专利名称：疫苗的凝胶形式的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于向家禽雏禽施用活疫苗和添加剂的一种凝胶形式以及这种施用的方法。
背景技术：
目前，出生几日内的家禽雏禽需要针对多种疾病进行免疫接种，用于每种疾病的疫苗类型决定着其用药方法。减毒疫苗通常在孵化场中在将雏禽从孵化恒温箱分拣至贮存或运送托架时通过注射用药。活疫苗则更多地是在雏禽刚安置在孵化托架中时以水性悬液形式喷洒于饲料上或加至饮用水中。
活疫苗的一个实例为用于针对艾美球虫属(Eimeria)的原虫引起的球虫病而免疫接种家禽的疫苗。球虫病是一种非常常见的家禽疾病，有数种艾美球虫可引起这种疾病。疾病的症状和严重性取决于家禽感染的艾美球虫的种属，其中禽艾美球虫(E.tenella)，堆型艾美球虫(E.acervulina)和极大艾美球虫(E.maxima).为三种最常见的种属。目前，保护家禽不受艾美球虫感染涉及两种可能的方法-使用杀球虫剂作为食物添加剂或使用球虫病疫苗进行免疫接种，免疫接种逐渐成为优选的方法。球虫病疫苗目前包含供施用的适当载体中的球虫目有毒性株系，该球虫目能引起轻型的疾病并被选择具有非常强的抗球虫敏感性。
针对球虫病免疫接种的一种常用方法涉及在家禽通过浅盘或其它容器进食时饲料上喷洒用药的应用。将包含水性载体中的艾美球虫种属球虫卵(oocyst)的疫苗喷洒在将提供给雏禽的饲料上。饲料上喷洒用药的应用需要大量的球虫卵，而且常常不能获得禽群对疫苗的均匀暴露。
疫苗的施用还可使用水配给系统包括自动喷泉，以及自动水给药器或配料装置。然而，由于球虫病疫苗的特别属性，很可怀疑疫苗是否实际上能达到运水线的末端，导致了禽群的不均匀暴露。另外，通过水配给系统施用疫苗要求在施用疫苗后，彻底清洗该配给系统以去除任何残留的疫苗。
家禽雏禽目前通常在它们出生3至4天后针对球虫病进行免疫接种。通过将免疫接种延迟至这一时间，小鸡已完全处于饲养周期中并能够通过在食物上或经饮用水使用疫苗而被免疫。
然而，在更早阶段对雏禽进行免疫接种是有利的，优选地是在孵育场中。通过这种作法，免疫接种只需要较低剂量的球虫卵，并且球虫卵可作为用于诱导饲养周期开始的饮用水的一部分用药。疫苗在饮用水中的施用要求球虫卵保持悬溶以对禽群提供均匀的暴露。一种这样的溶液已由本申请人在加拿大专利1204057号中提出，它涉及将球虫卵悬溶于15％的角叉菜胶溶液中。虽然此方法具有很多优点，如提供免疫接种所需要的球虫卵水平降低以及易于施用，但也有一项缺点，即向雏禽提供开放供水系统可导致液体洒出或沾湿雏禽，这一点有可能影响雏禽的健康，特别是在寒冷天气和在运输中。
因此还需要一种用于向孵育场中一日龄雏禽用药的简单疫苗，它提供对禽群的足够保护，同时降低潜在的问题。
发明概述本发明提供用于向家禽雏禽施用活疫苗的活疫苗凝胶形式。该凝胶形式包含约1～2.5％的可食用多糖在一定温度可结胶的胶凝剂，在其中悬溶了足够水平的活疫苗以提供家禽雏禽群的免疫接种。
