一种抗体靶向修饰的阿尔茨海默病靶向药物递释复合物制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种抗体靶向修饰的阿尔茨海默病靶向药物递释复合物，所述的靶向药物递释复合物以氢化大豆卵磷脂和胆固醇形成磷脂双分子层结构，将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇穿插在磷脂双分子层，将水溶性药物包裹进脂质体中，并在脂质体表面修饰有抗体。本发明还涉及该靶向药物递释复合物的制备方法及应用。其优点表现在，本发明的靶向纳米载药体系具有良好的生物相容性；通过物理作用将亲水性药物包裹进双层脂质体内，与游离的药物相比，可以明显提高药物靶向性、延长药物在体内的循环时间，提高药物的生物利用率；对阿尔兹海默病的治疗提供一种无创伤给药方式。
【专利说明】一种抗体靶向修饰的阿尔茨海默病靶向药物递释复合物制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物【技术领域】，具体地说，是一种抗体靶向修饰的阿尔茨海默病靶向药物递释复合物制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]阿尔茨海默病(AD)是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。随着社会老龄化程度不断加剧，越来越多的老年人开始受到老年痴呆疾病的困扰，目前全世界患老年痴呆症的人数已近3000万，患病人数仍以每年460万的速度在增加。我国的患病人数约有500万，是世界上痴呆患者最多的国家之一。因此预防和治疗老年痴呆的研究有着重要的意义。
[0003]研究表明，β样淀粉蛋白(Αβ )聚集成淀粉样神经纤维是产生毒性的必要条件。淀粉样蛋白在细胞表面聚集是因为淀粉样前体蛋白APP在Y分泌酶的作用下产生的有毒性作用的多肽片段Αβ卜42，疏水性的淀粉样蛋白Αβ卜42与细胞表面的磷脂分子神经节苷脂GMl作用，在神经元细胞表面聚集成纤维状，插入磷脂双分子层，改变胆固醇水平，改变细胞膜的流动性及通透性，激活细胞表面相关信号分子，致使细胞内钙平衡紊乱，依次激活钙依赖性激酶、蛋白酶、脂肪酶、细胞内自由基生成，从而导致细胞损伤乃至死亡。人参皂苷Rbl是人参的主要有效成分，其可以明显提高体外培养神经元的活力，具有促进周围神经轴突生长、保护神经元的作用；人参皂苷能保护培养大鼠皮质神经细胞少受自由基损伤，增强神经元抗氧化能力，减轻氧自由基对神经元的损害。
[0004]连接特异性配体的聚合物载体可靶向至相应受体高表达的组织和细胞。脑主动靶向研究较广泛的受体有转铁蛋白受体、胰岛素受体、低密度脂蛋白受体、叶酸等。但有研究认为转铁蛋白并不是理想的脑部导向分子，转铁蛋白导向的药物与受体结合存在竞争抑制，受体基本被内源性转铁蛋白饱和，导致导向效率偏低。一种单克隆抗体mAb270能够靶向乙酰胆碱受体，可实现高效的脑转运。
[0005]氢化大豆卵磷脂和胆固醇具有生物可降解、生物相容性较好、毒性较低，形成的纳米尺寸双层脂质体可实现亲水性药物的包裹。同时抗体通过脂质体表面的活性基团很容易修饰到载体表面，实现载体向脑神经细胞的主动靶向。
[0006]本发明涉及的抗体靶向修饰的阿尔茨海默病靶向药物递释复合物，国内外尚未见类似的研究报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种阿尔茨海默病靶向药物递释复合物。
[0008]本发明的再一的目的是，提供一种阿尔茨海默病靶向药物递释复合物的制备方法。
[0009]本发明的另一的目的是，提供一种阿尔茨海默病靶向药物递释复合物的应用。
[0010]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:一种阿尔茨海默病靶向药物递释复合物，所述的靶向药物递释复合物以氢化大豆卵磷脂和胆固醇形成磷脂双分子层结构，将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇穿插在磷脂双分子层，将水溶性药物包裹进脂质体中，并在脂质体表面修饰有抗体。
