本发明具体涉及一种联合抑制肿瘤的组合物。
背景技术：
乳腺癌是全球女性死亡的主要原因之一。虽然手术加上辅助化疗在很大程度上提高了生存率，有仍然有相当部分的患者较短时间内即发生复发和转移，预后极差。因此，迫切需要开发更加有效的治疗和预后恢复的靶点药物。
aurora激酶属于苏氨酸/丝氨酸激酶家族，包括auroraa(aurka)，aurorab(aurkb)及aurorac(aurkc)三个成员。其中aurka激酶调节复杂的生物学过程，涉及到磷酸化/去磷酸化、降解与转录调控，并在细胞分裂期发挥重要的生理功能，还对维持细胞增殖与稳定细胞周期发挥着关键作用。
aurka激酶在许多癌细胞(如肺癌、乳腺癌、直肠癌、胰腺癌)中过度表达。aurka激酶的过度表达易导致细胞有丝分裂异常，与肿瘤的发生、发展及原发耐药有着密切的关系。抑制aurka激酶的活性可以导致肿瘤细胞多倍体的聚集、促进细胞凋亡、阻断细胞增殖。随着对aurka激酶活性位点晶体结构的阐明，一些世界顶尖的抗癌药物生产商纷纷致力于aurka激酶小分子靶向药物的研发。其中，aurka激酶特异性抑制剂mk-5108(merck公司)及mln8054(takeda公司)在i期临床试验后即宣告失败；alisertib(又名mln8237，takeda公司)在白血病的治疗中取得了较好的疗效，目前正在进行ⅲ期临床试验。
aurka激酶小分子靶向药物的研发正在如火如荼的进行。但是真正获得成功的是少数。很多在i期实验后就宣告失败，表明我们对aurka在生命活动中的功能和机制的认识尚需进一步完善。单独靶向aurka激酶活性可能不能达到抑制肿瘤的目的。
本课题组2016年初在《自然-通讯(naturecommunications)》发表论文(题目为nuclearaurkaacquireskinase-independenttransactivatingfunctiontoenhancebreastcancerstemcellphenotype，natcommun.2016jan19；7:10180.doi:10.1038/ncomms10180.)首次揭示aurka在肿瘤中的异常细胞定位，产生非激酶活性(转录激活活性)依赖的促癌功能，即可作为核转录因子促进乳腺癌干细胞自我更新，使其对激酶抑制剂(靶向药物)产生抵抗，导致耐药。文章指出通过纠正该靶标激酶的异常细胞定位，抑制其核转录功能，就有可能克服耐药性。但是对于如何靶向aurka转录激活活性或者aurka转录激活活性与哪些细胞信号通道相关，文章中没有任何提示。
本发明是在前面发现aurka有转录激活活性的基础上，发现aurka能够与foxm1结合，靶向foxm1就能够抑制aurka转录激活活性。因此，发明人提供了一种新的潜在的针对细胞质和细胞核中的aurka功能的治疗策略，也就是联合应用aurka激酶活性抑制剂和foxm1转录活性抑制剂治疗肿瘤，能够有效的清除乳腺癌肿瘤干细胞，以克服乳腺癌耐药的发生。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种联合抑制肿瘤的组合物。
本发明所采取的技术方案是：
一种联合抑制肿瘤的组合物，包括aurka激酶活性抑制剂和foxm1转录活性抑制剂。
优选的，aurka激酶抑制剂为aurka蛋白激酶活性小分子抑制剂。
优选的，aurka蛋白激酶活性小分子抑制剂包括aki603，是一个含有嘧啶环的小分子化合物，为本课题组自主设计合成。发明人研究证明aki603可以有效抑制aurka的激酶活性。相应文章已经发表在molcanther上(题目为anovelsmallmoleculeaurorakinaseinhibitorattenuatesbreasttumor-initiatingcellsandovercomesdrugresistance，molcancerther.2014aug；13(8):1991-2003.doi:10.1158/1535-7163.mct-13-1029.)。
aki603分子结构如下所示：
优选的，foxm1抑制剂为foxm1蛋白转录激活活性小分子抑制剂。
优选的，foxm1蛋白转录激活活性小分子抑制剂包括硫链丝菌肽(thiostrepton,tst)，购自sigma-aldrich公司。
thiostrepton简称tst的分子结构如下所示：
