原花青素b2在药物中的用途
【专利摘要】本发明提供原花青素B2在制备具有保护骨髓细胞作用的药物中的用途。在一种具体的实施方式中，所述原花青素B2为原花青素B2含量为100%的化合物。在另一种【具体实施方式】中，所述原花青素B2为含原花青素B2为0.05～1.5wt%的混合物，优选为含原花青素B2为0.05～0.4wt%的混合物。在该发明中，优选所述混合物中还包含儿茶素和地榆素中的至少一种。本发明提供的原花青素B2能保护骨髓造血干细胞，缓解放疗或化疗药物引起的小鼠骨髓DNA抑制，还能够升高白细胞数量。
【专利说明】原花青素B2在药物中的用途
[0001]本申请是申请号为201180038931.5的分案申请，母案申请日为2011年9月14日，母案的发明名称为一种地榆鞣质提取物及其制备方法和用途。
【技术领域】
[0002]本发明涉及原花青素B2在药物中的用途。
【背景技术】
[0003]骨髓抑制，是指骨髓中的血细胞前体的活性下降。血液里的红细胞和白细胞都源于骨髓中的造血干细胞。血液里的血细胞寿命短，常常需要不断补充。为了达到及时补充的目的，作为血细胞前体的干细胞必须快速分裂。化学治疗和放射治疗以及许多其它抗肿瘤治疗方法，都是针对快速分裂的细胞，因而常常导致正常骨髓细胞抑制，引起患者骨髓造血功能障碍，使得患者体内红细胞、白细胞、血小板等降低，从而导致贫血、出血、免疫机制下降等现象。
[0004]白细胞减少症，为常见血液病，它是指外周血液中白细胞持续低于4 X 109/L。白细胞是人体防御细菌入侵的巡逻兵。白细胞数减少，就会削弱人体抗菌能力，容易受感染。特别是放、化疗、感染患者、风湿病科系统性红斑狼疮等使用免疫抑制剂、传染病科使用抗结核药物利福平等均能引起的外周血白细胞的减少，从而削弱人体抗菌能力，导致免疫力下降等不良反应。目前，白细胞减少症主要分为原因不明性和继发性两种，前者多见，而后者多是由放疗、化疗、感染、免疫因素等引起的骨髓损伤而造成。
[0005]白细胞减少症和骨髓抑制都存在白细胞减少这一显著现象，但是，在用药时还是存在一定差异，目前，某些具有升白作用的药物，并不具有骨髓保护的作用，如rhG-CSF具有较强的升白作用，但其对骨髓细胞的损害作用不可忽视。因此，寻找能够升高白细胞浓度并能有效保护骨髓细胞的药物显得十分必要。
[0006]地偷为蔷薇科植物地偷Sanguisorba officinalis L.或长叶地偷Sanguisorbadofficinalis L.var.1ongifolia(Bert.)Yu et Li的干燥根，具有凉血止血、解毒敛疮之功效。地榆药材中含有大量的鞣质类成分(约20%左右)，除此之外，还含有皂苷、黄酮等化合物。当前对地榆的大多数研究都围绕地榆皂苷进行，普遍认为地榆升高白细胞作用以及骨髓保护作用的有效成分为地榆皂苷，国内对地榆升白作用的物质基础研究认为，地榆皂苷是促进小鼠骨髓细胞体外增殖的主要活性部位，地榆皂苷也能升高骨髓抑制小鼠的白细胞、红细胞以及血小板数量，而地榆鞣质和地榆黄酮不能促进骨髓细胞增殖，反而在高浓度下会产生骨髓抑制作用(高小平等，地榆促造血作用的有效部位筛选，中国天然药物，2006年4卷2期)。
[0007]目前，对地榆鞣质的药效研究较为少见，国外有文献报道称，地榆鞣质具有抗癌作用[Bastow kF.Bort LD.Fukushrma Y et al.1nhibition of DNA topoisomerases bysanguim H_6，a cytotoxic dimeric ella—gitan—ton from sanguisorba officinalis.Planta Med, 1993; 59 (3):240-245.]。对地榆鞣质的提取也有部分报道，如高小平等，采用70%含水丙酮对地榆进行提取，得到的提取物中鞣质含量为43.86%(中国天然药物，2006年4卷2期)；由于该方法是采用丙酮提取，未经过分离，得到提取物中除含有鞣质外，还含有皂苷类成分，其中皂苷含量经检测约占15% ;王满力等，也采用氧化铝柱来对地榆鞣质和地榆皂苷进行分离，最终将两者分离开(贵州工学院学报，1993年22卷2期)。