[0011]所述的水溶性药物为人参皂苷Rbl。
[0012]所述的脂质体表面的马来酸酐基团链接巯基化的抗体，所述的抗体为单克隆抗体mAb270o
[0013]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:一种阿尔茨海默病靶向药物递释复合物的制备方法，所述的方法包括以下步骤:取氢化大豆卵磷脂、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇于1.5 ml的离心管中，65°C加热溶解于0.3 ml的乙醇溶液中，吸取于I ml注射器中；取3 ml的250 mM的硫酸铵溶液于玻璃瓶中65°C加热，磁力搅拌下加入人参皂苷使其完全溶解；取出注射器，缓慢将注射器中的油相注入水相中，磁力搅拌10-15min形成包裹人参皂苷的脂质体；用巯基化的抗体与包裹人参皂苷的脂质体在常温搅拌下反应过夜，载体表面的马来酸酐活性基团与巯基化的抗体反应，最后用50K的透析膜将游离的抗体透析除去，制备得到抗体靶向药物纳米载体，即靶向药物递释复合物。
[0014]为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:所述的靶向药物递释复合物在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
[0015]本发明优点在于:
本发明的靶向药物递释复合物(I)以氢化大豆卵磷脂、胆固醇和DSPE-mPEG2000为基本材料形成类似细胞膜结构的双层脂质体结构，借助脂质体中亲水成分与水溶性药物Rbl之间的相互作用，将药物包裹进脂质体中，形成纳米尺寸的载药体系；
(2)通过纳米载体表面的活性基团，将单克隆抗体mAb270连接到纳米载体表面，借助抗原抗体特异结合效应，使载药纳米粒子靶向神经细胞；所述的纳米载药体系与游离药物相比具有更长的半衰期，能显著提高药物的生物利用率。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]附图1是靶向纳米载药体系构建示意图。
[0017]附图2是靶向纳米载药体系粒径检测。
[0018]附图3是淀粉样蛋白Aβ 25-35诱导神经细胞PC12活性检测。
[0019]附图4是靶向药物递送载体复合物抑制Αβ 25_35诱导神经细胞PC12损伤。
[0020]附图5是靶向药物递送载体复合物抑制A β 25_35诱导神经细胞PC12诱导活性氧的产生。
[0021]附图6是靶向药物递送载体复合物抑制A β 25_35对神经细胞PC12细胞膜损伤。
[0022]附图7是原子力显微镜检测靶向药物递送载体复合物抑制Αβ25_35对神经细胞PC12细胞膜损伤。
[0023]附图8是靶向药物递送载体复合物抑制A β 25_35对神经细胞PC12细胞骨架损伤。
[0024]附图9是靶向药物递送载体复合物诱导细胞内PPAR Y含量上升。
[0025]附图10是靶向药物递送载体复合物降低细胞膜表面胆固醇含量。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0027]实施例1
取氢化大豆卵磷脂(PC)、胆固醇(Choleaterol)和DSPE_mPEG2000于1.5 ml的EP管中，加热溶解于0.3 ml的乙醇溶液中(65°C)，吸取于I ml注射器中；取3 ml的250 mM的硫酸铵溶液于玻璃瓶中65°C加热，磁力搅拌下加入人参皂苷使其完全溶解；取出注射器，缓慢将注射器中的油相注入水相中，磁力搅拌10_15min形成包裹人参皂苷的脂质体；用巯基化的抗体与包裹人参皂苷的脂质体在常温搅拌下反应过夜，载体表面的马来酸酐活性基团与巯基化的抗体反应，最后用50K的透析膜将游离的抗体透析除去，制备得到抗体靶向药物纳米载体。
[0028]实施例2