在本发明的一方面，提供了一种使用活有机体的活疫苗免疫家禽群的方法。该方法包含。通过在冷水中制备活有机体的悬液而制备活疫苗的凝胶形式，在等于或高于多糖胶凝剂熔点时将可食用多糖在一定温度可结胶的胶凝剂溶于水性溶液中，混合有机体悬溶液和胶凝剂溶液，将混合物倒入适当的容器，然后让混合物冷却并胶凝以产生胶凝的活疫苗。这种胶凝的活疫苗包含约1～约2.5％可食用多糖凝胶，在其中悬溶了足够水平的有机体以提供对禽群的免疫接种。然后用胶凝的疫苗悬液喂食禽群。优选实施方案详述在家禽孵育场中，当雏禽在孵化托架中从壳中孵出时，通常要检查它们是否有缺陷，通过注射用家禽疫苗免疫接种和随后通过性别分类和置于运送托架中。在此时也可通过适当方法如管饲法(直接经口用药)对它们施用水性基质的活疫苗。一但在孵化托架中，家禽也可经给水系统方法或经食物上喷洒方法用药。水性基质活疫苗通常具特别属性，并且，如果在给水系统中用药，疫苗应在能保持有机体在疫苗中的相对均匀悬溶的组合物中提供。对于包含相对较大的艾美球虫种属球虫卵的球虫病疫苗特别是如此。球虫病疫苗通常经口用药以免疫接种家禽种属，使之不发生球虫病，该疫苗具有至少一种与所期望的免疫作用有关的球虫类球虫卵。
本发明的一项优选实施方案提供了球虫病疫苗的凝胶形式，在其中球虫类球虫卵被稀释并悬溶于凝胶形式，导致保持球虫卵的均匀悬浮和随后，禽群被球虫卵相对均匀的感染。本发明的凝胶形式对于艾美球虫种属特别有用，更特别地对禽艾美球虫或其它种属如Eimeria necatrix，Eimeria hagani，堆型艾美球虫，极大艾美球虫，Eimeria brunetti，Eimeria proecox，Eimeria mivata和Eimeria mitis也有用。获得这种种属的每一种的方法为本领域技术人员所公知。两或多个种属的艾美球虫可同时使用，而在本发明的实践中通常不需要在相同悬液中一起使用六个种属以上。
本发明的凝胶形式疫苗提供了在孵育场中免疫接种家禽雏禽时易于操作方法，并因此适合普通孵育场工人而不需要任何专家。该凝胶形式使用一种可食用在一定温度可结胶的藻酸盐或角叉菜胶，最优选κ角叉菜胶，以精炼角叉菜Bengel MB 910出售，为从红色海藻麒麟菜属Cottonii提取的一种水溶性κ角叉菜胶。
本疫苗的凝胶形式通过在适当的温度将凝胶粉末溶于水中而达到多糖粉末的完全溶解来制备。该粉末加至水中的浓度应使之与球虫卵悬液混合并胶凝时产生相对软的凝胶。典型地，溶解的凝胶粉末和球虫卵悬液以约1∶1(V∶V)的比例混合以制备疫苗的凝胶形式。已发现适合的这种凝胶形式在其凝胶形式中可食用多糖的终浓度为约1～2.5％，优选约1～2％，更优选约1.25～1.75％并最优选约1.25％。因此优选约2～5％的溶解的多糖凝胶溶液，优选约2～4％，更优选约2.5％至3.5％，最优选约2.5％，与等体积的球虫卵悬液混合，并让混合物在适当温度胶凝。
本发明的凝胶形式疫苗具有足够水平的球虫卵以提供对禽群的免疫接种。已发现每只雏禽将消耗约0.5至1.5ml凝胶，因而凝胶中的球虫卵浓度应足以在此典型的体积提供足够的有机体以使雏禽得到免疫。已发现每只雏禽约50至1000个球虫卵能够足够的保护，因此优选该疫苗的凝胶形式具有每ml约100至500个球虫卵，以提供对禽群的适当免疫接种。优选地，该疫苗的凝胶形式含有每ml凝胶约200至300个球虫卵，最优选每ml凝胶约250个球虫卵。由于凝胶形式是通过将溶解的多糖粉末与等体积的球虫卵悬液混合而制备，优选将1体积的2～5％多糖凝胶溶液与等体积的含每ml约200～1000个球虫卵的球虫卵悬液混合，更优选将1体积的2～4％。多糖溶液与等体积的含每ml约400～600个球虫卵的球虫卵悬液混合，最优选将2.5％的多糖溶液与等体积的含约每ml500个球虫卵的球虫卵悬液混合。