[0008]目前尚未见将原花青素B2应用于骨髓保护以及治疗白细胞减少症的相关报道。
【发明内容】
[0009]本发明提供原花青素B2在制备具有保护骨髓细胞作用的药物中的用途。
[0010]在一种具体的实施方式中，所述原花青素B2为原花青素B2含量为100%的化合物。
[0011]在本发明另一种【具体实施方式】中，所述原花青素B2为含原花青素B2为0.05~
1.5wt%的混合物，优选为含原花青素B2为0.05~0.4wt%的混合物。在该发明中，优选所述混合物中还包含儿茶素和地榆素中的至少一种，更优选所述混合物中还包含儿茶素和地榆素。
[0012]在一个具体实施例中，所述混合物中儿茶素的含量为I~5wt%，优选为2~5wt%，所述混合物中地榆素的含量为0.05~3wt%，优选为I~2wt%。
[0013]在上述实施方式中，具体地，所述药物是预防和/或治疗由放疗或化疗引起的抑制正常骨髓细胞的药物。或者是，所述药物是预防和/或治疗由放疗或化疗引起的贫血、白细胞减少症或血小板减少症的药物。
[0014]本发明还提供原花青素B2在制备治疗白细胞减少症的药物中的用途。
[0015]本发明还提供一种预防和/或治疗骨髓细胞抑制或白细胞减少症的药物组合物，它是由有效量的原花青素B2加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂，优选所述制剂为口服制剂。
[0016]本发明的目的在于提供一种地榆鞣质提取物；本发明的另一目的是提供该地榆鞣质提取物，地榆鞣质中含有的化合物的新用途。
[0017]本发明提供了一种地榆鞣质提取物，该提取物中含有鞣质的重量百分含量为35%-98.5%w/w ;提取物中地榆总皂苷含量< 10%w/w和地榆皂苷I的含量< 5%w/w。
[0018]优选地，一种地榆鞣质提取物，该提取物中含有鞣质的重量百分含量为35%-98.5%w/w ;提取物中地榆总皂苷含量< 10%w/w和地榆皂苷I的含量< 5%w/w。
[0019]进一步优选地，该提取物中，鞣质的重量百分含量为50%~98.5%。更进一步地，鞣质的重量百分含量为55%~98.5%。
[0020]进一步优选地，该提取物中，提取物中地榆总皂苷含量< 7.2%w/w、地榆皂苷I的含量< 4.9%w/w。更进一步优选地，提取物中地榆总皂苷含量< 0.001%w/w、地榆皂苷I的含量< 0.0001%w/w。
[0021]进一步地，地榆鞣质中含有地榆素、儿茶素、原花青素B2，其占该提取物中重量百分含量为地榆素0.05%-3.0%w/w,儿茶素1.0%-5.0%w/w,原花青素B20.05%-1.5%w/w。进一步优选地，其占该提取物中重量百分含量为地榆素1.0%-2.0%w/w,儿茶素2.0%-4.0%w/w,原花青素 B20.05%-0.4%w/w。
[0022]更进一步地，该提取物中，鞣质的重量百分含量为62%~98.5%。[0023]其中，该提取物来源于蔷薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.或长叶地榆Sanguisorba officinalis L.var.1ongifolia(Bert.)Yu et Li 的干燥根。
[0024]其中，该提取物是由下述方法制备而成:
[0025](1)提取:取地榆药材粉碎成粗粉，用水、乙醇、含水乙醇、丙酮或含水丙酮提取后，滤过，浓缩，得浓缩液；
[0026](2)纯化:取浓缩液，再经鞣质的常规分离方法处理后，即得地榆鞣质提取物。
[0027]其中，所述鞣质的常规分离方法包括色谱法、蛋白质沉淀法、溶剂法、或上述方法的结合。
[0028]进一步地，所述色谱法为吸附色谱，优选使用凝胶、大孔吸附树脂。
[0029]进一步地，所述蛋白质沉淀法，优选采用明胶进行沉淀。
[0030]进一步地，所述溶剂法，是指将含浓缩液的水溶液脱脂处理后，再用乙酸乙酯提取，即得地榆鞣质提取物；
