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本申请要求2015年3月10日提交的美国临时申请号62/131,227的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。
本发明提供涉及或源自抗psma(前列腺特异性膜抗原)抗体的组合物和方法。更具体地，本发明提供结合psma的全人抗体，这样的抗体的psma抗体结合片段和衍生物，以及包含这样的片段的psma结合多肽。此外，本发明提供编码这样的抗体、抗体片段和衍生物、和多肽的核酸，包含这样的多核苷酸的细胞，制备这样的抗体、抗体片段和衍生物、和多肽的方法，以及使用这样的抗体、抗体片段和衍生物、和多肽的方法，包括治疗疾病的方法。本公开还提供用于治疗前列腺癌的靶向治疗，其具有靶向所述治疗剂或细胞的所公开的抗psma抗体及其片段。
背景技术：
前列腺癌是最常见的癌症类型，并且是美国男性死于癌症的第二主要原因(landis,s.h.等，cacancerj.clin.48:6-29(1998))。诊断为患有前列腺癌的男性人数由于老年男性人口逐渐增加以及对该疾病更多的认识导致其更早期的诊断而稳定增加(parker等，1997，cacancerj.clin.47:5-280)。男性发生前列腺癌的寿命风险对于白种人约为5人中的1人，对于非裔美国人中约为6人中的1人。高风险群体由具有阳性前列腺癌家族史的那些或非裔美国人代表。
在一生中，诊断为患有前列腺癌的男性中超过2/3死于该疾病(wingo等，1996，cacancerj.clin.46:113-25)。此外，许多未死于前列腺癌的患者需要持续治疗以减轻症状，例如疼痛，出血和尿路梗阻。因此，前列腺癌也代表痛苦的主要原因，并增加医疗保健支出。
放射治疗也已被用作根治性前列腺切除术的替代方式。通过放疗治疗的患者通常是年龄较大且较不健康的那些，以及具有更高等级的、更加临床进展的肿瘤的那些。特别优选的程序是外粒子束治疗，其涉及三维共聚焦放疗，其中辐射场被设计成符合被处理的组织的体积；间质放疗，其中使用超声引导植入放射性化合物种子；以及外粒子束治疗和间质放疗的组合。
对于局部晚期疾病患者的治疗，已经采用在根治性前列腺切除术或放疗之前或之后的激素治疗。激素治疗是治疗患有播散性前列腺癌的男性的主要形式。睾丸切除术降低血清睾酮浓度，而雌激素治疗是类似地有益的。来自雌激素的二乙基己烯雌酚是另一种有用的激素治疗，其具有引起心血管毒性的缺点。当施用促性腺激素释放激素激动剂时，睾酮浓度最终被降低。氟他胺和其他非甾体抗雄激素剂阻断睾酮与其细胞内受体的结合。结果，它阻止睾酮的作用，增加血清睾酮浓度，并允许患者保持有性交能力(potent)，其是在根治性前列腺切除术和放疗后的一个重大问题。
细胞毒性化疗在治疗前列腺癌方面几乎无效。其毒性使这样的治疗不适合老年患者。此外，前列腺癌相对耐受细胞毒性剂。
复发或更晚期的疾病也用抗雄激素疗法治疗。不幸的是，在没有任何有效治疗的情况下，几乎所有的肿瘤都变得耐受激素且迅速进展。
因此，需要对前列腺癌有效的治疗剂，其对于患者的正常组织没有压倒性的毒性，并且其有效地选择性消除前列腺癌细胞。
技术实现要素：
本发明涉及能够结合前列腺特异性膜抗原(psma)(例如，人psma)的结合蛋白，包括抗psma抗体，及其抗原结合片段。
在一个方面，本发明提供结合psma表位的igg种类的分离的全人抗psma抗体，所述抗体包含与氨基酸序列seqidno:1至少95％相同的重链可变结构域序列，和与选自以下的氨基酸序列至少95％相同的轻链可变结构域序列：seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:5，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:8，seqidno:9，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:12，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:15，seqidno:16和seqidno:17。
在另一个方面，本发明提供以至少10-6m的结合亲和力结合psma表位的igg种类的全人抗体，其包含与氨基酸序列seqidno:1至少95％相同的重链可变结构域序列，并且包含与以下氨基酸序列至少95％相同的轻链可变结构域序列：seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:5，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:8，seqidno:9，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:12，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:15，seqidno:16和seqidno:17。在一个实施方式中，所述全人抗体包含重链和轻链二者，其中所述抗体具有选自以下的重链/轻链可变结构域序列：seqidno:1/seqidno:2(在本文中称为psa11)，seqidno:1/seqidno:3(在本文中称为psgb11)，seqidno:1/seqidno:4(在本文中称为psgb12)，seqidno:1/seqidno:5(在本文中称为psgc8)，seqidno:1/seqidno:6(在本文中称为psgc9)，seqidno:1/seqidno:7(在本文中称为psgc12)，seqidno:1/seqidno:8(在本文中称为psgd3)，seqidno:1/seqidno:9(在本文中称为psgd4)，seqidno:1/seqidno:10(在本文中称为psgd6)，seqidno:1/seqidno:11(在本文中称为psge10)，seqidno:1/seqidno:12(在本文中称为psge11)，seqidno:1/seqidno:13(在本文中称为psgf9)，seqidno:1/seqidno:14(在本文中称为psgf11)，seqidno:1/seqidno:15(在本文中称为psgg6)，seqidno:1/seqidno:16(在本文中称为psgh3)，seqidno:1/seqidno:17(在本文中称为psgh8)。
在另一个方面，本发明提供抗psmafab全人抗体片段，其具有来自重链的可变结构域区和来自轻链的可变结构域区，其中重链可变结构域包含与seqidno:1的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，并且包含与选自以下的氨基酸序列至少95％相同的轻链可变结构域序列：seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:5，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:8，seqidno:9，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:12，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:15，seqidno:16和seqidno:17。在一个实施方式中，所述全人抗体fab片段包含重链可变结构域区和轻链可变结构域区二者，其中所述抗体具有选自以下的重链/轻链可变结构域序列：seqidno:1/seqidno:2，seqidno:1/seqidno:3，seqidno:1/seqidno:4，seqidno:1/seqidno:5，seqidno:1/seqidno:6，seqidno:1/seqidno:7，seqidno:1/seqidno:8，seqidno:1/seqidno:9，seqidno:1/seqidno:10，seqidno:1/seqidno:11，seqidno:1/seqidno:12，seqidno:1/seqidno:13，seqidno:1/seqidno:14，seqidno:1/seqidno:15，seqidno:1/seqidno:16和seqidno:1/seqidno:17。
在另一个方面，本发明提供抗psma单链人抗体，其包含来自重链的可变结构域区和来自轻链的可变结构域区和连接重链与轻链可变结构域区的肽接头，其中重链可变结构域包含与seqidno:1的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，并且轻链可变结构域序列与选自以下的氨基酸序列至少95％相同：seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:5，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:8，seqidno:9，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:12，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:15，seqidno:16和seqidno:17。在一个实施方式中，所述单链全人抗体包含重链可变结构域区和轻链可变结构域区二者，其中所述单链全人抗体包含选自以下的重链/轻链可变结构域序列：seqidno:1/seqidno:2，seqidno:1/seqidno:3，seqidno:1/seqidno:4，seqidno:1/seqidno:5，seqidno:1/seqidno:6，seqidno:1/seqidno:7，seqidno:1/seqidno:8，seqidno:1/seqidno:9，seqidno:1/seqidno:10，seqidno:1/seqidno:11，seqidno:1/seqidno:12，seqidno:1/seqidno:13，seqidno:1/seqidno:14，seqidno:1/seqidno:15，seqidno:1/seqidno:16和seqidno:1/seqidno:17。
在一个实施方式中，本发明的特征在于分离的抗psma抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含seqidno.1中的互补决定区(cdr)；并且包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含选自以下的轻链可变区氨基酸序列中的cdr：seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:5，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:8，seqidno:9，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:12，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:15，seqidno:16和seqidno:17。在一个实施方式中，所述分离的抗psma抗体或其抗原结合片段是人类。
本发明还提供用于治疗前列腺癌的方法，其包括施用用于靶向化学或细胞治疗载荷的抗psma抗体，其中所述抗psma抗体具有与氨基酸序列seqidno.1至少95％相同的重链可变结构域序列，并且具有与以下氨基酸至少95％相同的轻链可变结构域序列：seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:5，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:8，seqidno:9，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:12，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:15，seqidno:16，seqidno:17，及其组合。
本发明还提供用于治疗前列腺癌的方法，其包括施用用于靶向化学或细胞治疗载荷的抗psma抗体fab全人片段，其中所述fab全人抗体片段包含与氨基酸序列seqidno.1至少95％相同的重链可变结构域序列，并且包含与选自以下的氨基酸序列至少95％相同的轻链可变结构域序列：seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:5，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:8，seqidno:9，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:12，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:15，seqidno:16，seqidno:17。
本发明还提供用于治疗前列腺癌的方法，其包括施用用于靶向化学或细胞治疗载荷的抗psma单链人抗体，其中所述抗psma抗体单链人抗体包含与氨基酸序列seqidno.1至少95％相同的重链可变结构域序列，并且包含与以下氨基酸序列至少95％相同的轻链可变结构域序列：seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:5，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:8，seqidno:9，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:12，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:15，seqidno:16，seqidno:17。
