技术领域
本发明属于生物医药卫生领域，具体涉及人源G9a及其重组腺病毒表达载体在制备治疗
糖尿病药物中的应用。
背景技术：
糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损而导致机体长时期处于高血糖状态
的慢性代谢疾病。流行病学研究表明糖尿病患者在全球范围内，特别是亚洲，持续性增长。
糖尿病根据发病机制可以分为主要三类：1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠糖尿病，其中2型糖
尿病患者占90-95％。
db/db小鼠为广泛应用的2型糖尿病动物模型，由瘦素受体(leptinreceptor，Lepr)点突
变导致leptin信号通路障碍，从而导致小鼠出现肥胖、胰岛素抵抗、高血糖、脂肪肝等症状。
胰岛素抵抗是2型糖尿病最主要的病理特征。胰岛素抵抗是指组织器官对胰岛素的敏感
性降低，不能正常应答胰岛素的调控功能，造成胰岛素分泌相对不足。胰岛素抵抗通常发生
在胰岛素敏感的组织中，如肝脏、脂肪、肌肉等。正常条件下，胰岛素参与调节糖代谢，控
制血糖稳定。当机体进食后，碳水化合物类营养物质被吸收转化成葡萄糖，造成血糖增高，
刺激胰岛细胞分泌胰岛素。胰岛素作用于多种组织，增加肝脏和肌肉对葡萄糖的吸收，刺激
肝脏和肌肉中糖原合成，最终维持血糖在正常的生理水平。当发生胰岛素抵抗时，组织不能
正常应答胰岛素的调控功能，肝脏和肌肉中葡萄糖吸收减少、糖原合成降低，大量的葡萄糖
依然留在循环的血液中。同时脂肪细胞中脂质裂解增强，游离脂肪酸增多，造成高血脂，并
使胰岛素抵抗进一步恶化。由于胰岛素敏感性降低，胰岛细胞代偿性胰岛素分泌增多，最终
造成高胰岛素症。
G9a属于包含SET(Su(var),Enhancerofzeste,Trithorax)结构域的SUV39H组蛋白甲
基化转移酶亚家族，由EHMT2基因编码。研究表明G9a可以甲基化H3K9和H3K27，募集
转录抑制子HP1形成复合物，从而抑制基因转录。同时，G9a可以与DNA甲基化酶相互结
合，参与DNA甲基化过程，从而调控基因转录。除了甲基化组蛋白外，G9a还能甲基化非组
蛋白，例如转录因子MyoD，从而改变蛋白活性。近期研究发现，G9a不仅能抑制基因转录，
还能通过其结构域募集激活子促进基因转录，而这个作用并不依赖于其甲基化酶活性。例如，
在糖皮质激素受体(glucocorticoidreceptor,GR)激活下游靶基因转录的过程中，GR首先结
合到DNA，并募集G9a和GRIP1(glutamatereceptorinteractingprotein1,谷氨酸受体作用蛋
白)。GRIP1和G9a随后进一步募集CARM1(coactivator-associatedargininemethylthrasferase)
(一种精氨酸甲基化酶)和p300(一种组蛋白乙酰化酶)，形成转录激活复合物，最终促进
GR靶基因转录。G9a这种转录激活功能是广泛存在的，在核受体调控基因转录的过程中也发
现了类似机制。
由于其在基因转录上的重要调控作用，所以G9a对机体的生长和发育是至关重要的。最
直接的证据是全身性G9a敲除小鼠胚胎致死。通过对G9a条件性敲除小鼠的研究，发现G9a
与胚胎发育、生殖细胞的发育及减数分裂、肿瘤细胞的生长及转移、认知及适应性行为和脂
肪细胞分化等生物过程都有着密切联系。但G9a在糖尿病等代谢疾病的发生发展过程中所起
的作用目前了解较少。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于提供人源G9a在制备治疗糖尿病药物中的应用。本发明的另一目
的在于提供表达人源G9a的重组腺病毒载体或表达人源G9a的重组腺病毒在制备治疗糖尿病
药物中的应用。本发明的再一目的在于提供表达人源G9a的重组腺病毒载体的构建方法或表
