二氧化娃纳米粒。
[0019]优选的，所述脂质体在加入到载8-羟基喹啉的介孔二氧化硅纳米粒混悬液之前，还包括步骤:将脂质体进行透明质酸修饰。
[0020]本发明介孔二氧化硅纳米制剂的上述制备工艺简单，条件温和，能充分保持药物活性，解决了 8-羟基喹啉不易被包封的问题。
[0021]本发明载8-羟基喹啉的介孔二氧化硅纳米制剂，对8-羟基喹啉有很好的包封作用，包封率为79.04 ± 0.95%，载药量高达13.65 ± 0.14%。
[0022]在本发明的另一方面，还提供了上述介孔二氧化硅纳米制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
[0023]优选的，在给药时，载8-羟基喹啉的介孔二氧化硅纳米制剂和载多西紫杉醇的介孔二氧化硅纳米制剂联合给药。因为多西紫杉醇主要作用于普通肿瘤细胞，对肿瘤干细胞作用不明显，停药后肿瘤在干细胞作用下会继续增长；而8-羟基喹啉主要作用于肿瘤干细胞，对肿瘤细胞的抑制作用没有多西紫杉醇强，停药后肿瘤体积变化不明显。因此，联合使用8-羟基喹啉和多西紫杉醇的介孔二氧化硅纳米制剂，既能提高抗肿瘤活性，又可以降低肿瘤的复发和非特异性毒性。
[0024]本发明载8-羟基喹啉或多西紫杉醇的介孔二氧化硅纳米制剂，具有粒径小、分布均匀、包封率高的优势，在中性条件(PH7.4)下显示出较长时间的稳定性，在偏酸性条件(pH5.0)下，药物在12小时内基本完全释放，说明本发明制剂在体循环状态稳定，而在细胞内偏酸环境下药物快速释放。该制剂适用于癌症的治疗，将脂质双分子层用透明质酸修饰后，可以靶向肿瘤细胞，并且该制剂粒径小于200nm，易于进入细胞内部，在细胞内环境中缓慢释放药物。本发明制剂特别适用于乳腺肿瘤细胞和肿瘤干细胞的靶向治疗，具有非常广阔的应用前景。【专利附图】
【附图说明】
[0025]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0026]图1是本发明的介孔二氧化硅纳米制剂的结构示意图；
[0027]图2是本发明的介孔二氧化硅纳米粒的氮气吸附-脱附等温线(图2A)和BJH模型孔径分布曲线图(图2B);
[0028]图3是本发明的介孔二氧化硅脂质靶向纳米粒的粒径和电位图；
[0029]图4是本发明的介孔二氧化硅脂质靶向纳米粒的透射电镜图；
[0030]图5是本发明的介孔二氧化硅脂质靶向纳米粒的扫描电镜图；
[0031]图6是本发明的介孔二氧化硅脂质靶向纳米粒的体外释放曲线图；
[0032]图7是本发明实施例4的DTX-1oaded MSS与DTX原料药对MCF-7细胞和乳腺肿瘤微球体生长抑制作用的浓度关系图；
[0033]图8是本发明实施例4的8-HQ-loaded HA-MSS与8-HQ原料药对MCF-7细胞和乳腺肿瘤微球体生长抑制作用的浓度关系图；
[0034]图9是本发明实 施例4的空白HA-MSS对MCF-7细胞和乳腺肿瘤微球体生长抑制作用的浓度关系图；
[0035]图10是本发明实施例5不同处方组裸鼠肿瘤体积随时间的变化图；
[0036]图11是本发明实施例5不同处方组裸鼠体重随时间的变化图。
【具体实施方式】
[0037]为了降低抗肿瘤药物的非特异性毒性，本发明研制出了一种载8-羟基喹啉或多西紫杉醇的介孔二氧化硅纳米制剂，该制剂以介孔二氧化硅纳米粒作为内核，介孔孔径可调节易修饰，载药量高；脂质双分子层作为外层，控制纳米粒的递释，并且可以选择靶头修饰，实现靶向肿瘤干细胞的作用。本发明选择透明质酸(HA)修饰脂质双分子层，HA是一种糖胺聚糖，对CD44受体有很强的亲和性，是乳腺肿瘤干细胞的理想靶头。本发明的纳米给药系统可以显著提高药物的稳定性，具有控释和靶向双重作用，能够维持较长的血液循环时间及必需的血药浓度，特异性识别肿瘤细胞或肿瘤干细胞，克服了其他剂型全身给药的无选择性分布和非特异性毒性，而且，特定粒径范围的纳米粒还可以通过细胞的内吞作用实现细胞内给药。本发明载8-羟基喹啉的介孔二氧化硅纳米制剂和载多西紫杉醇的介孔二氧化硅纳米制剂，联合使用，既能提高药物的抗肿瘤活性，又可以降低肿瘤的复发和非特异性毒性，具有非常广阔的应用前景。