这种可食用在一定温度可结胶的多糖形式的使用不需要使用催化剂系统。催化剂系统如CMC通常需要更仔细的操作，特别是在胶凝过程中。如果催化剂和凝胶化合物的浓度调节不适当，则该溶液的胶凝可能发生过快而不能达到提供寄生虫均匀悬液的足够混合。本发明的可食物多糖凝胶的使用导致一种凝胶，它优选地在4℃在约3至5分钟形成，保持疫苗有机体均匀悬溶并使家禽雏禽能更均匀地暴露于疫苗有机体。凝胶中可食用胶的低含量意谓着凝胶形式的约95％或更多是水，水可帮助雏禽的水化并诱导喂养反应。该凝胶形式比液体悬液的其它优点在于该凝胶形式不会沾湿雏禽因而不会影响雏禽的健康，特别是在冬天，如果雏禽由于暴露于水溶液而沾湿，这种暴露可能引起雏禽的死亡。在相对较低温度胶凝的本发明的可食用多糖凝胶的使用也适合加入氮源和其它添加剂如维生素于该凝胶形式或芬兰猎户公司(Orion Corp.)的竞争性专营产品如“BROILACT”。这对于热敏感营养素特别有用，这些热敏感营养素如果暴露于高于约50℃的温度会变性和失活。本发明的凝胶形式疫苗的使用还实现了孵育场的一种节省，在于由于该凝胶形式含95％或更多的水，因而附加的给水系统如内建的给水系统不再需要。这不仅降低了运转孵育场的花费，而且降低了水溅出并沾湿雏禽从而影响雏禽健康的可能性。
按照本发明的疫苗的应用在下列实施例中举例说明，但本发明并不限于此。在所有陈述动物被暴露于球虫卵的实施例中，应理解到该疫苗，即凝胶形式的球虫卵，不是手工喂给雏禽，而是简单地在该时间期间将雏禽放在与凝胶形式疫苗相同的区域并让它们自动进食该疫苗。在实施例中使用禽艾美球虫和Eimeria necatrix是因为它们是已发现可引起小鸡中球虫病的6种常见球虫中两种最致病的种属。然而，它们是两种免疫原性最低的种属，即，它们对免疫接种产生最低的保护。因此，如果一种免疫接种方法对禽艾美球虫或Eimeria necatrix有效，则它将对其余种属有效。禽艾美球虫是优选的实验种属，部分地是因为它比Eimerianecatrix更常见而且是患球虫病的小鸡的主要死亡原因。另外，由于禽艾美球虫几乎仅出现在小鸡的盲肠而不是象其它种属那样感染整个小肠，损伤或损害可精确评分。实施例1按照本发明的疫苗的制备是通过首先在一个容器中向5克κ角叉菜Bengel MB 910加入200ml热自来水并混合至MB 910溶解。向此溶液加入200ml含每ml500个堆型艾美球虫，极大艾美球虫和禽艾美球虫混合物球虫卵的溶液并将合并的溶液混合。将此溶液随后倒入塑料水盘并放置冷却和在4℃胶凝。这样就产生了含1.25％MB910和每ml250个球虫卵的疫苗凝胶形式。实施例2将33只小鸡，每只均为1日龄，分为3组，每组各11只小鸡。每组各通过3种方法之一暴露于禽艾美球虫而被免疫接种。一组通过使用大剂量喷雾箱被免疫接种，第2组通过按照加拿大专利1204057号生产的悬溶于1.5％角叉菜胶溶液中大剂量球虫卵被免疫接种，第3组暴露于按照上述实施例1制备的本发明的凝胶形式疫苗。每只小鸡在开始和结束时称重以计算平均重量增加量并且也对小肠道中的损伤评分。实验结果列于下表表1平均重量增加量(g)存在损伤平均损伤评分UMCUMC喷雾箱 67 6/11 4/11 2/11 0.4 0.4 0.1大剂量液体 7210/11 6/11 6/11 1.2 0.9 0.6大剂量凝胶 7711/11 11/11 6/11 1.3 1.2 0.6上述结果用于阐明小鸡对各种形式的疫苗的免疫反应。与疫苗的免疫能力最有关的是在肠道中间区的损伤的结果，即存在损伤和平均损伤评分。可以看到，本发明的凝胶形式疫苗提供了对11只小鸡的完全免疫反应，而喷雾箱和液体用药方法组仅有部分免疫反应。