一种脱细胞舌基质材料及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种脱细胞舌基质材料及其制备方法，其特点是选取健康的动物的舌组织进行物理、化学和酶综合法处理，通过低渗液、高渗液、Triton X-100和核酸酶低温处理制备,获得具有良好的生物相容性和适当的生物降解速率的脱细胞舌基质材料。该材料可用于舌部再生修复以及舌部疾患的研究模型。其材料来源广泛、易得，价格低廉，制作容易。
【专利说明】一种脱细胞舌基质材料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发属于及生物医用材料的加工领域，具体涉及一种脱细胞舌基质材料及其制备方法。
【背景技术】
[0002]细胞外基质(extracellular matrix, ECM)是由细胞分泌到细胞外间充质中的蛋白质和多糖类大分子物质。ECM通过高度组织有序的细胞外微环境，构成复杂的网架连接组织结构，对细胞的生存、分化等细胞生理活动具有关键的调节作用。因此，可模拟ECM的支架基底和支架材料是组织工程研宄和组织修复的理想载体。细胞与ECM的接触是动态的，ECM的变化将会导致邻近细胞形态和功能的改变。用于组织工程的理想支架材料需要为种植的细胞提供与体内ECM相同或者相似的微环境(包括ECM的组成、结构和生物力学特征等)。但是，天然的ECM是由多种蛋白质组成(主要分为胶原、糖蛋白、氨基聚糖及蛋白聚糖、弹性蛋白4大类)，并且具有复杂的结构，不易在体外重构与体内ECM组成相同和结构一致的ECM材料。通过不同化学、物理或酶学去细胞方法从组织和器官获得天然的ECM，为解决这一难题提供了新的有效解决途径。去细胞化基质具有组织或者细胞特异性的ECM蛋白质和微结构，同时具有良好的力学特性、细胞相容性以及生物降解性，有利于细胞粘附、生长、增殖及分化。
[0003]制备脱细胞基质材料的方法有很多，主要是通过物理、化学和生物酶综合处理的方法。中国专利申请号为201110134511.9的发明专利涉及制备一种脱细胞真皮基质材料的方法，虽然可以比较彻底地去除细胞而且处理时间短，但是制备过程中采用了十二烷基硫酸钠(SDS)的处理。由于SDS的强洗脱效果，很大程度上破坏了细胞基质的结构完整性和生物活性，此外使用SDS制备的细胞外基质具有潜在的生物毒性，不利于该基质材料对组织的三维结构重建。中国专利申请号为201210237911.7的发明专利涉及制备一种细胞外基质支架材料的脱细胞方法。虽然采用了吡喃葡萄糖苷降低了去污剂在清洗过程中可能对再植细胞造成的潜在生物毒性，但主要应用于含较多胶原纤维和弹力纤维的组织和器官，应用到肌纤维丰富且发达的舌组织中并不完全适用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了克服以上技术的不足，采用健康的动物舌组织为原料，应用复合酶处理剂和碱等化学物质，提供一种具有良好生物相容性和适当的生物降解速率的脱细胞舌基质材料。
[0005]本发明是由以下技术方案实现的:
[0006](1)选取健康的动物舌组织，切成1厘米见方的小块，用PBS缓冲液洗去血渍备用；
[0007](2)将舌组织反复冻融3次，破碎细胞；
[0008](3)把舌组织块置于75%酒精中消毒；
[0009](4)将舌组织块悬于入无菌三级水中，4°C中速搅拌处理12小时；
[0010](5)将舌组块织悬于1M NaCl无菌溶液中，4°C中速搅拌处理24小时；
[0011](6)将舌组织块悬于2% TritonX-100的无菌缓冲溶中，4°C中速搅拌处理48小时；
[0012](7)将舌组织块悬于5mM CaCl#P 5mM MgCl 2无菌溶液中，4°C中速搅拌处理24小时；
[0013](8)将舌组织块转移到含有DNase I的无菌D_Hanks缓冲液的EP管中，37°C处理24小时；