[0038]如图1所示，本发明提供了一种载8-羟基喹啉(8-HQ)或多西紫杉醇(DTX)的介孔二氧化硅纳米制剂，该制剂包含:抗肿瘤干细胞药物8-羟基喹啉(图1A)或抗肿瘤细胞药物多西紫杉醇(图1B)、介孔二氧化硅纳米粒、脂质双分子层，介孔二氧化硅纳米粒负载药物8-羟基喹啉或多西紫杉醇，脂质双分子层包裹在该载有8-羟基喹啉或多西紫杉醇的介孔二氧化娃纳米粒表面。在载8-羟基喹啉(8-HQ)的介孔二氧化娃纳米制剂表面,还修饰有透明质酸(HA)。
[0039]本发明介孔二氧化硅纳米制剂的制备方法，包括以下步骤:
[0040]一、介孔二氧化硅纳米粒(MSN)的制备
[0041]在装有机械搅拌器、温度计的500mL两口圆底烧瓶中，将一定量的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶解于超纯水中，加入一定量2.0M的NaOH溶液，混匀后将混合溶液升温至一定温度维持30min，得到澄清液体。将一定量的正硅酸四乙酯(TEOS)注入到混合溶液中，一定速度搅拌，3min后可见白色沉淀，维持反应温度在一定温度2h。混合溶液冷却至室温，离心分离固体产物(3500rpm，15min)，去除上清，沉淀依次分别用超纯水和乙醇洗三次，将固体产物置于坩埚中，于室温真空箱干燥12h。12h后，在550°C马弗炉中煅烧5h以去除介孔中的表面活性剂，即得到MSN。
[0042]反应的各项参数为:
[0043]CTAB 0.25-0.75g
[0044]超纯水120_480mL
[0045]NaOH 1.5-4.5mL
[0046]TEOS 1.25-4.67g
[0047]温度25 °C -80 °C
[0048]揽拌速度200rpm-1000rpm
[0049]二、氨基化介孔二氧化硅纳米粒(Ap-MSN)的制备
[0050]精密称取一定量MSN置于西林瓶，加入一定量无水乙醇和一定量二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷(AEPTMS)，超声分散，室温下磁力搅拌24h，转移至离心管中，1000Orpm离心3min，依次用超纯水和乙醇洗涤三次，沉淀室温下真空干燥12h，即得到氨基化介孔二氧化硅纳米粒(Ap-MSN)。
[0051]它们的配比为:
[0052]MSN 100-300mg
[0053]无水乙醇3.2_9.6mL
[0054]AEPTMS 0.8-2.4mL
[0055]三、制备载药的介孔二氧化硅纳米粒
[0056]分别精密称取药物DTX和8-HQ，加适当溶剂溶解。精密称取一定质量的Ap-MSN，分别加入DTX或8-HQ溶液，在常温下磁力搅拌24h。然后转入离心管，置于高速离心机，1000Orpm离心10min,即得载DTX或8-HQ的Ap-MSN。它们的配比为:
[0057]Ap-MSN25_75mg
[0058]DTX 溶液 2.5-7.5mg/mL
[0059]8-HQ 溶液 2.5-7.5mg/mL
[0060]四、脂质体的制备
