趋化因子受体88－2b[ckr－3]和88c及其抗体的制作方法

专利名称：：趋化因子受体88－2b[ckr－3]和88c及其抗体的制作方法
技术领域：
：本发明总的来讲涉及信号传导途径。具体地讲，本发明涉及趋化因子受体、编码趋化因子受体的核酸、趋化因子受体的配体、趋化因子受体活性的调节因子、识别趋化因子和趋化因子受体的抗体、鉴别趋化因子受体配体和调节因子的方法、生产趋化因子受体的方法以及生产鉴别趋化因子受体的抗体的方法。
背景技术：
：最近，分子生物学的进展使人们认识到信号传导途径在生物过程中的中心地位。这些信号传导途径组成了多细胞机体中单个细胞之间相互传递信息的主要手段，机体籍此协调各种生物过程。见Springer，《细胞》(Cell)，76306-314(1994)，表I为一个模型。一条因有细胞内鸟嘌呤结合蛋白的参与而以之命名的信号传导途径，影响着广泛的生物过程。Lewin对G-蛋白信号传导途径进行了概括性的讨论[《基因》(Gene)，V319-348(1994)]，他认为G-蛋白信号传导途径至少含有以下成分一个细胞外信号(如神经递质、肽类激素、有机分子、光和气味分子)、一个信号识别受体(G-蛋白偶联受体，见Probst等综述，《DNA和细胞生物学)》(DNAandCellBiology)，111-20，即通常所说的GPR和GPCR)以及一个细胞内GTP-结合蛋白即G蛋白的异源三聚体。这些信号传导途径因在白细胞迁移中所起的作用而尤其引人注目。白细胞包含一组具有迁移能力的血细胞类型，这些血细胞类型包括粒细胞(即嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)、淋巴细胞和单核细胞。在迁移和活化后，这些细胞主要参与机体对异物的防御。由于其参与正常生理过程和病理过程的多样性，白细胞的防御作用非常复杂，例如白细胞在应答感染的正常炎症反应中起作用，但也参与多种病理性炎症。详见Schall等，《现代免疫评论》(Curr.Opinion.Immunol)，6865-873(1994)。在不同的生物过程中，每种白细胞所起作用的程度、种类、持续时间都各不相同。在研究这些免疫反应时，研究者们最初的注意力主要集中在作用于白细胞的信号上，这是因为任何种类应答的诱导都需要一个信号。Murphy对一类重要的白细胞信号-多肽信号的成员进行了综述[《免疫学年度综述》(Ann.Rev.Immunol.)，12593-633(1994)]。有一类多肽信号包含趋化因子(化学吸引细胞因子)，Oppenheim等人称之为Intercrine[《免疫学年度综述》(Ann.Rev.Innunol.)，9617-648(1991).]。除Oppenheim等人外，Baggiolini等人还列出了数目不断增加的已经鉴定和进行遗传学及生物化学分析的趋化因子[《免疫学进展》(AdvancesinImmunol.)5597-179(1994)]。通过比较已知趋化因子的氨基酸顺序得到一种分类方法，可将趋化因子分为两个家族α家族趋化因子的特征是头两个胱氨酸残基被一个氨基酸残基间隔开(CXC，指N-末端)；而在β家族中这两个胱氨酸残基则直接相连(CC)，见上文Baggiolini等。已经发现了趋化因子与对其信号产生应答的特定白细胞类型之间的关系。Schall等人(见上文)报导说CXC趋化因子一般影响嗜中性粒细胞；而CC趋化因子倾向于影响单核细胞、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。例如Baggiolini等人(见上文)报导RANTES(一种CC族趋化因子)可作为单核细胞、淋巴细胞(即记忆T细胞)、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的化学吸引剂，并诱导嗜碱性粒细胞中组胺的释放，但不能对嗜中性粒细胞产生趋化作用。最近，Cocchi等人报导趋化因子是HIV增殖的抑制剂[Cocchi等，《科学》(Science)，2701811-1815(1995)]。他们证明RANTES、MIP-1α和MIP-1β能抑制HIV-1、HIV-2和SIV在一种名为PM1的CD4+细胞系和人外周血单核细胞原代培养物中的感染。然而最近研究重点已转向结合趋化因子的细胞受体，因为细胞外的趋化因子看起来不加区别地与细胞接触，因而缺乏调节单个白细胞种类所需的特异性。Murphy(见上文)报导，GPCR受体超家族包含趋化因子受体家族。典型的趋化因子受体结构包括一个位于N-末端的胞外趋化因子结合区域；接着是七个被间隔开的疏水区域，这种疏水区域主要由能形成跨膜α-螺旋的疏水氨基酸组成；亲水区域位于α-螺旋之间，它们或在细胞内或在细胞外。这些特征使嵌于膜上的趋化因子受体呈螺旋状结构。趋化因子受体通常以胞内区的第三环与G-蛋白作用。另外，Murphy(见上文)还指出，胞内的羧基末端也能与G-蛋白作用。首先用分子克隆技术获得分析的趋化因子受体是两个人IL-8的嗜中性粒细胞受体，IL-8为一种CXC趋化因子。Homels等人[《科学》(Science)253178-1280(1991)]Mur等人[《科学》(Science)2531280-1283(1991)]报导克隆了这两个IL-8的受体。Lee等人[《生物与化学杂志》(J.Biol.Chem.)26716283-16287(1992)]对编码这两个受体的cDNA进行了分析，发现它们之间有77％的氨基酸相同并都具有G-蛋白偶联受体家族的特征。其中一个受体是IL-8特异性的，而另一个可与IL-8、gro/MGSA、和NAP-2结合并传导信号。对IL-8受体基因进行的基因操作增进了我们对这些受体生物学作用的了解。例如，Cacalano等人[《(科学》(Science)265682-684(1994)]报导小鼠中IL-8受体同系物的缺失将导致淋巴结病和脾大等多种表型的出现。另外，Leong等人[《生物与化学杂志》(J.Biol.Chem.)26919343-19348(1994)]对错义突变所做的一项研究揭示了IL-8受体中与IL-8结合至关重要的氨基酸。Murphy(见上文)对结构域置换实验所做的讨论暗示胞外氨基末端结构域决定了结合的特异性。CC族趋化因子中也已有数个受体得到鉴定和克隆，CCCKR1可与MIP-1α和RANTES结合并都导致钙离子内流。Charo等人[《美国国家科学院院报》(Pro.Natl.Acad.Sci.)(USA)912752-2756(1994)]报导了另一个趋化因子受体-MCP-RI(CCCKR2)，MCP-R1由单一基因编码但可产生两种剪接变体，这两种剪接变体的差异位于羧基端结构域，这种受体除可与MCP-1结合和产生应答外，还可与MCP-3结合并产生应答。还发现了一个能不加区别地与CXC趋化因子和CC趋化因子结合的受体。这种受体最初是在红细胞上发现的，Horuk等人[《科学》(Science)2611182-1184(1993)]报导它可与IL-8、NAP-2、GROα、RANTES、和MCP-1结合。这种红细胞趋化因子受体与其它趋化因子受体有大约25％的同源性，可帮助调节循环中趋化因子的水平或协助将趋化因子呈递给靶细胞。