[0014](9)将舌组织块悬于无菌PBS缓冲溶液中，4°C中速搅拌处理24小时，获得所述脱细胞舌基质材料。
[0015]进一步地，所述步骤(1)中选取组织为新鲜的无病毒感染的、无病史的动物舌头。
[0016]进一步地，所述步骤(2)中，破碎细胞的方法为将组织块放入_80°C冰冻30分钟后取出，在37°C水浴解冻，如此反复冻融3次。
[0017]进一步地，所述步骤(6)中，无菌缓冲液可选用PBS缓冲液或者pH = 7.4的Tris-HCl缓冲液。
[0018]进一步地，所述脱细胞舌基质材料可放置于含有90 μ g/ml氨苄的PBS中，4°C保存2个月以上。
[0019]本发明还包括根据上述任意一项的方法制备获得的脱细胞舌基质材料。
[0020]本发明脱细胞舌基质材料的制备方法中所有操作均在无菌超净工作台中进行。
[0021]采用本方法所制备的脱细胞舌基质材料，能够满足以下医学应用和医学研宄的要求:
[0022]1、作为舌的替代品，用于手术后舌部损伤和缺失的修复。
[0023]2、用于舌部溃疡的修复，尤其适用于因不良修复体和咬伤引起的舌部溃疡的医治Ο
[0024]3、可以用于口腔科整形术，如腭裂的修复等。
[0025]4、可作为细胞培养和组织工程体外模型材料，如用于舌再生和舌发育研宄、舌癌发生和浸润的研宄等。
[0026]本发明具有以下优点:
[0027]1、在维持动物舌头三维组织构造不变的前提下，彻底清除了动物舌中的细胞成分，得到具有完整的三维组织构造的舌部基质。
[0028]2、具有良好的力学性能、可赋形性、良好的细胞分化增殖环境以及良好的粘附性會κ ;
[0029]3、方法简便、易行，经济、合理、安全、可靠。
[0030]4、整个工艺过程属于清洁化制备，对环境无污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图la为含有细胞的新鲜小鼠舌组织的HE染色显微镜照片，图lb为经脱细胞处理后的小鼠舌细胞外基质材料的HE染色显微镜照片。
[0032]图2a为含有细胞的新鲜小鼠舌组织的扫描电子显微镜照片，图2b为经脱细胞处理后的小鼠舌细胞外基质材料的扫描电子显微镜照片。
[0033]图3为新鲜小鼠舌组织DNA含量和脱细胞处理后小鼠舌组织ECM中的DNA含量柱状图。
[0034]图4a为含有细胞的新鲜小鼠舌组织的Collagen I免疫组化结果，图4b为经脱细胞处理后的小鼠舌细胞外基质材料的Collagen I免疫组化结果。
[0035]图5a为含有细胞的新鲜小鼠舌组织的Collagen IV免疫组化结果，图5b为经脱细胞处理后的小鼠舌细胞外基质材料的Collagen IV免疫组化结果。
[0036]图6a为含有细胞的新鲜小鼠舌组织的Fibronectin免疫组化结果，图6b为经脱细胞处理后的小鼠舌细胞外基质材料的Fibronectin免疫组化结果。
[0037]图7a为含有细胞的新鲜小鼠舌组织的Laminin免疫组化结果，图7b为经脱细胞处理后的小鼠舌细胞外基质材料的Laminin免疫组化结果。
[0038]图8a为含有细胞的新鲜猪舌组织的HE染色显微镜照片(X 100)，图8b为经脱细胞处理后的猪舌细胞外基质材料的HE染色显微镜照片(X 100)。
[0039]图9为经脱细胞处理后的猪舌细胞外基质的扫描电子显微镜照片。
[0040]图10为新鲜猪舌组织DNA含量和脱细胞处理后猪舌组织ECM中的DNA含量柱状图。
[0041]图11a为含有细胞的新鲜大鼠舌组织的HE染色显微镜照片，图lib为经脱细胞处理后的大鼠舌细胞外基质的HE染色显微镜照片(X 100)。
[0042]图12为经脱细胞处理后的大鼠舌细胞外基质材料的扫描电子显微镜照片。
[0043]图13为新鲜大鼠舌组织DNA含量和脱细胞处理后大鼠舌组织ECM中的DNA含量柱状图。
