Fe3O4磁性纳米粒子在制备抗衰老剂中的应用的制作方法

本发明涉及Fe₃O₄磁性纳米粒子的新用途领域，尤其涉及一种Fe₃O₄磁性纳米粒子在制备抗衰老剂中的应用。所述的抗衰老剂可以是食品、药品或保健品。

背景技术：

四氧化三铁是一种具有铁磁性的黑色固体，其化学式为Fe₃O₄。粒度为纳米级别的Fe₃O₄通常被称为Fe₃O₄磁性纳米粒子，其制备方法主要有沉淀法、水热法、溶胶-凝胶法、微乳化法、微波法、热解羰基前躯体法、超声法、空气氧化法、热解-还原法、多元醇还原法等。

Fe₃O₄磁性纳米粒子不仅可以用于磁记录、磁密封和涂料等领域，还可以用于生物医药领域。在现有技术中，Fe₃O₄磁性纳米粒子在生物医药领域已知可用于生物分离、磁热疗、靶向给药、磁共振造影和磁性粒子成像。

目前，已经报道的一个衰老因素是细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的浓度超出生理浓度，这会造成氧化应激、脂质体过度氧化、DNA损坏、蛋白质氧化、线粒体损伤，进而诱导细胞死亡，加速个体衰老，因此只要能够降低或消除细胞内的ROS就可以达到抗衰老的目的。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种Fe₃O₄磁性纳米粒子在生物医药领域的新用途，即在制备抗衰老剂中的应用。

实际上，本发明涉及Fe₃O₄磁性纳米粒子在制备抗衰老剂中的应用，抗衰老剂以Fe₃O₄磁性纳米粒子为活性成分。

优选地，所述的抗衰老剂是可食用营养物质包覆的Fe₃O₄磁性纳米粒子。其中，所述可食用营养物质可以是糖类、脂类、蛋白质、维生素、无机盐或膳食纤维中的至少一种，但最好为叶酸、聚乳酸、胶原蛋白、多肽、透明质酸、淀粉、壳聚糖或大豆卵磷脂中的至少一种。

优选地，Fe₃O₄磁性纳米粒子与可食用营养物质的质量比为1:0.01～1:100。

优选地，抗衰老剂所使用的Fe₃O₄磁性纳米粒子的水力学直径为5～80nm，并且粒径分布不大于15％。

可食用营养物质包覆的Fe₃O₄磁性纳米粒子具有较高的水相稳定性和生物相容性，从而可以使Fe₃O₄磁性纳米粒子进入细胞内；而进入细胞内的Fe₃O₄磁性纳米粒子在一定剂量范围内能够显著降低由双氧水或神经毒素诱导的细胞内ROS水平上升和细胞凋亡，消除细胞内过量氧自由基，缓解由外界刺激、衰老或基因功能异常造成的氧化应激，从而能够起到良好的抗衰老功效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。

图1为本发明所提供的10nm油溶性Fe₃O₄磁性纳米粒子的透射电镜照片。

图2为本发明实施例1所提供的大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子的透射电镜照片。

图3为本发明实施例1所提供的大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子的水力学尺寸统计图。

图4为本发明实施例1所提供的大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子的细胞毒性实验结果图。

图5为本发明实施例1所提供的大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子的流式细胞仪分析的实验结果图。

图6为本发明实施例2所提供的20nm油溶性Fe₃O₄磁性纳米粒子的透射电镜照片。

图7为本发明实施例2所提供的大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄磁性纳米粒子的透射电镜照片。

图8为本发明实施例2所提供的大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄磁性纳米粒子的水力学尺寸统计图。

图9为本发明实施例2所提供的大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄磁性纳米粒子的细胞毒性实验结果图。

图10为本发明实施例2所提供的大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄磁性纳米粒子的流式细胞仪分析的实验结果图。