[0061]精密称取一定量的D0PC(1, 2-dioIeoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 二油酸憐脂酸胆喊)、D0PE(1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 二油酸憐脂酸乙醇胺)、胆固醇、18: 0PEG2000-PE (I, 2-dioIeoyl-sn-glycero-3-phosphoethanoIamine-N-[methoxy (polyethyleneglycol) -2000],甲氧基聚乙二醇2000- 二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺)，置于梨形瓶。加入一定量的氯仿溶解，置于旋转蒸发仪旋蒸30min。然后将脂质膜用一定量的0.5 X杜氏磷酸缓冲液(D-PBS)充分水化，使用薄膜挤出器，选用200nm膜挤压15次，再用IOOnm膜挤压20次，得到脂质体。它们的配比为:
[0062]DOPC 10-20mg
[0063]DOPE 0.75-1.75mg[0064]胆固醇5.0-10.0mg
[0065]18:0PEG2000-PE 0.75-1.75mg
[0066]氯仿l-5mL
[0067]0.5 X D-PBS l_5mL
[0068]五、脂质体的透明质酸(HA)修饰
[0069]精密称取一定量的HA，加超纯水溶解，加入一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)，用盐酸调至pH4.0，置于恒温振荡箱37°C活化2h，按体积比1:1加入脂质体，用NaOH溶液调至pH8.6，充入氮气，置于37°C恒温振荡箱孵育24h。最后，超速离心(15，000g, 40C，30min)，用超纯水洗三次后重悬，冻干，得透明质酸(HA)修饰的脂质体。它们的配比为:
[0070]HA5-15mg
[0071]EDC.HC15_15mg
[0072]六、制备载多西紫杉醇的脂质双分子层包裹的介孔二氧化硅纳米粒(DTX-loadedMSS)
[0073]精密称取一定质量的载DTX的Ap-MSN，用超纯水溶解，加入过量的脂质体，室温下孵育lh。然后置于高速离心机，10，OOOrpm离心5min，用0.5 X D-PBS洗三次，去除过量的脂质。最后用0.5XD-PBS重分散，即得到DTX-loaded MSS，保存在4°C。它们的配比为:
[0074]载DTX 的 Ap-MSN 混悬液浓度 5_15mg/mL
[0075]脂质体混悬液浓度5_15mg/mL
[0076]纳米粒混悬液与脂质体混悬液体积比1:2-1:4
[0077]七、制备载8-HQ的透明质酸修饰脂质双分子层包裹的介孔二氧化硅纳米粒(8-HQ-loaded HA-MSS)
[0078]精密称取一定质量的载8-HQ的Ap-MSN，用超纯水溶解，加入过量的透明质酸修饰脂质体，室温下孵育lh。然后置于高速离心机，10，OOOrpm离心5min，用0.5 XD-PBS洗三次，去除过量的脂质。最后用0.5 X D-PBS重分散，即得到8-HQ-loaded HA-MSS,保存在4°C。它们的配比为:
[0079]载8-HQ 的 Ap-MSN 混悬液浓度 5_15mg/mL
[0080]透明质酸修饰脂质体混悬液浓度5_15mg/mL
[0081 ] 纳米粒混悬液与透明质酸修饰脂质体混悬液体积比1:2-1:4
[0082]下面通过具体实施例阐述本发明。
[0083]仪器和材料:
[0084]十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),美国sigma公司；
[0085]原娃酸四乙酯(TE0S),美国sigma公司；
[0086]DOPC (二油酰磷脂酰胆碱)，美国Avanti Polar Lipid公司；
[0087]DOPE (二油酰磷脂酰乙醇胺),美国Avanti Polar Lipid公司；
[0088]胆固醇，美国Avanti Polar Lipid 公司；
