用于肺癌诊断的靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法

用于肺癌诊断的靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法
【专利摘要】本发明的用于肺癌诊断的靶向生长抑素类似物奥曲肽(OCT)修饰的壳聚糖(CS)分子信标(MB)纳米复合物，通过用自组装法合成壳聚糖分子信标纳米复合物，然后通过化学反应以戊二醛为交联剂合成靶向奥曲肽修饰的壳聚糖miR-155(microRNA-155)分子信标纳米复合物，该靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物能够根据荧光强度动态监测肺癌的发生、发展过程，可应用于肺癌细胞及肺癌荷瘤鼠活体动物成像，具有靶向性强、转染效率高、特异性高、稳定性好、背景低等特点，将为肺癌的早期诊断提供新思路、新方法和新技术。
【专利说明】用于肺癌诊断的靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法

【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药【技术领域】，尤其是涉及一种用于肺癌诊断的靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法。

【背景技术】
[0002]肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其发病率和死亡率逐年攀升，早期诊断及早治疗是改善患者预后的关键，但是肺癌患者在病变早期往往无明显症状，就诊时大多为中晚期，丧失了治疗的最佳时机。因此从肺癌发生的“起源”着手，探寻高效、特异的早期诊断的新方法，将会对肺癌的预防、诊断及治疗产生深远的影响。
[0003]肿瘤干细胞理论认为在肿瘤组织细胞中存在一群数量极少的肿瘤细胞，称为肿瘤干细胞，所有的肿瘤细胞都是由肿瘤干细胞分化来的。微小RNA(miRNA，microRNA)在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，检测NSCLC干细胞相关的miRNAs是肺癌早期诊断的一个重要策略。研究表明常见的不同肿瘤类型呈现特征性的miRNAs表达谱，这将为肿瘤的组织来源和诊断提供依据，特征性的miRNA表达谱可以作为肿瘤早期诊断分子标志物，也可判断不同肿瘤的预后、预测治疗效果。多项研究显示miR-155在NSCLC中高表达，检测肺组织内的miR-155表达水平能区分肺癌患者与非肺癌患者，而且检测肿瘤组织内的miR-155表达水平能预测患者的肿瘤复发和不良预后风险，肺癌干细胞中miR-155表达高于普通肺癌细胞。如果能够直接携带荧光物质或化疗药物靶定肺癌细胞甚至肺癌干细胞，将有望最终达到早期诊断和根治肺癌的目的。分子信标(molecular beacon, MB)是基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理设计的一种高灵敏性和高特异性检测工具，实际上是一种呈茎环结构的双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对。未结合目标链时，位于其末端的荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，荧光被淬灭；当分子信标与目标链结合时，分子信标的空间构象发生改变，荧光基团远离猝灭基团，荧光信号恢复，因此分子信标是一种特异性检测DNA和RNA靶向序列的发夹型核酸探针，可被用来进行核酸-核酸和活细胞内可视化研究。
