专利名称：利用白细胞介素-10诱导白细胞介素-1受体拮抗物的产生的制作方法
从大体上说本发明涉及通过施用有效量的白细胞介素-10而诱导白细胞介素-1受体拮抗物产生的方法。
本发明涉及使用白细胞介素-10(IL-10)治疗与白细胞介素-1水平升高相关的疾病和状态。具体地说，本发明涉及治疗与不希望的炎性反应，例如败血病休克，风湿性关节炎等，相关联的各种各样的疾病和状态，例如见，Gallinetal.，editors，Inflammation(RavenPress，NewYork，1988);Evansetal.，CirculatoryShock，Vol.29，pgs.279-290(1989);Waageetal.，J.Exp.Med.Vol.169，pgs.333-338(1989)等等。
在某种程度上本发明基于下列发现IL-10能诱导IL-1rd的产生，而IL-1rd使IL-1的生物活性受阻。本发明包括含有白细胞介素-10的药物组合物。本发明的白细胞介素-10较好的是选自于由下列氨基酸序列定义的开放阅读框架的一组成熟多肽MetHisSerSerAlaLeuLeuCysCysLeuValLeuLeuThrGlyValArgAlaSerProGlyGlnGlyThrGlnSerGluAsnSerCysThrHisPheProGlyAsnLeuProAsnMetLeuArgAspLeuArgAspAlaPheSerArgValLysThrPhePheGlnMetLysAspGlnLeuAspAsnLeuLeuLeuLysGluSerLeuLeuGluAspPheLys
GlyTyrLeuGlyCysGlnAlaLeuSerGluMetIleGlnPheTyrLeuGluGluValMetProGlnAlaGluAsnGlnAspProAspIleLysAlaHisValAsnSerLeuGlyGLuAsnLeuLysThrLeuArgLeuArgLeuArgArgCysHisArgPheLeuProCysGluAsnLysSerLysAlaValGluGlnValLysAsnAlaPheAsnLysLeuGlnGluLysGlyIleTyrLysAlaMetSerGluPheAspIlePheIleAsnTyrIleGluAlaTyrMetThrMetLysIleArgAsn和MetGluArgArgLeuValValThrLeuGlnCysLeuValLeuLeuTyrLeuAlaProGluCysGlyGlyThrAspGlnCysAspAsnPheProGlnMetLeuArgAspLeuArgAspAlaPheSerArgValLysThrPhePheGlnThrLysAspGluValAspAsnLeuLeuLeuLysGluSerLeuLeuGluAspPheLysGlyTyrLeuGlyCysGlnAlaLeuSerGluMetIleGlnPheTyrLeuGluGluValMetProGlnAlaGluAsnGlnAspProGluAlaLysAspHisValAsnSerLeuGlyGluAsnLeuLysThrLeuArgLeuArgLeuArgArgCysHisArgPheLeuProCysGluAsnLysSerLysAlaValGluGlnIleLysAsnAlaPheAsnLysLeuGlnGluLysGlyIleTyrLysAlaMetSerGluPheAspIlePheIleAsnTyrIleGluAlaTyrMetThrIleLysAlaArg,其中用标准的三字母简写代表L-氨基酸，起始于N-末端。有时也将这两种类型的IL-10分别称作为人IL-10(或人细胞激活素合成抑制因子)以及病毒IL-10(或BCRF1);例如，Moore et al.，Science，Vol.248，1230-1234页(1990);Vieira et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.Vol.88，1172-1176页(1991);Fiorentino et al.，J.Exp.Med.，Vol.170，2081-2095页(1989);Hsu et al.，Science，Vol.250，pgs.830-832(1990)。在本发明方法中使用的成熟IL-10更优选的是选自于下列序列组
SerProGlyGlnGlyThrGlnSerGluAsnSerCysThrHisPheProGlyAsnLeuProAsnMetLeuArgAspLeuArgAspAlaPheSerArgValLysThrPhePheGlnMetLysAspGlnLeuAspAsnLeuLeuLeuLysGluSerLeuLeuGluAspPheLysGlyTyrLeuGlyCysGlnAlaLeuSerGluMetIleGlnPheTyrLeuGluGluValMetProGlnAlaGluAsnGlnAspProAspIleLysAlaHisValAsnSerLeuGlyGluAsnLeuLysThrLeuArgLeuArgLeuArgArgCysHisArgPheLeuProCysGluAsnLysSerLysAlaValGluGlnValLysAsnAlaPheAsnLysLeuGlnGluLysGlyIleTyrLysAlaMetSerGluPheAspIlePheIleAsnTyrIleGluAlaTyrMetThrMetLysIleArgAsn和ThrAspGlnCysAspAsnPheProGlnMetLeuArgAspLeuArgAspAlaPheSerArgValLysThrPhePheGlnThrLysAspGluValAspAsnLeuLeuLeuLysGluSerLeuLeuGluAspPheLysGlyTyrLeuGlyCysGlnAlaLeuSerGluMetIleGlnPheTyrLeuGluGluValMetProGlnAlaGluAsnGlnAspProGluAlaLysAspHisValAsnSerLeuGlyGluAsnLeuLysThrLeuArgLeuArgLeuArgArgCysHisArgPheLeuProCysGluAsnLysSerLysAlaValGluGlnIleLysAsnAlaPheAsnLysLeuGlnGluLysGlyIleTyrLysAlaMetSerGluPheAspIlePheIleAsnTyrIleGluAlaTyrMetThrIleLysAlaArg.