[0044]图14a和图14b为小鼠舌ECM材料在注射舌癌细胞系Cal27培养20天后的HE染色显微镜照片。其中图14b (400 X)为图14a (100 X)的局部放大图。
[0045]图15a和图15b为利用I型胶原制作的皮肤模型在接种舌癌细胞系Cal27培养14天后的HE染色显微镜照片。其中图15b (400 X)为图15a (100 X)的局部放大图。
【具体实施方式】
[0046]下面通过实施例对本发明进行具体的描述。
[0047]实施例1小鼠舌ECM的制作
[0048](1)取材:选取健康的小鼠的舌组织，用PBS清洗两边去除血渍。至于EP管中-80 °C冰箱备用。
[0049](2)破碎细胞:将组织块从_80°C冰箱取出在37°C水浴锅解冻后再放回-80°C冰箱冰冻30分钟，如此反复冻融3次。
[0050](3)消毒和准备:把组织块至于75%的酒精中，用缝合线将舌组织块吊起，悬挂于250ml的广口瓶中，并在瓶底放置一枚1cm的磁力搅拌棒。
[0051](4)预清洗和破碎:加入250ml的无菌三级水，至于磁力搅拌器上(档位2)4°C处理12小时。
[0052](5)清洗细胞残片:将舌组织换到装有250ml 1M NaCl无菌溶液的小型搅拌循环器中。4°C处理24小时。
[0053](6)破碎并清洗:将舌组织换到装有250ml 2% TritonX-100的无菌PBS缓冲溶液的小型搅拌循环器中。4°C处理48小时。
[0054](7)清洗并增强酶活:将舌组织换到装有250ml 5mM CaCljP 5mM MgCl 2无菌溶液的小型搅拌循环器中。4°C处理24小时。
[0055](8)去残留核酸:将舌组织转移到含有300单位的DNase I (sigma)的lml无菌D-Hanks缓冲液的EP管中，37°C处理24小时。
[0056](9)清洗:将舌组织换到装有250ml无菌PBS缓冲溶液的小型搅拌循环器中，4°C处理24小时。
[0057]结果评价
[0058]1、ECM结构观察:ECM用10%中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5 μ m厚的薄片，经脱蜡脱水，苏木素-伊红(HE)染色，观察ECM结构，其HE染色显微镜照片见图lb，同时制作新鲜小鼠舌组织的HE染色，其显微镜照片见图la。可见用本发明方法制备的小鼠ECM结构，证实无细胞结构残留，并且细胞外基质结构保持完整。
[0059]2、ECM超微结构观察:将ECM组织用临界点干燥仪干燥，镀金，扫描电子显微镜观察，拍摄电子显微镜照片见图2b，同时拍摄新鲜小鼠舌组织电子微镜照片见图2a。对比两图可见用本发明方法制备的小鼠ECM结构，可以完整地脱去细胞结构，并且比较完好地保留了细胞外基质结构的纤维结构。
[0060]3、ECM 中 DNA含量检测:将ECM组织磨碎后，用 DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)裂解消化提取DNA，并用Nano-drop (Thermo)测定DNA含量，并与新鲜小鼠舌组织DNA含量进行对比，结果见图3。可见用本发明方法制得的小鼠ECM中，DNA含量减少了 90.98%，表明成功去除了绝大部分核酸残留。
[0061]4、ECM中Collagen I蛋白的免疫组化检测:ECM用10%中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5 μπι厚的薄片，经脱蜡脱水，去过氧化物酶，抗原修复，山羊血清封闭，孵育CollagenI抗体(稀释比例1:500) (abeam)4°C过夜，孵育二抗室温1小时，DAB显色，封片观察，拍摄显微镜照片如图4b所示；同时拍摄新鲜小鼠舌组织的Collagen I免疫组化显微镜照片4a作为对照。