达人源G9a的重组腺病毒的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明通过将人源G9a的编码基因EHMT2连接到腺病毒载体pDOV-mCMV-GFP，构建
了可以过表达G9a的重组腺病毒载体pDOV-mCMV-GFP-EHMT2，用该载体转染HEK293细
胞制备得到可过表达G9a的重组腺病毒Ad-G9a，再将重组腺病毒Ad-G9a注射到db/db小鼠
体内检测其血糖的变化，发现注射重组腺病毒Ad-G9a的小鼠的非空腹血糖(NFBG)和空腹
血糖(FBG)浓度均显著低于注射对照腺病毒Ad-GFP的小鼠，表明肝脏中G9a的过表达可
以有效缓解db/db小鼠的高血糖症状。
针对G9a具有缓解高血糖症状的作用，其可用于制备治疗糖尿病的药物。
基于G9a的作用，表达G9a的重组腺病毒载体也可用于制备治疗糖尿病的药物；相应的，
表达G9a的重组腺病毒也可用于制备治疗糖尿病的药物。
一种治疗糖尿病的药物，包含G9a、表达G9a的重组腺病毒载体或表达G9a的重组腺病
毒。
所述的表达G9a的重组腺病毒载体，其骨架载体优选为pDOV-mCMV-GFP。
所述的表达G9a的重组腺病毒载体优选通过包含如下步骤的方法(构建流程图见图1)
构建得到：
(1)以含有目的基因EHMT2的质粒pEGFP-hG9a(购自Addgene公司)为模板，用如
下引物扩增目的基因EHMT2，
引物1：
CGTAGAACGCATCGAATTCGCCACCATGGACTACAAGGATGACGATGACAAGATGG
CGGCGGCGGCGGGAGCTG；
引物2：GCCCTTGCTCACCATGAATTCTGTGTTGACAGGGGGCAGGGA。
(2)将腺病毒载体pDOV-mCMV-GFP用EcoRI酶切获得线性化表达载体。
(3)将胶回收的目的基因EHMT2用EcoRI酶切后，与线性化表达载体进行定向连接或
者交换，其产物转化大肠杆菌感受态细胞后进行培养。
(4)对长出的克隆用引物3和引物4先进行菌落PCR鉴定，引物3：
CAGAAGGTGATCCTGATGCT，引物4：TCAGCTTGCCGTAGGTGGCAT；再对PCR鉴定阳
性的克隆进行测序分析，测序分析正确的即为表达G9a的重组腺病毒载体
pDOV-mCMV-GFP-EHMT2。
所述的表达G9a的重组腺病毒优选通过包含如下步骤的方法制备得到：将表达G9a的重
组腺病毒载体转染到HEK293细胞中得到表达G9a的重组腺病毒Ad-G9a。
本发明发现了G9a可明显改善糖尿病小鼠的高血糖症状，该发现为研究G9a在胰岛素信
号通路中所起的调控作用，以及开发糖尿病治疗的新药物、新方法提供了基础。基于该发现，
G9a、表达G9a的重组腺病毒载体、表达G9a的重组腺病毒可用于制备治疗糖尿病的药物。
附图说明
图1为表达人源G9a的重组腺病毒载体的构建流程图。
图2为目的基因人源EHMT2PCR扩增产物的电泳图。1为PCR扩增产物，2为DNA
Marker(1KbDNAladderMarker)，其中箭头指的是目的基因EHMT2的条带。
图3为pDOV-mCMV-GFP载体的结构示意图。
图4为菌落PCR鉴定结果的电泳图。M为DNAMarker(1KbDNAladderMarker)，1-10
为转化子，其中1-5、7、10为阳性转化子。
图5为Ad-GFP腺病毒注射3天后，小鼠肝脏中绿色荧光蛋白的表达情况。
图6为小鼠肝脏中目的基因表达蛋白G9a的WesternBlot结果。
图7为体内G9a的过表达改善了db/db小鼠的高血糖。其中，+/++Ad-GFP：野生型小
鼠注射对照腺病毒，db/db+Ad-GFP：db/db小鼠注射对照腺病毒，db/db+Ad-G9a：db/db小
鼠注射表达G9a的重组腺病毒。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。应理解，下面的实施例仅用于