实施例3将480日龄的8015雄性肉鸡分为4个治疗组并在地面围栏鸡舍中饲养。A组是给予水安慰剂的对照组。B组通过管饲法给予按照加拿大专利1209057号制备的水性悬液疫苗，该疫苗包含1.5％角叉菜胶溶液中的堆型艾美球虫，极大艾美球虫和禽艾美球虫。C组给予按照实施例1的方法制备的本发明的凝胶形式疫苗。D组给予水安慰剂并置于加有1.25lbs“MAXIBAN”食物添加剂-杀球虫剂药物的低能量焙烤酵母食物上，该药物由礼来加拿大公司的分公司Elanco销售。A组至C组则置于未加药物的食物上。将小鸡分为4舍(4×30=120只)，每个治疗组(A-D)30只。在疫苗接种后(PI)29天，对各组的小鸡和食物称重并将食物改变为低能焙烤植物。C组继续维持加药物的食物(1.00lbMAXIBAN)。在免疫接种后59天再次测定小鸡和食物并将食物改变为焙烤停药食物。所有组均在停药期接受未加药物的食物直至免疫接种后70天。在免疫接种后29，59和70天对所有笼进行平均重量增加量，食物转变，和死亡率参数的测定。在第29天对5只小鸡/舍(总共20只小鸡/治疗组)进行损伤评分。
表24周5周损伤评分 4周平均 平均重量 平均 平均重量治疗重量 增加量重量 增加量 上部 中部 盲肠 食物UI-UC舍 914869 151014590.08 1.00 0.20 1.661-4管饲法I 904857 150014511.00 1.50 0.40 1.68舍5-8凝胶I舍 913864 149014400.05 0.60 0.00 1.649-12加药的舍 964917 157015110.00 0.20 0.00 1.6513-16UI＝未免疫接种I＝经免疫接种重量用克作单位从上面结果可看到，所有4组中的重量增加是和食物有效性近似相等。
A至C组的小鸡随后在3周时用每只小鸡25000个球虫卵的攻击剂量进行免疫攻击，并对所有笼测定重量增加量，食物转变和损害评分这些参数。
表3平均重量 损伤评分治疗 平均重量 增加量 食物转变 上部 中部 盲肠UI-UC 865 304 1.62 0.0 0.0 0.0UI-C 773 184 2.36 3.3 3.4 1.6I凝胶-UC833 276 1.67 0.0 0.0 0.0I凝胶-C826 203 2.06 2.5 3.0 0.8I管饲法-UC 904 309 1.60 0.0 0.0 0.0I管饲法-C 772 182 2.58 3.5 3.4 0.8加药的-UC899 307 1.71 0.0 0.0 0.0UC＝未免疫攻击的C＝免疫攻击的从表3中的结果可看到，用本发明的凝胶形式疫苗的免疫接种对小鸡提供针对大剂量球虫卵免疫攻击的更好保护，比那些通过管饲法免疫接种的小鸡具有更低的损伤评分。另外，出乎意料地，这些小鸡的食物转变和体重增加量远优于管饲法免疫接种组者。实施例4本发明的凝胶形式疫苗的有效性通过使用商用肉鸡群得到证实。鸡群或维持于加有盐霉素(COXISTACTM)或维及尼霉素(STAFACTM)的加药食物上，或使用按照加拿大专利1204057制备的疫苗或通过按照实施例1的改良方法制备的凝胶形式疫苗进行免疫接种。该疫苗的凝胶形式使用加拿大专利1204057号中提出的在1.5％角叉菜胶溶液中制备的强力球虫卵悬液制备。该溶解的角叉菜MB 910胶溶液通过将粉末以2.5％的浓度溶解于65℃水中而制备。这两种溶液被混合在一起，倒入香肠套筒并冷却使凝胶在约5分钟内形成。将香肠套筒切为100g的切片，每一片设计为供一个托架或100只小鸡使用。凝胶形式的消耗在30分钟至2小时间完成。通过凝胶形式疫苗的免疫接种的有效性通过每周从每层检查10份粪便样本进行研究，这种检查是通过制备粪便样本的涂片并在显微镜下检查进行的。这些粪便样本的结果显示于表4中。