除与趋化因子结合外，红细胞趋化因子受体还可作为间日疟原虫的受体，这种疟原虫是疟疾(id)的一个主要原因。另一个与趋化因子受体关系密切的G-蛋白偶联受体-血小板活化因子受体也可作为人类病原体(肺炎链球菌)的受体[Cundell等，《自然》(Nature)377435-438(1995)]。除哺乳动物的趋化因子受体外，还发现了两种病毒的趋化因子受体同系物.Ahuja等人[《生物与化学杂志》(J.Biol.Chem.)26820691-20694(1993)]报导了Herpesvirussaimiri的一个基因产物，该产物与IL-8受体有30％的同源性并能与CXC族趋化因子结合。Neote等人[《细胞》(Cell)，72415-425(1993)]报导人巨细胞病毒的一个基因可编码与CC族趋化因子受体有大约30％同源性的受体，该受体可与MIP-1α、MIP-1β、MCP-1和RANTES结合。这些病毒受体能影响趋化因子的正常功能，从而使病毒获得选择性的病理优势。由于趋化因子种类繁多活性多样，趋化因子受体的种类也非常多，已鉴定的受体仅占趋化因子总体的一部分。因此在本领域中仍需鉴定更多的趋化因子受体。应用这些新受体可为我们发展趋化因子和趋化因子受体的治疗用调节剂提供手段，本发明期望这样的调节剂可作为药物用于动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、肿瘤生长抑制、哮喘、病毒感染和其它炎症情况的治疗。另外，趋化因子受体的片断或变异体或识别这些受体的抗体也可望成为药物。发明概述本发明提供分离和纯化的核酸，这些核酸编码参与白细胞迁移的趋化因子受体，本发明的多核苷酸(包括有义链和反义链)包括基因组DNA、cDNA、RNA以及完全或部分人工合成的核酸。优选的多核苷酸包括编码趋化因子受体88-2B的DNA，该DNA的序列在SEQIDNO3中列出；编码趋化因子受体88C的DNA，该DNA的序列在SEQIDNO1中列出；以及能与上述DNA在标准的严格杂交环境下杂交的DNA或只与上述DNA遗传密码的冗余部分之外的序列杂交的DNA。典型的严格杂交条件包括杂交反应的温度为42℃；杂交缓冲液为50％甲酰铵、5XSSC、20mM磷酸钠、pH6.8；洗脱在0.2XSSC中进行，洗脱温度为55℃。本领域的技术人员都知道上述杂交条件可根据待杂交DNA的长度和GC含量作适当调整。本领域的标准公式可以用于确定精确的杂交条件。见Sambrook等，§§9.47-9.51，《分子克隆实验手册》(MolecularCloningALaboratoryManual)，ColdSringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork(1989)。本发明还涉及编码88-2B或88C各结构域的多核苷酸，例如编码一个或多个这两种蛋白质的胞外结构域或其它生物活性片断的多核苷酸。88-2B的胞外结构域对应于SEQIDNO3和SEQIDNO4的1-36、93-107、171-196和263-268位氨基酸残基，这些胞外结构域由对应于SEQIDNO3的362-469、638-682、872-949和1148-1213位核苷酸的多核苷酸序列编码。88C的胞外结构域对应于SEQIDNO1和SEQIDNO2的1-32、89-112、166-191和259-280位氨基酸残基，由对应于SEQIDNO1的55-150、319-390、550-627和829-894位核苷酸的多核苷酸序列编码。本发明还包括编码这两种细胞受体胞内结构域的多核苷酸序列。88-2B的胞内结构域包括SEQIDNO3和SEQIDNO4中的60-71、131-151、219-240和306-355位氨基酸残基，它们分别由对应于SEQIDNO3的539-574、752-814、1016-1081和1277-1426位核苷酸的多核苷酸序列编码。88C的胞内结构域包括SEQIDNO1和SEQIDNO2中的56-67、125-145、213-235和301-352位氨基酸残基，这些结构域分别由对应于SEQIDNO1的220-255、427-489、691-759和955-1110位核苷酸的多核苷酸序列编码。相当于一个或多个胞内和胞外结构域的多肽链或这些多肽链的特异性抗体，都可以用作受体活性尤其是与配体和G-蛋白结合活性的调节剂。本发明的核苷酸序列还可用来制备寡核苷酸标记探针，用于在严格杂交条件下分离编码88-2B和88C的基因组DNA(即用Southern分析和聚合酶链反应的方法)。这些寡核苷酸探针还可用于检查编码88-2B和88C基因的特殊等位基因，使特殊等位基因相关疾病的诊断和基因治疗变得方便易行。另外，这些寡核苷酸探针还可用于改变趋化因子受体的遗传，以利于趋化因子受体调节剂的鉴定。本发明的核苷酸序列也可用来设计反义核酸元件，用于探索和改变88-2B和88C的遗传和表达。本发明还包括上述DNA的生物复制子(即体内或体外分离的DNA拷贝)和RNA转录物。本发明还提供有效整合88-2B和88C多核苷酸并能自主复制的重组结构如质粒、病毒、染色体载体(如YAC)。而且，本发明还特别提供一类载体，在这种载体上，有效编码88-2B和88C的DNA序列与一个或多个内源或异源表达控制序列相连。88-2B和88C受体可从自然产物、重组产物和人工合成产物中获得。可以用本发明的多核苷酸按标准方法转化或转染宿主细胞(原核细胞和真核细胞)来表达趋化因子受体88-2B或88C。除完整的88-2B或88C基因产物外，本发明还涉及这两个蛋白的生物活性片断、类似物以及根据它们的氨基酸顺序人工合成的多肽，88-2B或88C的氨基酸序列分别见SEQIDNO4和SEQIDNO2。当用真核细胞生产时，88-2B或88C的基因产物或其生物活性片断还可获得翻译后修饰(例如二硫键形成、糖基化、磷酸化、豆蔻酰化、棕榈酰化、乙酰化等)。本发明进一步涉及88-2B和88C的基因产物或其生物活性片断的单体、同源多聚体和异源多聚体。本发明的一个方面特别地包括能与88-2B和88C趋化因子受体特异性结合的抗体。这种抗体可用重组的88-2B或88C受体、88-2B或88C受体的合成肽或肽片断、表达于宿主细胞表面的88-2B或88C以及从天然来源纯化的88-2B或88C受体作抗原按本领域的标准方法进行制备。这些抗体包括任何来源任何亚型的单克隆抗体和多克隆抗体。同时，本发明也包括抗体的单体、同源多聚体、异源多聚体以及它们的片断。本发明还进一步包含CDR-嵌合抗体、“人源化”抗体、以及其它仍保留与趋化因子受体特异性结合能力的抗体修饰产物。本发明还包含使用这些抗体来检测88-2B或88C的基因产物、类似物或生物活性片断。例如，抗体可用于揭示88-2B或88C的表达与多种正常或病理状态之间的关系。另外，抗体还可用来分析88-2B或88C的基因产物、同系物或生物活性片断表达的组织特异性差异。88-2B和88C趋化因子受体的特异性抗体还可用作受体活性的调节剂。另一方面，88-2B或88C受体的特异性抗体可用于治疗目的。本发明还提供试验方法来分析能与本发明的趋化因子受体相互作用的配体。这些试验可以包括通过监测标记配体与受体结合直接检测趋化因子受体的活性等。