[0089]18:0PEG2000-PE (甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺)，美国Avanti Polar Lipid 公司；
[0090]氢氧化钠(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；[0091]盐酸(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；
[0092]氯仿(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；
[0093]乙醇(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；
[0094]1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)，上海卡永生物技术公司；
[0095]杜氏磷酸缓冲液(D-PBS),美国Thermo公司；
[0096]薄膜挤出器，美国Avanti Polar Lipid公司；
[0097]JW-BK112全自动比表面及孔径分析仪，北京精微高博科学技术有限公司；
[0098]透射电子显微镜JEM2100F，日本JEOL公司；
[0099]扫描电子显微镜xl30feg，荷兰飞利浦公司；
[0100]Zetasizer nano ZS激光粒度分析仪,英国马尔文公司；
[0101]岛津高效液相色谱仪LC-20A，日本岛津公司。
[0102]实施例1制备载8-羟基喹啉或多西紫杉醇的介孔二氧化硅脂质靶向纳米粒
[0103]1.介孔二氧化 硅纳米粒(MSN)的制备
[0104]在装有机械搅拌器、温度计的500mL两口圆底烧瓶中，将0.75g的CTAB溶解于480mL超纯水中，加入3.5mL2.0M的氢氧化钠水溶液，混匀后将混合溶液升温至80°C维持30min，得到澄清液体。将4.67g TEOS连续快速的注入到混合溶液中，550rpm搅拌，3min后可见白色沉淀，维持反应温度在80°C 2h。室温下离心分离固体产物(3500rpm, 15min),去除上清，沉淀依次分别用超纯水和乙醇洗三次，真空干燥12h。12h后，在550°C马弗炉中煅烧5h以去除介孔中的表面活性剂，即得到MSN。
[0105]2.氨基化介孔二氧化硅纳米粒(Ap-MSN)的制备
[0106]精密称取200mg MSN置于西林瓶，加入6.4mL无水乙醇和1.6mL AEPTMS，超声分散，室温下磁力搅拌24h,转移至离心管中，1000Orpm离心3min,依次用超纯水和乙醇洗漆三次，沉淀室温下真空干燥12h，即得到氨基化介孔二氧化硅纳米粒(Ap-MSN)。
[0107]3.制备载DTX或8-HQ的介孔二氧化硅纳米粒
[0108]精密称取50mg DTX,加乙腈溶解，IOmL容量瓶定容。精密称取50mg的Ap-MSN，加入2mL DTX溶液，在常温下磁力搅拌24h。然后转入离心管，置于高速离心机，1000Orpm离心 lOmin，即得载 DTX 的 Ap-MSN。
[0109]精密称取50mg8-HQ，加甲醇溶解，IOmL容量瓶定容。精密称取50mg的Ap-MSN，加入2mL8-HQ溶液，在常温下磁力搅拌24h。然后转入离心管，置于高速离心机，1000Orpm离心 lOmin，即得载 8-HQ 的 Ap-MSN。
[0110]4.脂质体的制备
[0111]精密称取15mg DOPCU.25mg D0PE、7.5mg 胆固醇、1.25mg PEG2000-PE，置于梨形瓶。加入3mL氯仿溶解,置于旋转蒸发仪旋蒸30min。然后将脂质膜用2.5mL的0.5 X杜氏磷酸缓冲液(D-PBS)充分水化，使用薄膜挤出器，选用200nm膜挤压15次，再用IOOnm膜挤压20次，得到脂质体。
