本发明属于抗凝血材料技术领域，尤其涉及一种抗凝血材料及其制备方法。
背景技术：
我国每年心脑血管疾病死亡人数有数百万，并在逐年增加，因此，血液接触材料是目前临床上最为紧缺的生物材料(医疗器械)，尤其是人工血管移植，即便是得到临床应用的中、大口径人工血管，在我国产品也非常稀少，国产产品每年的使用比例只有20％左右，而小口径人工血管的移植还是临床空白，其最大的问题就是容易形成血栓，远期通畅率较差。
目前医学上应用的人工血管产品主要是由涤纶、膨体聚四氟乙烯等合成材料制成的，在大中口径人工血管方面有临床应用，但这些合成材料细胞相容性差，不利于内皮化，容易形成血栓，影响组织愈合。家蚕蚕丝是由家蚕合成与分泌的天然动物蛋白，来源广泛，其丝素蛋白具有良好的生物相容性，由20种人体可吸收的氨基酸组成，最终降解产物为氨基酸或小肽，易被细胞吸收或吞噬，不会引起明显的免疫反应。已有大量的文献研究表明丝素蛋白材料能够支持多种细胞的生长，在组织工程材料研究方面越来越深入，并取得了突破性的进展，近来，应用于血管组织工程上也越来越受到关注。
虽然丝素蛋白材料本身具有细胞相容性和组织相容性的优势，但作为外源材料，在与血液接触时都会刺激凝血系统，诱发溶血或凝血。为了提高丝素材料的抗凝血性能，国内外一些研究人员也关注到了改善丝素蛋白材料的抗凝血性能研究。
目前，对丝素蛋白的抗凝血改性主要报导了接枝具有抗凝作用的高分子及硫酸化或肝素化方法。如She等将肝素在温和的条件下加入丝素/壳聚糖支架中，增强了抗凝性(Polymer International,2010,59(1):55-61)；Liu等利用静电纺丝技术将氯磺酸处理过的丝素蛋白制成丝素纳米支架，硫酸化纳米丝素支架的抗凝血性显著增强(Biomaterials,2011,32(15):3784-3793)；Wang等利用静电纺丝技术制备了肝素改性丝素纳米材料，体外凝血测试结果表明改性后丝素纳米材料的抗凝血性远高于纯丝素(International Journal of Biological Macromolecules，2011，48(2):345-353)；用氯磺酸制备的硫酸化丝素蛋白的抗凝血活性要比硫酸制备的硫酸化丝素大大提高(Biomaterials,2004,25(3)：377-383)，但远远不及肝素。肝素改性丝素蛋白材料抗凝血性研究已存在知识产权(如抗凝血真皮支架的制备，申请号为CN200910223207.4的中国专利；纳米纤维人工血管及制备方法，申请号为CN200910228843.6的中国专利)，所以引入肝素是目前丝素材料抗凝血性改性的主要方法，但肝素属于一种凝血酶间接抑制剂，抗凝作用要依赖抗凝血酶和特定的辅因子，所以即使材料中共混或键合的肝素不一定能或都能发挥抗凝作用。
水蛭素是一种凝血酶特异性抑制剂，可以直接抑制血栓形成，还可以对已形成的血栓有一定的溶栓作用。我们已经研究开发了一种水蛭素/丝素蛋白抗凝血材料(一种抗凝血丝素材料及其制备方法，申请号为ZL201310250951.X的中国专利；一种抗凝血丝素膜及其制备方法，申请号为ZL201310251819.0的中国专利；Journal of Biomedical Materials Research Part B,2015:103B:556–562)，但深入研究发现，将研究结果与水蛭素抑制凝血酶活性的机理结合起来分析，采用共价键结合的改性方法会降低水蛭素的活性。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种抗凝血材料及其制备方法，该方法制备的抗凝血材料可抑制凝血酶活性、持续具有抗凝血功能。
本发明提供了一种抗凝血材料的制备方法，包括以下步骤：
S1)将丝素蛋白溶液、聚乙二醇二胺与交联剂混合，反应后，得到聚乙二醇二胺阳离子化的丝素蛋白材料；
S2)将所述聚乙二醇阳离子化的丝素蛋白材料用水浸泡，得到浸泡后的阳离子化丝素蛋白材料；
S3)将所述浸泡后的阳离子化丝素蛋白材料浸渍于水蛭素溶液中，得到抗凝血材料。
优选的，所述丝素蛋白溶液的质量浓度为3％～20％。
优选的，所述聚乙二醇二胺的质量与丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量比为A，0＜A≤0.5。
优选的，所述交联剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、2-吗啉乙磺酸、碳化二亚胺、京尼平与聚乙二醇甘油醚中的一种或多种。
优选的，所述交联剂的质量为丝素蛋白溶液中丝素蛋白质量的B％，B≥20。
优选的，所述步骤S1)中反应的时间为10～30min。
优选的，所述步骤S2)具体为：
