本发明属于人体植入医疗器械技术技术领域，尤其涉及一种利用合成的多元聚合物制备人工角膜的方法。
背景技术：
人角膜基质层占角膜厚度的90％，主要由角膜基质细胞和胶原纤维等细胞外基质成分规则排列而成，透明且具有一定的曲率半径，有利于光线通过和折曲，在维持整个角膜的透明度和曲光率等方面具有至关重要的作用。绝大多数角膜基质病盲患者均可以通过角膜移植手术来治愈，但由于捐献角膜的高度匮乏致使绝大部分患者得不到供体角膜而无法复明，导致许多眼角膜疾病患者长期处于等待供体捐献与失明的痛苦中。因此开发一种来源方便，可替代供体捐献角膜的人工眼角膜就变得格外重要和迫切。
人造角膜支架材料主要由合成生物材料和与ECM（细胞外基质）相关的生物材料组成。合成生物材料的优点是可以提供优异的生物力学性能，无限量供应，透光度高以及可塑性强的特点，缺点是亲水性差，缺乏生物活性，并且可能诱发一系列的炎症反应等问题。合成生物材料中加入ECM成分，能够为种子细胞创造一个有助于细胞黏附、增殖或分化的天然微环境。
3D打印技术是一项基于喷射型的快速成型技术，可以很容易控制局部材料组成、微观结构以及表面特性，可以应用到组织工程角膜的制备中。
技术实现要素：
本发明涉及一种多元聚合物人工角膜的制备方法，得到一种力学性能优异，生物相容性良好的人工角膜。
为实现上述目的采用的技术方案为：一种多元聚合物人工角膜的制备方法，步骤包括：
1）合成多元共聚材料：取多种单体原料混合，加入催化剂，抽真空，充氮气，在密闭的容器中进行反应，制备多元共聚物；
2）制备角膜三维支架：使用3D生物打印机，将上述多元共聚物为原料置于打印机的料筒中，根据预先设定的模型，打印出角膜形状的三维立体支架；
3）利用ECM对三维支架进行功能修饰：取脱细胞角膜细胞外基质干粉溶于蒸馏水中，制备成纳米颗粒混悬液，使用直接涂覆的方式将混悬液中的细胞外基质颗粒均匀覆盖到角膜三维支架表面；
4）残余角膜微组织化方法的构建：取患者角膜进行微组织化处理，制备成均匀的细微颗粒，离心收集沉淀，在沉淀中加入生物蛋白胶，在无菌条件下，将其注入到被修饰支架材料中，制得人工角膜。
为了控制多元共聚物的分子量，所述步骤1）中反应温度为130-160℃，反应时间为10-24h。
为了满足人工角膜的力学强度，所述步骤1）中多元共聚物的分子量为3000-50000。
为了满足人工角膜光学性能、力学强度和降解性能的需求，所述步骤1）中单体选自ε-己内酯、丙交酯、三亚甲基碳酸酯或乙二醇中的几种组合，使用时的质量比为，ε-己内酯：丙交酯：三亚甲基碳酸酯：乙二醇=5-90:5-90:3-50:5-30。
为了加速多元聚合反应，所述步骤1）中催化剂为辛酸亚锡、有机胍、金属锌、三丁基氯化锡、乙酰丙酮铁、乳酸锌、纳米氧化锌、牛磺酸、乙醇铁、正丙醇铁或正丁醇铁；催化剂的质量为原料质量的0.1%-1%。
进一步的，所述步骤2）中打印头直径为200μm，挤出速度为0.022-0.033mm/s，打印温度为120℃-180℃，打印速度为6mm/s，打印层厚为0.01-0.1mm。
为了提高三维支架的生物相容性，保证细胞能够在支架上存活，所述步骤2）中打印得到的角膜三维支架的孔隙率为90%，孔隙直径为200-500µm。
进一步的，所述步骤3）中脱细胞角膜细胞外基质干粉的制备方法为：将新鲜动物眼角膜放于生理盐水中洗净沥干后切成小块，使用双氧水浸泡；再使用蒸馏水和三蒸水清洗干净，细菌培养呈阴性后，将小块角膜使用超微湿法粉碎，离心分离，收集沉淀，冷冻干燥制备成脱细胞角膜细胞外基质纳米级干粉，在4℃下保存。