另外，这些试验还可用来间接估计配体与趋化因子受体的相互作用。本文中“配体”一词包括88-2B或88C的激动剂分子和拮抗剂分子以及其它能与这两种受体结合的分子。直接检测配体与趋化因子受体结合可用下面的试验方法进行。待测化合物(即假定的配体)先进行标记(如放射性同位素标记)。然后使标记的待测化合物与带有本发明的趋化因子受体的膜制备物相接触。优选使用携带表达本发明的趋化因子受体的重组质粒的宿主细胞制备所用的膜。温育一段时间使膜上的趋化因子受体与标记的待测化合物充分接触，用真空抽滤将膜组分收集在滤膜上。然后测定滤膜上的标记物，例如可用液闪分光光度计来测定放射性标记物。使用这种技术可鉴定能与趋化因子受体结合的配体。为进一步证实该化合物为配体，可在有非标记待测化合物的情况下，将标记的待测化合物与携带趋化因子受体的膜制备物作用，并且非标记化合物的量不断增加。如果随着非标记化合物的量增加，滤膜上的标记物水平下降，就证明该化合物为一种配体。激动剂和拮抗剂都是能与受体结合的配体，激动剂能引起细胞内的信号传导而拮抗剂不能。确定一种特定的配体究竟是激动剂还是拮抗剂，可以用诸如分析G-蛋白偶联的信号传导途径的方法进行。G-蛋白偶联信号传导途径的激活可通过测量细胞内Ca++流动、磷脂酶C的活性、腺苷酸环化酶的活性以及其它试验来确定(见实施例5和实施例6)。如本文中各实施例中所详细讨论的那样，可与88C受体结合的趋化因子包括RANTES、MIP-1α、MIP-1β；可与88-2B结合的趋化因子包括RANTES。另一个方面，本发明特别包括88-2B和88C受体与其配体相互作用的调节剂。趋化因子受体功能的调节剂可用类似鉴定配体的试验进行鉴定。将带有一种趋化因子受体的膜制备物与一种稳定的和已知量的标记配体进行作用，同时加入一种怀疑为该趋化因子受体活性调节剂的待测化合物，并且加入的量不断增加。如果滤膜上标记物的水平与加入的待测化合物的量有关，就说明这种化合物是趋化因子受体活性的调节剂。如果滤膜上标记物的水平随待测化合物的增加而升高，说明该化合物是一种激活剂；反之，如果如果滤膜上标记物的水平随待测化合物的增加而降低，说明该化合物是一种抑制剂。用这种方法检测受体结合活性的调节剂，可以对多种假定调节剂进行快速筛选，因为可以在同一个反应中，可以同时对含有多种潜在调节剂的混合物进行检测。受体结合的间接试验包括测量相关信号传导途径中任何组分的浓度或活性水平。趋化因子受体的激活通常与细胞内Ca++流动相关。可以使表达趋化因子受体的细胞带有一种钙敏感染料，当其表达的受体被激活时，就可用分光光度计通过染料观测到Ca++的流动，另外也可用显微镜进行观测。使用这两种方法中的任意一种，可在存在和不存在假定配体的条件下做平行试验。例如，使用显微镜法观测Ca++的流动，一个CC族趋化因子-RANTES被确定为88-2B趋化因子受体的一个配体。本领域的研究人员将会认识到这些试验也可用于鉴定和监测受体活性调节剂的纯化。在这些试验中，激活剂和抑制剂分别激活和抑制受体与其配体的相互作用。另外，趋化因子受体与G-蛋白的联系，使我们可以通过监测G-蛋白的活性来估计受体的活性。G-蛋白的一个特殊活性-GTP水解活性可以使用诸如32P标记的GTP来进行监测。G-蛋白还通过参与信号传导途径影响其它多种分子。例如，G-蛋白的效应分子包括腺苷酸环化酶、磷脂酶C、离子通道和磷酸二酯酶。当宿主细胞表达所感兴趣的趋化因子受体并与适当的配体作用时，可用针对上述任何效应分子的试验来监测配体结合所诱导的趋化因子受体活性。例如，有一种检测趋化因子受体活性的方法包含磷脂酶C的测定，在这一试验中，表达一种趋化因子受体的宿主细胞在存在激动剂时其放射性标记的磷酸肌醇产物得到测定。检测磷脂酶活性需要共转染一个编码外源G-蛋白的DNA。当需要共转染时，这个试验可用嵌合的G-蛋白DNA如Gqi5[Conklin等《自然》(Nature)363274-276(1993)]与88-2B或88CDNA进行共转染，在存在88-2B和88C受体的一种激动剂时，测定磷酸肌醇的产量。本领域的技术人员会认识到这些针对G-蛋白效应分子的试验同样能用于鉴定和监测受体活性调节剂的纯化。在这些试验中，受体激活剂和抑制剂分别激活和抑制受体与其配体的相互作用。趋化因子与多种炎症疾病有关，如牛皮癣、关节炎、肺纤维变性和动脉粥样硬化(见上文Baggiolini等)。趋化因子活性的抑制剂可用于这些疾病的治疗。在一个实例中，Broaddus等人[《免疫学杂志》(J.ofImmunol.)1522960-2967(1994)]介绍了IL-8的一种抗体，这种抗体能在兔肺急性炎症模型中抑制内毒素诱导胸膜炎的嗜中性粒细胞聚集。同样，能与88C受体结合的配体或能调节其活性的调节剂也可用于治疗艾滋病感染和艾滋病相关疾病。本发明所考虑的趋化因子与特异受体结合的调节剂可包括直接针对一种趋化因子或受体的抗体、生物或化学小分子、以及对应于趋化因子或受体片断的合成肽。本发明还包括对哺乳类受体给予含有88-2B和88C调节剂的组合物，用来监测和治疗正常或病理的免疫反应以及病毒感染，这些病毒感染包括逆转录病毒如HIV-1、HIV-2和SIV引起的感染。本发明还特别地包括通过给予药用可接受剂量的88-2B或88C受体调节剂来缓解炎症应答、造血异常和病毒感染。本发明进一步包括将上述活性物质与载剂、稀释剂或药剂组成可药用的组合物进行给药。本发明还包括多种给药途径。例如，活性物质可经下述途径给药静脉、皮下、腹膜、肌内、口、肛门(即使用栓剂)、或肺(即通过吸入器、喷雾器和雾化器等)。另一方面，依据本发明提供的DNA序列，可以在啮齿动物中运用同源重组或“基因剔除”策略，构建不能表达有功能的88-2B或88C趋化因子受体或表达突变受体的啮齿类动物。另外，运用众知的实验室技术还可构建表达克隆化88-2B或88C受体的转基因鼠[《小鼠胚胎操作指南》(ManipulatingtheMouseEmbryoALaboratoryManual)BrigidHohan，FrankCostantini和ElizabethLacy，编(1986)ColdSpringHarborLaboratoryISBN0-87969-175-I]。这些啮齿类动物可用作体内研究88-2B或88C受体活性的动物模型。本领域的技术人员在研究下面各实施例时很容易发现本发明的其它内容和优点。发明详述本发明用下面各实施例进行说明。实施例1介绍编码88-2B和88C趋化因子受体的基因组DNA的分离方法；实施例2介绍编码人88-2B和88C以及恒河猴88C的cDNA的分离和测序过程；实施例3介绍用Northern分析来揭示在不同组织中88-2B和88C受体的表达图谱；实施例4详细说明了88-2B和88C受体的重组表达；实施例5介绍了用于检测与潜在配体应答后88-2B和88C受体活性的多种试验方法，包括Ca++流动试验(Ca++FluxAssay)、磷酸肌醇水解试验和结合试验；实施例6和实施例7都是介绍88-2B和88C作为HIV的辅助受体所起作用的实验。实施例8介绍了能与88C进行免疫反应的单克隆抗体和多克隆抗体的制备方法和分析方法。实施例9介绍了用于鉴定88-2B或88C配体或调节剂的其它试验。