一种含阿霉素的氧化石墨烯载药复合材料的制备方法

一种含阿霉素的氧化石墨烯载药复合材料的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种含阿霉素的氧化石墨烯载药复合材料的制备方法，包括：(1)氧化石墨烯复合材料GOX-PEI-HA的合成；(2)将氧化石墨烯复合材料溶解于水中，加入盐酸阿霉素水溶液，并调pH值为中碱性。避光震荡反应后，离心除去未连接上的DOX，冷冻干燥合成GOX/DOX载药复合物。本发明的载药材料具有pH敏感型释放的特点，可以用于抗肿瘤研究，有着很好的实用价值。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明属于纳米材料的制备领域，特别涉及一种含阿霉素的氧化石墨烯载药复合 材料的制备方法。 一种含阿霉素的氧化石墨烯载药复合材料的制备方法

【背景技术】
[0002] 氧化石墨烯是石墨烯的氧化物，氧化石墨烯薄片是石墨粉末经化学氧化及剥离后 的产物，它一方面保持了石墨烯单一原子层的层状结构，可以随时在横向尺寸上扩展到数 十微米，这种结构跨越了一般化学和材料科学的典型尺度，成为人们研究的热点。而其在生 物医学领域的研究也在这几年兴起。另一方面，经过氧化处理后，在每一层的石墨烯单片上 引入了许多氧基功能团，如羟基、羧基、羰基、环氧基等亲水性基团，因而具有良好的水溶液 稳定性和生物相容性。同时，由于氧化石墨烯具有单原子层结构，其比表面积很大，且两个 基面都可以吸附药物，因此非常适合用作药物载体。
[0003] 然而尽管氧化石墨烯易溶于水，但是它在生理盐水中由于电荷屏蔽效应的存在易 团聚，使其在生物医学领域的潜在应用价值的发挥受到阻碍。纳米材料的表面化学是改善 纳米材料的生物相容性以及控制其在生物系统中行为的关键因素，因此不同的应用目的， 就产生了不同的表面修饰方法，其中包括共价和非共价键修饰，最终官能化的石墨烯基材 料有望用于可控释放及靶向控制的药物载体，在生物医药和诊断等领域有着很好的应用前 景。
[0004] 盐酸阿霉素（Doxorubicin，D0X)属蒽环类抗肿瘤抗生素，是一种抑制DNA和RNA 合成的抗肿瘤药物。其作用机制主要是嵌入DNA的相邻碱基对使DNA发生错配，从而使DNA 链裂解，阻碍DNA和RNA合成。阿霉素对实体瘤的有效率约达70%，主要用于治疗恶性淋巴 瘤、急性白血病、肺癌、乳腺癌、骨及软组织肉瘤、头颈部肿瘤、肝癌、食道癌、胃癌等。抗瘤谱 广，应用广泛，盐酸阿霉素也有着传统抗癌药物的不良反应，主要是消化道毒性、骨髓抑制、 心脏毒性、脱发等问题，少数患者有发热、肝功能损伤与肌红蛋白尿、红斑以及色素沉着。 [000 5]最近的研究表明，氧化石墨稀与阿霉素之间的结合是属于JI-II堆积的作用力的 非共价键结合。这种结合是pH依赖性的，在酸性环境下，由于去质子作用药物从氧化石墨 烯表面离去，达到pH敏感释放。