在一个实施方式中，所述全人抗体包含重链和轻链二者，其中所述抗体具有选自以下的重链/轻链可变结构域序列：seqidno:1/seqidno:2(在本文中称为psa11)，seqidno:1/seqidno:3(在本文中称为psgb11)，seqidno:1/seqidno:4(在本文中称为psgb12)，seqidno:1/seqidno:5(在本文中称为psgc8)，seqidno:1/seqidno:6(在本文中称为psgc9)，seqidno:1/seqidno:7(在本文中称为psgc12)，seqidno:1/seqidno:8(在本文中称为psgd3)，seqidno:1/seqidno:9(在本文中称为psgd4)，seqidno:1/seqidno:10(在本文中称为psgd6)，seqidno:1/seqidno:11(在本文中称为psge10)，seqidno:1/seqidno:12(在本文中称为psge11)，seqidno:1/seqidno:13(在本文中称为psgf9)，seqidno:1/seqidno:14(在本文中称为psgf11)，seqidno:1/seqidno:15(在本文中称为psgg6)，seqidno:1/seqidno:16(在本文中称为psgh3)和seqidno:1/seqidno:17(在本文中称为psgh8)。在一个实施方式中，所述单链全人抗体具有重链可变结构域区和轻链可变结构域区二者，其中所述单链全人抗体具有选自以下的重链/轻链可变结构域序列：seqidno:1/seqidno:2，seqidno:1/seqidno:3，seqidno:1/seqidno:4，seqidno:1/seqidno:5，seqidno:1/seqidno:6，seqidno:1/seqidno:7，seqidno:1/seqidno:8，seqidno:1/seqidno:9，seqidno:1/seqidno:10，seqidno:1/seqidno:11，seqidno:1/seqidno:12，seqidno:1/seqidno:13，seqidno:1/seqidno:14，seqidno:1/seqidno:15，seqidno:1/seqidno:16和seqidno:1/seqidno:17。
本发明还在另一方面提供用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的方面或实施方式中的任一者的抗psma抗体或抗体片段。在一个实施方式中，所述癌症选自卵巢癌，结肠癌，乳腺癌，肺癌，骨髓瘤，神经母细胞衍生cns肿瘤，单核细胞白血病，b细胞衍生白血病，t细胞衍生白血病，b细胞衍生淋巴瘤，t细胞衍生淋巴瘤和肥大细胞衍生肿瘤。
在某些实施方式中，所述抗psma抗体用于治疗广谱哺乳动物癌症，其包括，例如，卵巢癌，结肠癌，乳腺癌，肺癌，骨髓瘤，神经母细胞衍生cns肿瘤，单核细胞白血病，b细胞衍生白血病，t细胞衍生白血病，b细胞衍生淋巴瘤，t细胞衍生淋巴瘤，肥大细胞衍生肿瘤，及其组合。
本发明还在另一方面提供用于治疗前列腺癌的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的方面或实施方式中的任一者的抗psma抗体或抗体片段。
在某些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段具有至少1×10-6m的结合亲和力(kd)。在其它实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段具有至少1×10-7m的kd。在其它实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段具有至少1×10-8m的kd。
在某些实施方式中，所述抗体是igg1同种型。在其它实施方式中，所述抗体是igg4同种型。
在某些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段是重组的。
在某些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段是人抗体，或抗体的抗原结合片段。
本发明还提供药物组合物，其包含有效量的本文公开的抗psma抗体或片段，和药学上可接受的载体。
附图说明
图1a至1d图示抗psma抗体与psma阳性细胞(lncap)的结合(如图1a和1b所述)，以及与psma阴性正常人成纤维细胞(pc3)(如图1c和1d所述)的结合。
图2a至2c说明与在过表达psma的lncap癌细胞上的蛋白g(pg)-mmaf分子复合的抗psma抗体psgf9，psgc9，psgd6(图2a所示)；psgd3，psge10，psgh3，psgb11(图2b所示)；和psgd4和psgb12(图2c所示)的细胞毒性潜力。
图2d说明用与蛋白g-mmaf分子复合的各种抗psma抗体在正常人成纤维细胞(pc3)上观察到的非特异性细胞杀伤作用。
图3图示抗psma抗体psa11的亲和结合特性。
图4图示抗psma抗体psgb11的亲和结合特征。
具体实施方式
定义
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”各自是指包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基的分子。这些术语包括例如天然和人造蛋白质、蛋白质序列的蛋白质片段和多肽类似物(例如突变蛋白、变体和融合蛋白)以及翻译后或在其他方面共价或非共价修饰的蛋白质。肽、多肽或蛋白质可以是单体的或聚合的。
多肽的“变体”(例如，抗体的变体)包含氨基酸序列，其中相对于另一个多肽序列，一个或多个氨基酸残基被插入到该氨基酸序列中、被从该氨基酸序列删除，和/或被置换到该氨基酸序列中。公开的变体包括例如融合蛋白。
多肽的“衍生物”是已经化学修饰的多肽(例如，抗体)，例如通过缀合到另一化学部分(例如聚乙二醇或白蛋白，例如人血清白蛋白)，磷酸化和糖基化。除非另有说明，术语“抗体”除了包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体以外，还包括其衍生物，变体，片段和突变蛋白，其实例如下所述。
“抗原结合蛋白”是包含结合抗原的部分和，任选地，允许抗原结合部分采取促进抗原结合蛋白与抗原结合的构型的支架或框架部分的蛋白质。抗原结合蛋白的实例包括抗体，抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)，抗体衍生物和抗体类似物。抗原结合蛋白可以包含例如具有移植的cdr或cdr衍生物的替代性蛋白支架或人造支架。这样的支架包括但不限于包含被引入以例如稳定抗原结合蛋白的三维结构的突变的抗体衍生支架以及包含例如生物相容性聚合物的全合成支架。参见，例如，korndorfer等，2003，proteins:structure,function,andbioinformatics，第53卷，第1期:121-129；roque等，2004，biotechnol.prog.20:639-654。此外，可以使用肽抗体模拟物(“pam”)，以及利用纤维连接蛋白成分作为支架的基于抗体模拟物的支架。
抗原结合蛋白可以具有例如免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”是由相同的两对多肽链组成的四聚体分子，每对具有一个“轻”链(约25kda)和一个“重”链(约50-70kda)。每条链的氨基末端部分包含主要负责抗原识别的具有约100至110个或更多个氨基酸的可变区。每个链的羧基末端部分定义主要负责效应子功能的恒定区。人类轻链被分类为κ或λ轻链。重链被分类为μ，δ，γ，α或ε，并分别将抗体的同种型定义为igm，igd，igg，iga和ige。优选地，本文公开的抗psma抗体的特征在于其重vh和轻vl氨基酸序列中的可变结构域区序列。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过具有约12个或更多个氨基酸的“j”区连接，重链还包含具有约10或更多个氨基酸的“d”区。通常参见，fundamentalimmunologych.7(paul,w.编辑，第2版，ravenpress，n.y.(1989))。每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点，使得完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。
免疫球蛋白链的可变区显示出由也称为互补决定区或cdr的三个高变区连接的相对保守的框架区(fr)的相同通用结构。从n端到c端，轻链和重链二者都包含结构域fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3和fr4。氨基酸分配到每个结构域是根据kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，usdept.ofhealthandhumanservices，phs，nih，nihpublicationno.91-3242，1991中的定义。用于免疫球蛋白链中的氨基酸的其他编号系统包括imgt.rtm.(国际immunogenetics信息系统；lefranc等，dev.comp.immunol.29:185-203；2005)和aho(honegger和pluckthun，j.mol.biol.39(3):657-670；2001)。
除非另有规定，否则“抗体”是指完整免疫球蛋白或指其与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合部分。在一个实施方式中，抗体包含两个相同重链，所述重链各自包含重链可变结构域和重链恒定区ch1，ch2和ch3；并且包含两个相同轻链，所述轻链各自包含轻链可变结构域和轻链恒定区(cl)。在一个实施方式中，本发明的抗体包含选自表3所述的那些的重链和轻链可变结构域序列。
在某些实施方式中，抗体可以从含有具有不同抗原特异性的免疫球蛋白的来源例如血清或血浆获得。如果这样的抗体进行亲和纯化，则可以根据特定的抗原特异性富集它们。这种抗体富集制备物通常由小于约10％的具有针对特定抗原的特异性结合活性的抗体构成。使这些制备物进行多轮亲和纯化可以增加对该抗原具有特异性结合活性的抗体的比例。以这种方式制备的抗体通常被称为是“单特异性的”。
如本文所用，术语“单特异性的”是指显示对一种特定表位的亲和力的抗体。单特异性抗体制备物可以由约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，99％，或99.9％的具有针对特定抗原的特异性结合活性的抗体构成。
在某些实施方式中，抗原结合蛋白，例如抗体，可以具有一个或多个结合位点。如果存在多于一个结合位点，则结合位点可以彼此相同或可以不同。例如，天然存在的人免疫球蛋白通常具有两个相同结合位点，而“双特异性”或“双功能”抗体具有两个不同结合位点。
“抗体片段”或“抗体的抗原结合片段”包含完整抗体的一部分，并且优选包含抗体抗原结合或可变结构域。抗体片段的实例包括fab，fab'，f(ab')2，fv片段和线性抗体。
抗体的抗原结合部分(或片段)可以通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。抗原结合部分包括，尤其是，fab，fab'，f(ab')2，fv，结构域抗体(dab)和互补决定区(cdr)片段，单链抗体(scfv)，嵌合抗体，双抗体，三抗体，四抗体和含有免疫球蛋白的至少一部分的多肽，所述至少一部分足以赋予该多肽以特异性抗原结合。
fab片段是具有vl，vh，cl和ch1结构域的单价片段；f(ab')2片段是具有在铰链区通过二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；fd片段具有vh和ch1结构域；fv片段具有抗体的单臂的vl和vh结构域；并且dab片段具有vh结构域，vl结构域，或者vh或vl结构域的抗原结合片段(美国专利6,846,634；6,696,245，美国申请公布20/0202512；2004/0202995；2004/0038291；2004/0009507；2003/0039958和ward等，nature341:544-546，1989)。
单链抗体(scfv)是其中vl和vh区通过接头(例如，氨基酸残基的合成序列)连接以形成连续蛋白链的抗体，其中所述接头足够长以允许蛋白质链自身折叠并形成单价抗原结合位点(参见，例如，bird等，1988，science242:423-26和huston等，1988，proc.natl.acad.sci.usa，85:5879-83)。
双抗体是包含两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包含通过接头连接的vh和vl结构域，所述接头太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对，从而允许每个结构域与另一条多肽链上的互补结构域配对(参见，例如，holliger等，1993，proc.natl.acad.sci.usa90:6444-48，和poljak等，1994，structure2:1121-23)。如果双抗体的两条多肽链相同，则由其配对产生的双抗体将具有两个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可用于制备具有两个不同抗原结合位点的双抗体。类似地，三抗体和四抗体分别是包含三条和四条多肽链的抗体，并分别形成可以相同或不同的三个和四个抗原结合位点。
术语“人抗体”包括具有衍生自人免疫球蛋白序列的一个或多个可变区和恒定区的抗体。在一个实施方式中，抗体的所有可变和恒定结构域都衍生自人免疫球蛋白序列(称为“全人抗体”)。这些抗体可以以各种方式制备，其实例如下所述，包括通过用感兴趣的抗原对经遗传修饰以表达衍生自人重链和/或轻链编码基因的抗体的小鼠进行免疫。在优选实施方式中，使用重组方法制备全人抗体，使得抗体的糖基化模式与具有相同序列的抗体(如果其存在于自然界中)不同。
“人源化抗体”具有与衍生自非人物种的抗体的序列相差一个或多个氨基酸置换、缺失和/或添加的序列，使得在其被施用于人受试者时，人源化抗体与非人物种抗体相比，更不可能诱导免疫应答，和/或诱导更不严重的免疫应答。在一个实施方式中，非人物种抗体的重链和/或轻链的框架和恒定结构域中的某些氨基酸被突变以产生人源化抗体。在另一个实施方式中，来自人抗体的恒定结构域与非人物种的可变结构域融合。在另一个实施方式中，非人抗体的一个或多个cdr序列中的一个或多个氨基酸残基被改变以减少非人抗体在其被施用于人受试者时的可能免疫原性，其中被改变的氨基酸残基对于抗体对其抗原的免疫特异性结合不是关键的，或者对氨基酸序列造成的变化是保守变化，使得人源化抗体与抗原的结合不显著差于非人抗体与抗原的结合。如何制备人源化抗体的实例可见于美国专利6,054,297，5,886,152和5,877,293。
术语“嵌合抗体”是指含有来自一种抗体的一个或多个区域和来自一种或多种其它抗体的一个或多个区域的抗体。在一个实施方式中，cdr中的一个或多个衍生自人抗psma抗体。在另一个实施方式中，所有cdr都衍生自人抗psma抗体。在另一个实施方式中，来自多于一种人抗psma抗体的cdr在嵌合抗体中混合并匹配。例如，嵌合抗体可以包含来自第一人抗par-2抗体的轻链的cdr1，来自第二人抗psma抗体的轻链的cdr2和cdr3，以及来自第三抗psma抗体的重链的cdr。其他组合是可能的。
此外，框架区可以衍生自相同抗psma抗体之一，衍生自一种或多种不同抗体，例如人抗体，或者衍生自人源化抗体。在嵌合抗体的一个实例中，重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体相同、同源、或衍生自其，而链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体相同、同源、或衍生自其。还包括的是表现出期望生物活性(即特异性结合psma的能力)的这样的抗体的片段。