实施例1编码本发明的新趋化因子受体的基因组部分克隆由PCR方法获得。PCR依据已鉴定趋化因子受体基因的保守序列和趋化因子受体基因在人基因组中成束分布进行设计。基因组DNA按标准PCR方法以变性寡核苷酸片断作引物进行扩增。PCR扩增所用的模板来自商业化的人重组基因组DNA，这种人基因组DNA克隆构建在酵母人工染色体(即YAC)上(ResearchGenetics，Inc.，Huntsville，AL，YACLibraryPools，catalogno.95011B)。每个YAC载体可容纳500-1000个千碱基对的插入片断。首先，用PCR方法用针对编码CCCKR1的基因的特异引物对YAC克隆库进行筛选。其中，有义链引物CCCKR(2)-5’(对应于CCCKR1的有义链)见SEQIDNO15，其序列为5’-CGTAAGCTTAGAGAAGCCGGGATGGGAA-3’，其中下面划线的核苷酸为CCCKR1的翻译起始密码子。反义链引物为CCCKR-3’(对应于CCCKR1的反义链)，其序列见SEQIDNO，CCCKR-3’的序列为5’-GCCTCTAGAGTCAGAGACCAGCAGA-3’，其中含有CCCKR1翻译终止密码子的反向互补核苷酸(划线核苷酸)。可用合适的鉴定方案，将能产生可察PCR产物(即凝胶电泳中出现DNA带)的YAC库鉴定为适宜的YAC亚库。(ResearchGenetics，Inc.，Huntsville，AL)。PCR反应起始条件为94℃温育4分钟。序列扩增共采用33个循环，每轮循环变性条件为94℃、1分钟，退火条件为55℃、1分钟，链延伸条件为72℃、2分钟。所获得的YAC克隆亚库可用PCR方法进行第二轮筛选，PCR所使用的条件和引物与第一轮相同。从亚库中可筛选到能用CCCKR1的特异引物进行PCR反应的单个克隆。其中一个克隆-克隆881F10带有640Kb的人基因组DNA，PCR和杂交证实该基因组DNA来自3p21染色体并含有编码CCCKR1和CCCKR2的基因。一个重叠克隆941A7带有700Kb的人基因组DNA，也含有编码CCCKR1和CCCKR2的基因。接着对这两个YAC克隆进行进一步图谱分析，Southern分析发现，CCCKR1和CCCKR2之间仅相距约100Kb。CCCKR1和CCCKR2基因紧密靠近表明新的相关基因很可能也与它们相连。以YAC克隆881F10和941A7的DNA为模板，可用PCR方法扩增任何与CCCKR1和CCCKR2相连的受体基因。设计变性寡核苷酸作为PCR引物，寡核苷酸序列对应于编码CC族趋化因子受体第二胞内环和第六跨膜结构域的基因区，这些基因区可通过比较CCCKR1、CCCKR2和V28的相应序列推导得出。使用V28是因为它是一个具有趋化因子受体特征的孤儿受体，V28已被定位在人的3号染色体上[Raport等，《基因》(Gene)163295-299(1995)]。需进一步说明的是，CCCKR2的两个剪接变体-CCCKR2A和CCCKR2B对于所分析的第二胞内环和第六跨膜结构域来说是相同的。5’引物命名为V28degf2，V28degf2内部有一个BamHI酶切位点(见下文)，其序列见SEQIDNO5，引物V28degf2的序列与编码受体典型结构第二胞内环的DNA一致，(Probst等，见上文)；3’引物命名为V28degr2，V28degr2内部有一个HindIII酶切位点(见下文)，其序列见SEQIDNO6，V28degr2的序列与编码受体典型结构第六跨膜结构域的DNA一致。PCR扩增后的DNA随后用BamHI和HindIII消化，产生大小约390bp的DNA片断，这一数据与由典型序列所推测的片断大小一致。然后将消化后的，PCR片断克隆到pBluescript上(StratageneInc.，LaJolla，CA)。对所获得的54个克隆片断进行核酸自动测序分析，在这54个克隆中，除CCCKR1和CCCKR2的序列外，还找到本发明的两个新趋化因子受体基因的序列。这两个新趋化因子受体基因被命名为88-2B和88C。运用限制内切酶图谱技术和杂交技术测量了编码受体88C、88-2B、CCCKR1和CCCKR2的基因在图谱中的相对位置。这四种基因紧密相连，其中88C与CCCKR2都位于人染色体3p21上，相距仅约18KBP。实施例288-2B和88C的全长cDNA可按下述步骤从巨噬细胞cDNA文库中获得。首先，用人巨噬细胞mRNA在pRc/CMV(InvitrogenCorp.，SanDiego，CA)中构建一个cDNA文库[见Tjoelker等，《自然)》(Nature)374549-553(1995)]，然后用88-2B或88C的特异引物对在cDNA文库中PCR筛选含88-2B和88C的cDNA克隆。PCR的起始变性条件为94℃、4分钟，扩增共进行33个循环。反应条件为变性94℃、1分钟；退火55℃、1分钟；链延伸72℃、2分钟。88-2B的第一条特异引物为88-2B-f1，其序列见SEQIDNO11，它对应于SEQIDNO3中有义链的844-863核苷酸。88-2B的第二条特异引物为88-2B-r1，其序列见SEQIDNO12，它对应于SEQIDNO3中1023-1042核苷酸的反义链。与此类似，88C的第一条特异引物88C-f1的序列见SEQIDNO13，它对应于SEQIDNO1中有义链的453-471核苷酸。88C的第二条特异引物为88C-r3，其序列见SEQIDNO14，它对应于SEQIDNO1中744-763核苷酸的反义链。筛选得到了克隆777，它是88-2B的一个cDNA克隆。克隆777含有一个1915bp的DNA插入片断，该插入片断包括88-2B的全部编码序列，这是根据以下标准确定的这个克隆含有一个长的以ATG密码子为起点的开放阅读框，有一个Kozak序列，且在上游有一个框内终止密码子。克隆777中插入DNA的序列及由其推导出的氨基酸顺序分别见SEQIDNO3和SEQIDNO4。88-2B在巨噬细胞cDNA文库中的转录水平非常低，在估计总数为三百万的克隆中，只筛选到三个88-2B克隆。在筛选编码88C趋化因子受体的cDNA克隆时找到两个克隆101和134，这两个克隆看来都含有完整的88C编码区并有一个假定的起始密码子。但这两个克隆缺少必需的5’辅助序列来证实其起始密码子。88C转录子在巨噬细胞cDNA文库中相对多一些，在筛库过程中，估计每3000个转录子(库总量约为三百万克隆)中就有一个88C转录子。运用RACEPCR(cDNA末端快速扩增)技术延伸已存在的88C克隆的序列，就可以方便地对88CcDNA的5’末端进行精确的分析。人脾5’-RACE-readycDNA购自ClontechLaboratories，Inc.，PaloAlto，CA并按厂商推荐的方法使用。将cDNA制备成5’-RACE-ready的方法是将一段锚序列连接在cDNA片断的5’端。这段锚序列与ClontechLaboratories，Inc.，PaloAlto，CA提供的一个锚引物互补，这个锚序列-锚引物多核苷酸双链中有一个EcoRI酶切位点。选用人脾cDNA为模板的原因是Northern杂交表明88C能在脾中表达。