【发明内容】

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种含阿霉素的氧化石墨烯载药复合材料的 制备方法，该载药方法操作简单、反应条件温和。氧化石墨烯复合载药材料药物装载率高， 且具有pH敏感型释放特性。
[0007] 本发明的一种含阿霉素的氧化石墨烯载药复合材料的制备方法，包括：
[0008] 将氧化石墨烯-聚乙烯亚胺-透明质酸G0X-PEI-HA溶解在水中，加入阿霉素 D〇x 的水溶液，混合均匀，用氢氧化钠调pH值至中碱性，避光摇床反应1〇小时，离心除去未连接 上的D0X，冷冻干燥合成G0X/D0X载药复合物。
[0009] 所述的GOX-PEI-HA与D0X的质量比为1 : 0.5?1 : 1。
[0010] 采用〇· 1M的氢氧化钠溶液调pH值为8-10。
[0011] 所述反应条件为避光，摇床37°C，时间4?10小时。
[0012] 所述的离心转速为13000rpm，离心时间为8?12分钟。
[0013] 本发明配制不同浓度的D0X磷酸缓冲溶液液及醋酸缓冲溶液，于紫外分光光度计 中检测最大吸收值，并绘制两种pH环境下的D0X标准曲线。
[0014] 所述的不同pH值环境分别为5?6及7?7. 5。
[0015] 所述的标准曲线D0X浓度为0. 001?0. 08mg/ml。
[0016] 本发明将G0X/D0X载药复合物溶于PBS缓冲液中，置于透析袋。再将透析袋放入 两种pH值环境中的溶出仪。于不同时间点取样，并补充缓冲液，得出药物释放曲线。
[0017] 所述透析工艺为采用透析袋，内液为pH二7.5的PBS缓冲液，外液为步骤（2)中 的缓冲液。
[0018] 所述药物释放所需的G0X/D0X为0. 5?2mg,缓冲液体积为5?20ml。
[0019] 所述透析袋MW为8, 000?14, 000。
[0020] 有益效里
[0021] (1)本发明利用氧化石墨烯与阿霉素之间的π-ατ堆积作用，合成含阿霉素的氧 化石墨烯载药复合材料，制备方法操作简单、实验条件温和；
[0022] (2)本发明的含阿霉素的氧化石墨烯载药复合材料药物装载量高，能够长效缓释。 且具有pH敏感型输送，在较低pH值环境下释放率高，适合肿瘤组织的微环境，具有应用其 做后续相关实验分析的潜力；
[0023] (3)含阿霉素的氧化石墨烯载药复合材料可以研究其体内循行及特定组织的定向 输送。

【专利附图】

【附图说明】
[0024]图1为实施例1所得的含阿霉素的氧化石墨烯载药复合材料在不同pH环境下的 释放曲线。
[0025] 图2为实施例2所得的阿霉素在不同pH环境下的标准曲线。其中2a为pH = 7. 5 的PBS缓冲溶液、此为pH二5. 8的醋酸缓冲液。
[0026] 图3为实施例3所得的不同pH条件下的D0X的上样率和包封率。