表4阳性粪便样本数底层 中层顶层第1周2/10 3/9 4/9第2周7/95/9 8/10第3周10/10 11/11 10/10可以看到，施用本疫苗3周后，禽群对存在于所有粪便样本中的所有艾美球虫种属得到完全免疫接种。
免疫接种后3周，将16只小鸡从各个围栏中移出，保持隔离并随后在免疫接种后5周用大剂量禽艾美球虫，堆型艾美球虫和极大艾美球虫进行免疫攻击。显示于下表的结果证实了疫苗的有效性。上部，中部肠道和盲肠的平均损伤在对照组小鸡中明显高于疫苗接种组小鸡。
表5平均损伤评分小鸡数目 上部 中部盲肠对照7*3.3 0.9 3.3，3.4底层6000.2，0.1中层6000.3，0.2顶层6000.1，0.2*1只小鸡死亡小鸡在41日龄时购入，并且，用凝胶形式疫苗免疫接种的小鸡的平均重量为2.11kg，食物转化为1.91。用本疫苗的凝胶形式免疫接种的2个禽群的死亡率为放置的46818只小公鸡中占4.2％，并且定罪率为0.87％。通过使用加拿大专利1204057号疫苗的孵育场方法免疫接种的23052只小公鸡的禽群具有平均重量2.02kg和食物转化率为1.92。与此对比，4群在41日龄出售的，用盐霉素和维及尼霉素给药的总共102506只小公鸡和小母鸡具有平均重量1.99kg，食物转化为1.88。这些结果在下列表中阐明。
表6放置的 死亡率 年龄 定罪率平均重量日期 小鸡数(％)(日)(％) KG(1bs) FCR药物7/94 28,050a4.0 41 0.75 1.82(4.00) 1.959/94 26,826b3.9 41 0.47 2.08(4.58) 1.8611/94 24,578a4.1 40 0.52 1.98(4.36) 1.831/94 23,052a3.5 41 0.82 2.08(4.58) 1.88平均3.9 40.80.64 1.99(4.39) 1.88免疫3/95 23,052c3.6 41 0.22 2.02(4.44) 1.925/95 24,174d*5.8 42 0.59 2.16(4.76) 1.877/95 22,644d2.5 40 1.14 2.06(4.54) 1.94平均4.2 41 0.87 2.11(4.65) 1.91aCoxistac，1/2小公鸡和1/2小母鸡bCobanc孵育场方法d凝胶方法*第一周内葡萄球菌属感染本发明的凝胶形式疫苗提供了在孵育场中对家禽雏禽免疫接种的易于掌握的方法，因此适合普通孵育场工人，不需要特殊专家。该凝胶形式的生产使用了一种可食用多糖凝胶，优选一种温育调节藻酸盐或角叉菜胶，最优选κ角叉菜Bengcl MB 910。在该凝胶形式中可食用凝胶的终浓度为1～2.5％，优选1～2％，更优选1.25～1.75％并最优选约1.25％。本发明的可食用多糖凝胶的使用导致了一种在4℃在约3至5分钟内形成的凝胶，它保持了疫苗有机体的均匀悬溶并使家禽雏禽更均一地暴露于疫苗有机体。可食用胶在凝胶形式中的低含量意谓着该凝胶形式的约95％或更多是水，这可帮助小鸡的水化并诱导喂养反应。
虽然本文中描述描述了本发明的多种优选实施方案，本领域技术人员应理解到，对这些实施方案可进行各种改变而不偏离本发明的实质或所附权利要求书的范围。
权利要求