具体实施方式

下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

下面对本发明所提供的Fe₃O₄磁性纳米粒子在制备抗衰老剂中的应用进行详细描述。

实施例1

10nm油溶性Fe₃O₄磁性纳米粒子的制备：将2mmol乙酰丙酮铁、4mmol油酸和20mL十八烯加入到150mL的三口瓶中，并且边加热边以1600rpm/min的转速磁力搅拌混合均匀；当加热到80℃时，对三口瓶抽真空30min，再向三口瓶内充入氮气，继续升温至300℃，回流1小时进行反应；反应结束后，移除热源，并自然冷却到室温。向反应结束后的产物中加入适量的乙醇，然后以6000rpm/min的转速离心分离10min；取离心分离得到的沉淀物，加入适量的氯仿，使沉淀物溶解，然后以6000rpm/min的转速再次离心分离10min；取再次离心分离得到的上层液体，重复加入乙醇—离心分离—加入氯仿—再次离心分离的过程3次，最后离心分离得到的沉淀物就是油溶性Fe₃O₄磁性纳米粒子，将该油溶性Fe₃O₄磁性纳米粒子倒入一个20mL的样品瓶中备用。由于该油溶性Fe₃O₄磁性纳米粒子的生物相容性不是很好，不便食用，因此需要采用可食用营养物质包覆的Fe₃O₄磁性纳米粒子，以提高Fe₃O₄磁性纳米粒子的生物相容性，例如：可以采用大豆卵磷脂包覆Fe₃O₄磁性纳米粒子。

大豆卵磷脂包覆Fe₃O₄磁性纳米粒子的制备：将本发明实施例1中制得的10nm油溶性Fe₃O₄磁性纳米粒子以及市场购买的大豆卵磷脂一同分散在氯仿中，并在60℃的环境中旋转蒸发，直至氯仿全部蒸发完全，然后加入去离子水超声分散10分钟，从而即可得到大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子而成的磁性水溶胶。

油溶性Fe₃O₄磁性纳米粒子的形貌观察：将本发明实施例1中制得的10nm油溶性Fe₃O₄磁性纳米粒子滴加在300孔的铜网上，自然干燥后采用透射电镜(加速电压为200kV)观测其粒子的大小和形态，从而可以得到如图1所示的透射电镜照片。由图1可以看出：该油溶性Fe₃O₄磁性纳米粒子的尺寸为10nm左右，大小形貌均一。

大豆卵磷脂包覆Fe₃O₄磁性纳米粒子的形貌观察：将本发明实施例1中制得的大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子滴加在300孔的铜网上，自然干燥后采用透射电镜(加速电压为200kV)观测其粒子的大小和形态，从而可以得到如图2所示的透射电镜照片。对本发明实施例1中制得的大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子进行水力学尺寸统计，从而可以得到如图3所示的水力学尺寸统计图。由图2和图3可以看出：本发明实施例1中制得的大豆卵磷脂包覆Fe₃O₄磁性纳米粒子的尺寸为10nm左右，大小形貌均一，尺寸分布窄，而且在水中具有较好的单分散性。

生物毒性试验：本发明实施例1中Fe₃O₄磁性纳米粒子与大豆卵磷脂可以采用不同的质量比，从而可以制得Fe浓度不同的大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子。将不同Fe浓度的大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子与人的子宫颈细胞共培养，然后采用CellCounting Kit-8(CCK-8)来检测其生物毒性，从而可以得到如图4所示的细胞毒性实验结果图。由图4可以看出：培养时间为24小时后，在浓度为12.5μg/mL到200μg/mL的Fe之间，本发明实施例1中制得的大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子均有很好的生物相容性，细胞的毒性仍然很弱，细胞的活性约为1；大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子具有非常高的生物相容性，尤其是在用Fe浓度高的大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄纳米颗粒去培养子宫颈细胞时生物相容性更好。