为了提高离心效果，降低脱细胞角膜细胞外基质颗粒的粒径，所述离心是在4℃条件下分三次离心，离心时间分别为10-20min，离心速度分别为1000rmp-8000rmp，且三次离心的速率是递增的。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明首先制备一种具有优异力学性能的多元聚合物材料，利用3D打印技术以多元聚合物为原料制备角膜三维支架；然后利用脱细胞角膜细胞外基质干粉（ECM）对三维支架进行功能修饰，使用3D打印方式或使用直接涂覆的方式将细胞外基质颗粒均匀覆盖到角膜三维支架表面；最后将患者的残余角膜进行“微组织化处理”，也即将自体角膜“种子细胞”复合到角膜三维支架中，促进了人工角膜的最优微环境，避免了种子细胞的体外培养环节，具有快速临床转化的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。本发明所提到的比例、“份”，如果没有特别的标记，均以重量为准。
本发明提供了一种人工角膜的制备方法，利用化学合成的方法，制备一种力学性能可调的合成生物材料，利用3D打印技术打印出人工角膜支架，为了改善其生物相容性，用ECM进行生物功能性修饰，使其在具有良好力学性能的前提下，得到优异的生物活性。步骤包括：
1）合成多元共聚材料：取多种单体原料混合，加入催化剂，抽真空，充氮气，在密闭的容器中，在无水无氧条件下进行反应，温度为130-160℃，反应时间为10-24h；反应完成后将产物溶于二氯甲烷或乙酸乙酯中，加入甲醇或石油醚使多元共聚物沉淀，过滤，将沉淀于30-50℃条件下真空干燥，得到多元共聚物。
由反应温度和反应时间控制多元共聚物的分子量为3000-50000。多元共聚物的分子量影响三维支架的力学性能，包括支架的拉伸强度、弹性模量以及断裂伸长率，本实施例中分子量在3000-50000的范围内力学性能的综合指标是最优异的，满足角膜在临床上对力学强度的所有需求；而且分子量大的多聚物降解速率比分子量小的慢。
本实施例中所述单体选自ε-己内酯、丙交酯、三亚甲基碳酸酯或乙二醇中的几种组合，使用时的质量比为，ε-己内酯：丙交酯：三亚甲基碳酸酯：乙二醇=5-90:5-90:3-50:5-30。当只使用其中两种或三种时，仍然满足以上质量比关系，例如使用ε-己内酯与丙交酯二元单体时，二者质量比为5-90:5-90；又如使用ε-己内酯、丙交酯、三亚甲基碳酸酯三元单体时，三者质量比为5-90:5-90:3-50。其中所述丙交酯可以为左旋丙交酯和/或右旋丙交酯。
所述催化剂为辛酸亚锡、有机胍、金属锌、三丁基氯化锡、乙酰丙酮铁、乳酸锌、纳米氧化锌、牛磺酸、乙醇铁、正丙醇铁或正丁醇铁。催化剂的质量为原料质量的0.1%-1%，优选为0.5%。
2）制备角膜三维支架：使用步进电动驱动的3D生物打印机，将上述多元共聚物为原料置于打印机的料筒中，一次打印需要原料8-12g，根据预先设定的模型，将多元共聚物材料挤出在载有灭菌玻璃底板的打印平台上，打印出角膜形状的三维立体支架。打印头直径为200μm，挤出速度为0.022-0.033mm/s，打印温度为120℃-180℃，优选为150℃，打印速度为6mm/s，打印层厚为0.01-0.1mm。
上述3D打印的工艺参数会影响三维支架的精度，且它们之间相互影响，例如（1）打印头直径，直接影响打印输出纤维的粗细，还与材料的粒径大小有关。（2）打印温度，影响到材料的黏度、供料压力、成型固化速度等，从而间接影响成型精度。（3）打印速度，与材料挤出速度、材料黏度、材料固化成型速度匹配，太快不易成型或出现断丝，太慢出现材料堆积。（4）打印层厚，本身是打印精度指标，层厚过大，要求挤出速度高，在材料黏度过高时难以实现。层厚设置与材料黏度、打印温度、打印速度、挤出速度相关。
打印得到的角膜三维支架的孔隙率为90%，孔隙直径为200-500µm，所述孔隙率及孔隙直径对支架的生物相容性有很大影响，孔隙率决定营养物质和氧气的传递，孔隙直径影响细胞生长所需空间，二者直接决定细胞能否在支架上存活。
3）利用ECM对三维支架进行功能修饰：取脱细胞角膜细胞外基质干粉溶于蒸馏水中，制备成纳米颗粒混悬液，将上述三维支架浸泡入混悬液中，使用直接涂覆的方式将混悬液中的细胞外基质颗粒均匀覆盖到角膜三维支架表面，于4℃下保存备用。