PCR反应的起始步骤是将样品94℃变性4分钟，然后进行35轮扩增，扩增条件为变性94℃、1分钟；退火60℃、45秒钟；链延伸72℃、2分钟。第一轮PCR的反应混合物含有2ul的5’-RACE-ready脾cDNA、1ul的锚引物、和1ul的88c-r4引物(100ng/ul)，反应总体积为50ul。88C的特异引物88c-r4(5’-GATAAGCCTCACAGCCCTGTG-3’)见SEQIDNO7，其序列与SEQIDNO1中745-765核苷酸的反义链顺序一致。第二轮PCR的反应混合物包含1ul的首轮PCR产物、1ul的锚引物、和1ul的引物88C-r1b(100ng/ul)。88C-r1b的序列为5’-GCTAAGCTTGATGACTATCTTTAATGTC-3’并见SEQIDNO8。引物88C-r1b的序列含有一个HindIII酶切位点(划线核苷酸)。HindIII酶切位点的3’序列与SEQIDNO1中636-654核苷酸的反义链一致。得到的PCR产物用EcoRI和HindIII消化并用1％的琼脂糖凝胶电泳分离，回收大小约700bp的DNA片断，并将其克隆到pBluescript上。对插入片断最大的克隆进行测序分析。另外，还可以用一种商业化的TA克隆试剂盒将完整的PCR产物连接到pCR载体上(InvitrogenCorp.，SanDiego，CA)进行测序分析。88-2B和88C的序列测定使用PRISMTMReadyReactionDyeDeoxyTMTerminatorCycle测序试剂盒(PerkinElmerCorp.，FosterCity，CA)和A即liedBiosystems373ADNA测序仪。使用克隆777的插入片断作为88-2BcDNA的双链测序模板。所测得克隆777完整插入片断的序列作为88-2B的cDNA序列与由其推导出的氨基酸顺序在SEQIDNO3列出。这段插入序列长1915bp，包括361bp的5’非翻译区(对应于SEQIDNO3的1-361核苷酸)、1065bp的编码区(对应于SEQIDNO3的362-1426核苷酸)、489bp的3’非翻译区(对应于SEQIDNO3的1427-1915核苷酸)。88-2B的基因组DNA(见上文实施例1)对应于SEQIDNO3的746-1128核苷酸。88C的cDNA序列及由其推导出的氨基酸顺序见SEQIDNO1。88C的cDNA是由RACE-PCRcDNA、克隆134和克隆101的测序结果拼组而来。以RACE-PCRcDNA为模板测定了SEQIDNO1的1-654核苷酸，其中包括独特的对应于SEQIDNO1的1-9核苷酸的9bp5’非翻译区。由RACE-PCRcDNA的测序结果证实88C的第一个甲硫氨酸密码子位于SEQIDNO1的55-57核苷酸，并支持克隆134和101含有88C的全部编码区这一观点。克隆134含有45bp的5’非翻译区(对应于SEQIDNO1的10-54核苷酸)、1056bp的88C编码区(对应于SEQIDNO1的55-1110核苷酸)及492bp的3’非翻译区(对应于SEQIDNO1的1111-1602核苷酸)。克隆101含有25bp的5’非翻译区(对应于SEQIDNO1的30-54核苷酸)、1056bp的88C编码区(对应于SEQIDNO1的55-1110核苷酸)及2273bp的3’非翻译区(对应于SEQIDNO1的1111-3383核苷酸)。前面实施例1中介绍的88C基因组DNA对应于SEQIDNO1的424-809核苷酸。推导而来的88-2B和88C氨基酸顺序表现出GPCR的疏水特征，它们有七个与GPCR跨膜结构域一致的疏水结构域。将它们的序列与其它GPCR相比也可看出一定程度的同源性。特别有意义的是，推导而来的88-2B和88C氨基酸顺序与趋化因子受体的氨基酸顺序有最高的同源性。表1列出了这些氨基酸顺序进行比较的结果1显示88-2B与CCCKR1最相似(62％的氨基酸同源性)；88C与CCCKR2最相似(72％的氨基酸同源性)。推导而来的882B和88C氨基酸顺序也表现出GPCR的胞内和胞外结构域特征。88-2B的胞外结构域对应于SEQIDNO3和SEQIDNO4所示氨基酸顺序的1-36、93-107、171-196和263-284氨基酸残基。88-2B的胞外结构域由对应于SEQIDNO3中的362-469、638-682、872-949和1148-1213核苷酸的多核苷酸序列编码。88C的胞外结构域包括SEQIDNO1和SEQIDNO2中的1-32、89-112、166-191和259-280氨基酸残基。88C的胞外结构域由对应于SEQIDNO1中的55-150、319-390、550-627和829-894核苷酸的多核苷酸序列编码。88-2B的胞内结构域包括SEQIDNO3和SEQIDNO4中的60-71、131-151、219-240和306-355氨基酸残基。这些结构域分别由对应于SEQIDNO3中的539-574、752-814、1016-1081和1277-1426核苷酸的多核苷酸序列编码。88C的胞内结构域包括SEQIDNO1和SEQIDNO2中的55-67、125-145、213-235和301-352氨基酸残基。这些结构域分别由对应于SEQIDNO1中的220-255、427-489、691-759和955-1110核苷酸的多核苷酸序列编码。另外，使用对应于人88CcDNA5’和3’两翼区域的引物，用PCR的方法扩增了一个恒河猴的88CDNA，所用的5’端引物对应于紧接甲硫氨酸起始密码子并包括甲硫氨酸起始密码子的上游区域，而3’端引物则与紧接终止密码子的下游区域互补。两个引物中含有酶切位点，可将扩增产物克隆到表达载体上。5’端引物的序列为GACAAGCTTCACAGGGTGGAACAAGATG(划线部分为HindIII酶切位点)(SEQIDNO17)，3’端引物的序列为GTCTCTAGACCACTTGAGTCCGTGTCA(划线部分为XbaI酶切位点)(SEQIDNO18)。扩增的起始条件为94℃、8分钟，然后进行40个循环的扩增。每轮扩增的条件为变性94℃、1分钟、退火55℃、45秒钟、链延伸72℃、1分钟。扩增产物克隆到pcDNA3的HindIII和XbaII酶切位点上。最后得到了一个克隆并进行了序列测定。全长的恒河猴cDNA序列及由之推导的氨基酸顺序分别见SEQIDNO19和SEQIDNO20。恒河猴88C的核苷酸序列与人88C的核苷酸序列有98％的同源性，由两者推导而来的氨基酸顺序有97％的同源性。实施例388-2B和88CmRNA的表达图谱用Northern印迹法进行了测定。所用的Northern印迹购自ColntechLaboratories，Inc.，PaloAlto，CA.，含有固定化的人多种组织的polyA+RNA。特别对下列组织进行了检测心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠以及外周血中的白细胞。用cDNA克隆478制备了一个88-2B核苷酸序列的特异性探针。克隆478的cDNA插入片断含有与SEQIDNO3中641-1915核苷酸一致的序列。