“中和性抗体”或“抑制性抗体”是使用试验如本文实施例中所述的那些，当过量的抗psma抗体将活化量减少至少约20％时，抑制psma的蛋白水解活化的抗体。在各种实施方式中，抗原结合蛋白将psma的蛋白水解活化的量减少至少30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，99％和99.9％。
“cdr移植抗体”是包含衍生自特定物种或同种型的抗体的一个或多个cdr和相同或不同物种或同种型的另一抗体的框架的抗体。
“多特异性抗体”是识别一个或多个抗原上的多于一个表位的抗体。这种类型的抗体的亚类是识别相同或不同抗原上的两个不同表位的“双特异性抗体”。
如果抗原结合蛋白以1纳摩尔或更低的解离常数结合抗原(例如psma)，则其“特异性结合”该抗原。
“抗原结合结构域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”是含有与抗原相互作用并有助于抗原结合蛋白对该抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基(或其他部分)的抗原结合蛋白的一部分。对于特异性结合其抗原的抗体，这将包含其cdr结构域中的至少一个的至少部分。
术语“fc多肽”包括衍生自抗体的fc区的多肽的天然和突变蛋白形式。还包括含有促进二聚化的铰链区的这样的多肽的截短形式。包含fc部分(和由其形成的寡聚体)的融合蛋白提供容易通过在蛋白a或蛋白g柱上进行亲和色谱法纯化的优点。
“表位”是由抗原结合蛋白(例如抗体)结合的分子的部分。表位可以包含分子的不连续部分(例如，在多肽中，在多肽的一级序列中不连续，但在多肽的三级和四级结构的情况下彼此足够接近以被抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。
通过使用默认参数，使用gap计算机程序(gcgwisconsinpackage的一部分，10.3版(accelrys，sandiego，calif.))比较序列，测定两个多核苷酸或两个多肽序列的“百分比同一性”或“百分比同源性”。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可全文互换使用，并且包括dna分子(例如cdna或基因组dna)，rna分子(例如mrna)，使用核苷酸类似物产生的dna或rna的类似物(例如肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)，及其杂交物。核酸分子可以是单链或双链的。在一个实施方式中，本发明的核酸分子包含编码抗体或其片段，衍生物，突变蛋白或变体的连续开放阅读框。
如果两个单链多核苷酸的序列可以在反向平行方向上对准，使得一个多核苷酸中的每个核苷酸都与其在其他多核苷酸中的互补核苷酸相反，而不引入间隙，并且在每一序列的5'或3'端没有未成对核苷酸，则它们是彼此的“补体”。如果两个多核苷酸可以在适度严格的条件下彼此杂交，则多核苷酸与另一多核苷酸“互补”。因此，多核苷酸可以与另一多核苷酸互补而不是其补体。
“载体”是可用于将与其连接的另外的核酸引入细胞的核酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以连接另外的核酸片段的线性或圆形双链dna分子。另一种类型的载体是病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其中可将另外的dna片段引入病毒基因组。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。“表达载体”是可以指导选定多核苷酸的表达的一种载体。
如果调控序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达的水平、时机或位置)，则核苷酸序列被“可操作地连接”到调控序列。“调控序列”是影响其可操作地连接的核酸的表达(例如，表达的水平、时机或位置)的核酸。调控序列可以例如直接对所调控的核酸发挥其作用，或者通过一种或多种其它分子(例如结合调控序列和/或核酸的多肽)的作用发挥其作用。调控序列的实例包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。调控序列的另一些实例描述于例如goeddel，1990，geneexpressiontechnology:methodsinenzymology185，academicpress，sandiego，calif.和baron等，1995，nucleicacidsres.23:3605-06。
“宿主细胞”是可用于表达核酸(例如本发明的核酸)的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌，或者它可以是真核生物，例如单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)，植物细胞(例如烟草或番茄植物细胞)，动物细胞(例如人细胞，猴细胞，仓鼠细胞，大鼠细胞，小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的实例包括猴肾细胞的cos-7系(atcccrl1651)(参见gluzman等，1981，cell23:175)，l细胞，c127细胞，3t3细胞(atccccl163)，中国仓鼠卵巢(cho)细胞或其衍生物如素食cho(veggiecho)和在无血清培养基中生长的相关细胞系(参见rasmussen等，1998，cytotechnology28:31)或cho品系dx-b11，其具有dhfr缺陷(参见urlaub等，1980，proc.natl.acad.sci.usa77:4216-20)，hela细胞，bhk(atcccrl10)细胞系，衍生自非洲绿猴肾细胞系cv1的cv1/ebna细胞系(atccccl70)(参见mcmahan等，1991，emboj.10:2821)，人胚肾细胞如293,293ebna或msr293，人表皮a431细胞，人colo205细胞，其他转化灵长动物细胞系，正常二倍体细胞，衍生自原代组织的体外培养物的细胞品系，原代外植体，hl-60，u937，hak或jurkat细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，但不是人宿主细胞。通常，宿主细胞是可以用编码多肽的核酸转化或转染的培养细胞，其可以在宿主细胞中表达。短语“重组宿主细胞”可用于表示已经用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞还可以是包含核酸，但除非调控序列被引入宿主细胞，使得调控序列变得与核酸可操作地连接，否则不以期望水平表达核酸的细胞。应当理解，术语宿主细胞不仅指特定的受试细胞，而且还指这样的细胞的后代或潜在后代。因为由于例如突变或环境影响，在后续世代中可能发生某些修饰，所以这样的后代实际上可能不与母细胞相同，但仍被包括在本文所用术语的范围内。
术语“重组抗体”是指根据标准重组表达方法制备的抗体。重组抗体可以例如从用包含抗体的编码序列的表达载体(或可能多于一种表达载体)转染的细胞或细胞系表达，其中所述编码序列不是天然地与细胞结合。在一个实施方式中，重组抗体具有与具有相同序列的抗体(如果其存在于自然界中)的糖基化模式不同的糖基化模式。在一个实施方式中，重组抗体在不是人宿主细胞的哺乳动物宿主细胞中表达。特别地，个体哺乳动物宿主细胞具有独特的糖基化模式
本文所用的术语“有效量”是指结合psma的抗体或其抗原结合部分的量，其足以在被施用于受试者时，实现对疾病的治疗。本文提供的抗体或片段的治疗有效量将根据抗体的相对活性，并且根据所治疗的受试者和疾病状况，受试者的体重和年龄，疾病状况的严重度，施用方式等而发生变化，其可以由本领域普通技术人员容易地确定。
术语“分离的”是指基本上不含其它细胞物质的蛋白质(例如抗体)。在一个实施方式中，分离的抗体基本上不含来自相同物种的其它蛋白质。在一个实施方式中，分离的抗体由来自不同物种的细胞表达，并且基本上不含来自所述不同物种的其它蛋白质。通过使用本领域熟知的蛋白质纯化技术进行分离，可以使蛋白质基本上不含天然相关组分(或与用于产生抗体的细胞表达系统相关的组分)。在一个实施方式中，本发明的抗psma抗体或抗原结合片段是分离的。
psma抗原结合蛋白
本发明涉及结合psma(例如人psma)的psma结合蛋白，特别是抗psma抗体或其抗原结合部分，及其用途。本发明的各个方面涉及抗体和抗体片段，药物组合物，核酸，重组表达载体和用于制备这样的抗体和片段的宿主细胞。本发明还包括使用本发明的抗体检测人psma，体外或体内抑制psma活性，以及预防或治疗疾病如癌症的方法。在一个实施方式中，本发明的抗体是人抗体。
如下表3所述，本发明包括的是包含对psma具有特异性的重链和轻链可变区的新型人抗体。在一个实施方式中，本发明提供抗psma抗体，或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链具有包含seqidno:1所述的氨基酸序列的可变结构域。在一个实施方式中，本发明提供抗psma抗体，或其抗原结合片段，其包含轻链，所述轻链具有包含以下中的任一个所述的氨基酸序列的可变结构域：seqidno:2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16和17。在一个实施方式中，本发明提供抗psma抗体，或其抗原结合片段，其包含轻链，所述轻链具有包含以下中的任一个所述的氨基酸序列的可变结构域：seqidno:2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16和17；和重链，所述重链具有包含seqidno:1所述的氨基酸序列的可变结构域。
已知互补决定区(cdr)是轻链和重链可变结构域二者中的高变区。可变结构域的更加高度保守的部分被称为框架(fr)。给定抗体的互补决定区(cdr)和框架区(fr)可以使用kabat等，同上；lefranc等，同上；和/或honegger和pluckthun，同上所描述的系统识别。本领域技术人员也熟悉kabat等(1991，nihpublication91-3242，nationaltechnicalinformationservice，springfield，va.)描述的编号系统。在这个方面，kabat等定义了适用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域普通技术人员可以毫无疑问地将该“kabat编号”系统分配给任何可变结构域氨基酸序列，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。
在某些实施方式中，本发明提供抗psma抗体，其包含表3所述的重链和轻链可变结构域(seqidno:1至17)的cdr。例如，本发明提供抗psma抗体，或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区具有seqidno:1所述的氨基酸序列中的cdr。在一个实施方式中，本发明提供抗psma抗体，或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，所述轻链可变区具有以下中的任一个所述的氨基酸序列中的cdr：seqidno:2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16和17。在一个实施方式中，本发明提供抗psma抗体，或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，所述轻链可变区具有以下中的任一个所述的氨基酸序列中的cdr：seqidno:2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16和17；和重链可变区，所述重链可变区具有seqidno:1所述的氨基酸序列中的cdr。
在一个实施方式中，本发明提供分离的抗psma抗体，或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链包含包含seqidno:1的氨基酸序列的可变结构域，和轻链，所述轻链包含包含选自以下的氨基酸序列的可变结构域：seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:5，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:8，seqidno:9，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:12，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:15，seqidno:16和seqidno:17。
在一个实施方式中，本发明提供igg种类的全人抗体，其以10-6m或更小的结合亲和力结合psma表位，并且具有与氨基酸序列seqidno:1至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同或至少99％相同的重链可变结构域序列，并且具有与以下氨基酸序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同或至少99％的轻链可变结构域序列：seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:5，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:8，seqidno:9，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:12，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:15，seqidno:16，seqidno:17，及其组合。
在一个实施方式中，所述全人抗体具有重链和轻链二者，其中所述抗体具有选自以下的重链/轻链可变结构域序列：seqidno:1/seqidno:2(在本文中称为psa11)，seqidno:1/seqidno:3(在本文中称为psgb11)，seqidno:1/seqidno:4(在本文中称为psgb12)，seqidno:1/seqidno:5(在本文中称为psgc8)，seqidno:1/seqidno:6(在本文中称为psgc9)，seqidno:1/seqidno:7(在本文中称为psgc12)，seqidno:1/seqidno:8(在本文中称为psgd3)，seqidno:1/seqidno:9(在本文中称为psgd4)，seqidno:1/seqidno:10(在本文中称为psgd6)，seqidno:1/seqidno:11(在本文中称为psge10)，seqidno:1/seqidno:12(在本文中称为psge11)，seqidno:1/seqidno:13(在本文中称为psgf9)，seqidno:1/seqidno:14(在本文中称为psgf11)，seqidno:1/seqidno:15(在本文中称为psgg6)，seqidno:1/seqidno:16(在本文中称为psgh3)，seqidno:1/seqidno:17(在本文中称为psgh8)，及其组合。