图1是在哺乳动物细胞中表达IL-10时使用的载体pcD(SRα)的简图。
图2是在细菌中表达IL-10时使用的载体TRP-C11的简图。
图3显示携带有插入至其XhoI限制性位点的鼠IL-10，病毒IL-10，或人IL-10的开放阅读框架(ORF)的pGSRG质粒;还显示了最终构建体(称为TAC-RBS)中RBS-ATG-多聚接头区域的序列。
本发明是针对利用IL-10改善处于炎性状态或患炎症的患者中IL-10的毒性作用的方法。为了实施该方法本发明包括含有IL-10的药物组合物。用于本发明中的IL-10选自于由pH5C，pH15C和pBCRF1(SRα)中的cDNA插入物定义的开放阅读框架编码的一组成熟多肽，相应的质粒已寄存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，Maryland，其保藏号分别为No.68191，68192和68193。
Ⅰ.白细胞介素-10的分析IL-10s具有几种作为分析的依据和构成单位的生物学活性。具体的是，IL-10s具有抑制由IFN-r，淋巴毒素，IL-2，IL-3构成的组中至少一种细胞激活素以及T辅助细胞群中GM-CSF的合成的特性，其中的GM-CSF通过与同基因抗原递呈细胞(APCs)和抗原接触后，诱导一种或多种上述细胞激活素的合成。在该活性中，处理APCs，使之不能复制但其加工抗原的结构仍能维持其功能。在与T细胞混合前，例如用约1500-3000R(γ或X-射线)辐射APCs便能简便地完成这一过程。
另外，在一级或，更好的是二级混合淋巴细胞反应(MLR)中可检测对细胞激活素的抑制作用，在这种情况下，不需要使用同基因的APCs。MLRs是本领域内熟知的，例如，Bradley，162-166页，Mishell等人，“SeleetedMethodsinCellularImmunology”(Freeman，SanFrancisco，1980);以及Battisto等人，Meth.inEnzymol.Vol.150，83-91页(1987)。简单地说，将两种类群的异基因淋巴样细胞混合，其中的一个类群已在混合前进行处理如通过辐射，以阻止其增殖。优选的是，在增补培养基如补充了10%胎牛血清的RPMI1640中以约2×106细胞/毫升的浓度制备两个细胞群。为了进行对照和测试培养物，分析时，各将0.5ml的每一类群混合用于检测。对于第二级MLR，用新鲜制备的，经辐射的刺激器细胞再刺激在一级MLR中维持了7天的细胞。含有IL-10的样品可以在混合的同时加入到测试培养物中，在混合后1-3天可检测对照以及测试培养物中产生的细胞激活素。
利用本领域内熟知的技术获得进行IL-10分析的T细胞群和/或APC群，该方法在Disabato et al.，eds.，Meth.in Enzymol.，Vol.108(1984)中进行了详细描述。用于更好的IL-10分析的APCs是外周血单核白细胞。利用标准技术可以获得这些细胞，例如由Boyum，Meth.in Enzymol.，Vol.108，88-102页(1984);Mage，Meth.in Enzymol.，Vol.108，118-132页(1984);Litvin et al.，Meth.in Enzgmol.，Vol.108，298-302页(1984);Stevenson，Meth.in Enzymol.，Vol.108，242-249页(1989);和Romain et al.，Meth.in Enzymol.，Vol.108，148-153页(1984)描述，这些文献引入本文作为参考。较好的是，在IL-10检测中使用辅助T细胞，这些细胞可由下列方法获得，首先从外周血中分离淋巴细胞，然后利用一个通过商业途径获得的抗-CO4抗体，例如可从美国专利4，381，295中描述和从Ortho Pharmaceutical公司获得的OKT4，通过例如扫描或流动细胞检测仪筛选辅助细胞。必要的技术已由Boyum在Scand.J.Clin.Lab.Invest.，Vol.21(增刊，97)，<p>聚(丁烯-4，4-二膦酸)钠，其具有下列重复组成单位
聚(烯丙基双膦酸乙基胺)，其具有下列重复组成单位
欧洲专利申请0321233中描述的其它膦酸聚合物，例如聚(烯丙基膦酰乙酯)，膦酸化异丁烯酸酯等以及成对的双膦酸化聚合物均可作为AEA在此应用，当然，只要它们含有或通过修饰后含有上述的有机保留增强基团。