[0004]常规分子信标本身易被核酸酶或核结合蛋白降解，存在稳定性差、细胞摄取困难等缺点。而用锁核酸(locked nucleic acid, LNA)修饰碱基，由于几何和立体性质改变，其在较高温度的环境中能稳定存在，抗核酸酶降解的能力显著增强，具有与DNA/RNA强大的杂交亲和力。利用分子信标的关键是如何获得理想的转运载体，既可有效地保护免于被降解，又可高效地将分子信标递送入宿主细胞发挥靶向识别核酸序列的功能。壳聚糖(chitosan, CS)纳米为天然阳离子多糖，体外及体内实验均证实了壳聚糖作为转移载体的安全性及有效性，其主要特点有:①组织相容性好、免疫原性低，毒性小荷正电，易与DNA分子自组装结合成纳米复合物，形成稳定的核壳结构，且对DNA有保护作用制作过程简单、温和，对DNA、抗体等生物大分子理化性质影响小壳聚糖纳米表面密集的活性氨基基团便于大分子修饰和耦联。
[0005]目前，多肽类受体作为恶性肿瘤诊断和治疗的分子靶点已成为研究的热点，其中生长抑素受体(SSTR)就是其中的典型代表，许多肿瘤及其转移灶组织都有SSTR的表达，较正常组织明显增高，大多以表达SSTR2为主，如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、内分泌胰腺癌、垂体瘤、淋巴瘤、脑膜瘤以及结肠、直肠、乳腺和前列腺肿瘤等。目前人工合成的SSTR类似物(SSA)经过修饰后可选择性增强和延长其生物学活性，半衰期长，作用强大，如奥曲肽(octreotide, 0CT)、兰瑞肽(Ianreotide)、伐普肽(vapreotide)等。SSA 在体内不仅可以与肿瘤组织表达的SSTR特异性结合，而且也可以与肿瘤血管内皮细胞上的SSTR结合，进而达到双重靶向肿瘤组织的目的。
[0006]在现有技术中，已有研究表示奥曲肽(OCT)作为药物递送系统的主动靶向基团，可以将抗肿瘤药物递送到肿瘤部位；也有报道奥曲肽放射性核素标记物被FDA批准作为肿瘤的诊断试剂。但现有技术中的分子信标或者奥曲肽等复合物制备方法复杂，工艺条件苛亥IJ，且这些复合物只能用于诊断肺癌的中、晚期，这会使肺癌患者错过最佳治疗时间，影响肺癌患者的治疗，同时这些复合物在用于诊断肺癌的靶向性、特异性或稳定性等方面中至少有一方面效果不佳，因此急需一种制备方法简便且可获得靶向性强、特异性高、稳定性好的新思路、新方法的诊断肺癌的试剂，尤其是早期可以诊断肺癌优良试剂。


【发明内容】

[0007]本发明的目的是提供一种用于肺癌诊断的靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法，解决现有技术中用于肺癌诊断的药物或试剂的制备方法复杂、工艺条件苛刻且其靶向性、特异性或稳定性不佳以及只能诊断中、晚期肺癌的问题。
[0008]本发明解决技术问题所采用的技术方案是:提供一种用于肺癌诊断的靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法，包括下述步骤:
[0009]A、将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比7:1?10:1的比例在pH6.0-7.0的PBS缓冲液中混合，并漩涡震荡40s?120s，在室温下静置40min?120min，得到壳聚糖分子信标纳米复合物；
[0010]B、在壳聚糖分子信标纳米复合物中滴加0.5%?2.0%的戊二醛溶液，所述戊二醛溶液与所述壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为900:1?1300:1，通过第一次搅拌混合进行反应Ih?2h,第一次搅拌速度为10rpm?300rpm,反应后通过微量透析柱第一次透析0.5h?2h去除未结合的戊二醛；然后按照奥曲肽与所述壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为120:1?80:1的比例加入奥曲肽，进行第二次搅拌混合反应3h?6h，第二次搅拌速度为10rpm?300rpm,反应后通过微量透析柱第二次透析Ilh?15h去除未结合的奥曲肽，得到用于肺癌诊断的靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物。
[0011]在本发明的制备方法中，在步骤A中，所述壳聚糖纳米的粒径< 300nm。