[0112]5.脂质体的透明质酸(HA)修饰
[0113]精密称取IOmg HA，加IOmL超纯水溶解，加入IOmgl-(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐化00此1)，用盐酸调至？!14.0，置于恒温振荡箱371:活化211，按体积比1: 1，取其中2mL加入2mL脂质体(10mg/mL)，用NaOH溶液调至pH8.6，充入氮气，置于37°C恒温振荡箱孵育24h。最后，超速离心(15，000g，4°C，30min)，用ImL超纯水洗三次后重悬，冻干，得透明质酸(HA)修饰的脂质体。
[0114]6.制备载多西紫杉醇的脂质双分子层包裹的介孔二氧化硅纳米粒(DTX-loadedMSS)
[0115]精密称取IOmg的载DTX的Ap-MSN，加ImL超纯水溶解，加入3倍体积的脂质体(月旨质体混悬液浓度10mg/mL),室温下孵育lh。然后置于高速离心机，10, OOOrpm离心5min,用0.5XD-PBS洗三次，去除过量的脂质。最后用0.5XD-PBS重分散，即得到DTX-loaded MSS,保存在4°C。
[0116]7.制备载8-HQ的透明质酸修饰脂质双分子层包裹的介孔二氧化硅纳米粒(8-HQ-loaded HA-MSS)
[0117]精密称取IOmg的载8-HQ的Ap-MSN，加ImL超纯水溶解，加入3倍体积的透明质酸修饰脂质体(透明质酸修饰脂质体混悬 液浓度10mg/mL)，室温下孵育lh。然后置于高速离心机，10，OOOrpm离心5min，用0.5XD-PBS洗三次，去除过量的脂质。最后用0.5XD-PBS重分散，即得到8-HQ-loaded HA-MSS,保存在4°C。
[0118]实施例2制备载8-羟基喹啉或多西紫杉醇的介孔二氧化硅脂质靶向纳米粒
[0119]1.介孔二氧化硅纳米粒(MSN)的制备
[0120]在装有机械搅拌器、温度计的500mL两口圆底烧瓶中，将0.25g的CTAB溶解于120mL超纯水中，加入1.5mL2.0M的氢氧化钠水溶液，混匀后将混合溶液升温至60°C维持45min，得到澄清液体。将1.25g TEOS连续快速的注入到混合溶液中，200rpm搅拌，3min后可见白色沉淀，维持反应温度在60°C 2h。室温下离心分离固体产物(3500rpm, 15min),去除上清，沉淀依次分别用超纯水和乙醇洗三次，真空干燥12h。12h后，在550°C马弗炉中煅烧5h以去除介孔中的表面活性剂，即得到MSN。
[0121]2.氨基化介孔二氧化硅纳米粒(Ap-MSN)的制备
[0122]精密称取IOOmg MSN置于西林瓶，加入3.2mL无水乙醇和0.8mL AEPTMS，超声分散，室温下磁力搅拌24h,转移至离心管中，1000Orpm离心3min,依次用超纯水和乙醇洗漆三次，沉淀室温下真空干燥12h，即得到氨基化介孔二氧化硅纳米粒(Ap-MSN)。
[0123]3.制备载DTX或8-HQ的介孔二氧化硅纳米粒
[0124]精密称取25mg DTX,加乙腈溶解，IOmL容量瓶定容。精密称取25mg的Ap-MSN，加入2mL DTX溶液，在常温下磁力搅拌24h。然后转入离心管，置于高速离心机，1000Orpm离心 lOmin，即得载 DTX 的 Ap-MSN。
[0125]精密称取25mg8-HQ，加甲醇溶解，IOmL容量瓶定容。精密称取25mg的Ap-MSN，加入2mL8-HQ溶液，在常温下磁力搅拌24h。然后转入离心管，置于高速离心机，1000Orpm离心 lOmin，即得载 8-HQ 的 Ap-MSN。
[0126]4.脂质体的制备