硫链丝菌肽(thiostrepton,tst)是一种提取于链霉菌的天然噻唑类抗生素，具有广谱的抗革兰阴性、阳性细菌的作用，在兽医中常用来治疗乳腺炎。2011年发表在《自然-化学(naturechemistry)》上的文章(natchem.2011aug21；3(9):725-31.doi:10.1038/nchem.1114.)表明，tst可以直接抑制foxm1与dna双螺旋的结合，从而抑制foxm1的转录活性。
优选的，所述肿瘤为腺上皮性肿瘤。
优选的，所述腺上皮性肿瘤包括乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌。
其中结直肠癌包括结肠癌和直肠癌。
优选的，所述腺上皮性肿瘤为乳腺癌。
aurka激酶活性抑制剂和foxm1转录活性抑制剂的联合应用在制备治疗肿瘤药物中的应用。
优选的，aurka激酶抑制剂为aurka蛋白激酶活性的小分子抑制剂。
优选的，foxm1抑制剂为foxm1蛋白转录激活活性的小分子抑制剂。
优选的，所述肿瘤为腺上皮性肿瘤。
优选的，所述腺上皮性肿瘤包括乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌。
其中结直肠癌包括结肠癌和直肠癌。
优选的，所述腺上皮性肿瘤为乳腺癌。
在体内同时抑制aurka激酶活性以及foxm1转录活性的试剂在制备治疗肿瘤药物中的应用。
优选的，所述肿瘤为腺上皮性肿瘤，包括乳腺癌、结直肠癌。
优选的，所述腺上皮性肿瘤为乳腺癌。
本发明的有益效果是：
本发明是在前面发现aurka有转录激活活性的基础上，发现aurka能够与foxm1结合，靶向foxm1就能够抑制aurka转录激活活性。因此，发明人提供了一种新的潜在的针对细胞质和细胞核中的aurka功能的治疗策略，也就是联合应用aurka激酶活性抑制剂和foxm1转录活性抑制剂治疗肿瘤，能够有效的清除乳腺癌肿瘤干细胞，以克服乳腺癌耐药的发生。
发明人通过westernblot实验、肿瘤干细胞体外微球悬浮培养实验和裸鼠体内成瘤实验发现aurka能够促进乳腺癌干细胞自我更新(图1)。进一步研究表明细胞核内aurka与经典转录因子foxm1结合激活foxm1转录从而促进乳腺癌干细胞(图2和图3)。此外，发明人发现foxm1可以激活aurka的转录从而上调aurka蛋白的水平(图4)。这些研究表明aurka和foxm1形成正反馈通路促进乳腺癌肿瘤干细胞。进一步，发明人研究表明，aurka激酶抑制剂aki603和foxm1抑制剂thiostrepton(tst)联合应用可以协同抑制乳腺癌肿瘤干细胞(图5)。
所述正反馈通路的意思是：1)foxm1可以直接转录激活aurka；2)aurka可以通过与foxm1形成二聚体激活foxm1转录。即aurka与foxm1二者互相激活转录，形成正反馈。而foxm1是否是aurka的转录激活活性所必需的唯一的共作用因子，本发明研究中暂时没有确定的答案。
附图说明
图1.aurka能够促进乳腺癌肿瘤干细胞自我更新；
图2.细胞核内aurka与foxm1结合激活foxm1转录；
图3.foxm1促进乳腺癌干细胞自我更新；
图4.foxm1转录激活aurka表达；
图5.aurka激酶抑制剂aki603和foxm1抑制剂thiostrepton联合应用可以协同抑制乳腺癌肿瘤干细胞；
图6.靶向aurka激酶及foxm1转录因子全面抑制aurka激酶及非激酶功能策略示意图。
具体实施方式
中英文对照：
胎牛血清(fbs)，强力霉素(doxycycline)，成纤维细胞生长因子(fgf)，马血清(horseserum)，表皮生长因子(egf)，胰岛素(insulin)，氢化可的松(hydrocortisone)，霍乱毒素(choleratoxin)，青霉素(penicillin)，链霉素(streptomycin)。
主要试剂
胎牛血清购自invitrogen公司；马血清购自hyclone公司，胰岛素购自sigma公司；氢化可的松购自sigma公司；霍乱毒素购自sigma公司；基础培养基dmem/f12购自invitrogen公司。
细胞株和培养基
实施例中涉及到三种细胞的培养。所用到的培养基和配方方法见下说明。
1)mda-mb-231细胞(乳腺癌细胞株)