抗衰老试验：对本发明实施例1中制得的大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子进行抗衰老试验：将人体子宫颈细胞种在6孔板中，每个孔种3×10⁴个细胞，并且在37℃和5％CO₂的细胞培养箱中过夜培养，待细胞贴壁后向6孔板中加入100μg/mL本发明实施例1中制得的大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子，共培养24小时；再向6孔板中加入800μM的双氧水继续共培养20小时；然后将细胞收集起来，用磷酸缓冲液PBS洗三次，接着用100μL的2,7-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)给细胞染色，20分钟后染色结束，用DMEM细胞培养液洗两次，再用流式细胞仪检测细胞内的ROS水平，从而可以得到如图5所示的流式细胞仪分析的实验结果图；其中，图5中的“Ctrl”表示未加入双氧水而只有人体子宫颈细胞和大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子进行共培养的，“Fe₃O₄+H₂O₂”表示人体子宫颈细胞、大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子以及双氧水这三者进行共培养的，“H₂O₂”表示未加入大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子而只有人体子宫颈细胞和双氧水进行共培养的。由图5可以看出：“H₂O₂”组的细胞内ROS水平最高，当加入大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子后，Fe₃O₄磁性纳米粒子能够起到类似过氧化氢酶的作用，使细胞内ROS水平大幅降低。

由此可见，本发明实施例1中制得的大豆卵磷脂包覆10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子具有较高的水相稳定性和生物相容性，可以使Fe₃O₄磁性纳米粒子进入细胞内；而进入细胞内的Fe₃O₄磁性纳米粒子在一定剂量范围内能够显著降低由双氧水或神经毒素诱导的细胞内ROS水平上升和细胞凋亡，消除细胞内过量氧自由基，缓解由外界刺激、衰老或基因功能异常造成的氧化应激，从而能够起到良好的抗衰老功效。

实施例2

20nm油溶性Fe₃O₄磁性纳米粒子的制备：将2mmol乙酰丙酮铁、6mmol油酸、6mmol油胺和20mL十八烯加入到150mL的三口瓶中，并且边加热边以1600rpm/min的转速磁力搅拌混合均匀；当加热到80℃时，对三口瓶抽真空30min，再向三口瓶内充入氮气，继续升温至200℃，保温30分钟，然后升温至300℃，回流30分钟进行反应；反应结束后，移除热源，并自然冷却到室温。向反应结束后的产物中加入适量的乙醇，然后以6000rpm/min的转速离心分离10min；取离心分离得到的沉淀物，加入适量的氯仿，使沉淀物溶解，然后以6000rpm/min的转速再次离心分离10min；取再次离心分离得到的上层液体，重复加入乙醇—离心分离—加入氯仿—再次离心分离的过程3次，最后离心分离得到的沉淀物就是Fe₃O₄磁性纳米粒子，将该油溶性Fe₃O₄磁性纳米粒子倒入一个20mL的样品瓶中备用。由于该油溶性Fe₃O₄磁性纳米粒子的生物相容性不是很好，不便食用，因此需要采用可食用营养物质包覆的Fe₃O₄磁性纳米粒子，以提高Fe₃O₄磁性纳米粒子的生物相容性，例如：可以采用大豆卵磷脂包覆Fe₃O₄磁性纳米粒子。

大豆卵磷脂包覆Fe₃O₄磁性纳米粒子的制备：将本发明实施例2中制得的20nm油溶性Fe₃O₄磁性纳米粒子以及市场购买的大豆卵磷脂一同分散在氯仿中，并在50℃的环境中旋转蒸发，直至氯仿全部蒸发完全，然后加入去离子水超声分散10分钟，从而即可得到大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄磁性纳米粒子而成的磁性水溶胶。

油溶性Fe₃O₄磁性纳米粒子的形貌观察：将本发明实施例2中制得的20nm油溶性Fe₃O₄磁性纳米粒子滴加在300孔的铜网上，自然干燥后采用透射电镜(加速电压为200kV)观测其粒子的大小和形态，从而可以得到如图6所示的透射电镜照片。由图6可以看出：该油溶性Fe₃O₄磁性纳米粒子的尺寸为20nm左右，大小形貌均一。