在一个实施方式中，本发明提供抗psma抗体，或其抗原结合片段，其包含重链，所述重链包含seqidno:1中的cdr3结构域，并且包含可变结构域，所述可变结构域包含与seqidno:1所述的序列至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明提供抗psma抗体，或其抗原结合片段，其包含轻链，所述轻链包含以下中的任一个中的cdr3结构域：seqidno:2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16和17，并且包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与以下中的任一个所述的序列至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同的氨基酸序列：seqidno:2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16和17。因此，在某些实施方式中，cdr3结构域保持不变，同时可变性可被引入重链和/或轻链的其余cdr和/或框架区，同时抗体或其抗原结合片段保留结合psma的能力并保留母体的功能特性，例如结合亲和力。
在一个实施方式中，在至少95％相同(或至少96％相同，或至少97％相同，或至少98％相同或至少99％相同)的重链或轻链中进行的置换是保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有化学性质(例如电荷或疏水性)相似的侧链(r基团)的另一个氨基酸残基置换的置换。通常，保守氨基酸置换将基本上不改变蛋白质的功能性。在两个或更多个氨基酸序列彼此相差保守置换的情况下，可以向上调整百分比序列同一性或相似程度，以就置换的保守性质作出修正。用于进行该调整的方法是本领域技术人员熟知的。参见，例如，pearson(1994)methodsmol.biol.24:307-331，其通过引用并入本文。具有化学性质相似的侧链的氨基酸的组的实例包括(1)脂族侧链：甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸，精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，和(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。
在一个实施方式中，本发明涉及具有表3所述抗体中的任一个的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体psa11的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如seqidno:1所示的重链可变结构域序列和如seqidno:2所示的轻链可变结构域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含seqidno:1的cdr的重链可变结构域和包含seqidno:2的cdr的轻链可变结构域的抗体。在一个实施方式中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seqidno:1所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的重链可变区，并且包含具有与seqidno:2所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。抗体还可以是igg1或igg4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体psgb11的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如seqidno:1所示的重链可变结构域序列和如seqidno:3所示的轻链可变结构域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含seqidno:1的cdr的重链可变结构域和包含seqidno:3的cdr的轻链可变结构域的抗体。在一个实施方式中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seqidno:1所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的重链可变区，并且包含具有与seqidno:3所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。抗体还可以是igg1或igg4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体psgb12的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如seqidno:1所示的重链可变结构域序列和如seqidno:4所示的轻链可变结构域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含seqidno:1的cdr的重链可变结构域和包含seqidno:4的cdr的轻链可变结构域的抗体。在一个实施方式中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seqidno:1所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的重链可变区，并且包含具有与seqidno:4所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。抗体还可以是igg1或igg4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体psgc8的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如seqidno:1所示的重链可变结构域序列和如seqidno:5所示的轻链可变结构域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含seqidno:1的cdr的重链可变结构域和包含seqidno:5的cdr的轻链可变结构域的抗体。在一个实施方式中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seqidno:1所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的重链可变区，并且包含具有与seqidno:5所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。抗体还可以是igg1或igg4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体psgc9的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如seqidno:1所示的重链可变结构域序列和如seqidno:6所示的轻链可变结构域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含seqidno:1的cdr的重链可变结构域和包含seqidno:6的cdr的轻链可变结构域的抗体。在一个实施方式中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seqidno:1所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的重链可变区，并且包含具有与seqidno:6所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。抗体还可以是igg1或igg4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体psgc12的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如seqidno:1所示的重链可变结构域序列和如seqidno:7所示的轻链可变结构域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含seqidno:1的cdr的重链可变结构域和包含seqidno:7的cdr的轻链可变结构域的抗体。在一个实施方式中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seqidno:1所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的重链可变区，并且包含具有与seqidno:7所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。抗体还可以是igg1或igg4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体psgd3的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如seqidno:1所示的重链可变结构域序列和如seqidno:8所示的轻链可变结构域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含seqidno:1的cdr的重链可变结构域和包含seqidno:8的cdr的轻链可变结构域的抗体。在一个实施方式中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seqidno:1所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的重链可变区，并且包含具有与seqidno:8所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。抗体还可以是igg1或igg4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体psgd4的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如seqidno:1所示的重链可变结构域序列和如seqidno:9所示的轻链可变结构域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含seqidno:1的cdr的重链可变结构域和包含seqidno:9的cdr的轻链可变结构域的抗体。在一个实施方式中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seqidno:1所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的重链可变区，并且包含具有与seqidno:9所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。抗体还可以是igg1或igg4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体psgd6的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如seqidno:1所示的重链可变结构域序列和如seqidno:10所示的轻链可变结构域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含seqidno:1的cdr的重链可变结构域和包含seqidno:10的cdr的轻链可变结构域的抗体。在一个实施方式中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seqidno:1所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的重链可变区，并且包含具有与seqidno:10所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。抗体还可以是igg1或igg4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体psge10的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如seqidno:1所示的重链可变结构域序列和如seqidno:11所示的轻链可变结构域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含seqidno:1的cdr的重链可变结构域和包含seqidno:11的cdr的轻链可变结构域的抗体。在一个实施方式中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seqidno:1所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的重链可变区，并且包含具有与seqidno:11所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。抗体还可以是igg1或igg4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体psge11的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如seqidno:1所示的重链可变结构域序列和如seqidno:12所示的轻链可变结构域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含seqidno:1的cdr的重链可变结构域和包含seqidno:12的cdr的轻链可变结构域的抗体。在一个实施方式中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seqidno:1所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的重链可变区，并且包含具有与seqidno:12所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。