[0062]5、ECM中Collagen IV蛋白的免疫组化检测:ECM用10%中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5 μπι厚的薄片，经脱蜡脱水，去过氧化物酶，抗原修复，山羊血清封闭，孵育Collagen IV抗体(稀释比例1:300) (abeam)4°C过夜，二抗室温孵育1小时，DAB显色，封片观察拍摄显微镜照片如图5b所示；同时拍摄新鲜小鼠舌组织的Collagen IV免疫组化显微镜照片5a作为对照。
[0063]6、ECM中laminin蛋白的免疫组化检测:ECM用10%中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5 μ m厚的薄片，经脱蜡脱水，去过氧化物酶，抗原修复，山羊血清封闭，孵育laminin抗体(稀释比例1:200) (abeam) 4°C过夜，二抗室温孵育1小时，DAB显色，封片观察，拍摄显微镜照片如图6b所示；同时拍摄新鲜小鼠舌组织的Laminin免疫组化显微镜照片6a作为对照。
[0064]7、ECM中fibronectin蛋白的免疫组化检测:ECM用10%中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5 μ m厚的薄片，经脱蜡脱水，去过氧化物酶，抗原修复，山羊血清封闭，孵育fibronectin抗体(稀释比例1:250) (abeam)4°C过夜，二抗室温孵育1小时，DAB显色，封片观察，拍摄显微镜照片如图7b所示；同时拍摄新鲜小鼠舌组织的fibronectin免疫组化显微镜照片7a作为对照。
[0065]实施例2，猪舌ECM的制作
[0066](1)取材:选取健康的猪的舌组织，分解为一厘米见方的小块，用PBS清洗两边去除血渍。至于EP管中-80°C冰箱备用。
[0067](2)破碎细胞:将组织块从_80°C冰箱取出在37°C水浴锅解冻后再放回-80°C冰箱冰冻30分钟，如此反复冻融3次。
[0068](3)消毒和准备:把组织块至于75%的酒精中，用缝合线将舌组织块吊起，悬挂于250ml的广口瓶中，并在瓶底放置一枚1cm的磁力搅拌棒。
[0069](4)预清洗和破碎:加入250ml的无菌三级水，至于磁力搅拌器上(档位2)4°C处理12小时。
[0070](5)清洗细胞残片:将舌组织换到装有250ml 1M NaCl无菌溶液的小型搅拌循环器中。4°C处理24小时。
[0071](6)破碎并清洗:将舌组织换到装有250ml 2% TritonX-100的无菌PBS缓冲溶液的小型搅拌循环器中。4°C处理48小时。
[0072](7)清洗并增强酶活:将舌组织换到装有250ml 5mM CaCljP 5mM MgCl 2无菌溶液的小型搅拌循环器中。4°C处理24小时。
[0073](8)去残留核酸:将舌组织转移到含有300单位的DNase I (sigma)的lml无菌D-Hanks缓冲液的EP管中，37°C处理24小时。
[0074](9)清洗:将舌组织换到装有250ml无菌PBS缓冲溶液的小型搅拌循环器中。4°C处理48小时。
[0075]结果评价
[0076]1、ECM结构观察:ECM用10%中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5 μ m厚的薄片，经脱蜡脱水，HE染色，其HE染色显微镜照片见图8b，同时制作新鲜猪舌组织的HE染色，其显微镜照片见图8a。可见用本发明方法制备的猪ECM结构中无细胞结构残留，并且细胞外基质结构保持完整。
[0077]2、ECM超微结构观察:将ECM组织用临界点干燥仪干燥，镀金，扫描电子显微镜观察，拍摄电子显微镜照片见图9。可见用本发明方法制备的猪ECM结构，可以完整地脱去细胞结构，并且比较完好地保留了细胞外基质结构的纤维结构。