制备这一探针的过程为先将克隆478消化并用凝胶电泳分离DNA插入片断，然后用本领域通用的方法用32P标记核苷酸对插入片断进行放射性标记。通过分离和标记克隆493中发现的DNA插入片断，制备了一个88C核苷酸序列的特异性探针。克隆493的DNA插入片断含有与SEQIDNO1中421-1359核苷酸一致的序列。同样，这一探针的制备也运用了包含32P标记核苷酸等传统技术。以88-2B为探针的Northern印迹在外周血白细胞中发现了一种长度约1.8kb的mRNA。88CNorthern试验表明在多种人组织中存在一种长度约4kb的mRNA，包括在脾或胸腺组织中用探针检测到的强阳性信号和在外周血白细胞及小肠中略弱的阳性信号。用88C探针在肺组织和卵巢组织中也得到了相对弱的阳性信号。88C在人T细胞和造血细胞系中的表达也用Northern印迹法进行了检测。88C在CD4+和CD8+T细胞中的水平非常高。转录水平在髓样细胞系THP1和HL-60中也相对较高，在B细胞系Jijoye中也发现了同样的现象。另外，在用PCR方法扩增而来的人巨噬细胞cDNA文库中，88C的转录水平相对较高。实施例4用重组方法在哺乳动物细胞中表达88-2B和88C的cDNA。为进行瞬时转染实验，先将88C亚克隆到哺乳动物细胞表达载体pBJ1[Ishi，K等，《生物与化学杂志》(J.Biol.Chem)27016435-16440(1995)]上。这一载体含有一段编码催乳素信号肽的序列，可以让重组产物在细胞表面有效表达。88C的氨基端有一个FLAG表位，可用于表达产物的检测。这个FLAG表位含有“DYKDDDD”氨基酸顺序。按产品说明，使用脂质转染胺(LifeTechnology，Inc.，GrandIsland，NY)将88C表达载体瞬时转染至COS-7细胞中。简单地说，先将细胞按4×104每孔接种到24孔板上培养过夜，然后用PBS洗涤细胞，将0.3mgDNA和1.5ul脂质转染胺在0.25mlOpti-MEM中混匀并加入到每个孔中。37℃、5小时后，用含10％FCS的培养基取代原来的培养基。使用FLAG表位的特异性抗体M1(EastmanCo.，NewHaven，CT)进行定量ELISA证实88C在瞬时转染的COS-7细胞的细胞表面上有表达。按厂家推荐的方法使用转染试剂DOTAP(N-[1-[(2，3-二油酰基氧)丙基]-N，N，N-三甲基铵]甲基硫酸盐，Boehringer-Mannheim，Inc.，Indianapolis，IN)，FLAG标记的88C受体也可稳定转染到HEK-293细胞中，HEK-293是一种人胚肾细胞系。在有药物G418存在的条件下选择稳定的细胞系。使用针对FLAG表位的抗体M1，用ELISA方法评价88C在转染后HEK-293细胞表面的表达。ELISA的结果表明，FLAG表位标记的88C在稳定转化的HEK-293细胞表面获得了表达。使用88-2B和88C的cDNA来获得稳定的HEK-293转染子。先用PCR方法将88-2B受体的cDNA克隆到pRc/CMV(InvitrogenCorp.，SanDiego，CA)上巨细胞病毒启动子的后面。PCR反应所用的模板为克隆777中的cDNA插入片断。两条引物为88-2B-3(内含XbaII酶切位点)和88-2B-5(内含HindIII酶切位点)。88-2B-3的核苷酸序列见SEQIDNO9，88-2B-5的核苷酸序列见SEQIDNO10。cDNA上一个1104bp的区域得到了扩增。扩增完成后，用XbaII和HindIII酶切得到的DNA，并将其克隆到用相同酶切处理的pRc/CMV上。所获得的重组质粒命名为777XP2。777XP2含有18bp的5’端非翻译区、88-2B的完整编码区和3bp的3’非编码区。对于88C来说，克隆134的全长cDNA插入片断在转染HEK-293前不需进一步加工。为获得稳定的转化细胞系，按厂家推荐的方法使用转染试剂DOTAP(N-[1-[(2，3-二油酰基氧)丙基]-N，N，N-三甲基铵]甲基硫酸盐，Boehringer-Mannheim，Inc.，Indianapolis，IN)将pRc/CMV重组子转染到人胚肾细胞系HEK-293中。用标准筛选方法(即Northern印迹法)鉴定能高水平产生88-2B和88CmRNA的稳定细胞系。实施例5A.Ca++流动试验为了分析多肽的表达，我们采用了一个检测趋化因子受体活性的功能试验。已知的趋化因子受体在传导信号时有一个共同的特征，那就是在信号传导过程中伴随着细胞内Ca++的释放。因此可以通过分析转染后HEK-293细胞内Ca++的浓度来判断88-2B或88C受体是否对任何一种已知趋化因子产生应答。将用上文所述的方法稳定转染了88-2B、88C(不含编码FLAG表位的序列)或一种对照序列(编码IL-8R或CCCKR2，见下文)的HEK-293细胞在T75培养瓶中培养至约90％汇合，所用的培养基为MEM+10％血清。用Versene(0.6mMEDTA，10mMNa2HPO4，0.14MNaCl，3mMKCl，1mM葡萄糖)洗涤并收集细胞，在MEM+10％血清+1uMFura-2AM(MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR)中室温温育30分钟，其中Fura-2AM是一种Ca++敏感的染料。用含有0.9mMCaCl2和0.5mMMgCl2的Dulbecco’s磷酸缓冲盐(D-PBS)重新悬浮细胞并将其浓度调整至约107细胞/毫升，用一台荧光分光光度计(HitachiModelF-4010)监测荧光的变化。将1.8ml悬浮有约106细胞的D-PBS加入维持在37℃的测量杯中，激发波长在340nm和380nm之间以4秒钟为间隔进行改变。发射波长为510nm，待测化合物由注射接口加入。最大Ca++流动通过加入离子霉素进行测量。在表达IL-8RA的细胞中用IL-8刺激可以观测到阳性应答，用MCP-1或MCP-3刺激表达CCCKR2的细胞也可以观测到阳性应答。但表达88-2B或88C的HEK-293细胞在与下列趋化因子作用时，却观测不到细胞内Ca++的浓度变化，这些趋化因子包括MCP-1、MCP-2、MCP-3、MIP-1α、MIP-1β、IL8、NAP-2、gro/MGSA、IP-10、ENA-78、PF-4(Peproteeh，Inc.，RockyHill，NJ)。用一种更敏感的试验，将表达88-2B的细胞在有Fura-2AM的情况下与RANTES作用，可以观测到应答于RANTES的Ca++流动，这一试验所用的细胞和试剂均按前述方法制备。RANTES(RegulatedonActivation，NormalTExpressedandSecreted)是一种CC族趋化因子，已经证明这种趋化因子是嗜酸性粒细胞的化学吸引剂和激活剂(见上文Neote等)。这种细胞因子还可介导嗜碱性粒细胞释放组胺，并在体外具有记忆T细胞化学吸引剂的功能。因此，88C受体活性的调节对于调节白细胞活性是有用的。FLAG标记的88C受体在HEK-293细胞中进行表达，其与趋化因子的相互作用用Ca++流动试验进行检测。88C在细胞表面的表达用M1抗体通过ELISA和FACScan进行证实。