【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0028] 实施例1
[0029] (1)称取5mg氧化石墨烯复合材料，溶解在5ml水中，在搅拌的情况下，逐滴加入 5mL含D0X (4. 5mg)的水溶液，用〇· 1M的氢氧化钠溶液调pH = 9. 03,铝箔纸避光，在37-C摇 床条件下反应5h。最后将含阿霉素的氧化石墨烯溶液离心，i3〇〇〇rpm离心8min，用以将未 连接上的阿霉素除去。最后将沉淀冷冻干燥后获得GOX/DOX。
[0030]⑵称取 2mg 阿霉素，分别配制 〇· 〇〇2Μ、0· 004Μ、0· 008Μ、0· 01碰、0· 032M 的 PBS 溶 液（pH = 7. 5)及醋酸溶液（pH = 5· 8)，对阿霉素溶液进行紫外检测，吸收波长设为481nm， 收集数据并拟合阿霉素在两种pH条件下的标准曲线。
[0031] (3)称取2. 4mg载药复合物于2. 4ml磷酸缓冲液（pH = 7. 5)中，充分溶解，各取 1ml分别放入两个透析袋（MW = 8, 000?14, 000)中，并放置在溶出仪，分别补加15ml的 PBS溶液（pH = 7. 5)及醋酸溶液（pH = 5. 8)。溶出仪温度设为37度，转速90转/分，分 别于 2h、4h、6h、8h、1 Oh、24h、48h、72h、96h、120h 取出 lml 透析液，并回补 lml 相应的 PBS 缓 冲溶液和醋酸缓冲溶液。对收集的透析液进行紫外检测，吸收波长设为481nm，收集数据并 并计算药物释放情况。
[0032] (4)D0X在两种pH环境下的释放曲线如图1所示。在120h后，D0X在pH = 5. 8的 缓释液中约释放25%。而在PBS环境中释放不足5%，两者释放存在显著差异，肿瘤组织较 正常组织细胞相比其pH要低，该载药符合材料的释放正好符合这一特性。表明该载药复合 材料是一种可以用于肿瘤治疗的pH敏感型材料。
[0033] 实施例2
[0034] (1)称取7. 8mg氧化石墨烯复合材料，溶解在8ml水中，在搅拌的情况下，逐滴加入 8mL含D0X (6. 2mg)的水溶液，用0. 1M的氢氧化钠溶液调pH = 8. 86,铝箔纸避光，在37°C摇 床条件下反应4h。最后将含阿霉素的氧化石墨烯溶液离心，13000rpm离心8min，用以将未 连接上的阿霉素除去。最后将沉淀冷冻干燥后获得G0X/D0X。
[0035] (2)称取 2mg 阿霉素，分别配制 0· 0025Μ、0· 005Μ、0· 01Μ、0· 02Μ、0· 04M 的 PBS 溶液 (pH = 7· 5)及醋酸溶液（pH = 5. 8)，对阿霉素溶液进行紫外检测，吸收波长设为481nm，收 集数据并拟合阿霉素在两种pH条件下的标准曲线。
[0036] (3)称取4. 5mg载药复合物于4. 5ml磷酸缓冲液（pH = 7. 5)中，充分溶解，各取 2ml分别放入两个透析袋（MW = 8, 000?14, 000)中，并放置在溶出仪，分别补加20ml的 PBS溶液（pH = 7. 5)及醋酸溶液（pH = 5. 8)。溶出仪温度设为37度，转速100转/分，分 别于 2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h、96h、120h 取出 1. 5ml 透析液，并回补 1. 5ml 相应的 PBS溶液和醋酸溶液。对收集的透析液进行紫外检测，吸收波长设为481mn，收集数据并并 计算药物释放情况。
[0037] (4)D0X在两种pH值环境下的标准曲线如图2所示，选择481nm处的吸光度为纵坐 标与横坐标（D0X浓度）制做标准曲线。当D0X在PBS(pH = 7. 5)(图2-a)中的浓度范围在 0· 0025-0. 04mg/mL时，D0X的浓度-吸光度线性相关系数为R2 = 0. 99937说明其有着很好 的线性关系。当D0X在醋酸盐缓冲液（pH = 5. 8)(图2-b)中的浓度范围在0. 0025-0. 04mg/ mL时，线性相关系数为R2 = 0. 99993,说明该pH值下D0X的浓度-吸光度依然有着很好的 线性关系。
[0038] 实施例3