基于本发明的一个方面，口用复方含有一种口用上可接受的赋形剂和一种有效剂量的实质上水不溶性非阳离子抗菌剂，以及具有平均分子量约为1，000～1，000，000的抗菌增强剂，并至少含有一个释放增强基团及一个有机保留增加基团，该药剂含有上述基团，而这些基团不含有或实质上不含有水溶性合成阴离子线性聚合物，聚羧酸碱金属盐或铵盐，这些盐类的分子量约为1，000～1，000，000。
通过mRNA分析也可以测定细胞激活素的产生。利用如由White等人，J.Biol.Chem.，Vol.257，8569-8572页(1982)，和Gillespie等人，U.S专利4，483，920描述的细胞质点杂交法可检测细胞激活素mRNAs。由此，这些文献作为本文的参考文献。其他方法包括利用纯RNA的点吸印法，例如Chapter6，在Hames等人编著的，NucleicAcidHybridizationAPracticalApproach(IRLPress，Washington，D.C.，1985)。
将需要检测IL-10活性的几个样品进行预处理，以去除可能会干扰检测的已预先测定的细胞激活素。例如，IL-2在某些细胞中增加IFN-γ的产生。因此基于该分析中使用的辅助T细胞，必须从测试样品中除去IL-2。通过将样品通过标准的抗细胞激活素亲和柱可以很方便地完成该“去除”过程。
IL-10活性单位可用各种方法定义。优选的是，基于IL-10具有在植物血球凝集素刺激的外周血球单核细胞中抑制IFN-γ产生的能力定义的单位。通常采用免疫测量法检测样品和标准物的IFN-γ水平。也可以根据IL-10′s增加IL-4诱导的MC/9细胞的增殖的能力而定义IL-10活性单位，MC/9细胞在美国专利4，559，310中描述并且可从ATCC获得，寄存号为CRL9306。1单位/毫升的定义是在下列分析中高于IL-4水平时产生MC/9增殖的50%最大刺激时需要的IL-10的浓度。在标准微滴板上在每孔的50μl培养基中制备IL-4和IL-10的二倍或三倍稀释液。培养基由RPMI1640，10%胎牛血清，50mM 2-巯基乙醇，2mM谷氨酰胺，青霉素(100U/L)和链霉素(100μg/L)组成。加入IL-4，即将25μl/孔的1600U/ml(终浓度为400U/ml)稀释于培养基中，培养过夜，例如20-24小时。以0.5-1.0μCi/孔浓度加入3H-胸腺嘧啶(例如50μCi/ml溶于培养基)，再将细胞培养过夜，其后收集细胞，检测掺入的放射性活性。
Ⅱ.纯化和药物组合物当本发明的多肽以可溶性形式表达时，例如作为酵母或哺乳动物细胞的一种分泌产物，可按照本领域内的标准方法纯化该产物，包括以下步骤硫酸铵沉淀，离子交换层析，凝胶过滤，电泳，亲和层析和/或其他;例如，“EnzymePurificationandRelatedTechniques，“MethodsinEnzymology，22233-577(1977);andScopes，R.，ProteinPurificationPrinciplesandPractice(Springer-Verlag，NewYork，1982)可作为这些纯化方法的参考。另外如果本发明的多肽以非可溶性形式表达，例如以聚集体，内含体等形式，则也可用本领域内的标准方法纯化这些产物，包括通过离心从破碎的宿主细胞中分离内含体，用离液序列高的和还原剂溶解内含体，稀释该溶解混合物，并且降低离液序列高的试剂和还原性试剂的浓度以便该多肽能形成生物学活性构型。后一方案在下列文献中被描述，本文参考地结合该文献Winkler等人，“Biochemistry”，254041-4045(1986);Winkler等人，“Biotechnology”，3992-998(1985);Koths等人，美国专利4，569，790;以及欧洲专利申请86306917.5和86306353.3。
本文中使用的“有效量”是指足以降低或阻止发炎的量。对于具体的患者该有效量是依据如发炎的状态，类型和程度，患者的总体健康，施药方法，副作用的严重性等等因子而变化。一般，IL-10以含有有效量的IL-10和药用载体的药物组合物形式给药。药用载体可以是适用于将本发明的组合物释放给患者的相容性的无毒性物质。一般来说，这些药物的适用于非肠道给药的组合物也是已知的，例如，Remington′sPharmaceuticalScience，15thEd.(MackPublishingCompany，Easton，PA1980)。另外，通过可植入的或可注射的药物释放系统可以将本发明的组合物引入患者体内，例如，Urquhartetal.，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，Vol.24，199-236页(1984);Lewis，ed.ContvolledReleaseofPesticidesandPharmaceuticals(PlenumPress，NewYork，1981);美国专利3，773，919;美国专利3，270，960等等。