培养基：dmem添加10％胎牛血清(fbs)，50u/ml青霉素，50mg/ml链霉素。
37℃，5％co2培养，2-3天传代一次。
2)mcf-7细胞(乳腺癌细胞株)
培养基：dmem添加10％胎牛血清(fbs)，50u/ml青霉素，50mg/ml链霉素。
37℃，5％co2培养，2-3天传代一次。
3)293ft细胞(人胚肾细胞株)
培养基：dmem添加10％胎牛血清，50u/ml青霉素，50mg/ml链霉素。
37℃，5％co2培养，2-3天传代一次。
下面结合具体实验，进一步阐述本发明内容。下列实验中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如，《分子克隆实验指南》(第三版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
一、稳定表达aurka和foxm1细胞株的构建
1.aurka和foxm1的克隆和表达载体的构建
用pcr扩增aurka的cdna全长序列(genbankmrna序列号nm_001323303.1；蛋白质序列号np_001310232.1)和foxm1的cdna全长序列(genbankmrna序列号nm_001243088.1；蛋白质序列号np_001230017.1)。将纯化的aurka和foxm1全长序列分别克隆进入慢病毒包装表达载体plvpt上，获得用于包装慢病毒的aurka和foxm1表达质粒plvpt-aurka和plvpt-foxm1。
2.包装病毒
转染前一天接种3×106个293ft细胞于10cm培养皿。
具体步骤如下：
第一天：转染前2-3小时给细胞换新鲜培养基。为每一个需转染的细胞准备两只聚苯乙烯管，标记a、b，分别配置a、b液。a液：pspax215μg，pmd2.g5μg，载体质粒20μg，2mcacl298.4μl，加无菌水至800μl；b液：800ul2×hbs。在震荡溶液b的同时缓缓的将溶液a匀速的滴加到溶液b中，在室温放置30-40分钟。30-40分钟后缓慢的将混合液均匀地滴入培养皿中，轻轻摇晃培养皿使溶液混合均匀，将细胞放入37℃培养箱中。
第二天：转染16h小时后，换液，15ml培养基。
第三天：收集上清保存于4度，换新鲜培养基15ml。
第五天：4℃2000转离心5分钟，收集上清保存于4℃，转移上清至新管，2ml/管分装并冻入-80度保存。
3.感染细胞
转染前一天接种1×105个mcf-7细胞于6孔板(密度10％左右)。
具体步骤如下：
1)取1000μl病毒液与1000μl培养基混合，并加入2μl8mg/ml基因转染增强剂聚凝胺(终浓度为8μg/ml)，混匀；
2)加入细胞中，轻轻摇晃孔板混和；
3)培养2-3天。
4.细胞筛选
1)将培养2-3天的细胞消化，以1:10或1:20传代；
2)传代24h后，加入2ug/ml的嘌呤霉素筛选细胞；
3)抗生素筛选1周后即为阳性克隆。
5.westernblot分析阳性克隆aurka或foxm1是否过表达。
westernblot实验结果见图1a和图3a。实验结果表明，所获得阳性克隆aurka(图1a)或foxm1(图3a)均实现了过表达。
图1和图3中的标注中，c-myc和nanog为干细胞标志物，gapdh为内参，ctrl(control缩写)组为对照，其中对照组中aurka和foxm1均为细胞中固有的，所以也会有少量表达。
gapdh或g3pdh是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)的英文缩写。该基因为管家(housekeeping)基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，故被广泛用作抽提totalrna，poly(a)+rna，westernblot等实验操作的标准化的内参。内参的定义是正常样品中表达水平恒定的分子，通过与内参进行比较，可以判断目的基因或蛋白在处理前后表达是否有变化。
二、稳定表达aurka和foxm1细胞株的功能分析
1、对获得的aurka或foxm1表达阳性的mcf-7细胞克隆及对照组mcf-7细胞进行westernblot分析。westernblot实验结果见图1a和图3a，其中gapdh为内参。