[0012]在本发明的制备方法中，在步骤A中，所述纳米壳聚糖与所述分子信标的质量比为 7:1。
[0013]在本发明的制备方法中，在步骤A中，所述PBS缓冲液的pH为6.0。
[0014]在本发明的制备方法中，在步骤A中，漩涡震荡时间为60s。
[0015]在本发明的制备方法中，在步骤B中，所述戊二醛溶液的浓度为1.0%，所述戊二醛溶液与所述壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为1000:1。
[0016]在本发明的制备方法中，在步骤B中，所述奥曲肽与所述壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为100:1。
[0017]在本发明的制备方法中，在步骤B中，第一次搅拌混合反应时间为1.5h，第一次搅拌速度为150rpm。
[0018]在本发明的制备方法中，在步骤B中，第二次搅拌混合反应时间为4h，第一次搅拌速度为150rpm。
[0019]在本发明的制备方法中，在步骤B中，第一次透析时间为Ih ;第二次透析时间为12h。
[0020]实施本发明的用于肺癌诊断的靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法，具有以下有益效果:本发明的用于肺癌诊断的靶向多肽奥曲肽(OCT)修饰的壳聚糖(CS)分子信标(MB)纳米复合物，通过用自组装法合成壳聚糖分子信标纳米复合物，然后通过化学反应以戍二醒为交联剂合成祀向奥曲肽修饰的壳聚糖miR-155 (microRNA-155)分子信标纳米复合物，该制备方法简便易行且方便工业化生产，所制得的靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物能够根据荧光强度动态监测肺癌的发生、发展过程，可应用于肺癌细胞及肺癌荷瘤鼠活体动物成像，具有靶向性强、转染效率高、特异性高、稳定性好、背景低等特点，将为肺癌的诊断提供新思路、新方法和新技术，尤其是针对肺癌的早期诊断；另外目前研究关于细胞和动物活体成像方面，主要是在蛋白方面研究，而本研究是利用高表达的基因进行成像，国内外报道几乎没有，属于首创。

【专利附图】

【附图说明】
[0021]图1为实施例8中液相分子杂交实验验证设计分子信标的灵敏性、特异性实验结果图；
[0022]图2为实施例9中不同质量比合成的壳聚糖分子信标纳米复合物的凝胶阻滞分析图；
[0023]图3为实施例10中不同质量比合成的壳聚糖分子信标纳米复合物的包封率实验结果图；
[0024]图4为实施例11中不同质量比合成的壳聚糖分子信标纳米复合物的荧光屏蔽实验结果图；
[0025]图5为实施例12中CS及CS-MB的zeta电位分析图；
[0026]图6为实施例12中CS及CS-MB的DNase I实验分析图；
[0027]图7为实施例13采用激光共聚焦商品化SiPORT脂质体转染试剂检测肺癌细胞、肺癌干细胞(LCSL)及阴性对照vero、CT-26细胞中miR-155的表达实验结果图，CS-RSMB组为阴性对照组；
[0028]图8为实施例14采用激光共聚焦壳聚糖分子信标纳米复合物(CS-MB)检测肺癌细胞及肺癌干细胞LCSL中miR-155的表达实验结果图，CS-RSMB组为阴性对照组；
[0029]图9为实施例15采用激光共聚焦免疫荧光技术检测肺癌细胞及移植瘤肺癌组织中SSTR2的表达实验结果图；
[0030]图10为实施例16采用激光共聚焦奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物(CS-MB-0CT-FITC)检测肺癌细胞中miR-155的表达实验结果图，CS-RSMB-OCT-FITC组为阴性对照组；
[0031]图11为实施例17动物水平上，活体成像技术检测皮下移植瘤组织内miR-155的表达的实验结果图，CS-RSMB为阴性对照组；
[0032]图12为实施例17中冰冻切片激光共聚焦观察的实验结果图，CS-RSMB为阴性对昭相.>、\、>-~1 1.?