当以非肠道给药时，IL-10以单位剂量可注射形式(例如，溶液，悬浮液或乳液)与一种药用载体相结合配制。这些载体的例子有正常的盐水，林格氏液，葡萄糖溶液，和Hank′s溶液。也可以用如不易挥发的油和乙基油酸盐这样的非水溶性载体。一种优选的载体是5%葡萄糖/盐水。该载体可以含有最少量的添加物，如增加等渗性和化学稳定性的物质，例如，缓冲剂和防腐剂。用基本上不含聚合体的纯化形式和浓度为约5-20μg/ml范围的其他蛋白质配制IL-10较好。优选的是，以连续灌输形式施用IL-10，以便每天释放约50-800μg范围的量(即约1-16μg/Kg/天)。每天的灌注速率依据对副作用检测和血细胞数而变化。
实施例下面的实施例用于说明本发明。所选择的载体和宿主，试剂的浓度，温度，以及各种变量的值仅是为了举例说明本发明的应用，而不能认为是其限制。
实施例1细菌宿主中人CSIF的表达从多步的化学方法合成的双链DNA片段装配合成的人CSIF基因，从而形成一种命名为TAC-RBS-hCSIF的表达载体。在标准细菌系统，例如E.coliK-12菌株JM101，JM103等等(由Viera和Messing，在Gene，Vol.19，pgs.259-268(1982)中描述)中完成克隆和表达。用标准方案例如，Maniatisetal.，MolecularCloningALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，1982)完成限制性核酸内切酶消化和连接酶反应。
对于小批量质粒制备可用碱性方法(Maniatisetal.，上文所述)。对于大批量质粒的制备可以用一种修改的碱性方法，其中用等量的异丙醇从澄清裂解液中沉淀核酸。在进行氯化铯平衡密度离心前用冷2.5M乙酸铵进行沉淀以去除RNA，并用溴化乙锭检测。
为了进行滤纸杂交，用Whatman 540过滤循环仪以选出克隆，然后裂解这些克隆，并通过用0.5M NaOH，1.5M NaCl;1M Tris-HCl pH8.0，1.5M NaCl连续处理(每次2分钟)并在80℃加热(30分钟)而进行固定。利用32P-标记的(激酶处理)合成DNAs在6×SSPE，20%甲胺，0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)，100mg/ml E.coli tRNA，100mg/ml考马斯亮蓝G-250(Bio-Rad)中42℃杂交6小时。(通过在800ml水中溶解174克NaCl，27.6克NaH2PO4.9H2O，以及7.4克EDTA而制备20×SSPE，用NaOH将PH调至7.4，体积调至1升，并将整个溶液用高压蒸汽消毒锅进行灭菌)。将滤纸用1×SSPE，0.1%SDS洗涤两次(15分钟，室温)。在进行放射自显影(Fuji RX胶片)照相后，用在滤纸上已染成蓝色的菌落与重新生成的菌落相对照而确定阳性菌落的位置。用Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.74，pg.5463(1977)的二脱氧方法对DNA测序。二脱氧反应的模板是再克隆至M13mp载体中的相关区域的单链DNAs(例如，Messing et al.Nucleic Acids Res.，Vol.9，pg.309(1981))或者是由下列方法制备的双链DNA;即用微碱性方法制备，并用0.2M NaOH变性(5分钟，室温)以及通过加入2倍体积乙醇从0.2M NaOH，1.43M乙酸铵沉淀得到DNA。利用应用生物系统380A(AppliedBiosystcms380A)合成仪，借助于氨基磷酸酯化学过程合成DNA。按照380A合成仪指南中描述的方法进行合成，去保护，切割和纯化(7M脲PAGE，洗脱，DEAE-纤维层析)。