将所述聚乙二醇阳离子化的丝素蛋白材料用水浸泡，每隔2～4h更换浸泡所用的水，浸泡1～3天后，得到浸泡后的阳离子化丝素蛋白材料。
优选的，所述水蛭素溶液中水蛭素的浓度为C U/ml，0＜C≤500。
优选的，所述步骤S3)中浸渍的时间为2～10h。
本发明还提供了一种抗凝血材料，包括经聚乙二醇二胺阳离子化的丝素蛋白与水蛭素。
本发明提供了一种抗凝血材料的制备方法，包括以下步骤：S1)将丝素蛋白溶液、聚乙二醇二胺与交联剂混合，反应后，得到聚乙二醇二胺阳离子化的丝素蛋白材料；S2)将所述聚乙二醇阳离子化的丝素蛋白材料用水浸泡，得到浸泡后的阳离子化丝素蛋白材料；S3)将将所述浸泡后的阳离子化丝素蛋白材料浸渍于水蛭素溶液中，得到抗凝血材料。与现有技术相比，本发明提供的制备方法保护了与凝血酶结合区域的官能团(-COOH、-NH2、-OH)不因被反应而影响与凝血酶结合的结构域、又能使水蛭素以较强结合力的离子键结合于聚乙二醇双胺阳离子化的丝素蛋白上，达到稳定发挥抗凝的作用，从而使得到的抗凝血材料具有显著抑制凝血酶活性的功能，尤其可应用于防止如人工血管的新生内膜增生和术后血栓的形成。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种丝素蛋白抗凝血材料，包括经聚乙二醇二胺与交联剂阳离子化的丝素蛋白与水蛭素。
其中，所述聚乙二醇二胺与丝素蛋白的质量比优选为A，0＜A≤0.5，更优选为0.01～0.5，再优选为0.01～0.2，最优选为0.05～0.1；在本发明提供的一些实施例中，所述聚乙二醇二胺与丝素蛋白的质量比优选为0.005；在本发明提供的一些实施例中，所述聚乙二醇二胺与丝素蛋白的质量比优选为0.05；在本发明提供的另一些实施例中，所述聚乙二醇二胺与丝素蛋白的质量比优选为0.1。
所述交联剂为本领域技术人员熟知的交联剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、2-吗啉乙磺酸、碳化二亚胺、京尼平与聚乙二醇甘油醚中的一种或多种；所述交联剂的质量优选为丝素蛋白质量的B％，B≥20，更优选为20％～50％。
本发明还提供了一种上述丝素蛋白抗凝血材料的制备方法，包括以下步骤：S1)将丝素蛋白溶液、聚乙二醇二胺与交联剂混合，反应后，得到聚乙二醇二胺阳离子化的丝素蛋白材料；S2)将所述聚乙二醇阳离子化的丝素蛋白材料用水浸泡，得到浸泡后的阳离子化丝素蛋白材料；S3)将所述浸泡后的阳离子化丝素蛋白材料浸渍于水蛭素溶液中，得到丝素蛋白抗凝血材料。
本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售或自制均可。
其中，所述丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量浓度优选为3％～20％；所述丝素蛋白为本领域技术人员熟知的丝素蛋白即可，并无特殊的限制，本发明中优选为家蚕丝素蛋白；所述丝素蛋白溶液优选按照以下方法制备：将蚕丝或蚕壳进行脱胶、溶解后，灌注于透析袋内，用去离子水透析，得到丝素蛋白溶液。
其中，所述脱胶的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，本发明中优选将蚕丝或蚕壳在碳酸钠水溶液中加热处理，水洗，拉松后，得到脱胶的丝素纤维；所述碳酸钠水溶液为本领域技术人员熟知的水溶液即可，并无特殊的限制，本发明中优选为浓度0.1％～1％的碳酸钠水溶液，更优选为0.1％～0.5％，再优选为0.2％～0.3％；所述蚕丝或蚕壳与碳酸钠水溶液的比例优选为(0.1～10)g：50ml，更优选为(0.5～5)g：50ml，再优选为(0.5～2)g：50ml，最优选为1g：50ml；所述加热处理的温度优选为98℃～100℃；所述加热处理的时间优选为20～40min；所述加热处理的次数优选为2～4次。
将脱胶的丝素纤维溶解，得到丝素溶解液；所述溶解的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，本发明中优选为将脱胶的丝素纤维与于氯化钙-乙醇的水溶液混合，加热溶解后，得到丝素溶解液；所述脱胶的丝素纤维与氯化钙-乙醇的水溶液的比例优选为(0.1～5)g：10ml，更优选为(0.5～3)g：10ml，再优选为(1～2)g：10ml；所述氯化钙与乙醇的摩尔比优选为1：2；所述加热溶解的温度优选为60℃～80℃，更优选为65℃～75℃，最优选为70℃；所述加热溶解的时间优选为1～3h，更优选为2～3h。