[0078]3、ECM 中 DNA含量检测:将ECM组织磨碎后，用 DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)裂解消化提取DNA，并用Nano-adrop (Thermo)测定DNA含量，并与新鲜小鼠舌组织DNA含量进行对比，结果见图10。可见用本发明方法制备的猪ECM中，DNA含量减少97.17%，表明成功去除了绝大部分核酸残留。
[0079]实施例3，大鼠舌ECM的制作
[0080](1)取材:选取健康的大鼠的舌组织，分解为一厘米见方的小块，用PBS清洗两边去除血渍。至于EP管中-80 °C冰箱备用。
[0081](2)破碎细胞:将组织块从_80°C冰箱取出在37°C水浴锅解冻后再放回_80°C冰箱冰冻30分钟，如此反复冻融3次。
[0082](3)消毒和准备:把组织块至于70%的酒精中，用缝合线将舌组织块吊起，悬挂于250ml的广口瓶中，并在瓶底放置一枚1cm的磁力搅拌棒。
[0083](4)预清洗和破碎:加入250ml的无菌三级水，至于磁力搅拌器上(档位2)4°C处理12小时。
[0084](5)清洗细胞残片:将舌组织换到装有250ml 1M NaCl无菌溶液的小型搅拌循环器中。4°C处理24小时。
[0085](6)破碎并清洗:将舌组织换到装有250ml 2% TritonX-100的无菌PBS缓冲溶液的小型搅拌循环器中。4°C处理24小时。
[0086](7)清洗并增强酶活:将舌组织换到装有250ml 5mM CaCljP 5mM MgCl 2无菌溶液的小型搅拌循环器中。4°C处理24小时。
[0087](8)去残留核酸:将舌组织转移到含有300单位的DNase I (sigma)的lml无菌D-Hanks缓冲液的EP管中，37°C处理24小时。
[0088](9)清洗:将舌组织换到装有250ml无菌PBS缓冲溶液的小型搅拌循环器中。4°C处理24小时。
[0089]结果评价
[0090]1、ECM结构观察:ECM用10%中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5 μ m厚的薄片，经脱蜡脱水，HE染色，观察ECM结构其HE染色显微镜照片见图11b，同时制作新鲜大鼠舌组织的HE染色，其显微镜照片见图11a。可见用本发明方法制备的大鼠ECM结构中无细胞结构残留，并且细胞外基质结构保持完整。
[0091 ] 2、ECM超微结构观察:将ECM组织用临界点干燥仪干燥，镀金，扫描电子显微镜观察，见图12。可见用本发明方法制备的大鼠ECM结构，可以完整地脱去细胞结构，并且比较完好地保留了细胞外基质结构的纤维结构。
[0092]3、ECM 中 DNA含量检测:将ECM组织磨碎后，用 DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)裂解消化提取DNA，并用Nano-adrop (Thermo)测定DNA含量，并与新鲜大鼠舌组织DNA含量进行对比，结果见图13。可见用本发明方法制得的大鼠ECM中，DNA含量减少98.93%，表明成功去除了绝大部分核酸残留。
[0093]实施例4，小鼠舌ECM在舌癌细胞增殖和浸润研宄的应用
[0094](1)注射细胞:准备106的Cal27 口腔癌细胞。在超净工作台中用无菌的大头针将实施例1制得的舌ECM组织固定在新制蜡板上。用酒精灯将巴氏管拉取口径大约为100 μπι左右的玻璃针，吸取Cal27 口腔癌细胞注入ECM组织中。
[0095](2)培养:将注入Cal27 口腔癌细胞的舌ECM组织放至于加有3mlDF+10% FBS培养液的3.5cm的细胞培养皿中，将培养皿放于37°C的C02培养箱，定期换液，培养20天。
[0096](3)组织固定:将培养后的舌ECM组织至于10%中性福尔马林中，固定48小时。
[0097](4)制片:将固定的ECM组织用PBS缓冲液洗5分钟，经自动脱水机脱水、石蜡包埋、石蜡切片、切成5 μπι的薄片，烘片过夜，4°C保存。