抗体还可以是igg1或igg4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体psgf9的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如seqidno:1所示的重链可变结构域序列和如seqidno:13所示的轻链可变结构域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含seqidno:1的cdr的重链可变结构域和包含seqidno:13的cdr的轻链可变结构域的抗体。在一个实施方式中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seqidno:1所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的重链可变区，并且包含具有与seqidno:13所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。抗体还可以是igg1或igg4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体psgf11的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如seqidno:1所示的重链可变结构域序列和如seqidno:14所示的轻链可变结构域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含seqidno:1的cdr的重链可变结构域和包含seqidno:14的cdr的轻链可变结构域的抗体。在一个实施方式中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seqidno:1所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的重链可变区，并且包含具有与seqidno:14所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。抗体还可以是igg1或igg4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体psgg6的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如seqidno:1所示的重链可变结构域序列和如seqidno:15所示的轻链可变结构域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含seqidno:1的cdr的重链可变结构域和包含seqidno:15的cdr的轻链可变结构域的抗体。在一个实施方式中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seqidno:1所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的重链可变区，并且包含具有与seqidno:15所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。抗体还可以是igg1或igg4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体psgh3的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如seqidno:1所示的重链可变结构域序列和如seqidno:16所示的轻链可变结构域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含seqidno:1的cdr的重链可变结构域和包含seqidno:16的cdr的轻链可变结构域的抗体。在一个实施方式中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seqidno:1所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的重链可变区，并且包含具有与seqidno:16所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。抗体还可以是igg1或igg4同种型。
在一个实施方式中，本发明涉及具有抗体psgh8的抗原结合区的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供包含如seqidno:1所示的重链可变结构域序列和如seqidno:17所示的轻链可变结构域序列的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明涉及具有包含seqidno:1的cdr的重链可变结构域和包含seqidno:17的cdr的轻链可变结构域的抗体。在一个实施方式中，本发明的特征在于分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含具有与seqidno:1所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的重链可变区，并且包含具有与seqidno:17所示的序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。抗体还可以是igg1或igg4同种型。
抗原结合蛋白(例如，抗体，抗体片段，抗体衍生物，抗体突变蛋白和抗体变体)是结合psma的多肽。
本发明的抗原结合蛋白的抗原结合片段可以通过常规技术产生。这样的片段的实例包括但不限于fab和f(ab')2片段。
单链抗体可以通过经由氨基酸桥(短肽接头)连接重链和轻链可变结构域(fv区)片段形成，产生单个多肽链。这样的单链fv(scfv)已经通过在编码两个可变结构域多肽(vl和vh)的dna之间融合编码肽接头的dna而制备。取决于两个可变结构域之间的柔性接头的长度，所得多肽可以自身折叠以形成抗原结合单体，或者它们可以形成多聚体(例如二聚体，三聚体或四聚体)(kortt等，1997，prot.eng.10:423；kortt等，2001，biomol.eng.18:95-108)。通过组合不同的包含vl和vh的多肽，可以形成结合不同表位的多聚体scfv(kriangkum等，2001，biomol.eng.18:31-40)。开发用于生产单链抗体的技术包括美国专利4,946,778；bird，1988，science242:423；huston等，1988，proc.natl.acad.sci.usa85:5879；ward等，1989，nature334:544，degraaf等，2002，methodsmol.biol.178:379-87中所述的那些。
在某些实施方式中，本发明提供fab全人抗体片段，其具有来自重链的可变结构域区和来自轻链的可变结构域区，其中重链可变结构域序列与氨基酸序列seqidno:1至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同，并且轻链可变结构域序列与以下氨基酸序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同：seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:5，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:8，seqidno:9，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:12，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:15，seqidno:16，seqidno:17，及其组合。在一个实施方式中，所述全人抗体fab片段具有重链可变结构域区和轻链可变结构域区二者，其中所述抗体具有选自以下的重链/轻链可变结构域序列：seqidno:1/seqidno:2，seqidno:1/seqidno:3，seqidno:1/seqidno:4，seqidno:1/seqidno:5，seqidno:1/seqidno:6，seqidno:1/seqidno:7，seqidno:1/seqidno:8，seqidno:1/seqidno:9，seqidno:1/seqidno:10，seqidno:1/seqidno:11，seqidno:1/seqidno:12，seqidno:1/seqidno:13，seqidno:1/seqidno:14，seqidno:1/seqidno:15，seqidno:1/seqidno:16，seqidno:1/seqidno:17，及其组合。
在一个实施方式中，本发明提供单链人抗体，其具有来自重链的可变结构域区和来自轻链的可变结构域区和连接所述重链可变结构域区与轻链可变结构域区的肽接头，其中重链可变结构域序列与seqidno:1的氨基酸序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同，并且其中轻链可变结构域序列与选自以下的氨基酸序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同：seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:5，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:8，seqidno:9，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:12，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:15，seqidno:16，seqidno:17，及其组合。在一个实施方式中，所述单链全人抗体具有重链可变结构域区和轻链可变结构域区二者，其中所述单链全人抗体具有选自以下的重链/轻链可变结构域序列：seqidno:1/seqidno:2，seqidno:1/seqidno:3，seqidno:1/seqidno:4，seqidno:1/seqidno:5，seqidno:1/seqidno:6，seqidno:1/seqidno:7，seqidno:1/seqidno:8，seqidno:1/seqidno:9，seqidno:1/seqidno:10，seqidno:1/seqidno:11，seqidno:1/seqidno:12，seqidno:1/seqidno:13，seqidno:1/seqidno:14，seqidno:1/seqidno:15，seqidno:1/seqidno:16，seqidno:1/seqidno:17，及其组合。
已知用于从感兴趣的抗体衍生不同亚类或同种型的抗体的技术，即亚类切换。因此，例如，igg抗体可以衍生自igm抗体，反之亦然。这样的技术允许制备具有给定抗体(母体抗体)的抗原结合性质，但也表现出和与母体抗体的抗体同种型或与亚类不同的抗体同种型或与亚类相关的生物学性质的新抗体。可以使用重组dna技术。编码特定抗体多肽的克隆dna可用于这样的程序，例如编码期望同种型的抗体的恒定结构域的dna(lantto等，2002，methodsmol.biol.178:303-16)。此外，如果igg4是期望的，在铰链区中引入点突变(cpsc->cppc)(bloom等，1997，proteinscience6:407)以减轻形成可能导致igg4抗体中的异质性的内部h链二硫键的趋势也可以是期望的。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体是人igg1抗体。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体是人igg4抗体。
本发明提供结构特征在于其可变结构域区的氨基酸序列的许多抗体。然而，氨基酸序列可以经历一些改变，同时保持其与其特异性靶标的高度结合。更具体地，可变结构域区中的许多氨基酸可以用保守置换改变，并且可以预测所得抗体的结合特性与野生型抗体序列的结合特性将没有不同。抗体可变结构域中有许多氨基酸不与抗原直接相互作用或影响抗原结合，并且对于决定抗体结构不是关键性的。例如，所公开的抗体中的任一个的预测的非必需氨基酸残基优选被来自同一类别的另一个氨基酸残基替代。识别不消除抗原结合的氨基酸保守置换的方法是本领域公知的(参见，例如，brummell等，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等，proteineng.12(10):879-884(1999)；和burks等，proc.natl.acad.sci.usa94:412-417(1997))。near等，mol.immunol.30:369-377，1993解释了如何通过定点诱变影响或不影响结合。near等只突变了他们认为具有改变抗原结合的高概率的残基。大多数对结合亲和力(near等，表3)和结合不同形式的地高辛(near等，表2)具有适度或负面影响。因此，在某些实施方式中，本发明还包括与本文公开的那些序列具有至少95％同一性，至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，或至少99％同一性的可变序列。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或其抗原结合片段具有1×10-6m或更低；5×10-7m或更低，1×10-7m或更低；5×10-8m或更低；1×10-8m或更低；5×10-9m或更低；或1×10-9m或更低的结合亲和力(kd)。在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段的kd为1×10-7m至1×10-10m。在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段的kd为1×10-8m至1×10-10m。
本领域普通技术人员将意识到已知用于测定抗体或其片段的kd的标准方法。例如，在一个实施方式中，通过放射性标记抗原结合试验(ria)测量kd。在一个实施方式中，用感兴趣的抗体的fab版本及其抗原进行ria。例如，通过在未标记的抗原的一系列滴定的存在下，用最小浓度的(125i)-标记的抗原使fab平衡，然后用抗fab抗体涂布的平板俘获结合的抗原，测量fab对抗原的溶液结合亲和力(参见，例如，chen等，j.mol.biol.293:865-881(1999))。根据另一个实施方式，使用biacore表面等离子体共振试验测量kd。本文所用的术语“表面等离子体共振”是指允许通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的变化分析实时相互作用的光学现象，例如使用biacore系统(biacorelifesciencesdivision，gehealthcare，piscataway，nj)。