将丝素溶解液灌注于透析袋内，用去离子水透析，得到丝素蛋白溶液；所述透析袋为半透膜，其截留分子量优选为12.0～16.0kDa；透析时优选每隔1～3h，更优选每隔2h用新的去离子水或纯净水更换透析所用的去离子水；所述透析的时间优选为3天。
将丝素蛋白溶液、聚乙二醇二胺与交联剂混合，优选先将丝素蛋白溶液与聚乙二醇二胺混合后，再加入交联剂；所述聚乙二醇二胺的质量与丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量比优选为A，0＜A≤0.5，更优选为0.01～0.5，再优选为0.01～0.2，最优选为0.05～0.1；所述交联剂为本领域技术人员熟知的交联剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、2-吗啉乙磺酸、碳化二亚胺、京尼平与聚乙二醇甘油醚中的一种或多种，更优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺与2-吗啉乙磺酸；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺与2-吗啉乙磺酸的质量比优选为2:1:2；所述交联剂的质量优选为丝素蛋白溶液中丝素蛋白质量的B％，B≥20，更优选为20％～50％。
然后进行反应；所述反应的时间优选为10min～1h，更优选为15～45min，再优选为20min。
反应后，优选进行干燥，得到聚乙二醇二胺阳离子化的丝素蛋白材料；所述干燥可为加热干燥，也可为冷冻干燥；干燥时优选将聚乙二醇二胺阳离子化的丝素蛋白溶液倒入平板内，再进行加热干燥或冷冻干燥；所述平板优选为聚苯乙烯板；所述加热干燥的温度优选为50℃～70℃。
将所述聚乙二醇二胺阳离子化的丝素蛋白材料用水浸泡；所述水优选为去离子水；所述浸泡的时间优选为1～3天，更优选2～3天，再优选为2天；在浸泡时，优选每隔2～4h更换浸泡所用的水；浸泡后，优选取出风干或冻干后，得到浸泡后的阳离子化丝素蛋白材料。
将所述浸泡后的阳离子化丝素蛋白材料浸渍于水蛭素溶液中；所述水蛭素溶液中水蛭素的浓度优选为C U/ml，0＜C≤500，更优选为5～500U/ml，再优选为5～300U/ml，再优选为5～200U/ml，再优选为5～100U/ml，再优选为5～50U/ml，最优选为5～20U/ml；所述浸泡后的阳离子化丝素蛋白材料与水蛭素溶液的比例优选为每毫克材料1～10ml水蛭素溶液，更优选为每毫克材料1～8ml水蛭素溶液，再优选为每毫克材料1～5ml水蛭素溶液，再优选为每毫克材料2～5ml水蛭素溶液，最优选为每毫克材料3ml水蛭素溶液；所述浸渍的时间优选为2～10h，更优选2～8h，再优选为4～6h，最优选为5h。
浸渍后，优选取出风干，再用缓冲液冲洗，风干后，得到抗凝血材料；所述缓冲液优选为磷酸盐缓冲液(PBS)；所述冲洗的次数优选为3～4次。
本发明提供的制备方法保护了与凝血酶结合区域的官能团(-COOH、-NH2、-OH)不因被反应而影响与凝血酶结合的结构域、又能使水蛭素以较强结合力的离子键结合于聚乙二醇双胺阳离子化的丝素蛋白上，达到稳定发挥抗凝的作用，从而使得到的抗凝血材料具有显著抑制凝血酶活性的功能，尤其可应用于防止如人工血管的新生内膜增生和术后血栓的形成。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种抗凝血材料及其制备方法进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售。
实施例1
1.1将家蚕生丝或烘干分层的茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98℃～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
1.2称取脱胶后的家蚕丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩尔比1:2的氯化钙-乙醇的水溶液(乙醇与水的摩尔比1:4)中，70℃溶解2小时得家蚕丝素溶解液。
1.3将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为12.0～16.0kDa范围，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。调整透析后的丝素蛋白溶液浓度为4％。
1.4按质量比100:5配置丝素蛋白与聚乙二醇双胺的混合溶液、搅拌均匀，向上述混合溶液中添加质量比为丝素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺搅拌均匀、10％的N-羟基琥珀酰亚胺和20％的2-吗啉乙磺酸，搅拌10分钟后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中60℃烘干，得到聚乙二醇二胺阳离子化的丝素蛋白材料。