在浓度为100nM时，趋化因子RANTES、MIP-1α、和MIP-1β都能在88C-转染细胞中诱导Ca++流动。Ca++流动试验还可设计用于鉴定趋化因子受体结合活性的调节剂。在有待测化合物存在的条件下进行前述的荧光检测试验或显微镜检测试验，如果在存在待测化合物时Ca++流动增加，说明这种化合物为趋化因子受体结合活性的激活剂；如果Ca++流动减少，则表明待测化合物是趋化因子受体结合活性的抑制剂。B磷酸肌醇水解另一个检测配体或调节剂的试验包括磷脂酶C活性的监测[见Hung等，《生物与化学杂志》(J.Biol.Chem.)116827-832(1992)].首先，将表达一种趋化因子受体的细胞用3H-肌醇标记24小时。在细胞中加入待测化合物(即可能的配体)，37℃温育15分钟。然后用20mM的甲酸溶解细胞并抽提磷酸肌醇代谢的水解产物(即磷脂酶C介导的水解反应产物)。抽提物用一个AG1X8阴离子交换柱(甲酸型)进行阴离子交换层析。磷酸肌醇用2M甲酸铵/0.1M甲酸洗脱，带有3H标记的化合物用液闪分光光度计测定。磷脂酶C试验也可用于鉴定趋化因子受体活性的调节剂。试验方法与前面介绍的方法相同，只是多加入一种可能的调节剂。如果标记物的水平升高，就表明这种调节剂是一种激活剂；而标记物的水平降低则说明调节剂是一种趋化因子受体活性的抑制剂。磷脂酶C试验也可用于鉴定FLAG-标记的88C受体的趋化因子配体。在转染后约24小时，表达88C的COS-7细胞用肌-[2-3H]肌醇(1uCi/ml)标记20-24小时。标记时所用的培养基含10％透析过的FCS且不含肌醇。标记后的细胞用含有10mMLiCl且不含肌醇的DMEM洗涤，然后在含有10mMLiCl和下列一种趋化因子且不含肌醇的DMEM中37°温育1小时，所用的趋化因子包括RANTES、MIP-1β、MIP-1α、MCP-1、IL-8或鼠的MCP-1同系物JE。磷酸肌醇(IP)的生成用上段所述的方法进行分析。在与趋化因子一起温育后，将培养基吸出并加入0.75ml冰冷的20mM甲酸(30分钟)。将上清装入AG1-X8Dowex柱(Biorad.Hercules，CA)并迅速加入时3ml50mM的NH4OH。然后用4ml40mM的甲酸铵洗柱，接着用2M的甲酸铵洗脱。通过测量beta射线计算磷酸肌醇的总量。由于发现某些趋化因子受体如IL-8RA和IL-8RB只有在与一种外源G蛋白共转染时，才能在COS-7细胞中产生可检测到的信号传导，因此88C受体与嵌合G蛋白Gqi5进行了共表达[Conklin等，《自然》(Nature)363274-276，(1993)]。Gqi5是一种Gi(受体结合部位)羧基端的五个氨基酸被剪接到Gαq的G蛋白。与Gqi5一起共转染明显增强了由CCCKR1和CCCKR2传导的信号。Gqi5共转染显示88C在应答RANTES、MIP-1β和MIP-1α时能很好地传导信号，但不能对MCP-1、IL-8或鼠MCP-1同系物JE产生应答。剂量应答曲线显示RANTES、MIP-1β和MIP-1α的EC50值分别为1nM、6nM和22nM。88C是第一个克隆到的与MIP-1β应答传导信号的人受体。与其它CC族趋化因子相比，MIP-1β明显有一个独特的细胞激活谱。它似乎能激活T细胞而不能激活单核细胞(见上文Baggiolini等)，这与受体刺激研究所获得的结果一致。例如，MIP-1β与CCCKR1结合时不能诱导Ca++流动(见上文Neote等)。相反，MIP-1α和RANTES能够与CCCKR1和CCCKR5结合并传导信号(RANTES还能激活CCCKR3)。这样看来MIP-1β与其它CC族趋化因子相比更具有选择性。这种选择性具有治疗意义，因为这样可以刺激一个特定有益的活性(如抑制HIV感染)而不会刺激多种白细胞群体从而导致广泛的炎症活性。C结合试验另一个用于分析受体与趋化因子相互作用的试验为修改的Ernst结合试验[Ernst等，《免疫学杂志》(J.Immunol.)1523541-3549(1994)]。MIP-1β用Bolton和Hunter试剂(二碘化物，NEN，Wilmington，DE)按产品说明进行标记。通过PD-10柱(Pharmacia)洗脱使未连接的二碘化物与标记好的蛋白分离，PD-10在使用前用PBS和BSA(1％w/v)平衡。特异活性一般为2200Ci/mmole。平衡结合按如下步骤进行在聚丙烯管内加入5×105HEK-293细胞，该细胞已转染了FLAG标记的88C。将125I标记的配体与或不与100倍过量的非标记配体一起加入到细胞中，反应总体积为300ul(50mM的HEPESpH7.4，1mM的CaCl2，MgCl2，0.5％的BSA)。27℃、150rpm振荡温育90分钟。用Skatron细胞收集仪(SkatronInstrumentsInc.，Sterling，VA)将细胞收集到预先用0.3％的聚乙烯亚胺和0.2％BSA浸泡过的玻璃纤维滤膜上，漂洗并取出滤膜，通过计量gamma射线计算结合的配体。非标记配体竞争条件下的配体结合用5×105的转染细胞(同上)与1.5nM的放射性标记配体和指定浓度的非标记配体一起温育，按前述方法对样品进行收集、洗涤和计量。用曲线拟合程序Prism(GraphPadInc.，SanDiego，CA)和迭代非线性回归程序LIGAND(PM220)对获得的数据进行分析。在平衡结合试验中，88C受体与放射性标记MIP-1β的结合具有专一性和饱和性，用Scatchard的方法对这一结合的数据进行分析发现其解离常数(Kd)为1.6nM。用标记的MIP-1α所做的竞争结合试验表明88C与MIP-1β(IC50＝7.4nM)、RANTES(IC50＝6.9nM)和MIP-1α(IC50＝7.4nM)都能高亲和地结合，这一结果与上文B节中由瞬时转染的COS-7细胞获得的信号传导数据一致。实施例6已经发现MIP-1α、MIP-1β及RANTES能抑制HIV-1和HIV-2在人外周血单核细胞和PM1细胞中的复制(见上文，Cocchi等)。鉴于这一发现以及例5中所述的结果，本发明认为激活88C受体或用配体与88C受体结合可在HIV感染中提供保护作用。最近，有报导说孤儿G蛋白偶联受体融合素(fusin)可作为HIV侵入的辅助受体。融合素/CXCR4与HIV的主要受体CD4组合，能明显促进HIV对T细胞培养物的感染[Feng等，《科学》(science)272872-877(1996)]。基于融合素与趋化因子受体的同源性及88C的趋化因子结合能力，并且由于88C在T细胞中为组成型表达且在巨噬细胞中表达量丰富，88C很可能参予了病毒和HIV的感染。用88C或88-2B转染表达CD4的细胞，并用HIV进行攻击，证明88C和88-2B具有HIV辅助受体功能。只有当细胞同时表达CD4和一种有功能的辅助受体时，HIV才能感染细胞。HIV感染可用多种方法测定。用来检测HIV抗原表达的ELISA试剂盒可由商业途径购得，如CoulterHIV-1p24antigenassay(USPatentNos.4,886,742)，CoulterCorp.，11800SW147thAve.，Miami，FL33196。