所述脱细胞角膜细胞外基质干粉的制备方法为：将新鲜动物眼角膜放于生理盐水中洗净沥干后切成小块，使用双氧水浸泡，双氧水的质量浓度为3%，浸泡时间为10-24h；再使用蒸馏水和三蒸水清洗干净，细菌培养呈阴性后，将小块角膜使用超微湿法粉碎，在4℃条件下分三次离心，离心时间分别为10-20min，离心速度分别为1000rmp-8000rmp，且三次离心的速率是递增的；收集沉淀，冷冻干燥制备成脱细胞角膜细胞外基质纳米级干粉，平均直径为130-180nm，在4℃下保存。
4）残余角膜微组织化方法的构建：取患者角膜，去除退化变性组织，保留“相对正常”组织备用。将残余角膜组织进行微组织化处理，在无菌条件下转移到超净工作台内的培养皿中，切成小块，转移到消毒好的玻璃瓶内，加入1-5µL质量浓度为0.1%-1%的胶原酶，用于将角膜组织分离成为单个细胞，充分剪碎，制备成均匀的残余角膜组织混悬液，通过300µm直径的滤网过滤，离心，弃掉上清液收集沉淀，在沉淀中加入1-5mL生物蛋白胶，用于粘连ECM，防止其渗出；在无菌条件下，将其注入到被修饰支架材料中。
本发明采用的多元聚合物人工合成材料能够满足人工角膜光学性能、力学强度和降解性能的需求。利用3D生物打印机打印角膜三维支架，精度高。利用脱细胞眼角膜细胞外基质对角膜三维支架进行功能修饰，使得修饰后的眼角膜支架具有良好的细胞外基质微环境，在具有良好力学性能的前提下，获得更为优秀的生物相容性，并且可以进一步发挥细胞外基质对细胞行为的调控，促进细胞迁移、增殖和分化的作用，从而使得修饰后的支架具有更好的促进眼角膜再生的作用。同时，患者残余角膜微组织化处理能够获得自体的种子细胞，促进了组织工程角膜的“最优微环境化” ，具有快速向临床转化的应用前景。
实施例1
以如下步骤制备人工角膜：
（1）二元共聚材料的合成：按质量百分比取35%的ε-己内酯单体、65%的丙交酯单体为原料投入反应设备中，加入原料质量0.5%的辛酸亚锡作为催化剂，抽真空，充氮气，在密闭的聚合设备中，于150℃条件下反应20h，即可获得分子量为22938的多元共聚物。
（2）打印眼角膜三维支架：以上述三元共聚材料为原料，利用生物打印机，构建人角膜形状的三维立体构，结构体的孔隙直径为350µm，孔隙率为90%，得到可负载细胞的角膜三维支架。打印头直径为200μm，挤出速度为0.022mm/s，打印温度为120℃，打印速度为6mm/s，打印层厚为0.1mm。
（3）利用脱细胞角膜细胞外基质对3D打印支架进行功能修饰：取新鲜的猪眼眼角膜，生理盐水洗净沥干后切成小块，浸泡3%的双氧水20小时，蒸馏水和三蒸水清洗干净后，将角膜小块超微湿法粉碎，4℃条件下分三次离心，离心时间依次为10min、15min、20min，离心速度依次为1000rmp、5000 rmp、8000rmp；收集沉淀，冷冻干燥制备成干粉4℃下保存，干粉直径为150-180nm。将脱细胞角膜细胞外基质干粉溶于蒸馏水中，制备成纳米颗粒混悬液，将打印好的角膜支架浸泡入混悬液中，并用涂覆的方式将混悬液中的细胞外基质颗粒均匀分布于角膜支架表面，4℃下保存备用。
（4）残余角膜微组织化方法的构建：取角膜损伤患者角膜全切除后的残余角膜若干，去除退化变性组织，保留“相对正常”组织备用。将残余角膜组织在无菌条件下转移到超净工作台内，在培养皿里切成小块，然后转移到消毒好的玻璃瓶内，加入2µL质量浓度为0.1%的胶原酶，充分剪碎，制备成均匀的残余角膜组织混悬液，通过300µm直径的滤网过滤，离心，弃掉上清液收集沉淀，在沉淀中加入3mL生物蛋白胶，在无菌条件下，将其注入到被修饰支架材料中。
本实施例制备的人工角膜，拉伸强度为2.3MPa，弹性模量为4.2MPa，完全满足组织工程眼角膜对力学强度的需求。
实施例2
以如下步骤制备人工角膜：
（1）三元共聚材料的合成：按质量百分比取5%-90%的ε-己内酯单体、5%-90%的丙交酯单体和3%-50%的三亚甲基碳酸酯单体为原料投入反应设备中，加入质量为所投入原料质量的0.5%的三丁基氯化锡作为催化剂，抽真空，充氮气，在密闭的聚合设备中，于158℃条件下反应20小时，即可获得分子量为48338的多元共聚物。