1.5将聚乙二醇二胺阳离子化的丝素蛋白材料放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干，得到浸泡后的阳离子化丝素蛋白材料。
1.6将浸泡后的阳离子化丝素蛋白材料剪成一定质量的小片，按照每毫克材料3ml水蛭素溶液的比例浸渍于10U/mL的水蛭素溶液，5h后取出静置风干后用PBS冲洗3～4次，最后风干，得到抗凝血材料。
将实施例1中得到的抗凝血材料进行抗凝血酶活性测试，检测450nm处凝血酶活性的吸光度值为纯凝血酶活性的吸光度值的50％，即实施例1得到的抗凝血材料能够明显地抑制凝血酶的活性，说明水蛭素牢固地结合于丝素蛋白材料上了。
实施例2
2.1将家蚕生丝或烘干分层的茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98℃～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.2称取脱胶后的家蚕丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩尔比1:2的氯化钙-乙醇的水溶液(乙醇与水的摩尔比1:4)中，70℃溶解2小时得家蚕丝素溶解液。
2.3将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为12.0～16.0kDa范围，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。调整透析后的丝素蛋白溶液浓度为5％。
2.4按质量比100:10配置丝素蛋白与聚乙二醇双胺的混合溶液、搅拌均匀，向上述混合溶液中添加质量比为丝素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺搅拌均匀、10％的N-羟基琥珀酰亚胺和20％的2-吗啉乙磺酸，搅拌10分钟后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中冷冻干燥，得到聚乙二醇二胺阳离子化的丝素蛋白材料。
2.5将聚乙二醇二胺阳离子化的丝素蛋白材料放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干或冻干，得到浸泡后的阳离子化丝素蛋白材料。
2.6将浸泡后的阳离子化丝素蛋白材料剪成一定质量的小片，按照每毫克材料3ml水蛭素溶液的比例浸渍于5U/mL的水蛭素溶液，5h后取出静置风干后用PBS冲洗3～4次，最后风干，得到抗凝血材料。
将实施例2得到的抗凝血材料进行抗凝血酶活性测试，检测450nm处凝血酶活性的吸光度值为纯凝血酶活性的吸光度值的52％，即实施例2中得到的抗凝血材料能够明显地抑制凝血酶的活性。说明水蛭素牢固地结合于丝素蛋白材料上了。
实施例3
3.1将家蚕生丝或烘干分层的茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98℃～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
3.2称取脱胶后的家蚕丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩尔比1:2的氯化钙-乙醇的水溶液(乙醇与水的摩尔比1:4)中，70℃溶解2小时得家蚕丝素溶解液。
3.3将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为12.0～16.0kDa范围，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。调整透析后的丝素蛋白溶液浓度为5％。
3.4按质量比100:10配置丝素蛋白与聚乙二醇双胺的混合溶液、搅拌均匀，向上述混合溶液中添加质量比为丝素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺搅拌均匀、10％的N-羟基琥珀酰亚胺和20％的2-吗啉乙磺酸，搅拌10分钟后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中冷冻干燥，得到聚乙二醇二胺阳离子化的丝素蛋白材料。
3.5将聚乙二醇二胺阳离子化的丝素蛋白材料放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干或冻干，得到浸泡后的阳离子化丝素蛋白材料。