图1a结果显示：在乳腺癌细胞中通过导入aurka表达质粒提高aurka蛋白表达水平可以显著促进干细胞标志物c-myc和nanog的表达(图1a)。
图3a结果显示：在乳腺癌细胞中通过导入fomx1表达质粒提高fomx1蛋白表达水平可以显著促进干细胞标志物c-myc和nanog的表达(图3a)。
2、利用肿瘤干细胞体外微球悬浮培养实验检查aurka或foxm1是否促进乳腺癌干细胞自我更新。
体外微球悬浮培养，包括下列步骤：
悬浮培养液的配制：
基础培养基dmem/f12中添加20ng/ml表皮生长因子；10μg/ml胰岛素；20ng/ml成纤维细胞生长因子(fgf)；1u/mlb27；50u/ml青霉素；50mg/ml链霉素。以下成份于每次新鲜配制时加：0.5μg/ml氢化可的松，6.25u/ml肝素钠。
悬浮培养步骤如下：
1)将处于对数生长期的mcf-7细胞用0.25％的胰酶消化，加入含血清培养液中止胰酶的作用；
2)离心，用pbs洗涤3次后，用新鲜配制的悬浮培养液重悬细胞，吹打均匀；
3)将细胞悬液滴于计数板中，于显微镜下计数每ml细胞数量；
4)细胞计数后，将细胞接种于已加有悬浮培养液的低粘附六孔板中，3000细胞/孔；
5)将细胞置于37℃，4％co2培养箱中培养2周，其间每三天加入500μl新鲜培养液；
6)2周后于倒置显微镜下观察细胞成球大小。
结果如图1b和图3b所示，在稳定表达aurka(图1b)或foxm1(图3b)的mcf-7乳腺癌细胞成球能力显著强于对照细胞。
三、稳定敲低aurka和foxm1细胞株的构建
1.aurka和foxm1敲低载体的构建
通过invitrogen公司合成敲低aurka和foxm1的干扰片段各两对，分别如下：
shaurka-1正向片段：
5'-ccggggcaaccagtgtacctcatctcgagatgaggtacactggttgccttttt-3'(seqidno：1)；
shaurka-1反向片段：
5'-attaaaaaggcaaccagtgtacctcatctcgagatgaggtacactggttgcc-3'(seqidno：2)。
shaurka-2正向片段：
5'-ccggattcttcccagcgcgttccctcgagggaacgcgctgggaagaat-3'(seqidno：3)；
shaurka-2反向片段：
5'-aattaaaaaattcttcccagcgcgttccctcgagggaacgcgctgggaagaat-3'(seqidno：4)。
shfoxm-1正向片段：
5'-ccgggcccaacaggagtctaatcaactcgagttgattagactcctgttgggcttttt-3'(seqidno：5)；
shfoxm-1反向片段：
5'-aattaaaaagcccaacaggagtctaatcaactcgagttgattagactcctgttgggc-3'(seqidno：6)。
shfoxm-2正向片段：
5'-ccgggccaatcgttctctgacagaactcgagttctgtcagagaacgattggcttttt-3'(seqidno：7)；
shfoxm-2反向片段：
5'-aattaaaaagccaatcgttctctgacagaactcgagttctgtcagagaacgattggc-3'(seqidno：8)。
分别将上述正向及反向片段等量混合退火后克隆进入慢病毒包装表达载体plko-tet-on上，获得用于包装慢病毒的aurka或foxm1敲低质粒shaurka-1、shaurka-2、shfoxm-1和shfoxm-2。
2.包装病毒及方法同上。
3.感染mda-mb-231细胞，方法同上。
4.细胞筛选及分析方法同上。
结果见图1c和图3c。其中，c-myc和nanog为干细胞标志物，gapdh为内参，shctrl组为对照组，即未连入aurka干扰片段的plko-tet-on空载体，不能够敲低aurka或foxm1的表达。
westernblot分析结果表明，相应干扰片段均能够有效敲低aurka(图1c)或foxm1(图3c)的表达。
四、稳定敲低aurka和foxm1细胞株的功能分析