[0033]图13为实施例18动物水平上尾静脉注射CS-MB及CS_MB_0CT纳米复合物进而检测分子信标纳米复合物对肺组织中肺癌细胞的识别、诊断作用的实验结果图，CS-RSMB为阴性对照组；
[0034]图14为实施例18中用冰冻切片激光共聚焦观察进行验证的实验结果图，CS-RSMB为阴性对照组。

【具体实施方式】
[0035]下面结合附图和实施例，对本发明用于肺癌诊断的靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法的具体实现作进一步说明:
[0036]本发明涉及一种将壳聚糖纳米与分子信标结合，靶向奥曲肽修饰，通过识别肺癌细胞或肺癌干细胞内micro-RNA的表达来识别癌细胞，通过荧光成像实现对肿瘤细胞甚至肿瘤干细胞的识别功能，达到肺癌诊断的目的。为此本发明提供的一种用于肺癌诊断的靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法，其具体实施例如下，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
[0037]实施例1-7为用于肺癌诊断的靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物的制备。其中壳聚糖纳米只要为纳米级别均在本发明的保护范围之内，优选为< 300nm，更优选为< 200nm,这样的壳聚糖纳米制备的壳聚糖分子信标纳米复合物更有利于进一步制备稳定性高、靶向性强的靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物。
[0038]实施例1:
[0039]将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比7:1的比例在pH6.0的PBS缓冲液中混合，并漩涡震荡60s，在室温下静置60min，得到壳聚糖分子信标纳米复合物；在壳聚糖分子信标纳米复合物中滴加1.0%的戊二醛溶液，戊二醛溶液与壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为1000:1,通过第一次搅拌混合进行反应1.5h,第一次搅拌速度为150rpm,反应后通过微量透析柱第一次透析Ih去除未结合的戊二醛；然后按照奥曲肽与壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为100:1的比例加入奥曲肽，进行第二次搅拌混合反应4h，第二次搅拌速度为150rpm，反应后通过微量透析柱第二次透析12h去除未结合的奥曲肽，得到粒径45nm?55nm的祀向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物。
[0040]实施例2:与实施例1不同之处在于，壳聚糖纳米与分子信标按照质量比为10:1，最终得到粒径40nm?55nm的祀向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物。
[0041]实施例3:与实施例1不同之处在于，壳聚糖纳米与分子信标按照质量比为8:1，最终得到粒径45nm?60nm的祀向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物。
[0042]实施例4:与实施例1不同之处在于，壳聚糖纳米与分子信标按照质量比为9:1，最终得到粒径40nm?60nm的祀向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物。
[0043]实施例5:
[0044]将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比9:1的比例在pH6.5的PBS缓冲液中混合，并漩涡震荡40s，在室温下静置lOOmin，得到壳聚糖分子信标纳米复合物；在壳聚糖分子信标纳米复合物中滴加0.5%的戊二醛溶液，戊二醛溶液与壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为1300:1，通过第一次搅拌混合进行反应2h，第一次搅拌速度为lOOrpm，反应后通过微量透析柱第一次透析1.5h去除未结合的戊二醛；然后按照奥曲肽与所述壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为80:1的比例加入奥曲肽，进行第二次搅拌混合反应3h，第二次搅拌速度为10rpm，反应后通过微量透析柱第二次透析Ilh去除未结合的奥曲肽，得到粒径30nm?50nm的祀向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物。
[0045]实施例6:
[0046]将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比8:1的比例在pH7.0的PBS缓冲液中混合，并漩涡震荡120s，在室温下静置120min，得到壳聚糖分子信标纳米复合物；在壳聚糖分子信标纳米复合物中滴加2.0%的戊二醛溶液，戊二醛溶液与壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为900:1，通过第一次搅拌混合进行反应lh，第一次搅拌速度为300rpm，反应后通过微量透析柱第一次透析2h去除未结合的戊二醛；然后按照奥曲肽与所述壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为120:1的比例加入奥曲肽，进行第二次搅拌混合反应5h，第二次搅拌速度为250rpm，反应后通过微量透析柱第二次透析15h去除未结合的奥曲肽，得到粒径45nm?65nm的祀向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物。
[0047]实施例7:
[0048]将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比10:1的比例在pH6.0的PBS缓冲液中混合，并漩涡震荡120s，在室温下静置40min，得到壳聚糖分子信标纳米复合物；在壳聚糖分子信标纳米复合物中滴加1.5%的戊二醛溶液，戊二醛溶液与壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为1200:1，通过第一次搅拌混合进行反应1.8h，第一次搅拌速度为200rpm，反应后通过微量透析柱第一次透析0.5h去除未结合的戊二醛；然后按照奥曲肽与所述壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为HO:1的比例加入奥曲肽，进行第二次搅拌混合反应6h，第二次搅拌速度为200rpm，反应后通过微量透析柱第二次透析14h去除未结合的奥曲肽，得到粒径50nm?70nm的祀向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物。
[0049]实施例8-18为靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物用于诊断肺癌的相关实验。
[0050]实施例8:液相分子杂交实验
[0051]液相分子杂交实验验证设计分子信标序列的正确性和特异性。
[0052]根据人的miR-155序列设计并合成锁核酸修饰的miR-155分子信标，同时设计不与任何祀基因结合的随机分子信标序列(random sequence, RS-MB)作为阴性对照。
[0053]其中miR_155MB:
[0054]5’ -05-CCAGCG-ACC+CCT+ATCA+CGAT+TAGCATTAA-CGCTGG-BHQ3-3’ ；
[0055]RS MB:
[0056]5’ -Cv5-CCAGCG-AC+GCCA+ATG+ACC+TTA+AGCATTAA-CGCTGG-BHQ2~3，。
[0057]+N表示碱基由锁核酸结构修饰，Cy5代表荧光基团，BHQ2代表淬灭基团，划线部分表示分子信标的茎干机构；由上海生物工程公司合成。
[0058]配制杂交缓冲液，其中含1mM KCl、5mM MgCljP 1mM Tris-HCl。将同浓度的分子信标与靶向序列在杂交缓冲液中充分混合，加入到96孔黑板中，每孔体积250μ 1，分子信标终浓度为lOOnmol/L，以杂交缓冲液调零，Var1skan Flash多功能酶标仪检测每孔的荧光强度，设置激发波长649nm，发射波长670nm，狭缝5nm，检测每组荧光强度。从图1中可以看出，当只有分子信标存在的时候，荧光信号非常低；当靶向序列存在的时候，分子信标茎环结构打开，产生强烈的荧光信号，约为单独分子信标组的50倍，差异具有统计学意义；当有不互补序列基因存在的情况下，分子信标仍保持茎环结构，表明分子信标合成的特异性、灵敏性。
[0059]实施例9:凝胶阻滞分析
[0060]将壳聚糖纳米和miR-155MB于PBS缓冲溶液(pH6.0)中，按不同的质量比(Wcs:WmiE_155MB)进行混合，WmiK_155MB固定质量为2μ g并迅速漩涡振荡60s，室温放置60min，利用凝胶电泳分析。从图2中可以看出，随着壳聚糖纳米质量的增加，miR-155MB的量逐渐减少，当质量比为7:1和10:1时，壳聚糖与miR-155MB基本上完全结合。
[0061]实施例10:包封率测定
[0062]将壳聚糖纳米和miR-155分子信标于PBS缓冲溶液中，按不同的质量比(Wcs:WmiE_155MB)进行混合，总体积为300 μ 1，miR-155MB终浓度为200nM，并迅速漩涡振荡60s，室温放置60min，于高速离心机上20000rpm离心60分钟，取上清在紫外分光光度计上检测miR-155MB的浓度，并计算包封率。计算公式为:包封率EE%= (W总-?)/W总X 100%。从图3可以看出，随着壳聚糖质量的增加，包封率逐渐增强，在质量比为7:1和10:1时达到最大，约为95%左右，这与凝胶阻滞分析结果较一致。
[0063]实施例11:荧光屏蔽实验