[0031]或将浓缩液溶于乙醇和乙酸乙酯中，加乙醚或石油醚沉淀析出地榆鞣质提取物。
[0032]更进一步地，该提取物是由下述方法制备而成:
[0033](1)提取:取地榆药材粉碎成粗粉，用水、乙醇、10%_90%的含水乙醇、丙酮或50-90%的含水丙酮提取后，滤过，浓缩，得浓缩液；
[0034](2)纯化:取浓缩液，采用大孔吸附树脂进行吸附除杂，先用水洗脱至无色，再用10%乙醇洗脱，最后用60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，干燥，即得地榆鞣质提取物；或，
[0035]取浓缩液，脱脂后，用乙酸乙酯萃取，即得地榆鞣质提取物。
[0036]优选地，所述的含水乙醇的浓度为70% ;含水丙酮的浓度为70%。
[0037]其中，所述大孔吸附树脂为非极性树脂或低极性树脂，优选DA-20UD-10ULSA-20、HP-10或AB-8型大孔吸附树脂。
[0038]本发明还提供了上述地榆鞣质提取物的制备方法，它包括如下操作步骤:
[0039](I)提取:取地榆药材粉碎成粗粉，用水、乙醇、含水乙醇、丙酮或含水丙酮提取后，滤过，浓缩，得浓缩液；
[0040](2)纯化:取浓缩液，再经鞣质的常规分离方法处理后，即得地榆鞣质提取物。
[0041]其中，所述鞣质的常规分离方法包括色谱法、蛋白质沉淀法、溶剂法、或上述方法的结合。
[0042]进一步地，所述色谱法为吸附色谱，优选使用凝胶、大孔吸附树脂。
[0043]进一步地，所述蛋白质沉淀法，优选采用明胶进行沉淀。
[0044]进一步地，所述溶剂法，是指将含浓缩液的水溶液脱脂处理后，再用乙酸乙酯提取，即得地榆鞣质提取物；
[0045]或将浓缩液溶于乙醇和乙酸乙酯中，加乙醚或石油醚沉淀析出地榆鞣质提取物。
[0046]更进一步地，该提取物是由下述方法制备而成:
[0047](1)提取:取地榆药材粉碎成粗粉，用水、乙醇、10%_90%的含水乙醇、丙酮或50-90%的含水丙酮提取后，滤过，浓缩，得浓缩液；
[0048](2)纯化:取浓缩液，采用大孔吸附树脂进行吸附除杂，先用水洗脱至无色，再用10%乙醇洗脱，最后用60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，干燥，即得地榆鞣质提取物；或，
[0049]取浓缩液，脱脂后，用乙酸乙酯萃取，即得地榆鞣质提取物。[0050]优选地，所述的含水乙醇的浓度为70% ;含水丙酮的浓度为70%。
[0051 ] 其中，所述大孔吸附树脂为非极性树脂或低极性树脂，优选DA-201、D-101、LSA-20、HP-10或AB-8型大孔吸附树脂。
[0052]本发明还提供了上述地榆鞣质提取物在制备具有骨髓保护作用的药物中的用途。
[0053]其中，所述的药物是预防或/和治疗骨髓抑制的药物。
[0054]进一步地，所述的药物是预防或/和治疗由放疗、化疗引起的正常骨髓细胞抑制的药物。
[0055]更进一步地，所述的药物是预防或/和治疗放疗或化疗引起的贫血、白细胞或血小板减少症的药物，优选为预防或/和治疗放疗、化疗引起的白细胞减少症的药物。
[0056]本发明还提供了上述地榆鞣质提取物在制备治疗白细胞减少症的药物中的用途。
[0057]本发明还提供了地榆素、原花青素B2在制备具有骨髓保护作用的药物中的用途。
[0058]其中，所述的药物是预防或/和治疗骨髓抑制的药物。
[0059]进一步地，所述的药物是预防或/和治疗由放疗、化疗引起的正常骨髓细胞抑制的药物。
[0060]更进一步地，所述的药物是预防或/和治疗放疗或化疗引起的贫血、白细胞或血小板减少症的药物，优选为预防或/和治疗放疗、化疗引起的白细胞减少症的药物。
[0061]本发明还提供了地榆素、原花青素B2在制备治疗白细胞减少症的药物中的用途。
[0062]本发明还提供了一种预防或治疗骨髓抑制、白细胞减少症的药物组合物，它是由有效量的地榆素、原花青素B2或上述的地榆鞣质提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。