在特别的实施方式中，本发明的抗原结合蛋白对psma具有至少106的ka。在其它实施方式中，抗原结合蛋白表现出至少107，至少108，至少109，或至少1010的ka。在另一个实施方式中，抗原结合蛋白表现出与实施例中所述的抗体基本上相同的ka。
在另一个实施方式中，本发明提供具有低psma解离速率的抗原结合蛋白。在一个实施方式中，抗原结合蛋白具有1×10-4至-1或更低的koff。在另一个实施方式中，koff为5×10-5至-1或更低。在另一个实施方式中，koff与本文所述的抗体基本上相同。在另一个实施方式中，抗原结合蛋白以与本文所述的抗体基本上相同的koff结合psma。
在另一方面，本发明提供抑制psma的活性的抗原结合蛋白。在一个实施方式中，抗原结合蛋白具有1000nm或更低的ic50。在另一个实施方式中，ic50为100nm或更低；在另一个实施方式中，ic50为10nm或更低。在另一个实施方式中，ic50与实施例中所述的抗体基本上相同。在另一个实施方式中，抗原结合蛋白以与本文所述抗体基本上相同的ic50抑制psma的活性。
在另一方面，本发明提供结合在细胞表面上表达的psma，并且当这样结合时，抑制细胞中的psma信号传导活性而不使细胞表面上psma的量显著降低的抗原结合蛋白。可以使用用于测定或估计细胞表面上和/或内部中的psma的量的任何方法。在其他实施方式中，抗原结合蛋白与psma表达细胞的结合导致少于约75％，50％，40％，30％，20％，15％，10％，5％，1％或0.1％的细胞表面psma被内化。
在另一方面，本发明提供体外或体内(例如当被施用于受试者时)具有至少一天的半衰期的抗原结合蛋白。在一个实施方式中，抗原结合蛋白的半衰期为至少三天。在另一个实施方式中，抗原结合蛋白的半衰期为4天或更长。在另一个实施方式中，抗原结合蛋白的半衰期为8天或更长。在另一个实施方式中，抗原结合蛋白被衍生化或修饰，使得其与未衍生化的或未修饰的抗原结合蛋白相比具有更长的半衰期。在另一个实施方式中，抗原结合蛋白含有一个或多个点突变以增加血清半衰期，例如wo00/09560中所述，其通过引用并入本文。
本发明还提供多特异性抗原结合蛋白，例如双特异性抗原结合蛋白，例如通过两个不同抗原结合位点或区域结合psma的两个不同表位或psma的表位和另一个分子的表位的抗原结合蛋白。此外，本文公开的双特异性抗原结合蛋白可以包含来自本文所述抗体中的一种的psma结合位点和来自本文所述抗体中的另一种的第二psma结合区，所述本文所述抗体包括本文参考其它出版物描述的那些。或者，双特异性抗原结合蛋白可以包含来自本文所述抗体中的一种的抗原结合位点和来自本领域已知的另一种psma抗体或者来自通过已知方法或本文所述方法制备的抗体的第二抗原结合位点。
制备双特异性抗体的许多方法是本领域已知的。这样的方法包括使用如milstein等，1983，nature305:537所述的杂交-杂交瘤，和抗体片段的化学偶联(brennan等，1985，science229:81；glennie等，1987，j.immunol.139:2367；美国专利6,010,902)。此外，双特异性抗体可以通过重组方法生产，例如通过使用亮氨酸拉链部分(即，来自fos和jun蛋白，其优先形成异二聚体；kostelny等，1992，j.immunol.148:1547)或其它锁和键交互式结构域结构，如美国专利5,582,996所述。另外的有用技术包括美国专利5,959,083和5,807,706中描述的那些。
在另一方面，抗原结合蛋白包含抗体的衍生物。衍生抗体可以包含赋予抗体以期望性质(例如在特定用途中增加的半衰期)的任何分子或物质。衍生抗体可以包含例如可检测(或标记)部分(例如，放射性的，比色的，抗原或酶分子，可检测的珠粒(例如磁性的或电子致密的(例如，金)珠粒)，或结合另一分子的分子(例如生物素或链霉抗生物素蛋白)，治疗或诊断部分(例如，放射性的，细胞毒性的或药学活性的部分)，或增加抗体对特定用途(例如，施用于受试者，如人受试者，或其他体内或体外用途)的适合性的分子。可用于使抗体衍生化的分子的实例包括白蛋白(例如，人血清白蛋白)和聚乙二醇(peg)。抗体的白蛋白连接衍生物和聚乙二醇化衍生物可以使用本领域熟知的技术制备，在一个实施方式中，抗体与转甲状腺素蛋白(ttr)或ttr变体缀合或以其他方式连接，ttr或ttr变体可以被例如选自葡聚糖，聚(正乙烯基吡咯烷酮)，聚乙二醇，聚丙二醇(propropyleneglycol)均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙基化(polyoxyethylated)多元醇和聚乙烯醇的化学物质化学修饰。
抗体靶向治疗的替代方法是利用本发明的抗psma抗体以将细胞毒性药物特异性递送到表达psma抗原的癌细胞。在一个实施方式中，本发明的抗psma抗体或片段通过接头与细胞毒性剂缀合，以形成抗psma抗体药物缀合物(adc)。抗体靶向治疗的替代方法是利用抗psma抗体以将细胞毒性药物特异性递送到表达psma抗原的癌细胞。本领域已知各种细胞毒性药物，其可以与本文公开的任何抗体缀合以形成adc，其包括但不限于阿司他汀(auristatin)。阿司他汀类，如单甲基阿司他汀e(mmae)和单甲基阿司他汀f(mmaf)，是通过阻断微管蛋白的聚合而抑制细胞分裂的抗有丝分裂剂(francisco等，blood.2003年8月15日，102(4):1458-65；smith等，molcancerther，2006年6月5日，1474-82)。如下文实施例2所述，由与抗psma抗体连接的阿司他汀mmaf组成的抗体-药物缀合物(adc)在表达psma的肿瘤细胞系中显示出有效的抗肿瘤活性。因此，在一个实施方式中，本发明的抗psma抗体或其片段与阿司他汀(例如mmaf)缀合。
含有一种或多种抗原结合蛋白的寡聚体可以用作psma拮抗剂。寡聚体可以是共价连接或非共价连接的二聚体、三聚体或更高级寡聚体的形式。设想使用包含两种或更多种抗原结合蛋白的寡聚体，一个实例是同二聚体。其它寡聚体包括异二聚体，同三聚体，异三聚体，同四聚体，异四聚体等。
一个实施方式涉及包含通过与抗原结合蛋白融合的肽部分之间的共价或非共价相互作用连接的多个抗原结合蛋白的寡聚体。这样的肽可以是肽接头(间隔子)或具有促进寡聚化的性质的肽。衍生自抗体的亮氨酸拉链和某些多肽是在可以促进连接到其的抗原结合蛋白的寡聚化的肽中，如下文更详细描述的。
在特别的实施方式中，寡聚体包含2至4个抗原结合蛋白。寡聚体的抗原结合蛋白可以是任何形式，例如任何上述形式，例如变体或片段。优选地，寡聚体包含具有psma结合活性的抗原结合蛋白。
在一个实施方式中，使用衍生自免疫球蛋白的多肽制备寡聚体。包含融合到抗体衍生多肽的各种部分(包括fc结构域)的某些异源多肽的融合蛋白的制备已经描述于，例如，ashkenazi等，1991，proc.natl.acad.sci.usa，88:10535；byrn等，1990，nature344:677；和hollenbaugh等，1992“constructionofimmunoglobulinfusionproteins”，currentprotocolsinimmunology，suppl.4，第10.19.1-10.19.11页。
一个实施方式涉及包含通过将抗psma抗体的psma结合片段融合到抗体的fc区而产生的两种融合蛋白的二聚体。所述二聚体可以通过例如以下方式制备，将编码融合蛋白的基因融合物插入合适的表达载体中，在用该重组表达载体转化的宿主细胞中表达该基因融合物，并使所表达的融合蛋白很像抗体分子那样组装，由此在fc部分之间形成链间二硫键以产生所述二聚体。
制备寡聚抗原结合蛋白的另一种方法涉及使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链结构域是促进其中发现它们的蛋白质的寡聚化的肽。亮氨酸拉链最初在多种dna结合蛋白中识别出(landschulz等，1988，science240:1759)，并且自那以后已经在多种不同蛋白质中发现。在已知亮氨酸拉链中的是二聚或三聚的天然存在的肽及其衍生物。wo94/10308中描述了适用于生产可溶性寡聚蛋白质的亮氨酸拉链结构域的实例，并且hoppe等，1994，febsletters344:191描述了衍生自肺表面活性蛋白d(spd)的亮氨酸拉链。fanslow等，1994，semin.immunol.6:267-78描述了使用允许与与其融合的异源蛋白质稳定三聚化的修饰的亮氨酸拉链。在一种方法中，在适合的宿主细胞中表达包含与亮氨酸拉链肽融合的抗psma抗体片段或衍生物的重组融合蛋白，并从培养物上清液中回收形成的可溶性寡聚抗psma抗体片段或衍生物。
针对psma的抗原结合蛋白可以例如体外或体内用于检测psma多肽的存在的试验。抗原结合蛋白也可用于通过免疫亲和色谱法纯化psma蛋白。阻断性抗原结合蛋白可用于本文公开的方法。用作psma拮抗剂的这种抗原结合蛋白可用于治疗任何psma诱导的病症，包括但不限于各种癌症。
抗原结合蛋白可以在体外程序中使用，或体内施用以抑制psma诱导的生物活性。因此可以治疗由psma的蛋白水解(直接或间接)造成或加重的疾病，其实例在本文中提供。在一个实施方式中，本发明提供治疗方法，其包括以有效降低psma诱导的生物活性的量向有需要的哺乳动物体内施用psma阻断性抗原结合蛋白。
在本发明的某些实施方式中，抗原结合蛋白包括抑制psma的生物活性的全人单克隆抗体。
抗原结合蛋白，包括本文所述的抗体和抗体片段，可以通过许多常规技术中的任一种制备。例如，使用本领域已知的任何技术，它们可以从天然表达它们的细胞中纯化(例如，抗体可以从产生它的杂交瘤中纯化)，或者在重组表达系统中产生。参见，例如，monoclonalantibodies,hybridomas:anewdimensioninbiologicalanalyzes，kennet等(编辑)，plenumpress，newyork(1980)；和antibodies:alaboratorymanual，harlow和land(编辑)，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.(1988)。
本领域已知的任何表达系统都可用于制备本发明的重组多肽，包括本文所述的抗体和抗体片段。通常，用包含编码期望多肽的dna的重组表达载体转化宿主细胞。在可以使用的宿主细胞中的是原核生物、酵母或高等真核生物细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。高等真核生物细胞包括昆虫细胞和哺乳动物来源的已建立的细胞系。适合的哺乳动物宿主细胞系的实例包括猴肾细胞的cos-7系(atcccrl1651)(gluzman等，1981，cell23:175)，l细胞，293细胞，c127细胞，3t3细胞(atccccl163)，中国仓鼠卵巢(cho)细胞，hela细胞，bhk(atcccrl10)细胞系，和衍生自非洲绿猴肾细胞系cv1的cv1/ebna细胞系(atccccl70)，如mcmahan等，1991，emboj.10:2821所述。pouwels等描述了与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的适合的克隆和表达载体(cloningvectors:alaboratorymanual，elsevier，n.y.，1985)。
可以在促进多肽表达的条件下培养转化细胞，并且通过常规蛋白质纯化程序回收多肽。一种这样的纯化程序包括使用亲和色谱法，例如在基质上，所述基质具有与其结合的psma的全部或部分(例如细胞外结构域)。设想用于本文的多肽包括基本上同质的重组哺乳动物抗psma抗体多肽，其基本上不含污染性内源性物质。
可以通过许多已知技术中的任一种制备抗原结合蛋白并根据期望性质进行筛选。技术中的某一些涉及分离编码感兴趣的抗原结合蛋白(例如抗psma抗体)的多肽链(或其部分)的核酸，并通过重组dna技术操纵核酸。例如，核酸可以与感兴趣的另一个核酸融合，或者被改变(例如通过诱变或其他常规技术)以添加、删除或置换一个或多个氨基酸残基。
本发明的多肽可以使用本领域已知的任何标准方法制备。在一个实例中，通过重组dna方法通过将编码多肽的核酸序列(例如，cdna)插入到重组表达载体中并在促进表达的条件下表达dna序列而产生多肽。
可以化学合成编码本文公开的各种多肽中的任一种的核酸。可以选择密码子使用以改善在细胞中的表达。这样的密码子使用将取决于所选择的细胞类型。已经为大肠杆菌和其他细菌以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞开发了专门的密码子使用模式。参见，例如，mayfield等，proc.natl.acad.sci.usa.2003100(2):438-42；sinclair等，proteinexpr.purif.2002(1):96-105；connellnd.curr.opin.biotechnol.200112(5):446-9；makrides等，microbiol.rev.199660(3):512-38；和sharp等，yeast.19917(7):657-78。
在一个实施方式中，本发明的特征在于编码本文公开的抗体或抗体片段的核酸。例如，在一个实施方式中，本发明包括编码seqidno:1所述的重链可变结构域和/或以下中的任一个所述的轻链可变结构域的核酸：seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:5，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:8，seqidno:9，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:12，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:15，seqidno:16和seqidno:17。
用于核酸操纵的一般技术描述于，例如，sambrook等，molecularcloning:alaboratorymanual，第1-3卷，coldspringharborlaboratorypress，第2版，1989或f.ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology(greenpublishingandwiley-interscience：newyork，1987)和定期的更新，其通过引用并入本文。编码多肽的dna可操作地连接到衍生自哺乳动物、病毒或昆虫基因的适合的转录或翻译调控元件。这样的调控元件包括转录启动子，控制转录的任选的操纵子序列，编码适合的mrna核糖体结合位点的序列，以及控制转录和翻译终止的序列。通常由复制起点赋予的在宿主中复制的能力以及促进转化体识别的选择基因被另外地引入。
重组dna还可以包括可用于纯化蛋白质的任何类型的蛋白质标签序列。蛋白质标签的实例包括但不限于组氨酸标签，flag标签，myc标签，ha标签或gst标签。与细菌，真菌，酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当的克隆和表达载体可见于cloningvectors:alaboratorymanual(elsevier，n.y.，1985)。