大豆卵磷脂包覆Fe₃O₄磁性纳米粒子的形貌观察：将本发明实施例2中制得的大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄磁性纳米粒子滴加在亲水性300孔的铜网上，自然干燥后采用透射电镜(加速电压为200kV)观测其粒子的大小和形态，从而可得到如图7所示的透射电镜照片。对本发明实施例2中制得的大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄磁性纳米粒子进行水力学尺寸统计，从而可以得到如图8所示的水力学尺寸统计图。由图7和图8可以看出：本发明实施例2中制得的大豆卵磷脂包覆Fe₃O₄磁性纳米粒子的尺寸为20nm左右，大小形貌均一，尺寸分布窄，而且在水中具有较好的单分散性。

生物毒性试验：本发明实施例2中Fe₃O₄磁性纳米粒子与大豆卵磷脂可以采用不同的质量比，从而可以制得Fe浓度不同的大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄磁性纳米粒子。将不同Fe浓度的大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄磁性纳米粒子与人的子宫颈细胞共培养，然后采用CellCounting Kit-8(CCK-8)来检测其生物毒性，从而可以得到如图9所示的细胞毒性实验结果图。由图9可以看出：培养时间为24小时后，在浓度为15.5μg/mL到200μg/mL的Fe之间，本发明实施例2中制得的大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄磁性纳米粒子均有很好的生物相容性，细胞的毒性仍然很弱，细胞的活性约为1；大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄磁性纳米粒子具有非常高的生物相容性，尤其是在用Fe浓度高的大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄纳米颗粒去培养子宫颈细胞时生物相容性更好。

抗衰老试验：对本发明实施例2中制得的大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄磁性纳米粒子进行抗衰老试验：将人体子宫颈细胞种在6孔板中，每个孔种3×10⁴个细胞，并且在37℃和5％CO₂的细胞培养箱中过夜培养，待细胞贴壁后向6孔板中加入100μg/mL本发明实施例2中制得的大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄磁性纳米粒子，共培养24小时；再向6孔板中加入800μM的双氧水继续共培养20小时；然后将细胞收集起来，用磷酸缓冲液PBS洗三次，接着用100μL的2,7-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)给细胞染色，20分钟后染色结束，用DMEM细胞培养液洗两次，再用流式细胞仪检测细胞内的ROS水平，从而可以得到如图10所示的流式细胞仪分析的实验结果图；其中，图10中的“Ctrl”表示未加入双氧水而只有人体子宫颈细胞和大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄磁性纳米粒子进行共培养的，“Fe₃O₄+H₂O₂”表示人体子宫颈细胞、大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄磁性纳米粒子以及双氧水这三者进行共培养的，“H₂O₂”表示未加入大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄磁性纳米粒子而只有人体子宫颈细胞和双氧水进行共培养的。由图10可以看出：“H₂O₂”组的细胞内ROS水平最高，当加入大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄磁性纳米粒子后，Fe₃O₄磁性纳米粒子能够起到类似过氧化氢酶的作用，使细胞内ROS水平大幅降低。

由此可见，本发明实施例2中制得的大豆卵磷脂包覆20nm Fe₃O₄磁性纳米粒子具有较高的水相稳定性和生物相容性，可以使Fe₃O₄磁性纳米粒子进入细胞内；而进入细胞内的Fe₃O₄磁性纳米粒子在一定剂量范围内能够显著降低由双氧水或神经毒素诱导的细胞内ROS水平上升和细胞凋亡，消除细胞内过量氧自由基，缓解由外界刺激、衰老或基因功能异常造成的氧化应激，从而能够起到良好的抗衰老功效。

综上可见，可食用营养物质包覆的Fe₃O₄磁性纳米粒子具有较高的水相稳定性和生物相容性，可以使Fe₃O₄磁性纳米粒子进入细胞内；而进入细胞内的Fe₃O₄磁性纳米粒子在一定剂量范围内能够显著降低由双氧水或神经毒素诱导的细胞内ROS水平上升和细胞凋亡，消除细胞内过量氧自由基，缓解由外界刺激、衰老或基因功能异常造成的氧化应激，从而能够起到良好的抗衰老功效。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。