[0063]其中，所述的制剂为口服制剂。
[0064]本发明还提供了肿瘤化疗药物与上述的地榆鞣质提取物在制备抗肿瘤的联合用药物中的用途。
[0065]其中，所述的肿瘤化疗药物为烷化剂类抗肿瘤药。
[0066]进一步地，所述的肿瘤化疗药物为环磷酰胺。
[0067]本发明还提供了一种抗肿瘤药物组合物，它是由有效量的肿瘤化疗药物和上述的地榆鞣质提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
[0068]其中，所述的肿瘤化疗药物为烷化剂类抗肿瘤药。
[0069]进一步地，所述的肿瘤化疗药物为环磷酰胺。
[0070]本发明地榆鞣质提取物中活性成分为地榆鞣质，具有保护骨髓造血干细胞的作用，其对化学物质和辐射引起的小鼠骨髓DNA抑制有显著保护作用，为临床缓解因放疗、化疗引起的正常骨髓细胞的抑制提供一种新的用药选择。此外，地榆鞣质还能够升高白细胞，具有明显的升白作用。本发明地榆鞣质提取物与化疗药物联合使用时，不但增强了对肿瘤的疗效，还可以保护骨髓细胞和全血细胞，降低或避免化疗药物对骨髓细胞和全血细胞的损伤。因此，在采用放疗、化疗方法治疗癌症前、后，或在治疗过程中，均可以采用放、化疗手段与本发明地榆鞣质提取物联合治疗的方法，以便减轻或避免放、化疗对患者骨髓细胞以及白细胞带来的损害。
【具体实施方式】[0071]1、本发明中地榆鞣质含量测定:
[0072]照《中国药典》2010年版一部附录X B鞣质含量测定项下:
[0073]本实验应避光操作。
[0074]对照品溶液的制备:精密称取没食子酸对照品50mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每Iml中含没食子酸0.05mg)。
[0075]标准曲线的制备:精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加入磷钥钨酸试液1ml，再分别加水11.50ml、11ml、IOml、9ml、8ml、7ml，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟以相应的试剂为空白，照紫外-可见光光度法(附录V A)，在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
[0076]供试品溶液的制备:取提取物粉末约0.lg，精密称定，置250ml棕色量瓶中，加水150ml，放置过夜，超声处理10分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置(使固体物沉淀)，滤过，弃去初滤液50ml，精密量取滤20ml，置100ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，SP得。
[0077]测定法
[0078]总酚:精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钥钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线读出供试品溶液中没食子酸的量(mg)，计算，即得。
[0079]不被吸附的多酚:精密量取供试品溶液25ml，加至已盛有酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中,密塞,置30°C水浴中报温I小时，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钨酸试液Iml ”起，加水IOml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg),计算，即得。
[0080]按下式计算鞣质的含量:鞣质含量=总酚量一不被吸附的多酚量。
[0081]2、地榆素、儿茶素、原花青素B2的含量测定方法见参照文献:地榆多酚的组分分析及功能研究，刘海英，陕西师范大学，2009年。具体测定方法为:
[0082]2.1.仪器与试验材料
[0083]2.1.1 仪器
[0084]Agilentl200高效液相色谱仪(Agilentl200 二极管阵列检测器；四元泵在线脱气系统;Agilentl200色谱工作站)(美国安捷伦科技有限公司)；
[0085]Mettler AE240十万分之一电子分析天平(德国Mettler公司)；
[0086]FAl 104万分之一电子分析天平(上海天平仪器厂)；
[0087]KQ3200型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
[0088]2.1.2 试药
[0089]原花青素B2 (纯度:HPLC ^ 99%)；
[0090]儿茶素(纯度:HPLC≥99%)；
[0091 ] 地榆素(纯度:HPLC≥99%)；
[0092]甲醇为色谱纯,水为重蒸水(自制)，其它试剂均为分析纯。[0093]2.1.3地榆鞣质提取物
[0094]取实施例的方法制备的地榆鞣质提取物。
[0095]2.2.供试品溶液制备
[0096]取地榆鞣质提取物约lg，精密称定置IOOmL容量瓶中，加水90mL，超声处理(功率250W，频率20KHz) 30min，取出，放冷，加水定容至刻度，滤过，即得。
[0097]2.3.色谱条件的研究
[0098]2.3.1检测波长的选择
[0099]为了保证图谱的最大信息量化，尽可能多地反映地榆组分全貌，采用甲醇:磷酸缓冲盐二元梯度洗脱，将成分大致分开，柱温30°C。利用二极管阵列检测器(DAD)采集各色谱成分在195nm~400nm光谱区的所有色谱光谱信息，比较了各考察波长下的色谱图中各峰的吸收情况，在265nm下各峰吸收值较大,且基线表现平稳。所以最终确定265nm作为检测波长。
[0100]2.3.2色谱条件
[0101]试验过程中采用了几种流动相进行试验，以确定最佳流动相，见表1。
[0102]表1流动相和洗脱程序
[0103]
【权利要求】
1.原花青素B2在制备具有保护骨髓细胞作用的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述原花青素B2为原花青素B2含量为100%的化合物。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述原花青素B2为含原花青素B2为0.05~1.5wt%的混合物，优选为含原花青素B2为0.05~0.4wt%的混合物。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述混合物中还包含儿茶素和地榆素中的至少一种，优选所述混合物中还包含儿茶素和地榆素。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述混合物中儿茶素的含量为I~5wt%，优选为2~5wt%，所述混合物中地榆素的含量为0.05~3wt%，优选为I~2wt%。
6.根据权利要求1~5中任意一项所述的用途，其特征在于，所述药物是预防和/或治疗由放疗或化疗引起的抑制正常骨髓细胞的药物。
7.根据权利要求1~5中任意一项所述的用途，其特征在于，所述药物是预防和/或治疗由放疗或化疗引起的贫血、白细胞减少症或血小板减少症的药物。
8.原花青素B2在制备治疗白细胞减少症的药物中的用途。
9.一种预防和/或治疗骨髓细胞抑制或白细胞减少症的药物组合物，它是由有效量的原花青素B2加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。
10.根据权利要9所述的药物组合物，其特征在于，所述制剂为口服制剂。
【文档编号】A61P7/00GK103784434SQ201410032553
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2011年9月14日 优先权日:2010年9月14日
【发明者】王达宾, 苏柘僮, 杨明, 杨胜, 邹文铨 申请人:成都科尔医药技术有限公司