[0127]精密称取IOmg D0PC、0.75mg D0PE、5.0mg 胆固醇、0.75mg PEG2000-PE，置于梨形瓶。加入ImL氯仿溶解,置于旋转蒸发仪旋蒸30min。然后将脂质膜用1.0mL的0.5 X杜氏磷酸缓冲液(D-PBS)充分水化，使用薄膜挤出器，选用200nm膜挤压15次，再用IOOnm膜挤压20次，得到脂质体。[0128]5.脂质体的透明质酸(HA)修饰
[0129]精密称取5mg HA，加IOmL超纯水溶解，加入5mgl-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.Η(:1)，用盐酸调至ρΗ4.0,置于恒温振荡箱37°C活化2h，按体积比1:1，取其中2mL加入2mL脂质体(10mg/mL)，用NaOH溶液调至pH8.6，充入氮气，置于37°C恒温振荡箱孵育24h。最后，超速离心(15，OOOg, 40C，30min)，用ImL超纯水洗三次后重悬，冻干，得透明质酸(HA)修饰的脂质体。
[0130]6.制备载多西紫杉醇的脂质双分子层包裹的介孔二氧化硅纳米粒(DTX-loadedMSS)
[0131 ] 精密称取5mg的载DTX的Ap-MSN，加ImL超纯水溶解，加入2倍体积的脂质体(月旨质体混悬液浓度15mg/mL),室温下孵育lh。然后置于高速离心机，10, OOOrpm离心5min,用0.5XD-PBS洗三次，去除过量的脂质。最后用0.5XD-PBS重分散，即得到DTX-loaded MSS,保存在4°C。
[0132]7.制备载8-HQ的透明质酸修饰脂质双分子层包裹的介孔二氧化硅纳米粒(8-HQ-loaded HA-MSS)
[0133]精密称取5mg的载8-HQ的Ap-MSN，加ImL超纯水溶解，加入2倍体积的透明质酸修饰脂质体(透明质酸修饰脂质体混悬液浓度15mg/mL)，室温下孵育lh。然后置于高速离心机，10，OOOrpm离心5min，用0.5XD-PBS洗三次，去除过量的脂质。最后用0.5XD-PBS重分散，即得到8-HQ-loaded HA-MSS，保存在4°C。
[0134]实施例3制备 载8-羟基喹啉或多西紫杉醇的介孔二氧化硅脂质靶向纳米粒
[0135]1.介孔二氧化硅纳米粒(MSN)的制备
[0136]在装有机械搅拌器、温度计的500mL两口圆底烧瓶中，将0.5g的CTAB溶解于300mL超纯水中，加入4.5mL2.0M的氢氧化钠水溶液，混匀后将混合溶液升温至80°C维持30min，得到澄清液体。将3.0g TEOS连续快速的注入到混合溶液中，1000rpm搅拌，3min后可见白色沉淀，维持反应温度在80 °C 2h。室温下离心分离固体产物(3500rpm, 15min),去除上清，沉淀依次分别用超纯水和乙醇洗三次，真空干燥12h。12h后，在550°C马弗炉中煅烧5h以去除介孔中的表面活性剂，即得到MSN。
[0137]2.氨基化介孔二氧化硅纳米粒(Ap-MSN)的制备
[0138]精密称取300mg MSN置于西林瓶，加入9.6mL无水乙醇和2.4mL AEPTMS，超声分散，室温下磁力搅拌24h,转移至离心管中，1000Orpm离心3min,依次用超纯水和乙醇洗漆三次，沉淀室温下真空干燥12h，即得到氨基化介孔二氧化硅纳米粒(Ap-MSN)。
[0139]3.制备载药的介孔二氧化硅纳米粒
[0140]精密称取75mg DTX,加乙腈溶解，IOmL容量瓶定容。精密称取75mg的Ap-MSN，加入2mL DTX溶液，在常温下磁力搅拌24h。然后转入离心管，置于高速离心机，1000Orpm离心 lOmin，即得载 DTX 的 Ap-MSN。
[0141]精密称取75mg8-HQ，加甲醇溶解，IOmL容量瓶定容。精密称取75mg的Ap-MSN，加入2mL8-HQ溶液，在常温下磁力搅拌24h。然后转入离心管，置于高速离心机，1000Orpm离心 lOmin，即得载 8-HQ 的 Ap-MSN。