测样品的准备:用MilliQ-water稀释10倍透析后的祀向药物纳米载体；取0.5mL待测样品，加入样品池，并确认测定容器中无气泡产生后。每个样品重复测定3次。测量条件为:170°散射角，25°C。
[0029]实施例3
高度分化的PC12细胞以5000个/孔的密度种于96孔板，在37°C，5% C02培养条件孵育。设0，10，15，20，25，30 μ M淀粉样蛋白处理的实验组和一个空白对照，每组设置3个复孔。淀粉样蛋白处理24h后，加入CCK-8试剂，培养基:CCK-8试剂的体积比为10:1(CCK_8试剂10 μ L)，置于摇床上摇匀，放入培养箱孵育细胞1.5 h。采用酶标仪(TECAN ModelSafire2)，在波长为450nm处测定各孔的OD值。
[0030]实施例4
高度分化的PC12细胞种于96孔板，在含10 %胎牛血清的DMEM培养液中培养。实验设置空白组、对照组、AD模型组和不同浓度包裹人参皂苷靶向纳米载体的保护组，其中对照组细胞不作处理；AD模型组细胞只用25 μ mol/L淀粉样蛋白处理24h ;而包裹人参皂苷靶向纳米载体保护组先用不同浓度(10、20、30、40、50 μ mol/L)的人参皂苷预处理24h (为了描述方便，以下所指的人参皂苷均表示用靶向载体包裹人参皂苷)，再用淀粉样蛋白与不同浓度的人参皂苷共孵育24h。每组设置3个复孔。细胞经过不同的处理后，加入事先稀释好的CCK-8试剂10 μ L，各孔加入培养基至100 μ L0 96孔板置于摇床上摇匀，放入培养箱孵育细胞1.5 h。在波长为450nm处利用酶标仪测各孔的OD值，计算细胞的存活率。
[0031]实施例5
实验设置对照组、AD模型组和人参皂苷低浓度保护组及人参皂苷高浓度保护组。各组细胞经过不同的条件处理后，用ROS检测试剂盒分析细胞内ROS水平。
[0032]检测ROS的荧光探针DCFH-DA先按照1:1000用无血清培养液稀释。本实验采用收集细胞后装载探针的方法，故收集好的各组细胞先用无血清的培养基漂洗两遍，加入稀释好的DCFH-DA溶液10 μ M ;然后，细胞在37°C培养箱中避光孵育20 min，其间每隔3_5 min晃动混匀一下，以使探针充分进入细胞，与细胞内ROS结合；再用无血清培养基洗涤细胞三遍，以充分除去细胞外的DCFH-DA，避免其干扰；最后重悬各组细胞，在488 nm激发波长下用流式细胞仪检测细胞内荧光探针的荧光强度，分析活性氧水平。
[0033]实施例6
细胞膜氧化情况采用脂质氧化(104)检测试剂盒进行分析，实验分为三个部分。第一部分是样品的制备:将不同处理组细胞用细胞裂解液进行裂解，裂解完全后，高速离心取上清液进行后续分析测定。裂解过程在冰浴上进行。第二部分是104的测定:第一步，对试齐0盒进行处理，按照说明书的步骤分别配置！'8八储存液和10八检测工作液，并用适量蒸馏水配置标准品。第二步，对样品进行分析，实验组分为空白对照组、标准品组和样品组。各实验组取0.11111，随后加入0.21111 10八检测工作液，混匀后置于沸水浴15111111。水浴后，冷却至室温，离心后取上清液在532=0处用酶标仪测吸光度，据标准品制作标准曲线，分析10八含量。第三部分是蛋白浓度的测定:第一步，蛋白标准溶液的配置，据说明书配置标准蛋白的吸收曲线。第二步，测定样品中蛋白的浓度，取与10八测定过程中相同量的样品按说明书进行分析。据蛋白标准品制作标准曲线，推算出样品中总蛋白的含量。
[0034]据样品中总蛋白含量及丙二醛的含量计算单位量蛋白中丙二醛的含量，从而分析细胞膜的氧化情况。
[0035]实施例7
实验设置对照组、仙模型组和低浓度人参皂苷保护组及高浓度人参皂苷保护组。将细胞以适当密度种于六孔板贴壁2处，其中仙模型组用25 ^ 001/1淀粉样蛋白处理2处；而人参皂苷保护组先用不同浓度的人参皂苷预处理2处，两个保护组再用淀粉样蛋白与相应浓度的人参皂苷共孵育2处。细胞经不同的处理后，吸去培养基，用4%的多聚甲醛固定细胞15111111,然后用超纯水洗涤细胞2-3次，室温下自然干燥。将制备好的样品置于八的VI扫描台上，采用⑶社狀!:模式成像。实验采用100 0 111大小的扫描器，111208娃探针，微悬臂的弹性系数为2.8图像处理用自带软件〈I？ 2.1版)进行平滑处理，以消除低频背景噪音。