说明本发明而不用于限制本技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技
术人员所熟知的常规手段。
实施例1人源组蛋白甲基化酶EHMT2基因片段的获取
根据人源EHMT2的基因序列(序列号：NM-001289413.1)设计上下游引物。从含有目的
基因的质粒中，利用PCR方法扩增目的基因EHMT2。引物序列、反应体系(表1)及反应条
件如下所示，PCR产物通过电泳进行鉴定。
(1)引物序列
引物1：CGTAGAACGCATCGAATTCGCCACCATGGACTACAAGGATGACGATGACA
AGATGGCGGCGGCGGCGGGAGCTG；
引物2：GCCCTTGCTCACCATGAATTCTGTGTTGACAGGGGGCAGGGA。
(2)PCR扩增目的基因：
取1μL模板(含有目的基因的质粒pEGFP-hG9a，购自Addgene公司)，PCR扩增目的片
段。
表1PCR反应体系
PCR反应条件：98℃3min；98℃10sec，55℃15sec，72℃1min，35个循环；72℃10min；
4℃保存。
经电泳鉴定，PCR产物大小为3003bp(图2)，与目的基因相符，表明成功获得EHMT2
基因。
实施例2表达人源G9a重组腺病毒载体的构建
(1)表达载体线性化
将腺病毒载体pDOV-mCMV-GFP(购自上海纽恩生物科技有限公司)(图3)用限制性内
切酶EcoRI酶切，酶切反应温度为37℃，反应时间为2小时，反应体系如下表2。
表2酶切反应体系
(2)PCR产物交换连接入线性化表达载体
将实施例1得到的PCR产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自Takara)进行胶回收
后，同样用限制性内切酶EcoRI酶切，再通过In-FusionEnzyme(购自美国Clontech公司)
交换入线性化表达载体，反应体系见表3，反应条件为42℃孵育30min。连接完成后立刻转
化或冻存于-20℃以后转化。
表3连接反应体系
说明：目的基因片段和线性化表达载体均通过胶回收纯化。阳性对照和自连对照，加入
的载体和连接组一致，但阳性对照加入的目的基因片段是基因片段1即GAPDH基因；连接
组加入的目的基因片段是基因片段2即实施例1扩增的EHMT2基因。
(3)转化
取(2)中连接产物10μL转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，取适当量的转化菌液涂布于
含氨苄青霉素(100μg/mL)的固体LB培养基上，倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养16
小时。
(4)阳性克隆鉴定
菌落PCR鉴定：挑取平板上长出的转化子重悬于10μLLB培养液中，取1μL做模板进
行菌落PCR鉴定。PCR引物、反应体系(表4)及反应条件如下。
PCR引物：引物3：CAGAAGGTGATCCTGATGCT；
引物4：TCAGCTTGCCGTAGGTGGCAT。
表4PCR反应体系
PCR反应条件：94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min，30个循环；72℃10min；
4℃保存。
菌落PCR鉴定重组克隆的结果见图4，其中阳性转化子PCR产物大小为1700bp，阴性
转化子PCR产物大小为0bp。接种图4中10号阳性转化子，37℃培养16小时后保存为甘油
菌，分装200μL送测序。测序引物采用鉴定引物3和华大通用引物EGFP-N-3、CMV-MF、
CN826-SF、CN826-SF2。通过对测序结果分析显示携带人源EHMT2基因的重组腺病毒载体
pDOV-mCMV-GFP-EHMT2构建成功。
实施例3表达人源G9a的重组腺病毒Ad-G9a的鉴定
将重组腺病毒载体pDOV-mCMV-GFP-EHMT2转染到HEK293细胞中，在HEK293细胞