对获得的aurka或foxm1敲低的克隆及对照组mda-mb-231细胞进行westernblot分析。westernblot实验结果见图1c和图3c。图1c结果显示：在乳腺癌细胞mda-mb-231中敲低aurka显著抑制干细胞标志物sox2、c-myc和nanog的表达。图3c结果显示：在乳腺癌细胞mda-mb-231中敲低fomx1表达抑制干细胞标志物sox2、c-myc和nanog的表达。
利用肿瘤干细胞体外微球悬浮培养实验检查敲低aurka或foxm1是否抑制乳腺癌干细胞自我更新。方法同上。结果如图1d和图3d所示，在稳定敲低aurka(图1d)或foxm1(图3d)的mda-mb-231乳腺癌细胞成球能力显著低于对照细胞。
五、稳定敲低aurka和foxm1细胞株的体内成瘤能力分析
将1×106个稳定敲低aurka或foxm1细胞株及对照组mda-mb-231细胞分别注射到10只4周龄左右裸鼠的左、右测背部。监测注射后2个月内肿瘤的形成和肿瘤的大小。实验结果显示稳定敲低aurka(图1e)或foxm1(图3e)显著降低了肿瘤细胞在小鼠体内的生长。
六、aurka转录激活foxm1表达的分析
1.aurka激酶激活型突变及激酶失活型突变载体的构建
利用《分子克隆第三版》描述的定点突变方法将aurka过表达载体plvpt-aurka上的编码aurka蛋白的序列进行突变，使得突变后表达的aurka蛋白的第288为由t变为d，即激活型突变(记名为t288d)，或第274位由d变为n，即失活型突变(记名为d274n)。
2.按照上述方法包装病毒并建立稳定表达t288d或d274n的mda-mb-231稳定细胞株。
3.westernblot方法分析过表达野生型(wt)及突变型(t288d或d274n)aurka对foxm1表达的影响。结果显示这三种aurka都能够显著促进foxm1的表达(图2a)。也就是aurka不管是有激酶活性的还是没有激酶活性，都能激活转录，说明aurka激活转录与它的激酶活性无关。
4.foxm1启动子荧光素酶报告载体的构建
按照《分子克隆第三版》方法分别将foxm1启动子-1121至+1034、-47至+1034及+18至+1034位克隆入启动子报告系统pgl3-basic里。
5.双荧光素酶报告实验分析aurka调控foxm1的转录
按promega公司的双荧光素酶报告检测系统的说明书所述，将上述启动子报告载体与prl-tk对照载体转入293ft细胞。转染后48小时后按照promega试剂盒说明书，裂解细胞，取上清液，在promage荧光素酶测定仪上测定荧光素酶活性。
荧光素酶报告基因分析表明，aurka能够激活foxm1启动子转录活性(图2b)。而当把foxm1启动子上-47/+18这段含有foxm1蛋白结合基序(-27/-22，gtgacc)的片段删除后，aurka对foxm1启动子的激活作用消失，提示aurka可能是与foxm1结合到foxm1启动子上-27/-22的foxm1结合基序上激活foxm1转录。
七、aurka与foxm1结合转录激活foxm1表达的分析
1.免疫共沉淀分析aurka与foxm1存在相互作用
1)待15cm细胞培养皿中mda-mb-231细胞长到90％密度时，用预冷的pbs洗涤细胞两次，最后一次吸干pbs，加入预冷的ripa缓冲液；
2)用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿上刮下，把悬液转到1.5mlep管中，4℃，缓慢晃动15min(ep管插冰上，置水平摇床上)；
3)4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中；
4)准备蛋白g琼脂糖(proteingagarose)，用pbs洗两遍珠子，然后用pbs配制成50％浓度，减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；
5)每1ml总蛋白中加入100μl蛋白a琼脂糖珠(50％)，4℃摇晃10min(ep管插冰上，置水平摇床上)，以去除非特异性杂蛋白，降低背景；
6)4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除蛋白a珠子；
7)用bradford法做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响；