[0142]4.脂质体的制备
[0143]精密称取20mg DOPCU.75mg DOPE、10.0mg胆固醇、1.75mg PEG2000-PE，置于梨形瓶。加入5mL氯仿溶解,置于旋转蒸发仪旋蒸30min。然后将脂质膜用5.0mL的0.5 X杜氏磷酸缓冲液(D-PBS)充分水化，使用薄膜挤出器，选用200nm膜挤压15次，再用IOOnm膜挤压20次，得到脂质体。
[0144]5.脂质体的透明质酸(HA)修饰
[0145]精密称取15mg HA，加IOmL超纯水溶解，加入15mgl_ (3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐化00此1)，用盐酸调至？!14.0，置于恒温振荡箱371:活化211，按体积比1: 1，取其中2mL加入2mL脂质体(10mg/mL)，用NaOH溶液调至pH8.6，充入氮气，置于37°C恒温振荡箱孵育24h。最后，超速离心(15，000g，4°C，30min)，用ImL超纯水洗三次后重悬，冻干，得透明质酸(HA)修饰的脂质体。
[0146]6.制备载多西紫杉醇的脂质双分子层包裹的介孔二氧化硅纳米粒(DTX-loadedMSS)
[0147]精密称取15mg的载DTX的Ap-MSN，加ImL超纯水溶解，加入4倍体积的脂质体(月旨质体混悬液浓度5mg/mL),室温下孵育lh。然后置于高速离心机，10, OOOrpm离心5min,用0.5XD-PBS洗三次，去除过量的脂质。最后用0.5XD-PBS重分散，即得到DTX-loadedMSS，保存在4°C。
[0148]7.制备载8-HQ的透明质酸修饰脂质双分子层包裹的介孔二氧化硅纳米粒(8-HQ-loadedHA-MSS)
[0149]精密称取15mg的载8-HQ的Ap-MSN，加ImL超纯水溶解，加入4倍体积的透明质酸修饰脂质体(透明质酸修饰脂质体混悬液浓度5mg/mL)，室温下孵育lh。然后置于高速离心机，10，000印111离心51^11，用0.5\0^^5洗三次，去除过量的脂质。最后用0.5XD-PBS M分散，即得到8-HQ-loaded HA-MSS，保存在4°C。
[0150]将实施例1~3制备的空白介孔二氧化硅纳米粒(MSN)、氨基化介孔二氧化硅纳米粒(Ap-MSN)、脂质体、载多西紫杉醇的脂质双分子层包裹的介孔二氧化娃纳米粒(DTX-loaded MSS)、载8_HQ的透明质酸修饰脂质双分子层包裹的介孔二氧化娃纳米粒(8-HQ-loaded HA-MSS),进行如下的实验验证:
[0151]一、介孔二氧化硅纳米粒的性质考察
[0152]采用比表面积及孔径分析仪测试实施例1~3中制备的空白介孔二氧化硅纳米粒的比表面积、孔径分布和孔容积等性能参数。样品测试前先在氮气流中于250°C脱气12h。用BET模型计算比表面积，用BJH模型计算孔容积。
[0153]图2是MSN的氮气吸附-脱附等温线(图2A)和孔容-孔径分布曲线图(图2B)。经BET模型计算得比表面积为733.726m2/g，经BJH模型计算得孔容积为0.695cm3/g,最可几孔径为1.978nm。图2A曲线属于Langmuir IV型吸附曲线,是典型的介孔结构吸附特征曲线。在低分压段(Ρ/Ρ/0.3阶段)，吸附量陡增产生突跃，这是N2分子低温下在介孔孔道内产生的毛细凝聚所致，吸附量的急剧增加表明介孔结构的存在并且孔径较均匀。之后N2分子吸附于外表面，曲线(0.3<P/P0<0.9阶段)变化不大，较为平坦，在P/匕约为0.9处又出现突跃，这是颗粒间空隙所造成的毛细管凝聚。样品的吸附-脱附等温线未出现比较明显的滞后环，说 明这些样品中存在3D形状规则且孔径高度均一的介孔孔道。