[0098](5)HE染色:将组织切片用二甲苯脱蜡，酒精梯度复水后用苏木素染色5分钟，伊红染色1分钟，酒精梯度脱水，二甲苯透化，中性树脂封片观察。图14a和图14b为小鼠舌ECM材料在注射舌癌细胞Cal27培养20天后的HE染色显微镜照片。从图中可以看出Cal27细胞在本发明的小鼠舌ECM材料中的具有很高的增殖能力和组织浸润性。
[0099]在此补充利用皮肤模型培养舌癌细胞系的方法，用于与舌ECM材料对照。
[0100](1)皮肤模型的建立:将含有1 x 105癌巢成纤维细胞(Cancer associatedfibroblast, CAF)的10% FBS的RD培养液与酸性胶原(collagen I)在冰上迅速混合均匀后，取2ml加入到24孔板的一个孔中。连续培养1周，让CAF细胞收缩皮肤模型。
[0101](2)培养:将牛津杯垂直放置于皮肤模型上方，在其中加入IX 106个Cal27细胞。将24孔板放于37°C的0)2培养箱，用DF+10% FBS培养液培养，定期换液，培养14天。
[0102](3)组织固定:将培养后的皮肤模型至于10%中性福尔马林中，固定48小时。
[0103](4)制片:将固定的皮肤模型用PBS缓冲液洗5分钟，经自动脱水机脱水、石蜡包埋、石蜡切片、切成5 μπι的薄片，烘片过夜，4°C保存。
[0104](5)HE染色:将组织切片用二甲苯脱蜡，酒精梯度复水后用苏木素染色5分钟，伊红染色1分钟，酒精梯度脱水，二甲苯透化，中性树脂封片观察。图15a和图15b为皮肤模型在接种舌癌细胞Cal27培养14天后的HE染色显微镜照片。从图中可以看出Cal27细胞主要分布于皮肤模型的表面，细胞呈单层生长，没有表现出明显的增殖和浸润现象。
[0105]以上实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述
【发明内容】
作出一些非本质的改进和调整。
【权利要求】
1.一种脱细胞舌基质材料的制备方法，包括以下步骤: (1)选取健康的动物舌组织，切成1厘米见方的小块，用？83缓冲液洗去血渍备用； (2)将舌组织块反复冻融3次，破碎细胞； (3)把舌组织块置于75%酒精中消毒； (4)将舌组织块悬于入无菌三级水中，41:中速搅拌处理12小时； (5)将舌组块织悬于11^01无菌溶液中，41:中速搅拌处理24小时；(6)将舌组织块悬于2%11-1^0^-100的无菌缓冲溶中，41:中速搅拌处理48小时；(7)将舌组织块悬于5禮0^12和5禮%012无菌溶液中，41:中速搅拌处理24小时；(8)将舌组织块转移到含有0似86I的无菌0-他1^8缓冲液的2？管中，371:处理24小时； (9)将舌组织块悬于无菌？83缓冲溶液中，400中速搅拌处理24小时，获得所述脱细胞舌基质材料。
2.根据权利要求1所述的脱细胞舌基质材料的制备方法，其特征在于:所述步骤(1)中选取舌组织为新鲜的无病毒感染的、无病史的动物舌头。
3.根据权利要求1所述的脱细胞舌基质材料的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中，破碎细胞的方法为将组织块放入-801:冰冻30分钟后取出，在371:水浴解冻，如此反复冻融3次。
4.根据权利要求1所述的脱细胞舌基质材料的制备方法，其特征在于:所述步骤(6)中，无菌缓冲液可选用缓冲液或者邱=7.4的缓冲液。
5.根据权利要求1所述的脱细胞舌基质材料的制备方法，其特征在于:所述脱细胞舌基质材料可放置于含有90 ^ 8加1氨苄的中，41:保存2个月以上。
6.按照权利要求1?5任意一项的方法制备得到的脱细胞舌基质材料。
【文档编号】A61L27/50GK104491927SQ201410664973
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】张雁, 赵龙, 余姝毅, 郑骏恒 申请人:中山大学