8)用pbs将总蛋白稀释到约1μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果目的蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高(如10μg/μl)；
9)加入1μg的兔抗到500μl总蛋白中；
10)4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h；
11)加入100μl蛋白a琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h；
12)14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的ripa缓冲液洗3遍，800μl/遍；
13)用60μl2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀；
14)将样品在100℃煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清可以暂时冻存在-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性；
15)westernblot分析蛋白质结合情况。
实验结果表明，aurka与foxm1在mda-mb-231细胞中存在相互结合(图2c)。用融合了gst标签的aurka能够将融合了flag的foxm1免疫沉淀下来，同样用融合了flag的foxm1也能够将融合了gst的aurka免疫沉淀下来，表明二者在细胞内是一个相互结合的复合体。
2.染色质免疫共沉淀分析aurka与foxm1共同结合到foxm1启动子上
其中chip-1组检测的区域为foxm1启动子-47/+98的区域，该区域包含了foxm1结合基序，即位于-27/-22的gtgacc基序。chip-ctrl-1组检测的区域为foxm1启动子上游-2756/-2651的区域，序列分析显示该区域不包含foxm1结合基序。
实验步骤如下：
1)待15cm细胞培养皿中mda-mb-231长到90％密度时，于培养基中加入适量的甲醛，使甲醛终浓度达到1％，37℃下交联10分钟；
2)加入适量甘氨酸室温孵育5分钟，终止甲醛交联作用；
3)尽量的去掉培养基，然后用加了蛋白酶抑制剂的预冷pbs清洗细胞两次；
4)把细胞刮下，置于离心管中，4℃2000rpm离心4分钟；
5)去掉上清液，加入200微升裂解液(注意：每1x106个细胞加200微升裂解液)，冰上裂解10分钟；
6)用超声波破碎细胞裂解液中的dna至dna的长度为250bp至500bp；
7)把破碎好的细胞裂解液置于冰冻离心机中4℃13000rpm离心10分钟，再把上清转移到2ml的离心管中；
8)用chip稀释液把细胞裂解液稀释10倍，并将此液称为原液(注意：稀释后取出200微升原液作为input样品)；
9)为了更好的去掉结果背景，往原液中加入75微升的蛋白a/g琼脂糖珠，4℃孵育30分钟，再稍微离心一下，收集上清液(以下称为a液)；
10)把a液分为两份，一份加入结合目的基因的aurka或foxm1蛋白的抗体，一份加入flag标签抗体，4℃孵育过夜；
11)分别加入40微升的蛋白a/g琼脂糖，4℃摇晃孵育1小时(注意：孵育的时间不能太长，而且摇晃的速度要快)；
12)700至1000rpm4℃冰冻离心1分钟，去掉上清，反复清洗琼脂糖珠四次(注意：务必把上清液彻底的去掉，否则残留的上清液会造成假阳性)；
13)即时制备洗脱缓冲液(1％sds，0.1mnahco3)；
14)往琼脂糖珠里加入120微升的洗脱缓冲液，室温下剧烈摇晃15分钟，2000g离心1分钟取上清液(以下称为b液)；
15)用pcr纯化试剂盒纯化b液；
16)纯化过的b液可以进行pcr分析(注意：检测时要带上之前取出的部分原液作为input对照)。
chip实验结果表明aurka能够结合foxm1启动子上包含foxm1结合基序gtgacc的区域，即chip-1(-47/+98)所示区域(图2b和图2d)。aruka不能结合不包含fomx1结合基序的区域，即chip-ctrl-1区(-2756/-2651，图2b和图2d)。re-chip实验结果表明，foxm1能够结合到chip-1区。chip及re-chip实验结果表明，aurka和foxm1同时结合到foxm1启动子上。