3.6将浸泡后的阳离子化丝素蛋白材料剪成一定质量的小片，按照每毫克材料3ml水蛭素溶液的比例浸渍于20U/mL的水蛭素溶液，5h后取出静置风干后用PBS冲洗3～4次，最后风干，得到抗凝血材料。
将实施例3中得到的抗凝血材料进行抗凝血酶活性测试，检测450nm处凝血酶活性的吸光度值为纯凝血酶活性的吸光度值的15％，即实施例3中得到的抗凝血材料能够显著地抑制凝血酶的活性。说明水蛭素牢固地结合于丝素蛋白材料上了。
比较例1
1.1将家蚕生丝或烘干分层的茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98℃～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
1.2称取脱胶后的家蚕丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩尔比1:2的氯化钙-乙醇的水溶液(乙醇与水的摩尔比1:4)中，70℃溶解2小时得家蚕丝素溶解液。
1.3将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为12.0～16.0kDa范围，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。调整透析后的丝素蛋白溶液浓度为5％。
1.4向丝素蛋白水溶液中加入质量比为丝素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺搅拌均匀、10％的N-羟基琥珀酰亚胺和20％的2-吗啉乙磺酸，搅拌10分钟后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中60℃烘干或冷冻干燥。再生丝素材料放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干(烘干膜)或冻干(多孔丝素)。
1.5将纯的再生丝素多孔材料剪成一定面积的小片，按照每毫克材料3ml水蛭素溶液的比例浸渍于20U/mL的水蛭素溶液，5h后取出静置风干后用PBS冲洗3～4次，最后风干，得到复合材料。
将比较例1中得到的复合材料进行抗凝血酶活性测试，检测450nm处凝血酶活性的吸光度值为纯凝血酶活性的吸光度值的99％，即比较例1中得到的复合材料没有能有效地抑制凝血酶的活性，说明水蛭素没有被牢固地加载到丝素蛋白材料上。
比较例2
2.1将家蚕生丝或烘干分层的茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98℃～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.2称取脱胶后的家蚕丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩尔比1:2的氯化钙-乙醇的水溶液(乙醇与水的摩尔比1:4)中，70℃溶解2小时得家蚕丝素溶解液。
2.3将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为12.0～16.0kDa范围，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。调整透析后的丝素蛋白溶液浓度为4％。
2.4按质量比100:0.5配置丝素蛋白与聚乙二醇双胺的混合溶液、搅拌均匀，向上述混合溶液中添加质量比为丝素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺搅拌均匀、10％的N-羟基琥珀酰亚胺和20％的2-吗啉乙磺酸，搅拌10分钟后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中60℃烘干。聚乙二醇双胺改性的阳离子化再生丝素材料放入盛有去离子水的容器内浸泡2天，每隔2～4小时更换一次容器内的去离子水，2天后取出风干。
2.5将阳离子化的再生丝素膜剪成一定面积的小片，浸渍于10U/mL的水蛭素溶液，静置风干后用PBS冲洗3～4次，最后风干。
将制备好的加载水蛭素的丝素膜进行抗凝血酶活性测试，检测450nm处凝血酶活性的吸光度值为纯凝血酶活性的吸光度值的95％，即材料没有明显抑制凝血酶的活性，说明水蛭素没有被牢固地加载到丝素蛋白材料上。
由于丝素蛋白与聚乙二醇双胺质量比100:0.5的丝素蛋白上接枝的阳离子NH3+数量极少，那么以离子键结合上去的水蛭素也极少，因而没有明显的抗凝血活性。