[0064]由上海生工公司合成 miR-155Cy5probes:5，-Cy5-TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT-3’，用同样的方法将不同质量比的壳聚糖纳米和miR-155-Cy5(2yg)荧光探针进行自组装，酶标仪检测荧光强度。从图4也可以看出，随着壳聚糖纳米质量的增加，荧光强度逐渐减弱，在质量比为7:1和10:1时荧光强度最低，表明壳聚糖可以包裹miR-155-Cy5探针，与DNA结合形成核壳结构，可以有效的保护DNA免受外界的干扰，并与凝胶阻滞分析、包封率测定结果较一致。
[0065]实施例12:壳聚糖分子信标纳米复合物理化性质分析
[0066]用同样的方法按照质量比为7:1的比例制备壳聚糖分子信标纳米复合物，将壳聚糖纳米和壳聚糖分子信标纳米复合物分别滴在铜片上，室温静止10分钟，2%磷钨酸染色I分钟，通过透射电镜检测壳聚糖及壳聚糖分子信标纳米复合物，用纳米粒度分析仪检测壳聚糖纳米及壳聚糖分子信标纳米粒径及zeta电位(Malvern3000HS, UK) (TEM, PhilipsTECNAI10)，并通过DNase I实验验证合成壳聚糖分子信标纳米复合物的稳定性，按照DNaseI试剂盒(碧云天)操作，分子信标的终浓度为ΙΟΟηΜ。在反应液中，37°C 10分钟后，加入EDTA，650C，10分钟终止反应，酶标仪测定各孔荧光强度。
[0067]透射电镜表明壳聚糖以及壳聚糖分子信标纳米复合物粒径较小，分布均匀，大小分别约为20nm、30nm,与纳米粒度分析仪结果较一致。如图5所示,Zeta电位表明壳聚糖纳米及复合物为正电荷，因为细胞膜带负电，利于细胞的结合和吞噬；CS-MB纳米复合物电荷有所降低可能与DNA结合后抵消了部分壳聚糖纳米的正电荷有关。如图6所示，DNase I实验表明壳聚糖分子信标纳米复合物在酶的作用下呈现非常低的荧光信号，表明CS-MB纳米复合物稳定性极佳，能够抵抗核酸酶的降解。
[0068]实施例13:商品化的SiPORT脂质体转染试剂(Amb1n，USA)转染分子信标检测非小细胞肺癌(NSCLC)细胞(A549、SPC-A1)及肺癌干细胞(LCSC)miR_155的表达
[0069]将细胞接种至细胞培养皿(激光共聚焦显微镜专用)中，细胞贴壁后用PBS充分漂洗，3minX 3次，充分去除碎片和死亡细胞；siP0RT转染试剂按照说明书操作，用OPTIMEM I培养基稀释(1:20稀释)，每个培养皿取5μ I的siPORT转染试剂稀释，室温孵育1min ^OPTI MEM I培养基配制400ηΜ的miR-155分子信标和随机序列分子信标；取等体积稀释后的siPORT转染试剂和稀释后的miR-155分子信标和随机序列分子信标(阴性对照)，miR-155分子信标和随机序列分子信标的终浓度为200nM，各培养皿中均加200 μ I上述稀释后的miR-155分子信标和随机序列分子信标；细胞培养箱内孵育120min ；PBS漂洗3minX3次；各培养皿中加300 μ I的Hoechst33342染色液复染20min ；PBS漂洗3minX3次，各培养皿中加入适量PBS后在激光共聚焦显微镜下检测拍照，如图7所示。拍完照片后用Iml RIPA裂解液裂解细胞，取10ul加入到96孔板中，每组细胞6个复孔，酶标仪检测荧光强度。以表达人miR-155的前列腺癌(PC-3)细胞作为阳性对照，同时以不表达人miR-155的非洲绿猴肾细胞vero细胞、小鼠结肠癌CT-26细胞作为阴性对照，以⑶133、⑶338做为肺癌干细胞的表面标志物，流式细胞仪从A549细胞中分选CD133和CD338的双阳性细胞为肺癌干细胞(CD133+CD338+)，同时采用qRT-PCR的方法检测NSCLC细胞及肺癌干细胞(⑶133+CD338+)内miR-155的表达。实验结果表明在表达miR-155的肺癌细胞及肺癌干细胞中可以看到红色荧光，且在干细胞内荧光信号更高，定位在细胞浆，而在不表达miR-155的veix)细胞、CT-26细胞未检测到红色荧光，且用酶标仪检测到的荧光信号强度与qRT-PCR结果趋势一致，综上表明设计合成的miR-155分子信标能够很好的检测高表达miR-155的癌细胞。
[0070]实施例14:壳聚糖分子信标纳米复合物(CS-MB)检测NSCLC细胞及LCSC细胞miR-155的表达
[0071]按前述方法合成的CS-MB纳米复合物，同样的细胞贴壁后用PBS充分漂洗，3minX 3次，每个细胞培养皿内加入OPTI MEM I培养基稀释的CS-MB纳米复合物，终浓度为200nM。37°C孵育 120min, PBS 漂洗 3minX3 次;各培养皿中加 300 μ I Hoechst33342 染色液复染20min ；PBS漂洗3minX3次，各培养皿中加入适量PBS后在激光共聚焦显微镜下检测拍照，如图8所示，拍完照片后用酶标仪检测荧光强度。以表达miR-155的PC-3细胞作为阳性对照，同时以不表达人miR-155的非洲绿猴肾细胞vero细胞、小鼠结肠癌CT-26细胞作为阴性对照。实验结果表明在表达miR-155的肺癌细胞及肺癌干细胞中可以看到较强的红色荧光，且在干细胞内荧光信号更高，定位在细胞浆，而不表达miR-155的veix)细胞、CT-26细胞未检测到红色荧光，实验结果同siPORT脂质体转染结果。且用酶标仪检测到的荧光信号强度与qRT-PCR结果趋势一致，并和商品化的siPORT脂质体转染试剂相比，荧光信号强度更高。