八、foxm1激活aurka表达的分析
1.用荧光定量pcr方法分析foxm1稳定表达的mcf-7细胞及对照细胞中aurka的mrna的表达情况。结果如图4a所示，foxm1过表达显著促进aurkamrna的转录。
2.用荧光素酶报告实验分析foxm1对aurka基因启动子的激活作用。分别将aurka启动子-2047至+126、-1507至+126、-807至+126以及-807至+10位克隆入启动子报告系统pgl3-basic里。实验方法同上。
chip-2组检测aurka启动子-5/+126的区域，该区域包含了foxm1结合基序gcgc。chip-ctrl-2组检测aurka启动子上游-2047/-1912的区域，序列分析显示该区域不包含foxm1结合基序(图4b)。
图4b结果显示foxm1能够激活aurka启动子转录活性。而当把aurka启动子上+10/+126这段包含有foxm1结合基序gcgc(+20/+23)的片段删除后，foxm1对aurka启动子的激活作用消失，提示foxm1结合到aurka启动子+20/+23的foxm1结合基序上激活aurka的转录。
将aurka启动子上+20至+23的foxm1结合基序从gcgc突变为aaaa后，则foxm1不能够激活aurka的启动子(图4c)。
3.用染色质免疫共沉淀分析foxm1在aurka启动子上的结合。实验方法同上。结果表明foxm1能够结合aurka启动子上包含foxm1结合基序gcgc的区域，即chip-2(-5/+126)所示区域(图4b和图4d)。foxm1不能结合不包含fomx1结合基序的区域，即chip-ctrl-2区(-2047/-1912，图4b和图4d)。
九、aurka抑制剂aki603与foxm1抑制剂硫链丝菌素(thiostrepton,tst)协同抑制乳腺癌细胞的分析
1.利用肿瘤干细胞体外微球悬浮培养成球实验检查aki603与tst(二者化学结构式见图5a)是否抑制乳腺癌干细胞自我更新。
实验方法同上。实验结果如图5b所示，aki603与tst联合应用能够更加有效的抑制肿瘤干细胞的形成。
其中，ctrl为只用溶剂的空白对照，aki603就是单独用aurka激酶的抑制剂，tst就是单独用foxm1的抑制剂，aki603&tst为aurka激酶的抑制剂和foxm1的抑制剂的联合使用。aki603与tst联合应用能够更加有效的抑制肿瘤干细胞的形成。
2.利用裸鼠体内成瘤实验检查aki603与tst是否抑制小鼠体内乳腺癌干细胞生长。
将裸鼠40只分为4组：每组10只，设1个对照组和3个处理组，注射mda-mb-231细胞，待瘤长至一定大小，用游标卡尺测量肿瘤直径并记录，进行腹腔注射给药。对照组注射不含药的溶剂(vehicle组)；溶解药物的溶剂为dmso；处理组1注射aurora-a激酶的小分子抑制剂aki603；处理组2注射foxm1抑制剂tst；处理组3同时注射aurora-a激酶的小分子抑制剂aki603和foxm1抑制剂tst；之后每三天测量肿瘤直径并记录，30天后取瘤、测量直径并拍照。
动物体内成瘤实验室的相关数据见表1。
表1动物体内成瘤结果
(注：上述数据为各组别在不同时间的肿瘤体积，单位为立方毫米)。
动物体内成瘤实验室也表明，aki603和tst能够协同抑制肿瘤在小鼠体内的生长(图5c)。图5c中，联合用药组的肿瘤生长的速度明显小于对照组及单独用药组。在接种肿瘤第27天后处死小鼠，解剖取瘤后可观察到联合用药组(aki603&tst组)的肿瘤体积为158.58立方毫米，为未用药处理组(vehicle组)的15.8％，为单独用药组(aki603组)的32.8％，为单独用药组(tst组)的35％。
因此，总结起来，发明人的研究结果提示靶向aurka激酶及foxm1转录因子能够全面抑制aurka激酶及非激酶功能(图6)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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<110>中山大学肿瘤防治中心
<120>一种联合抑制肿瘤的组合物
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