使用适合于宿主细胞的方法将表达构建体引入宿主细胞。将核酸引入宿主细胞的各种方法是本领域已知的，包括但不限于电穿孔；使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、deae-葡聚糖或其他物质的转染；微弹轰击；脂质体转染；和感染(其中载体是感染剂)。适合的宿主细胞包括原核生物，酵母，哺乳动物细胞或细菌细胞。
适合的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌物种。酵母，优选来自酵母属物种，例如酿酒酵母，也可用于生产多肽。还可以使用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统表达重组蛋白。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白的杆状病毒系统由luckow和summers综述(bio/technology，6:47，1988)。适合的哺乳动物宿主细胞系的实例包括内皮细胞，cos-7猴肾细胞，cv-1，l细胞，c127，3t3，中国仓鼠卵巢(cho)，人胚胎肾细胞，hela，293，293t和bhk细胞系。通过培养适合的宿主/载体系统表达重组蛋白而制备纯化多肽。在一些实施方式中，本文公开的许多多肽的小尺寸将使在大肠杆菌中表达是优选的表达方法。然后从培养基或细胞提取物中纯化蛋白质。
本文公开的蛋白质还可以使用细胞翻译系统产生。为了这样的目的，编码多肽的核酸必须被修饰以允许体外转录以产生mrna，并允许mrna在采用的特定无细胞系统中无细胞翻译(无真核生物(如哺乳动物或酵母)细胞翻译系统，或无原核生物(如细菌)细胞翻译系统)。
还可以通过化学合成产生psma结合多肽(例如通过solidphasepeptidesynthesis，第2版，1984，thepiercechemicalco.,rockford，ill.所述的方法)。对蛋白质的修饰也可以通过化学合成产生。
本发明的多肽可以通过蛋白质化学领域中通常已知的蛋白质分离/纯化方法纯化。非限制性实例包括提取，重结晶，盐析(例如用硫酸铵或硫酸钠)，离心，透析，超滤，吸附色谱，离子交换色谱，疏水色谱，正相色谱，反相色谱，凝胶过滤，凝胶渗透色谱，亲和色谱，电泳，逆流分布或这些的任何组合。纯化后，多肽可以通过本领域已知的多种方法(包括但不限于过滤和透析)中的任一种交换到不同缓冲液中和/或浓缩。
纯化多肽优选至少85％纯，更优选至少95％纯，和最优选至少98％纯。不管纯度的确切数值如何，多肽足够纯以用作药物产品。
在某些实施方式中，本发明提供结合psma的单克隆抗体。单克隆抗体可以使用本领域已知的任何技术制备，例如通过在免疫进度表完成后使从转基因动物收获的脾细胞永生化。可以使用本领域已知的任何技术使脾细胞永生化，例如通过将它们与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。用于产生杂交瘤的融合程序的骨髓瘤细胞优选不产生抗体，具有高融合效率，和具有使其不能在仅支持期望融合细胞(杂交瘤)的生长的某些选择培养基中生长的酶缺陷。用于小鼠融合的适合的细胞系的实例包括sp-20，p3-x63/ag8，p3-x63-ag8.653，ns1/1.ag41，sp210-ag14，fo，nso/u，mpc-11，mpc11-x45-gtg1.7和s194/5xx0bul；用于大鼠融合的细胞系的实例包括r210.rcy3，y3-ag1.2.3，ir983f和48210。可用于细胞融合的其它细胞系是u-266，gm1500-grg2，licr-lon-hmy2和uc729-6。
本领域普通技术人员可以根据本说明书的教导和使用本领域已知的技术容易地制备抗体的片段或类似物。片段或类似物的优选氨基和羧基末端出现在功能结构域的边界附近。可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库进行比较而识别结构和功能结构域。计算机化比较方法可用于识别出现在具有已知结构和/或功能的其它蛋白质中的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。识别折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。参见bowie等，1991，science253:164。
多肽的翻译后修饰
在某些实施方式中，本发明的结合多肽还可包含翻译后修饰。示例性的翻译后蛋白质修饰包括磷酸化，乙酰化，甲基化，adp-核糖基化，泛素化，糖基化，羰基化，sumo化，生物素化，或者增加多肽侧链或疏水基团。结果，修饰的可溶性多肽可以含有非氨基酸元件，例如脂质，多糖或单糖，和磷酸盐。糖基化的优选形式是唾液酸化，其将一个或多个唾液酸部分与多肽缀合。唾液酸部分提高溶解度和血清半衰期，同时也降低蛋白质的可能免疫原性。参见raju等，biochemistry.200131；40(30):8868-76。
在一个实施方式中，本发明的可溶性多肽的修饰形式包括将本发明的可溶性多肽与非蛋白质类聚合物连接。在一个实施方式中，聚合物是聚乙二醇(“peg”)，聚丙二醇或聚氧化烯，以美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所述的方式。
peg是可商购的或可根据本领域熟知的方法通过乙二醇的开环聚合制备的水溶性聚合物(sandler和karo，polymersynthesis，academicpress，newyork，第3卷，第138-161页)。术语“peg”广泛用于包括任何聚乙二醇分子，不考虑尺寸或peg末端的修饰，并且可由下式表示：x-o(ch2ch2o)n-ch2ch2oh(1)，其中n为20至2300，并且x为h或末端修饰，例如c1-4烷基。在一个实施方式中，本发明的peg在一端用羟基或甲氧基终止，即x为h或ch3(“甲氧基peg”)。peg可以含有结合反应所必须的另外的化学基团；其是由分子的化学合成产生；或者其是分子的部分的最佳距离的间隔物。此外，这样的peg可以由连接在一起的一个或多个peg侧链组成。具有多于一个peg链的peg被称为多臂或支化peg。支化peg可以例如通过向各种多元醇(包括甘油，季戊四醇和山梨糖醇)中加入聚环氧乙烷而制备。例如，四臂支化peg可以由季戊四醇和环氧乙烷制备。支化peg描述于例如ep-a0473084和美国专利5,932,462。peg的一种形式包含通过赖氨酸的伯氨基连接的两个peg侧链(peg2)(monfardini等，bioconjugatechem.6(1995)62-69)。
peg修饰多肽的血清清除率相对于未修饰的结合多肽的清除率可以降低约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或甚至90％。peg修饰多肽可以具有相对于未修饰蛋白的半衰期增强的半衰期(t1/2)。peg结合多肽的半衰期相对于未修饰的结合多肽的半衰期可以增强至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，125％，150％，175％，200％，250％，300％，400％或500％，或甚至1000％。在一些实施方式中，蛋白质半衰期在体外测定，例如在缓冲盐水溶液或血清中。在其它实施方式中，蛋白质半衰期是体内半衰期，例如蛋白质在动物的血清或其他体液中的半衰期。
治疗方法、制剂和施用模式
本发明提供用于治疗癌症的方法，其包括施用本文所述的抗psma抗体或抗体片段。本发明还提供用于治疗前列腺癌的方法，其包括施用本文所述的抗psma抗体或抗体片段。
研究已经证实在许多类型的前列腺组织中的psma表达和在癌症组织中增加的psma表达(chang,s.revurol.2004，6(suppl10):s13–s18；silver等，clincancerres.1997，3:81–85；troyer等，intjcancer.1995，62:552–558；haffner等，humpathol.2009年12月，40(12):1754-61)。因此，在一个实施方式中，本发明的抗psma抗体和抗体片段用于治疗与增加的psma表达相关的癌症。
本文公开的抗体中的任一种都可用于这样的方法。例如，可以使用以下实施所述方法：以至少10-6m的结合亲和力结合psma表位的igg种类的全人抗体，具有来自重链的可变结构域区和来自轻链的可变结构域区的fab全人抗体片段，具有来自重链的可变结构域区和来自轻链的可变结构域区和连接重链与轻链可变结构域区的肽接头的单链人抗体，包括seqidno:1-17(表3)所述的重链和轻链可变区(和所述序列内的cdr)。
在一个实施方式中，本文公开的抗体用于靶向化学或细胞治疗载荷，其中抗psma抗体包含与氨基酸序列seqidno:1至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的重链可变结构域序列，并且包含与选自以下的氨基酸序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的轻链可变结构域序列：seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:5，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:8，seqidno:9，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:12，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:15，seqidno:16和seqidno:17。
在一个实施方式中，本文所述的方法包括使用全人fab抗体片段，其包含与氨基酸序列seqidno:1至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的重链可变结构域序列，并且具有与选自以下的氨基酸序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的轻链可变结构域序列：seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:5，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:8，seqidno:9，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:12，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:15，seqidno:16和seqidno:17。
在一个实施方式中，本文所述的方法包括使用单链人抗体，其包含与氨基酸序列seqidno:1至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的重链可变结构域序列，并且包含与选自以下的氨基酸序列至少95％相同，至少96％相同，至少97％相同，至少98％相同，或至少99％相同的轻链可变结构域序列：seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:5，seqidno:6，seqidno:8，seqidno:8，seqidno:9，seqidno:10，seqidno:11，seqidno:12，seqidno:13，seqidno:14，seqidno:15，seqidno:16和seqidno:17。
在一个实施方式中，所述全人抗体具有重链和轻链二者，其中所述抗体具有选自以下的重链/轻链可变结构域序列：seqidno:1/seqidno:2，seqidno:1/seqidno:3，seqidno:1/seqidno:4，seqidno:1/seqidno:5，seqidno:1/seqidno:6，seqidno:1/seqidno:7，seqidno:1/seqidno:8，seqidno:1/seqidno:9，seqidno:1/seqidno:10，seqidno:1/seqidno:11，seqidno:1/seqidno:12，seqidno:1/seqidno:13，seqidno:1/seqidno:14，seqidno:1/seqidno:15，seqidno:1/seqidno:16和seqidno:1/seqidno:17。
在一个实施方式中，所述全人抗体fab片段包含重链可变结构域区和轻链可变结构域区二者，其中所述抗体具有选自以下的重链/轻链可变结构域序列：seqidno:1/seqidno:2，seqidno:1/seqidno:3，seqidno:1/seqidno:4，seqidno:1/seqidno:5，seqidno:1/seqidno:6，seqidno:1/seqidno:7，seqidno:1/seqidno:8，seqidno:1/seqidno:9，seqidno:1/seqidno:10，seqidno:1/seqidno:11，seqidno:1/seqidno:12，seqidno:1/seqidno:13，seqidno:1/seqidno:14，seqidno:1/seqidno:15，seqidno:1/seqidno:16和seqidno:1/seqidno:17。
在一个实施方式中，所述单链全人抗体包含重链可变结构域区和轻链可变结构域区二者，其中所述单链全人抗体包含选自以下的重链/轻链可变结构域序列：seqidno:1/seqidno:2，seqidno:1/seqidno:3，seqidno:1/seqidno:4，seqidno:1/seqidno:5，seqidno:1/seqidno:6，seqidno:1/seqidno:7，seqidno:1/seqidno:8，seqidno:1/seqidno:9，seqidno:1/seqidno:10，seqidno:1/seqidno:11，seqidno:1/seqidno:12，seqidno:1/seqidno:13，seqidno:1/seqidno:14，seqidno:1/seqidno:15，seqidno:1/seqidno:16和seqidno:1/seqidno:17。
在一个实施方式中，可使用本文公开的抗体和片段治疗的癌症包括但不限于卵巢癌，结肠癌，乳腺癌，肺癌，骨髓瘤，神经母细胞衍生cns肿瘤，单核细胞白血病，b细胞衍生白血病，t细胞衍生白血病，b细胞衍生淋巴瘤，t细胞衍生淋巴瘤和肥大细胞衍生肿瘤。
在一个实施方式中，本发明的抗psma抗体和抗体片段用于治疗前列腺癌。
本文所述的psma抗体和抗体片段可用于治疗癌症或其他肿瘤病症(包括血液恶性肿瘤和/或psma+肿瘤)的症状，延缓所述症状的进展，预防所述症状的复发，或缓解所述症状。本文所述的psma抗体可用于治疗选自以下的癌症：非霍奇金淋巴瘤(nhl)，急性淋巴细胞白血病(all)，急性骨髓性白血病(aml)，慢性淋巴细胞白血病(cll)，慢性骨髓性白血病(cml)，多发性骨髓瘤(mm)，乳腺癌，卵巢癌，头颈癌，膀胱癌，黑素瘤，结肠直肠癌，胰腺癌，肺癌，平滑肌瘤，平滑肌肉瘤，神经胶质瘤，成胶质细胞瘤和实体瘤，其中实体瘤选自乳腺肿瘤，卵巢肿瘤，肺肿瘤，胰腺肿瘤，前列腺肿瘤，黑素瘤肿瘤，结肠直肠肿瘤，肺肿瘤，头颈部肿瘤，膀胱肿瘤，食管肿瘤，肝肿瘤和肾肿瘤。