[0039] (1)称取10. 3mg氧化石墨烯复合材料，溶解在12ml水中，在搅拌的情况下，逐滴加 入10mL含D0X(9. 8mg)的水溶液，用〇· 1M的氢氧化钠溶液分别调pH = 5. 5、6· 5、7· 5、8. 5 和9. 5,铝箔纸避光，在37°C摇床条件下反应5h。最后将含阿霉素的氧化石墨烯溶液离心， 13000rpm离心8min，用以将未连接上的阿霉素除去。最后将沉淀冷冻千燥后获得G0X/D0X。
[0040]⑵称取 2mg 阿霉素，分别配制 〇· 001Μ、0· 002Μ、0· 004Μ、0· 012M、0. 036M 的 PBS 溶 液（pH = 7. 5)及醋酸溶液（pH = δ. 8)，对阿霉素溶液进行紫外检测，吸收波长设为48inm， 收集数据并拟合阿霉素在两种pH条件下的标准曲线。
[0041] ⑶各称取〇· 5mg载药复合物于1ml磷酸缓冲液（PH = 7. 5)中，充分溶解，放入两 个透析袋（MW = 8, 000?14, 000)中，并放置在溶出仪，分别补加 KM的PBS溶液（pH = 7.5)及醋酸溶液（PH = 5. S)。溶出仪温度设为37度，转速90转/分，分别于2h、4h、6h、 8h、10h、24h、48h、72h、96h、120h取出lml透析液，并回补lml相应的PBS溶液和醋酸溶液。 对收集的透析液进行紫外检测，吸收波长设为481nm，收集数据并计算药物释放情况。
[0042] ⑷不同pH条件下，DOX的上样率和包封率如图3所示。上样率与包封率之比为 5 : 3。pH值环境越高越有利与药物的上载，这是由于，碱性环境中，由于去质子作用，阿霉 素更容易和碳纳米管产生ji-ji堆积效应。
[0043] 实施例4
[0044] (1)将6. lmg氧化石墨烯复合材料，溶解在8ml水中，在搅拌的情况下，逐滴加入 5mL含DOX (4. 5mg)的水溶液，用0. 1M的氢氧化钠溶液调pH = 9· 52,铝箔纸避光，在37?摇 床条件下反应5h。最后将含阿霉素的氧化石墨烯溶液离心，13000rpm离心8min，用以将未 连接上的阿霉素除去。最后将沉淀冷冻干燥后获得GOX/DOX。
[0045]⑵称取 2mg 阿霉素，分别配制 0· 〇〇3Μ、0· 〇〇6Μ、0· 012Μ、0· 24Μ、0· 48M 的 PBS 溶液 (pH = 7· 5)及醋酸溶液（ΡΗ = 5· S)，对阿霉素溶液进行紫外检测，吸收波长设为481nm，收 集数据并拟合阿霉素在两种pH条件下的标准曲线。
[0046] ⑶称取lmg载药复合物于2ml磷酸缓冲液（ΡΗ = 7· 5)中，充分溶解，放入两个透 析袋（MW = 8, 000?14, 000)中，并放置在溶出仪，分别补加5ml的PBS溶液（pH = 7. 5)及 醋酸溶液（ρΗ= 5·8)。溶出仪温度设为37度，转速90转/分，分别于2h、4h、6h、8h、10h、 24h、48h、96h、120h取出0. 8ml透析液,并回补0. 8ml相应的PBS溶液和醋酸溶液。对收集 的透析液进行紫外检测，吸收波长设为481mn，收集数据并并计算药物释放情况。
【权利要求】
1. 一种含阿霉素的氧化石墨烯载药复合材料的制备方法，包括： 将氧化石墨烯-聚乙烯亚胺-透明质酸GOX-ΡΕΙ-ΗΑ溶解在水中，加入阿霉素D0X的水 溶液，混合均勻，用氢氧化钠调PH值至中碱性，摇床反应,离心除去未连接上的D〇x，所得沉 淀冷冻千燥得GOX/DOX载药复合物。 ^
2. 根据权利要求1所述的一种含阿霉素的氧化石墨烯载药复合材料的制备方法，其 特征在于：所述的GOX-PEI-HA溶液浓度为3mg/ml-5mg/ml，GOX-PEI-HA与d〇X的质量比为 1 : 0_ 5 ?1 : 1。
3·根据权利要求1所述的一种含阿霉素的氧化石墨烯载药复合材料的制备方法，其特 征在于：采用〇· 1M的氢氧化钠溶液调pH值为7?10。
4. 根据权利要求1所述的一种含阿霉素的氧化石墨烯载药复合材料的制备方法，其特 征在于：所述反应条件为避光，摇床37°C，时间4?10小时。
5. 根据权利要求1所述的一种含阿霉素的氧化石墨烯载药复合材料的制备方法，其特 征在于：所述离心转速为l3〇〇〇rpm,离心时间为8?12分钟。
【文档编号】A61K31/704GK104189917SQ201410395971
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月13日 优先权日:2014年8月13日
【发明者】朱利民, 杨卉卉, 陶磊, 公晓, 李赫宇, 胡娟 申请人:东华大学