[0154]图2B是介孔二氧化硅纳米粒的BJH模型孔径分布曲线(即孔容-孔径微分分布曲线)，结果与氮气吸附-脱附等温线一致，也显示样品的孔径是介孔范畴且孔径分布较为集中。
[0155]二、粒径及电位的测定
[0156]使用Zetasizer nano ZS测得实施例1~3制得的氨基化介孔二氧化娃纳米粒(Ap-MSN)的粒径为 101.6±1.237nm, zeta 电位为 37.1±1.07mv，见图 3。
[0157]使用Zetasizer nano ZS测得实施例1~3制得的脂质体(Liposomes)的粒径为166.6±0.6506nm, zeta 电位为-53.4±1.27mv，见图 3。
[0158]在图3 中，Al 和 B1:MSN，A2 和 B2: Ap-MSN, A3 和 B3: Liposomes, A4 和B4: HA-Liposomes, A5 和 B5:空白 MSS，A6 和 B6:空白 HA-MSS。
[0159]图3中各种纳米粒材料的粒径和zeta电位的详细数值见下表1。
[0160]表1材料的粒径和zeta电位表
【权利要求】
1.一种介孔二氧化硅纳米制剂，其特征在于，该制剂包含:多西紫杉醇、介孔二氧化硅纳米粒、脂质双分子层，所述介孔二氧化硅纳米粒负载多西紫杉醇，所述脂质双分子层包裹在该载有多西紫杉醇的介孔二氧化硅纳米粒表面。
2.—种介孔二氧化娃纳米制剂,其特征在于,该制剂包含:8_羟基喹啉、介孔二氧化娃纳米粒、脂质双分子层，所述介孔二氧化硅纳米粒负载8-羟基喹啉，所述脂质双分子层包裹在该载有8-羟基喹啉的介孔二氧化娃纳米粒表面。
3.根据权利要求1或2所述的介孔二氧化硅纳米制剂，其特征在于，所述介孔二氧化硅纳米粒为氨基化介孔二氧化硅纳米粒。
4.根据权 利要求2所述的介孔二氧化硅纳米制剂，其特征在于，所述脂质双分子层表面还修饰有透明质酸。
5.权利要求1或2所述介孔二氧化硅纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 将十六烷基三甲基溴化铵溶于碱性溶液后，加入正硅酸四乙酯反应，得空白介孔二氧化娃纳米粒； 将介孔二氧化硅纳米粒氨基化处理后，加入多西紫杉醇或8-羟基喹啉溶液，经搅拌、离心，得载多西紫杉醇或8-羟基喹啉的介孔二氧化硅纳米粒； 将DOPC、DOPE、胆固醇、18:0PEG2000-PE用氯仿溶解后旋蒸，得脂质膜，再将该脂质膜水化后，用薄膜挤出器过膜多次，得脂质体； 将上述制备的脂质体，加入到载多西紫杉醇或8-羟基喹啉的介孔二氧化硅纳米粒的混悬液中，孵育，离心，得脂质双分子层包裹的载多西紫杉醇或8-羟基喹啉介孔二氧化硅纳米粒。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述脂质体在加入到载8-羟基喹啉的介孔二氧化硅纳米粒混悬液之前，还包括步骤:将脂质体进行透明质酸修饰。
7.权利要求1所述的介孔二氧化硅纳米制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物在给药时，与权利要求2所述的介孔二氧化娃纳米制剂联合给药。
9.权利要求2所述的介孔二氧化硅纳米制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物在给药时，与权利要求1所述的介孔二氧化娃纳米制剂联合给药。
【文档编号】A61K47/04GK103990130SQ201310482687
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年6月24日
【发明者】钟延强, 何为, 王冬, 张翮, 鲁莹, 黄景彬, 王新霞, 张国庆, 陈琰, 俞媛, 邹豪, 刘俊杰, 孙治国, 陶春, 贾婷婷, 吴珊, 向婧洁 申请人:中国人民解放军第二军医大学