[0072]实施例15:细胞免疫荧光技术检测SSTR2在NSCLC细胞及组织内的表达
[0073]细胞爬片，密度约为70-80% ;吸取培养基后，用I毫升4%多聚甲醛固定15min ；PBS 漂洗，3X3min ；5 % BSA 室温封闭 20min ；.加入 PBS 稀释的一抗 SSTR2，1:200 (SataCruz)，于4°C冰箱孵育过夜；PBS作为阴性对照。PBS漂洗，3X3min ;加入1:200稀释后的的二抗，于37°C孵育30分钟；(此步骤及以后步骤注意避光处理)PBS漂洗，3X3min ;滴加50ul的DAPI染色5min ；PBS漂洗，3X3min ;抗淬灭封片剂封片。建立皮下移植瘤模型，制作冰冻切片，同样方法检测肿瘤组织中SSTR2的表达，如图9所示，可见到SSTR2在细胞膜表达，组织中在细胞膜和细胞浆表达，因此可以用奥曲肽进行靶向，在干细胞水平未检测到SSTR2的表达。
[0074]实施例16:祀向奥曲肽(OCT)修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物(CS-MB-OCT)以及FITC修饰的奥曲肽(OCT)所修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物(CS-MB-0CT-FITC)检测肺癌细胞内miR-155的表达
[0075]制备靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标复合物(200nM)和FITC修饰的奥曲肽所修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物(200nM)，分别用同样的方法和分子信标浓度转染(200nM)NSCLC细胞，I小时后在肺癌细胞细胞浆就可以看到更强的红色荧光信号，绿色荧光在细胞的周边，表明奥曲肽和生长抑素受体进行了结合，进而导致更多的纳米复合物进入细胞内，导致miR-155分子信标和细胞浆内的miR-155结合。如图10所示，实验结果表明在表达miR-155的肺癌细胞中可以看到较强的红色荧光，定位在细胞浆，而且时间缩短为I小时，而不表达miR-155的vero细胞、CT-26细胞未检测到红色荧光，实验结果同siPORT脂质体转染结果。且用酶标仪检测到的荧光信号强度与qRT-PCR结果趋势一致，并和商品化的siPORT脂质体转染试剂和壳聚糖分子信标纳米复合物相比，表现出了更高的荧光信号强度。
[0076]通过实施例13、14、16进行荧光强度分析:三种材料即商品化siPORT脂质体转染试剂、壳聚糖分子信标纳米复合物及靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物相比，荧光信号强度逐渐增强，且靶向性修饰的纳米材料孵育时间更短，为I小时。用同样的方法，三种材料转染肺癌细胞后，流式细胞仪分析细胞的转染效率，同样表明靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物表现了更高的转染效率。综上表明靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物不仅显示了更强的荧光强度，而且转染效率更高，且用酶标仪检测到的荧光信号强度与qRT-PCR结果趋势一致，表明可以通过分子信标识别癌细胞高表达的miR-155,达到早期识别肺癌细胞或肺癌干细胞的目的。
[0077]实施例17:动物活体成像技术检测皮下移植瘤组织内miR-155表达
[0078]建立皮下移植瘤动物模型，首先将三种纳米复合物(即CS-RSMB、CS_miR155MB和CS-miR155MB-0CT)分别直接注射到肿瘤组织内进行初步验证(浓度2 μ Μ，体积100 μ I)，如图11所示，实验结果表明CS-miR155MB组中可以见到强烈的荧光信号，且与肿瘤的大小分布较一致，而CS-RSMB组(阴性对照组)未见到红色荧光信号，由于肺癌组织内存在极少量的干细胞，表明分子信标可以和肿瘤细胞甚至可能和肿瘤干细胞内的miR-155结合，从而导致荧光信号的产生。同时将皮下移植瘤取出，冰冻切片观察，如图12所示，可以发现CS-miR155MB-0CT组表现出更强的荧光信号，荧光信号来自与肿瘤细胞内的miR-155结合(图片以A549细胞为例)，表明奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物可以通过与肿瘤细胞内的miR-155的结合达到更佳地识别肿瘤细胞的目的；同时表明可以通过识别癌细胞或癌干细胞高表达的miR-155，达到识别肺癌细胞或肺癌干细胞的目的。
[0079]实施例18:动物水平尾静脉注射壳聚糖分子信标纳米复合物(CS-MB)及奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物(CS-MB-OCT)纳米复合物检测其对肺癌细胞的识别、诊断作用