（2）打印眼角膜三维支架：以上述三元共聚材料为原料，利用生物打印机，构建人角膜形状的三维立体构，结构体的孔隙直径为250µm，孔隙率为90%，得到可负载细胞的角膜三维支架。打印头直径为200μm，挤出速度为0.028mm/s，打印温度为150℃，打印速度为6mm/s，打印层厚为0.05mm。
（3）利用脱细胞角膜细胞外基质对3D打印支架进行功能修饰：取新鲜的猪眼眼角膜，生理盐水洗净沥干后切成小块，浸泡3%双氧水18h，蒸馏水和三蒸水清洗干净后，将角膜小块超微湿法粉碎，4℃条件下分三次离心，离心时间依次为10min、10min、10min，离心速度依次为3000rmp、6000 rmp、9000rmp；收集沉淀，冷冻干燥制备成干粉4℃下保存，干粉直径为130-150nm。将脱细胞角膜细胞外基质干粉溶于蒸馏水中，制备成纳米颗粒混悬液，将打印好的角膜支架浸泡入混悬液中，用涂覆的方式使混悬液中的细胞外基质颗粒均匀分布于角膜支架表面，4℃下保存备用。
（4）残余角膜微组织化方法的构建：取角膜损伤患者角膜全切除后的残余角膜若干，去除退化变性组织，保留“相对正常”组织备用。将残余角膜组织在无菌条件下转移到超净工作台内，在培养皿里切成小块，然后转移到消毒好的玻璃瓶内，加入3µL质量浓度为0.5%的胶原酶，充分剪碎，制备成均匀的残余角膜组织混悬液，通过300µm直径的滤网过滤，离心，弃掉上清液收集沉淀，在沉淀中加入4mL生物蛋白胶，在无菌条件下，将其注入到被修饰支架材料中。
本实施例制备的人工角膜，拉伸强度为2.68MPa，弹性模量为3.2MPa，完全满足组织工程眼角膜对力学强度的需求。
实施例3
以如下步骤制备人工角膜：
（1）三元共聚材料的合成：按质量百分比取40%的ε-己内酯单体、40%的丙交酯单体和20%的乙二醇单体为原料投入反应设备中，加入所投入原料质量0.5%的乳酸锌作为催化剂，抽真空，充氮气，在密闭的聚合设备中，于160℃条件下反应24h，即可获得分子量为32838的多元共聚物。
（2）打印眼角膜三维支架：以上述三元共聚材料为原料，利用3D生物打印机，构建人角膜形状的三维立体构，结构体的孔隙直径为350µm，孔隙率为90%，得到可负载细胞的角膜三维支架。打印头直径为200μm，挤出速度为0.033mm/s，打印温度为150℃，打印速度为6mm/s，打印层厚为0.01mm。
（3）利用脱细胞角膜细胞外基质对3D打印支架进行功能修饰：取新鲜的猪眼眼角膜，生理盐水洗净沥干后切成小块，浸泡3%的双氧水20小时，蒸馏水和三蒸水清洗干净后，将角膜小块超微湿法粉碎，4℃条件下分三次离心，离心时间依次为15min、15min、20min，离心速度依次为4000rmp、5000 rmp、6000rmp；收集沉淀，冷冻干燥制备成干粉4℃下保存，干粉直径为140-160nm。将一定量的脱细胞角膜细胞外基质干粉溶于蒸馏水中，制备成纳米颗粒混悬液，将打印好的角膜支架浸泡入混悬液中，并用涂覆的方式使混悬液中的细胞外基质颗粒均匀分布于角膜支架表面，4℃下保存备用。
（4）残余角膜微组织化方法的构建：取角膜损伤患者角膜全切除后的残余角膜若干，去除退化变性组织，保留“相对正常”组织备用。将残余角膜在无菌条件下转移到超净工作台内，在培养皿里切成小块，然后转移到消毒好的玻璃瓶内，加入5µL质量浓度为1%的胶原酶，充分剪碎，制备成均匀的残余角膜组织混悬液，通过300µm直径的滤网过滤，离心，弃掉上清液收集沉淀，在沉淀中加入5mL生物蛋白胶，在无菌条件下，将其注入到被修饰支架材料中。
本实施例制备的人工角膜，拉伸强度为2.38MPa，弹性模量为1.6MPa，完全满足组织工程眼角膜对力学强度的需求。
以上实施例仅是本发明若干种优选实施方式中的几种，应当指出，本发明不限于上述实施例；对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。