在50ml反应体积中，将要克隆的合成DNAs的互补链(各400ng)混合并用多聚核苷酸激酶磷酸化。将该DNA与已用合适的限制性酶消化的1mg载体DNA相连接，在室温下50ml体积中连接反应进行4-12小时。磷酸化作用，限制性酶消化，聚合酶反应，以及连接反应已在现有技术中描述(Maniatis et al.，上文所述)。通过在补充了氨苄青霉素，异丙基-1-硫-β-半乳糖苷(IPTG)(0.4mM)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖苷(X-gal)(40mg/ml)的L琼脂上平板培养而筛选出LacZ+菌落(如果需要)。
通过用DNA聚合酶填充含有tacP的质粒pDR540(Pharmacia)的单BamHI位点而构建TAC-RBS载体。然后将其连接至未磷酸化的合成寡聚核苷酸(Pharmacia)上，这些寡聚核苷酸形成编码一个同感核糖体结合位点(RBS，GTAAGGAGGTTTAAC)的双链片段。在连接反应后，将该混合物磷酸化并用SstI接头ATGAGCTCAT再次连接。然后用SstI和EcoI切割该复合物，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离出173碱基对(bp)片段，将该片段克隆至已用EcoRI-SstI限制性切割的pUC19(Pharmacia)上(如下文中描述)。最终构建体(称为TAC-RBS)中的RBS-ATG-多聚接头区域的序列显示于图3中。
用8个步骤将合成IL-10基因装配到pUC19中。在每一步骤中，在通过将pUC19的LacZ(α)基因保持于步骤1中插入的ATG起始密码子框架中而进行克隆后，检测没有缺失和/或插入的插入物片段。通过在含有X-gal和IPTG的L-氨苄青霉素平板上筛选蓝菌落而过滤出含有缺失和/或插入的菌落。或者，在小规模质粒DNA制备时在各步骤中利用通用的测序引物，例如从BoehringerMannheim获得很容易地确征插入物的序列。
在步骤1中，用SstI消化TAC-RBS载体，用T4DNA聚合酶(其3′-内核酸酶活性消化SstI裂解产生的3′-突出链从而形成平齐末端片段)处理，并在T4DNA聚合酶失活后，用EcoRI处理以形成含有TAC-RBS区域并且在ATG起始密码子处具有平齐末端，在相反的另一末端有EcoRI裂解端的173bp碱基，最后，分离该173bpTAC-RBS片段。
在步骤2中，将步骤1中分离到的TAC-RBC片段与EcoRI/KpnI消化的pUC19质粒以及合成的1A/B片段相混合，如下文所示，该1A/B片段在其上游末端有平齐末端并且在其下游末端有相应于KpnI切割端的粘性末端。将该KpnI末端连接至并位于BstEⅡ位点的下游。连接这些片段以形成步骤2中的pUC19。
在步骤3中，将合成片段2A/B和3A/B(显示于下文)与BstEⅡ/SmaⅠ消化的步骤2中的pUC19(在扩增和纯化后)混合并连接形成步骤3中的pUC19。应注意，3A/B片段的下游末端含有形成SmaI平齐末端的额外碱基。在步骤4中切割这些额外碱基。所以2A/B和3A/B片段具有互补的9残基单链末端，将它们在混合时退火，留下2A/B的上游BstEⅡ切割端以及3A/B的下游平齐端，并连接至pUC19中。
在步骤4中，用AflⅡ/XbaⅠ消化步骤3中的pUC19，扩增，纯化，再纯化，与合成4A/B片段(显示于下文)混合，并连接形成步骤4的pUC19。
在步骤5中，用XbaⅠ/SalⅠ消化步骤4的pUC19，扩增和纯化，与合成的5A/B片段(显示于下文)混合，并且连接形成步骤5的pUC19。注意在步骤6中，5A/B片段的SalⅠ粘性末端用HpaⅠ消化除去。
在步骤6中，用HpaⅠ/PstⅠ消化步骤5的pUC19，扩增并纯化，与合成片段6A/B(显示于下文)混合并连接以形成步骤6的pUC19。
在步骤7中，用ClaⅠ/SphⅠ消化步骤6的pUC19，扩增并纯化，与合成片段7A/B(显示于下文)混合并连接以形成步骤7的pUC19。
在步骤8中，用MluⅠ/HindⅢ消化步骤7的pUC19，产扩增和纯化，与合成片段8A/B和9A/B混合并连接以形成最后构建体。采用标准技术，将该最后构建体插入至大肠杆菌K-12菌株JM101，例如可从ATCC获得，其寄存号为33876。在培养后，从JM101细胞中提取蛋白质，并检测提取物稀释的生物学活性。
AGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGG-TCGGGTCCGGTCCCGTGGGTCAGACTCTTGTCGACGTGGGTGAAGGGTCC-tAACCggtacaTTGGc片段1A/B
GtAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTG-GACGGATTGTACGAAGCTCTAGAGGCTCTACGGAAGTCGTCTCAC-AAGACTTTCTTTTTC片段2A/BCAAATGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTcTtAAGTGAAAGAAAGTTTACTTCCTAGTCGACCTGTTGAACAAgAaTTC片段3A/BGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGTC-CTCAGGAACGACCTCCTGAAATTCCCAATGGACCCAACGGTTCGGAACAG-TGAGATGATCCAGTTTTAtACTCTACTAGGTCAAAATaGAtC片段4A/BCTaGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGC-GAtCTCCTCCACTACGGGGTTCGACTCTTGGTTCTGGGTCTGTAGTTCCG-GCATGTtAACgCGTACAaTTGcagct片段5A/BAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTG-TTGAGGGACCCCCTCTTGGACTTCTGGGAGTCCGACTCCGATGCCGCGAC-TCATCGATctgcaAGTAGCTAg片段6A/BCGATTTCTTCCCTGTCAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAA-TAAAGAAGGGACAGTTTTGTTCTCGTTCCGGCACCTCGTCCACTTCTT-cGCgTgcatggCGcAc片段7A/BCGCGTTTAATAATAAGCTCCAAGACAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTG-AAATTATTATTCGAGGTTCTGTTTCCGTAGATGTTTCGGTACTCA-AGTTTGAC片段8A/B
ATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGA-CTCAAACTGTAGAAGTAGTTGATGTATCTTCGGATGTACTGTTACTTCT-TACGAAACTGAATGCTTTGACTtcga片段9A/B(小写字母指出该碱基不同于天然序列中同样位点处的碱基)实施例2在COS7猴细胞中表达vIL-10利用允许经扩增的片段后插入到EcoRⅠ消化的pCD-(CRα)载体(图1)中的引物，通过聚合酶链反应扩增编码vIL-10开放阅读框架的基因。该插入片段的编码链显示如下(该开放阅读框架以大写字母给出)aattcATGGAGCGAAGGTTAGTGGTCACTCTGCAGTGCCTGGTG44CTGCTTTACCTGGCACCTGAGTGTGGAGGTACAGACCAATGT86GACAATTTTCCCCAAATGTTGAGGGACCTAAGAGATGCCTTC128AGTCGTGTTAAAACCTTTTTCCAGACAAAGGACGAGGTAGAT170AACCTTTTGCTCAAGGAGTCTCTGCTAGAGGACTTTAAGGGC212TACCTTGGATGCCAGGCCCTGTCAGAAATGATCCAATTCTAC254CTGGAGGAAGTCATGCCACAGGCTGAAAACCAGGACCCGGAG296GCTAAGGACCATGTCAATTCTTTGGGTGAAAATCTAAAGACC338CTACGGCTCCGCCTGCGCAGGTTCCACAGGTTCCTGCCGTGT380GAGAACAAGAGTAAAGCTGTGGAACAGATAAAAAATGCCTTT422AACAAGCTGCAGGAAAAAGGAATTTACAAAGCCATGAGTGAA464TTTGACATTTTTATTAACTACATAGAAGCATACATGACAATT506AAAGCCAGGTGAg519通过表达vIL-10和/或限制消化产物的电泳图谱可以鉴别以正确方向携带该插入物的克隆。携带有vIL-10基因的这样一种载体命名为pBCRF1(SRα)并寄存于ATCC，其寄存号为68193。在E.coliMC1061中扩增pBCRF1(SRα)，通过标准技术分离，并按如下步骤用于转染COS7猴细胞在转染前一天，将约1.5×108COS7猴细胞接种于含有Dulbecco改变的Eagle培养基(DME)的单独的100mm平板上，该培养基含有5%胎牛血清(FCS)和2mM谷氨酰胺。