1.一种供向家禽雏禽施用活有机体的活疫苗凝胶形式，该凝胶形式包含在其中悬溶了足够水平的活有机体的约1～2.5％的在一定温度可结胶的可食用多糖胶凝剂，以提供家禽雏禽群的免疫接种。
2.按照权利要求1的活疫苗的凝胶形式，其中活有机体为艾美球虫的球虫卵。
3.按照权利要求2的活疫苗的凝胶形式，其中球虫卵选自禽艾美球虫，Eimerianecatrix，堆型艾美球虫，极大艾美球虫，EimeriaBrunetti，Eimeria proecox，Eimeria mivati和Eimeria mitis的一或多种。
4.按照权利要求3的活疫苗的凝胶形式，其中球虫卵选自禽艾美球虫，堆型艾美球虫和极大艾美球虫的一或多种。
5.按照权利要求4的活疫苗的凝胶形式，其中疫苗包含每ml约100～500个球虫卵。
6按照权利要求5的活疫苗的凝胶形式，其中疫苗包含每ml约200～300个球虫卵。
7.按照权利要求6的活疫苗的凝胶形式，其中疫苗包含每ml约250个球虫卵。
8.按照权利要求7的活疫苗的凝胶形式，其中疫苗约1.25％的一种可食用多糖胶凝剂。
9按照权利要求8的活疫苗的凝胶形式，其中可食用多糖胶凝剂是κ角叉菜胶。
10.使用活有机体的活疫苗免疫家禽群的方法，该方法包含a)按下述制备活瘦苗的凝胶形式i)在冷水中制备活有机体的悬液，ii)在等于或高于多糖胶凝剂的熔点将可食用温度依赖性胶凝剂溶于水溶液中，iii)混合有机体悬液和胶凝剂溶液，iv)将混合物倒入适当的容器，随后让混合物冷却并胶凝以产生包含在其中悬溶了向禽群提供免疫接种足够水平的有机体的约1-2.5％可食用多糖凝胶的胶凝活疫苗，和b)让家禽群进食该胶凝疫苗悬液。
11.按照权利要求10的方法，其中活有机体为艾美球虫的球虫卵。
12.按照权利要求11的方法，其中球虫卵选自禽艾美球虫，Eimerianecatix，Eimeria hagani，堆型艾美球虫，极大艾美球虫，Eimeriabrunetti，Eimeria proecox，Eimeria mivati和Eimeria mitis的一或多种。
13.按照权利要求12的方法，其中球虫卵选自包含禽艾美球虫，堆型艾美球虫和极大艾美球虫的一或多种。
14.按照权利要求13的方法，其中该疫苗包含每ml约100～500个球虫卵。
15.按照权利要求14的方法，其中该疫苗包含每ml约200～300个球虫卵。
16.按照权利要求15的方法，其中该疫苗包含每ml约250个球虫卵。
17.按照权利要求16的方法，其中该疫苗包含约1.25％可食用多糖胶凝剂。
18.按照权利要求17的方法，其中该可食用多糖胶凝剂是κ角叉菜胶。
全文摘要
本发明提供用于向家禽雏禽施用活疫苗的活疫苗凝胶形式。该凝胶形式包含约1.5～5.0%可食用多糖在一定温度可结胶的胶凝剂,其中悬溶了向家禽雏禽群提供免疫接种足够水平的活疫苗。本发明也提供了使用活有机体的活疫苗免疫禽群的方法,该方法包含通过下列步骤制备活疫苗的凝胶形式:在冷水中制备活有机体的悬液,在等于或高于多糖胶凝剂的溶点将可食用多糖在一定温度可结胶的胶凝剂溶于水性溶液,混合有机体悬液和胶凝剂溶液,将混合物倒入适当的容器,然后让该混合物冷却并胶凝以产生包含约1～2.5%可食用多糖凝胶的胶凝的活疫苗,在其中悬溶了向禽群提供免疫接种足够水平的有机体,并让禽群进食该胶凝的疫苗悬液。
文档编号A61K39/002GK1181705SQ96193332
公开日1998年5月13日 申请日期1996年2月21日 优先权日1995年2月21日
发明者李荣丰 申请人:李荣丰