如本文所用，“血液癌症”是指血液的癌症，并且包括白血病，淋巴瘤和骨髓瘤等。“白血病”是指血液的癌症，其中制造太多在抗击感染方面无效的白细胞，从而挤出构成血液的其他部分，如血小板和红细胞。据了解，白血病的情况分类为急性或慢性。因此，本发明的抗体和片段可用于治疗患有血液癌症的受试者。
白血病的某些形式包括急性淋巴细胞性白血病(all)；急性骨髓性白血病(aml)；慢性淋巴细胞白血病(cll)；慢性骨髓性白血病(cml)；骨髓增生性疾病/肿瘤(mpds)；和脊髓发育不良综合征。“淋巴瘤”可以指霍奇金淋巴瘤，惰性和侵袭性非霍奇金淋巴瘤二者，伯基特淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)等。骨髓瘤可以指多发性骨髓瘤(mm)，巨细胞骨髓瘤，重链骨髓瘤和轻链或bence-jones骨髓瘤。
本发明的特征在于用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法，其包括施用抗psma多肽。用于施用的技术和剂量根据具体多肽的类型和被治疗的具体病症而不同，但本领域技术人员可以容易地确定。通常，监管机构要求将用作治疗剂的蛋白质试剂配制成具有可接受的低水平的热原。因此，通常将治疗制剂与其它制剂区分开来，因为它们是基本上无热原的，或至少含有不超过由适当的管理机构(例如fda)确定的可接受水平的热原。
本发明的治疗组合物可以以单位剂型与药学上可接受的稀释剂，载体或赋形剂一起施用。作为非限制性实例，施用可以是肠胃外(例如静脉内，皮下)，口服或局部施用。此外，使用编码本发明的多肽的核酸，可以使用任何基因治疗技术，例如裸dna递送，重组基因和载体，基于细胞的递送，包括患者细胞的离体操纵等。
组合物可以是用于口服施用的丸剂，片剂，胶囊，液体或缓释片剂的形式；或用于静脉内，皮下或肠胃外施用的液体；用于局部施用的凝胶，洗剂，软膏，霜剂或聚合物或其它缓释载体。
在某些实施方式中，所公开的抗体通过吸入施用，但由于其分子大小(～150kda)，全igg抗体的雾化可能显示是有限的。
用于制备制剂的本领域熟知的方法见于，例如，“remington:thescienceandpracticeofpharmacy”(第20版，a.r.gennaroar.，2000，lippincottwilliams&wilkins，philadelphia，pa.)。用于肠胃外施用的制剂可以例如含有赋形剂，无菌水，盐水，聚亚烷基二醇如聚乙二醇，植物来源的油，或氢化萘。生物相容性的、可生物降解的丙交酯聚合物，丙交酯/乙交酯共聚物，或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制化合物的释放。纳米颗粒制剂(例如可生物降解的纳米颗粒，固体脂质纳米颗粒，脂质体)可用于控制化合物的生物分布。其它可能有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒，渗透泵，可植入输注系统，和脂质体。制剂中化合物的浓度根据许多因素而变化，包括待施用的药物的剂量和施用途径。
多肽可以任选地作为药学上可接受的盐施用，例如在制药工业中常用的无毒的酸加成盐或金属络合物。酸加成盐的实例包括有机酸如乙酸，乳酸，扑酸，马来酸，柠檬酸，苹果酸，抗坏血酸，琥珀酸，苯甲酸，棕榈酸，辛二酸，水杨酸，酒石酸，甲磺酸，甲苯磺酸或三氟乙酸等；聚合酸如单宁酸，羧甲基纤维素等；和无机酸如盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸等。金属络合物包括锌，铁等。在一个实例中，多肽在乙酸钠的存在下配制以增加热稳定性。
用于口服使用的制剂包括含有活性成分的片剂，所述活性成分与无毒的药学上可接受的赋形剂一起在混合物中。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂或填充剂(例如蔗糖和山梨糖醇)，润滑剂，助流剂和抗粘合剂(例如硬脂酸镁，硬脂酸锌，硬脂酸，二氧化硅，氢化植物油或滑石)。
用于口服使用的制剂也可以作为咀嚼片，或作为其中活性成分与惰性固体稀释剂混合的硬明胶胶囊，或作为其中活性成分与水或油介质混合的软明胶胶囊提供。
治疗有效剂量是指产生为此而施用的治疗效果的剂量。确切的剂量将取决于待治疗的疾病，并且可以由本领域技术人员使用已知技术确定。通常，多肽以每天约0.01μg/kg至约50mg/kg，优选每天0.01mg/kg至约30mg/kg，最优选每天0.1mg/kg至约20mg/kg施用。多肽可以每天施用(例如，每天一次，两次，三次或四次)，或优选较不频繁地施用(例如，每周，每两周，每三周，每月或每季度)。此外，如本领域已知的，根据年龄以及体重，一般健康状况，性别，饮食，施用时间，药物相互作用以及疾病的严重程度进行调整可以是必要的，并且可以将由本领域技术人员用常规实验确定。
本文公开的psma结合多肽可以单独施用或与一种或多种另外的疗法(例如化疗，放疗，免疫治疗，外科手术干预或这些的任何组合)组合施用。如上所述，长期治疗与在其他治疗策略情况下的辅助治疗同样可能。
在这样的方法的某些实施方式中，一种或多种多肽治疗剂可一起(同时)或在不同时间(依次)施用。此外，多肽治疗剂可以与用于治疗癌症或抑制血管生成的另外类型的化合物一起施用。
在某些实施方式中，本发明的抗psma抗体试剂可以单独使用。
在某些实施方式中，出于诊断目的，可以标记或不标记结合多肽或其片段。通常，诊断试验需要检测由结合多肽与psma的结合产生的复合物的形成。与抗体类似，结合多肽或片段可被直接标记。可以使用各种标记，包括但不限于放射性核素，荧光剂，酶，酶底物，酶辅因子，酶抑制剂和配体(例如生物素，半抗原)。许多适当的免疫测定法是本领域技术人员已知的(参见，例如，美国专利3,817,827；3,850,752；3,901,654和4,098,876)。当未作标记时，结合多肽可用于试验，例如凝集试验。未标记的结合多肽还可以与可用于检测结合多肽的另外的(一种或多种)适合试剂(例如具有与结合多肽的反应性的标记抗体或其他适合试剂(例如标记蛋白a))组合使用。
在一个实施方式中，本发明的结合多肽可用于酶免疫测定，其中本发明的多肽与酶缀合。当包含psma蛋白的生物样品与本发明的结合多肽组合时，在结合多肽与psma蛋白之间发生结合。在一个实施方式中，将含有表达psma蛋白的细胞(例如内皮细胞)的样品与本发明的抗体组合，并且在结合多肽与携带由结合多肽识别的psma蛋白的细胞之间发生结合。可以将这些结合的细胞与未结合的试剂分离，并且可以例如通过使样品与当酶对其起作用时产生颜色或其它可检测变化的酶的底物接触而确定特异性结合细胞的结合多肽-酶缀合物的存在。在另一个实施方式中，本发明的结合多肽可以是未标记的，并且可以添加识别本发明的结合多肽的第二标记多肽(例如，抗体)。
在某些方面，还可以制备用于检测生物样品中psma蛋白存在的试剂盒。这样的试剂盒将包括与所述受体的psma蛋白或一部分结合的psma结合多肽，以及适用于检测结合多肽与受体蛋白或其部分之间的复合物的存在的一种或多种辅助试剂。本发明的多肽组合物可以单独或与对其它表位具有特异性的另外的抗体组合以冻干形式提供。可以被标记或未标记的结合多肽和/或抗体可以与辅助成分(例如，缓冲液，如tris，磷酸盐和碳酸盐，稳定剂，赋形剂，杀生物剂和/或惰性蛋白质，如牛血清白蛋白)一起被包括在试剂盒中。例如，结合多肽和/或抗体可以与辅助成分作为冻干混合物提供，或者辅助成分可以单独提供以供用户组合。通常，这些辅助材料将基于活性结合多肽或抗体的量以小于约5重量％存在，并且通常将基于多肽或抗体浓度以至少约0.001重量％的总量存在。当使用能够结合结合多肽的第二抗体时，可以在试剂盒中提供这样的抗体，例如在单独的小瓶或容器中。第二抗体(如果存在)通常被标记，并且可以以与上述抗体制剂类似的方式配制。
多肽序列使用标准的一或三字母缩写表示。除非另有说明，否则每个多肽序列在左侧具有氨基末端而在右侧具有羧基末端；每个单链核酸序列和每个双链核酸序列的顶链在左侧具有5'末端而在右侧具有3'末端。也可以通过解释其如何与参比序列不同而描述特定的多肽序列。
现在已经详细描述了本发明，通过参考以下实施例将更清楚地理解本发明，这些实施例仅仅出于说明的目的而被包括，而非旨在成为本发明的限制。
实施例
实施例1
识别了人抗psma抗体，并且轻链和重链可变区的氨基酸序列如下表3所述。
该实施例说明了通过流式细胞法测定的抗psma抗体与在lncap人前列腺癌细胞上表达的内源性人psma的结合。抗体的ec50值如下测定。
用无酶细胞解离缓冲液(gibco)收获表达psma的lncap细胞，并转移到v底96孔板(50,000个细胞/孔)。将细胞与facs缓冲液(pbs+2％fbs)+nan3中的抗psma抗体psgb11，psgb12，psgc12，psgd4，psgd6和psa11的连续稀释一起在冰上孵育45分钟。对照抗体(cig)是阴性对照，并且是同种型匹配的、非特异性的(即不结合psma并且也不结合细胞)抗体。在facs缓冲液中洗涤1次后，加入藻红蛋白缀合的抗人igg(γ-链特异性)的1:1000稀释，并孵育30分钟。在最终洗涤后，在intellicyt高通量流式细胞仪(htfc)上测量荧光强度。
使用graphpadprism软件和非线性回归拟合分析数据。数据点显示为阳性标记细胞的中值荧光强度(mfi)+/-标准误差。ec50值报告为抗体达到结合psma表达细胞的最大程度psma抗体的50％的浓度。
平行地，还在pc3(前列腺癌细胞系，其不内源性表达人类psma)上用相同方法评估细胞结合，从而作为阴性对照。
癌症二者(psma特异性lncap细胞和阴性对照pc3细胞)的结合试验的结果在图1(a-d)中提供。如图1a和b所示，相对于阴性igg对照，抗psma抗体psgb11，psgb12，psgc12，psgd4，psgd6和psa11强力结合表达psma的lncap细胞(参见图1a)。而且，如图(c)和(d)所述，抗psma抗体psgb11，psgb12，psgc12，psgd4，psgd6和psa11显示与不表达人psma的细胞(pc3细胞)很少的结合至不结合，因为细胞显示与阴性对照抗体相似的结果(参见图1(c))。因此，图1(a-d)中的结果显示抗体对表达psma的细胞(包括表达psma的癌细胞)是特异性的。
此外，本文识别的抗psma抗体显示在lncappsma表达细胞的纳摩尔范围内的ec50值，如下表1所示。这些数据证实表3所述抗体与内源性psma的强力且特异性的结合。
表1：
实施例2
该实施例说明显示使用二抗-药物缀合技术(“secondaryantibody-drugconjugatesastoolsforadcdiscovery”，helenmao，poster，ibc24thannual，2013)在细胞毒性试验中评估抗psma抗体的体外数据。该实施例证明抗psma抗体用作抗体药物缀合物的潜力。
用无酶细胞解离缓冲液(gibco)收获表达psma的前列腺癌细胞(lncap，atcccrl-1740tm)，接种到白色96孔透明底板(90μl中2000个细胞/孔)中，并使其在37℃下粘附过夜。在实验中使用抗psma抗体psgf9，psgc9，psgd6，psgd3，psge10，psgh3，psgb11，psgd4，psgb12和psa11。抗体与蛋白g(pg)-mmaf(单甲基阿司他汀f，concortisbiosystems)在细胞培养基中以1:4的摩尔比预复合。对照抗体(cig)是同种型匹配的、非特异性的(即不结合psma)抗体。使用单独的pgmmaf作为阴性对照。在室温下10分钟后，在细胞培养基中制备抗体-蛋白g-mmaf复合物的连续稀释物，在室温下再孵育10分钟，并一式三份加到细胞(10μl/孔)中。在一些实验中，将板在37℃下孵育4天(“无洗涤方法”)。在其他实验(“2小时洗涤方法”)中，将板在37℃下孵育2小时，吸出培养基。然后将细胞用全培养基洗涤一次，并在37℃下孵育4天之前留在新鲜的全培养基中。对于所有实验，然后如下分析细胞增殖：向每个孔中加入100μlcelltiterglo缓冲液(promega)。将板在室温下振荡孵育20分钟。然后在flexstation3平板读数器(moleculardevice)上测量发光信号。数据报告为相对发光单位。在graphpad棱柱中产生剂量-响应曲线，并使用非线性回归拟合(log(抑制剂)vs.响应——可变斜率方程)计算ic50值。
结果如图2(a-c)和下表2所示。图2a-c中所示的结果显示各自与mmaf缀合的包含抗体psgf9，psgc9，psgd6(图2a)；psgd3，psge10，psgh3，psgb11(图2b)；psgd4，psgb12和psa11(图2c)的抗psmaadc可诱导lncap癌细胞中的细胞杀伤。相比之下，单独的mmaf和igg对照(参见图2a)对细胞死亡具有很少的影响至没有影响，并且具有高细胞存活率。
使用相同方法与psma阴性前列腺癌细胞(pc-3，atcccrl-1435)评估抗psma抗体(psgf9，psgc9，psgd6，psgd3，psge10，psgh3，psgb11，psgd4，psgb12和psa11)/蛋白g-mmaf复合物的细胞杀伤的非特异性。如图2d所示，结果表明，当与细胞毒素如mmaf复合时，抗psma抗体在psma阴性癌细胞中不诱导细胞杀伤。因此，图1和图2显示在不过表达psma的细胞上观察到很少至没有非特异性细胞杀伤，表明未来的psma抗体药物缀合物(adc)的良好选择性指数。总的来说，这说明了psma抗体作为抗体-药物缀合物的潜力。
测定抗psma-mmafadc的ic50值，并在下表2中描述。为了证实对这些类型的二级缀合物观察到的细胞杀伤是由于所测试的特异性内化的缀合物，洗掉了未结合的缀合物(表2中的2小时洗涤方法见)。如表2所述，ic50值在纳摩尔范围内。
表2：
实施例3
除了本文所述的抗psma抗体与psma结合并且当与毒素缀合时也诱导细胞死亡的能力之外，在octet上测定抗体psa11和psgb11的亲和力值。如图3所述，抗psma抗体psa11的kd为约6.7×10-10m，而抗体psa11(图4所示)的kd为约6.8×10-10m。
具体地，使用磺基-n-羟基琥珀酰亚胺/n-乙基-n'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(sulfo-nhs/edc)偶联法，用抗体(乙酸缓冲液中15μg/ml，ph5.0)涂布胺反应性二代(ar2g)传感器。用1mph8.5乙醇胺淬灭传感器。通过将传感器移动到连续稀释的重组人psma/his(在pbs缓冲液中)孔中收集数据，然后通过将传感器转移到pbs孔中解离数据。使用1:1结合模型拟合数据。图3和图4提供试验结果。
表3：氨基酸重链和轻链可变域
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