为了完成转染，通过用胰蛋白胨培养，用无血清DME洗涤2次而从培养皿中移走COS7细胞，并悬浮于无血清DME中，浓度为107个细胞/ml。将0.75ml试样与20μgDNA混合并转染至灭菌的0.4cm电击穿小试管中。在10分钟后，将细胞在Biorad Gene Pulser装置中以200伏，960μF进行脉冲。再经10分钟后，从小试管中移出细胞，将其加至含有5%FCS，2mM谷氨酰胺，青霉素，链霉素和庆大霉素的20mlDME中。将该混合物等分至四个100mm组织培养皿中。在37℃，5%CO2中培养12-24小时后，用类似的仅含1%FCS的培养基代替前面的培养基，在37℃，5%CO2中继续培养另外72小时，其后，收集培养液，分析其抑制IFN-γ合成的能力。
将10ml新鲜分离的PBLs等分试样(约2×108个细胞/ml)与PHA(100ng/ml)一起于37℃在由(ⅰ)补充了5%FCS和2mM谷氨酰胺的90%DME和(ⅱ)从前面用pBCRF1(SRα)转染的COS7细胞得到的10%上清液组成的培养基中进行培养。24小时后，收集细胞和上清液，分别检测IFN-γmRNA或IFN-γ蛋白质的存在。对照也进行相同处理，不同的是10%上清液来自于先前用携带不相关cDNA插入物的质粒转染的COS7培养物。相对于对照而言，vIL-10处理的样品对IFN-γ的合成具有约50%的抑制。
实施例3在E.coli中表达vIL-10编码下列成熟vIL-10的基因在大肠杆菌中表达。
ThrAspGlnCysAspAsnPheProGlnMetLeuArgAspLeuArgAspAlaPheSerArgValLysThrPhePheGlnThrLysAspGluValAspAsnLeuLeuLeuLysGluSerLeuLeuGluAspPheLysGlyTyrLeuGlyCysGlnAlaLeuSerGluMetIleGlnPheTyrLeuGluGluValMetProGlnAlaGluAsnGlnAspProGluAlaLysAspHisValAsnSerLeuGlyGluAsnLeuLysThrLeuArgLeuArgLeuArgArgCysHisArgPheLeuProCysGluAsnLysSerLysAlaValGluGlnIleLysAsnAlaPheAsnLysLeuGlnGluLysGlyIleTyrLysAlaMetSerGluPheAspIlePheIleAsnTyrIleGluAlaTyrMetThrIleLysAlaArg.
将pBCRF1(SRα)的cDNA插入物再克隆至M13质粒中，通过位点特异性诱变将该cDNA改变两次首先在成熟vIL-10多肽编码区的5′-末端形成一个ClaⅠ位点，其次，在成熟vIL-10多肽的编码区3′-末端形成一个BamHⅠ位点。经过突变的序列很容易插入至下文中描述的TRPC11表达载体。
通过将一个合成的同感RBS片段与ClaⅠ接头(ATGCAT)连接以及将得到的片段克隆至ClaⅠ限制的pMT11hc(在前面已将该质粒修饰使之含有ClaⅠ位点)而构建得TRPC11载体。pMT11hc是一种小型(2.3Kb)高拷贝的pBR322的AMPR，TETS衍生物，它含有πVX质粒的EcoRⅠ-HindⅢ多接头区域(πVX由Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1982)。通过用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性切割，用ClaⅠ接头(CATCGATG)填平得到的粘性末端异连接，从而重新获得EcoRⅠ和BamHⅠ位点并用ClaⅠ位点代替SmaⅠ位点，由此修饰了pMT11hc质粒使之含有ClaⅠ位点。来自TRPC11构建体的一个转化体具有侧面为ClaⅠ位点的串联PBS序列。通过用PstⅠ消化该质粒，用Bal31核酸酶处理，用EcoRⅠ限制性切割并在所有四种三磷酸脱氧核苷酸存在下用T4DNA聚合酶处理从而移去一个ClaⅠ位点和RBS序列的第二拷贝的部分序列。通过PAGE重新获得得到的30-40bp片段并将其克隆至SmaⅠ限制性切割的pUC12中。然后将来源于pKC101(由Nichols et al.，在Methods in Enzymology，Vol.101，pg.155中描述(Academic Pness，N.Y.1983)的248bp的携带E.coli trpP的EcoRⅠ片段克隆至EcoRⅠ位点以得到整个TRPC11构建体，显示于图2中。通过首先用ClaⅠ和BamHⅠ消化TRPC11，纯化消化产物，然后在标准连接溶液中将它与含有编码成熟BCRF1的核苷酸序列的M13的ClaⅠ-BamHⅠ片段相混合从而将TRPC11用作为vIL-10的载体。含有该插入物的TRPC11称作为TRPC11-BCRF1，将它在E.coliK12JM101菌株中繁殖，例如，该菌株可从ATCC获得，其保藏号为33876。