[0080]通过尾静脉注射A549肺癌细胞建立肺移植瘤动物模型，尾静脉注射CS-MB (浓度2 μ Μ，体积300ul)或相同分子信标浓度的CS-MB-0CT，活体成像检查对肺内肿瘤的识别情况，如图13所示，I小时后可以看到在肺部产生明亮的荧光信号，而对照组未见荧光信号。同时将肺组织取出，冰冻切片观察，如图14所示，可以发现CS-MB-OCT纳米复合物表现出更强的荧光信号，同时也可以观察到肺组织内较多癌结节形成，荧光信号来自肺组织内的癌结节，表明CS-MB-OCT可以通过与细胞内的miR-155的结合达到更好地识别肿瘤细胞的目的，并表明可以通过识别癌细胞或癌干细胞高表达的miR-155，达到识别肺癌细胞或肺癌干细胞的目的。
[0081]需要说明的是，实施例1-7制备奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物的方法不仅适用于生长抑素类似物奥曲肽，同样适用于FITC修饰的生长抑素类似物奥曲肽。
[0082]需要说明的是，在实施例中出现的浓度单位“mM”表示“mmol/L”;“nM”表示“nmol/L”；“ μΜ” 表示 “ ymol/L”。
[0083]应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种用于肺癌诊断的靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括下述步骤: A、将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比7:1?10:1的比例在pH6.0-7.0的PBS缓冲液中混合，并漩涡震荡40s?120s，在室温下静置40min?120min，得到壳聚糖分子信标纳米复合物； B、在壳聚糖分子信标纳米复合物中滴加0.5 %?2.0 %的戊二醛溶液，所述戊二醛溶液与所述壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为900:1?1300:1，通过第一次搅拌混合进行反应Ih?2h,第一次搅拌速度为10rpm?300rpm,反应后通过微量透析柱第一次透析0.5h?2h去除未结合的戊二醛；然后按照奥曲肽与所述壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为120:1?80:1的比例加入奥曲肽，进行第二次搅拌混合反应3h?6h，第二次搅拌速度为10rpm?300rpm,反应后通过微量透析柱第二次透析Ilh?15h去除未结合的奥曲肽，得到用于肺癌诊断的靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤A中，所述壳聚糖纳米的粒径^ 300nm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤A中，所述纳米壳聚糖与所述分子信标的质量比为7:1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤A中，所述PBS缓冲液的pH为6.0。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤A中，漩涡震荡时间为60s。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤B中，所述戊二醛溶液的浓度为1.0%，所述戊二醛溶液与所述壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为1000:1。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤B中，所述奥曲肽与所述壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为100:1。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤B中，第一次搅拌混合反应时间为1.5h,第一次搅拌速度为150rpm。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤B中，第二次搅拌混合反应时间为4h,第一次搅拌速度为150rpm。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤B中，第一次透析时间为Ih；第二次透析时间为12h。
【文档编号】A61K49/00GK104174035SQ201410421419
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月25日 优先权日:2014年8月25日
【发明者】陈正堂, 孙建国, 朱海振, 姚权, 安江宏, 韩静, 李雪涛, 朱聪慧, 江飞龙, 陈光朋, 彭丽娜 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院