[0036]实施例8
高分化的细胞以适当的密度种于玻片，设置对照组、八0模型组和低浓度人参皂苷保护组及高浓度人参皂苷保护组。经淀粉样蛋白和人参皂苷处理后，吸除培养基，用冲洗3遍，然后冰浴下用4%多聚甲醛固定细胞20旧!!，随后再用？83缓冲液清洗细胞3遍。将事先配置好的200 11 I 1*110(1211111116-1)11211101(1111工作液滴置玻片上，使细胞充分浸泡在1*110(^1111116-1)1^1101(1111工作液中。室温避光孵育细胞，孵育过程在一个密闭的湿盒内进行以避免溶液的蒸发。细胞孵育60111111后，用？83冲洗3遍以去除未进入细胞的
1-110(181111116-1)1181101(1111染色液。最后，进行封片，置于激光共聚焦显微镜下观察。
[0037]实施例9
实验设置对照组、人参皂苷处理组、仙模型组、低浓度人参皂苷保护组和高浓度人参皂苷保护组。含量的分析按照抗体标记说明书进行操作分析:第一步:先离心收集细胞，再用缓冲液清洗细胞3遍。第二步:将罗丹明8811(:标记的兔抗？？八8 V抗体按比例稀释，不同组细胞在41避光条件用抗体稀释液孵育过夜。第三步:用？83缓冲液清洗细胞2遍，随后重悬细胞，上机进行流式分析。
[0038]实施例10
实验设置四个不同的处理组，分别为对照组、仙模型组和低浓度人参皂苷保护组及高浓度人参皂苷保护组。细胞在不同情况下处理后，收集细胞进行处理。先用清理液八清3遍，再用抗干扰液0处理10111111。然后，加入胆固醇染色液0室温避光孵育30 111111后，用清理液纟清洗3遍。最后用清理液重悬细胞，上机进行流式检测荧光强度。
[0039]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种阿尔茨海默病靶向药物递释复合物，其特征在于，所述的靶向药物递释复合物以氢化大豆卵磷脂和胆固醇形成磷脂双分子层结构，将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇穿插在磷脂双分子层，将水溶性药物包裹进脂质体中，并在脂质体表面修饰有抗体。
2.根据权利要求1所述的靶向药物递释复合物，其特征在于，所述的水溶性药物为人参皂苷Rb I。
3.根据权利要求1所述的靶向药物递释复合物，其特征在于，所述的脂质体表面的马来酸酐基团链接巯基化的抗体，所述的抗体为单克隆抗体mAb270。
4.根据权利要求1所述的靶向药物递释复合物的制备方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤:取氢化大豆卵磷脂、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇于1.5ml的离心管中，65°C加热溶解于0.3 ml的乙醇溶液中，吸取于I ml注射器中；取3 ml的250 mM的硫酸铵溶液于玻璃瓶中65°C加热，磁力搅拌下加入人参皂苷使其完全溶解；取出注射器，缓慢将注射器中的油相注入水相中，磁力搅拌10-15min形成包裹人参皂苷的脂质体；用巯基化的抗体与包裹人参皂苷的脂质体在常温搅拌下反应过夜，载体表面的马来酸酐活性基团与巯基化的抗体反应，最后用50K的透析膜将游离的抗体透析除去，制备得到抗体靶向药物纳米载体，即靶向药物递释复合物。
5.根据权利要求1-3任一所述的靶向药物递释复合物在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
【文档编号】A61P25/28GK104288102SQ201410542823
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月15日 优先权日:2014年10月15日
【发明者】李威, 柯长洪, 孙赟, 蒋成, 陈迪, 祝仙弟, 张付雷, 赵孟鑫 申请人:中国人民解放军第二军医大学