实施例4由IL-10诱导的IL-1受体拮抗剂利用标准技术例如Figdoretal.，Blood，Vol.60，pg.46(1982);Figdoretal.，J.Immunol.Meth.，Vol.68，pg.73(1984)从500ml正常供血者的血中分离人外周血单核细胞。简单地说，通过在血成份分离器中密度离心而分离单核细胞，接着通过离心淘选将其分馏成淋巴细胞和单核白细胞。通过非特异性酯酶染色而判断的单核白细胞制剂纯度大于95%并且含有98%以上的活细胞。在Yssel′s培养基(Yssel et al.，Immunol.Meth.，Vol.72，pg.219)培养单核白细胞，该培养基含有补充了1%贮存的热失活的人AB+血清的人血清白蛋白(HSA)。利用Limulus amebocyte裂解液分析测定该培养液不含内毒素(内毒素含量＜0.2ng/ml)。在‘Teflon’袋(Jansen MNL，St.Niklaas，Belgium)中37℃以4×108个细胞/ml培养单核白细胞，该‘Teflon’袋阻止这些细胞吸附。为了检测IL-1ra的诱导作用，通过与脂多糖(LPS，Difco Laboratories，Detroit，ML，E.coli 0127B8)(1μg/ml)接触24小时而失活培养液中的单核白细胞。然后收集上清液，检测产生的IL-1β和IL-1ra。用浓度为10μg/ml的单克隆抗体19F1中和IL-10。结果列于下表中。
表培养液状况IL-1β(ng/mL)IL-1ra(ng/mL)仅培养基(对照)0.030.40LPS40.00102.50LPS+IL-10(100U/ml)8.75149.37LPS+IL-4(100U/ml)9.25100.00LPS+抗-IL-10Mab42.5060.87上面描述的本发明的实施例是为了说明和描述的目的。而不是指本发明的全部内容或将本发明限制至所公开的精确形式，并且根据上面的论述显然可以进行修改和变化。所选择和描述的实施例仅是为了最好地解释本发明的原理从而能使本领域内的其他技术人员在各种具体方案以及适合于所需要的特定用途而进行的各种修改方案中最好地使用本发明。直正的意图是本发明的范围由本文所附的权利要求定义。
在1989年12月20日，本申请人在美国典型培养物收集中心，Rockville，MD，USA(ATCC)寄存了携带pH5C，PH15C和pBCRF1(SRα)的各个E.coliMC1061培养物，其保藏号分别为No.68191，68192和68193。这些寄存物是按照ATCC的用于专利目的的培养物寄存物的协议提供的条件保藏的，该协议确保美国专利和商标委员会依据35USC122和37CFR1.14获得这些寄存物，并且根据美国公开原则公众也可获得这些寄存物，并且要求这些寄存物保持存活。这些寄存菌株的可用性不能解释为在违背政府当局按照其专利法授予的权力的情况下特权实施该发明。
已对寄存作为某些改进使其满足布达佩斯公约的要求。
权利要求
1.改良患者的炎性反应的方法，该方法包括给患者施用有效量的白细胞介素-10的步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中所说的白细胞介素-10选自于由病毒白细胞介素-10和人白细胞介素-10构成的组。
3.根据权利要求1的方法，其中的炎性状态是败血病休克或风湿性关节炎。
4.根据权利要求1的方法，其中IL-10按基本上不含聚合体的纯化形式以及浓度为5-20μg/ml范围的其他蛋白质一起配制。
5.根据权利要求1的方法，其中IL-10通过连续灌注方式给药，以便每天释放出1-16μg/Kg范围的量。
全文摘要
本发明提供治疗炎性症状的方法，包括给患者施用有效量的白细胞介素-10。
文档编号A61K38/20GK1081378SQ93104408
公开日1994年2月2日 申请日期1993年3月19日 优先权日1992年3月20日
发明者R·迪瓦尔马力菲特, J·迪弗赖斯 申请人:先灵公司