中包装产生重组腺病毒Ad-G9a，并对其进行大规模扩增及纯化，最后检测重组腺病毒滴度。
(1)检测腺病毒在肝脏中的感染效率：对11周龄的雄性野生型C57BL/6J小鼠尾静脉注
射等量的PBS和对照腺病毒Ad-GFP(对照腺病毒购自上海纽恩生物科技有限公司)，7×109pfu/
只。注射3天后，取小鼠肝脏组织进行冰冻切片后在显微镜下观察。如图5所示，PBS注射
的小鼠肝脏中没有任何绿色荧光表达，而Ad-GFP注射的小鼠肝脏中可见大量绿色荧光蛋白
表达，表明腺病毒在小鼠肝脏中有较高的感染效率。
(2)利用蛋白质免疫印记反应(WesternBlot)检测所构建的腺病毒在小鼠肝脏中的过
表达效率
对11周龄的雄性db/db小鼠进行尾静脉注射Ad-GFP或Ad-G9a(已构建好的携带人源
G9a的腺病毒)，7×109pfu/只。在病毒注射7天后，处死小鼠并取适量小鼠肝脏组织置于RIPA
缓冲液(购自碧云天公司)中超声破碎。总蛋白质浓度用BCA蛋白定量法定量。等量的蛋白
经过SDS-PAGE电泳后，转印到纤维素膜上(美国Bio-rad公司)。纤维素膜经过5％的脱脂
牛奶封闭后，用抗G9a的抗体(购自美国Abcam公司)进行孵育。漂洗经抗体孵育的纤维素
膜，再加入相对应的二抗进行孵育。用ECL试剂进行反应后，抗体识别的蛋白条带可经过曝
光后在X光片上显示。结果如图6所示，经WesternBlot检测，可以观察到在140kDa和165kDa
处，与对照病毒相比，Ad-G9a感染的小鼠肝脏中G9a的表达显著增加。用QuantityOne1-D
分析软件(美国Bio-rad公司)对蛋白条带进行定量分析，目的蛋白G9a的表达量报道为相
对于考马斯亮蓝染色(coomassiebluestaining)的水平。结果显示注射携带人源G9a的腺病
毒的小鼠与注射对照病毒组相比其肝脏中G9a的表达增加约31倍。
实施例4体内G9a的过表达改善了db/db小鼠的高血糖
对11周龄的雄性db/db小鼠进行尾静脉注射Ad-GFP或Ad-G9a，7×109pfu/只。分别在病
毒注射0、3、7天后，检测其血糖的变化。结果如图7所示，与正常的野生型C57BL/6J小鼠
相比，db/db小鼠的非空腹血糖(NFBG)和空腹血糖(FBG)显著增高，但db/db小鼠尾静
脉注射Ad-G9a病毒3天后，NFBG和FBG都有一定程度的降低，但没显著性变化。但在Ad-G9a
病毒注射7天后，db/db小鼠的NFBG和FBG均有显著性降低。表明肝脏中G9a的过表达可
以有效改善db/db小鼠的高血糖症状。
SEQUENCELISTING
<110>武汉百奥京生物医药有限公司
<120>人源G9a及其重组腺病毒表达载体在制备治疗糖尿病药物中的应用
<130>1
<160>4
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>74
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>引物1
<400>1
cgtagaacgcatcgaattcgccaccatggactacaaggatgacgatgacaagatggcggc60
ggcggcgggagctg74
<210>2
<211>42
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>引物2
<400>2
gcccttgctcaccatgaattctgtgttgacagggggcaggga42
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>引物3
<400>3
cagaaggtgatcctgatgct20
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>引物4
<400>4
tcagcttgccgtaggtggcat21