另外，还用基因工程的方法使待测细胞表达一个报告基因如LACZ，并将这一基因连接在HIVLTR启动子的后面[Kimpton等，《病毒学杂志》(J.Virol.)，662232-2239(1992)]。在这个方法中，感染HIV的细胞可用比色试验进行检测。88C瞬时转染至一个猫细胞系CCC[Clapham等，181703-715(1991)]中，这一细胞已稳定转染了人CD4并能表达人CD4(CCC-CD4)。通常情况下，这种细胞能够抵抗任何HIV-1株的感染，因为这种细胞本身不表达88C。在实验中，将88C克隆到表达载体pcDNA3.1(InVitrogenCorp.，SanDiego，CA)上，并用脂质转染胺(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)瞬时转染到CCC/CD4细胞中。转染两天后用HIV攻击转染细胞。温育4天，将细胞固定染色，观测p24抗原作为HIV感染的指标。88C的表达使转染细胞对多株HIV-1的感染敏感。这些HIV株包括四种原代非合胞体诱导型HIV-1分离株(M23、E80、SL-2和SF-162)，它们都只能以88C作辅助受体而不能用融合素作辅助受体。几种原代合胞体诱导型HIV-1株(2006、M13、2028和2076)则可用88C或融合素作辅助受体。而且，两种克隆化的HIV-1病毒(GUN-1和89.6)也可使用88C或融合素作辅助受体。有报导说某些HIV-2株可感染特定的CD4阴性细胞系，这暗示HIV-2可以不需CD4而直接与一种受体作用[Clapham等，《病毒学杂志》(J.Virol.)663531-3537(1992)]。对某些HIV-2株来说，可溶性的CD4(sCD4)可促这种感染。因为88-2B与其它可作为HIV辅助受体的趋化因子受体(即88C和融合素)有很高的同源性，88-2B很可能是HIV-2的辅助受体。88-2B作为一种HIV-2辅助受体的作用可用HIV-2的ROD/B株进行证明。内源不表达CD4的猫CCC细胞用88-2B进行转染。在实验中，先用脂质转染胺将带有88-2B的pcDNA3.1转染到细胞中，48小时后用HIV-2进行感染，在感染三天后，用免疫染色的方法检测HIV-2包膜糖蛋白的存在。在HIV-2ROD/B攻击时存在sCD4可使感染的细胞增加10倍。HIV-2侵入88-2B转染细胞可为400-800ng/ml的eotaxin所阻断，eotaxin是88-2B的一种配体。CCC/88-2B细胞的基础感染水平(没有可溶性的CD4)与没有用88-2B转染的CCC细胞相同。通过制备稳定转化并表达88C或88-2B的细胞系并用HIV和SIV的多种分离株进行攻击，已经证实了88-2B和88C作为HIV辅助受体的作用。这些结果在例7中介绍。另外，88C和88-2B的辅助受体功能也可用不需使用活病毒的实验方法进行证明。在这种方法中，共表达88C或88-2B、CD4和一个LACZ报告基因的细胞系与共表达HIV包膜糖蛋白(ENV)和一个报告基因转录因子的细胞系进行混合[Nussbaum等，1994，《病毒学杂志》(J.Virol.)685411]，表达有功能的HIV辅助受体的细胞将会与表达ENV的细胞融合从而使报告基因表达。在这一方法中，用比色试验检测到报告基因就说明88C或88-2B具有HIV辅助受体功能。趋化因子抑制病毒感染的机制还不清楚。一种可能的机制是趋化因子结合引起受体活化。趋化因子结合导致细胞内信号传导，使细胞能抵抗病毒的感染和/或阻止病毒在细胞内复制。与干扰素诱导类似，细胞将分化以抵抗病毒的感染或建立一种抗病毒状态。另一种可能的机制是，趋化因子的结合通过阻断病毒包膜糖蛋白与辅助受体靠近，直接干扰了病毒进入细胞。在这一机制中，趋化因子抑制病毒感染不需要G蛋白信号传导。为弄清88C和88-2B究竟以这两种机制中哪一种来行使其病毒或HIV感染的辅助受体功能。我们将趋化因子与受体的结合同信号传导解偶联，并测定趋化因子对病毒感染的抑制效果。配体结合与信号传导解偶联可通过加入能抑制G蛋白介导信号传导的化合物如百日咳毒素和霍乱毒素来实现。另外，下游的效应多肽可用其它化合物如渥曼青霉素来抑制。如果G蛋白信号传导参予病毒感染的抑制，加入这些化合物将会阻止趋化因子对病毒感染的抑制。此外还可将88C和88-2B受体与G蛋白偶联所需的结构域或关键氨基酸残基改变或删除。这样就可改变或破坏其与G蛋白的偶联而不影响趋化因子的结合。在这种情况下，如果趋化因子不能抑制病毒或HIV的感染，就说明G蛋白信号传导对于抑制病毒和HIV感染是必需的；反之，如果趋化因子能够抑制病毒的感染，说明G蛋白信号传导不是趋化因子抑制病毒感染所必需的，趋化因子的保护作用可能是通过阻断病毒利用受体来实现的。另一条证明途径包含88C或88-2B特异性抗体的使用。某些抗体能与88C或88-2B结合但不引起G蛋白信号传导，这种抗体能阻断受体上趋化因子或病毒的结合位点。如果在有88C或88-2B抗体的情况下，病毒的感染受到抑制，就说明趋化因子的保护机制是阻断病毒与受体的结合。Feng等人报导，针对融合素受体氨基端的抗体能抑制HIV感染(Feng等，1996)。实施例7用稳定转化了88C或88-2B的细胞系来进一步说明88C和88-2B在HIV感染中所起的作用。Kimpton和Emerman在《通过激活整合β-半乳糖苷酶基因检测敏感细胞系中有复制能力的假型人免疫缺陷病毒》(DetectionofReplication-CompetentandPseudotypedHumanImmunodeficiencyViruswithaSensitiVeCellLineontheBasisofActivationofanIntegratedBeta-GalactosidaseGene)，《病毒学杂志》(J.Virol)66(5)3026-3031(1992)中介绍了一个指示细胞系，在这里我们称之为HeLa-MAGI细胞。HeLa-MAGI细胞是稳定转化了CD4并能表达CD4的HeLa细胞，这种细胞还整合有能启动染色体中β-半乳糖苷酶基因表达的HIV-1LTR。在细胞中整合一个HIV原病毒将会导致细胞合成病毒的反式激活因子Tat，后者又会启动β-半乳糖苷酶基因的表达。用X-gal原位检查细胞的β-半乳糖苷酶活性，阳性细胞的数量直接与受感染细胞的数量呈正比。这种HeLa-MAGI细胞可以检测出实验室获得的HIV-1分离株，但却只能检出少数原代分离株[见上文，Kimpton和Emerman]，而且这种细胞不能检出多数SIV分离株[Chackerian等，《能被多种猴免疫缺陷病毒分离株感染并且经一个复制循环即可检测出病毒的CD4表达恒河猴细胞系的鉴定》(CharacterizationofaCD4-ExpressingMacaqueCellLinethatcanDetectVirusAfterASingleReplicationCycleandcanbeinfectedbvDiverseSimianImmunodeficiencyVirusIsolates)《病毒学)》(Virology)，213(2)6499-6505(1995)]。另外，Harrington和Geballe在《I型人免疫缺陷病毒进入表达CD4的人细胞系必需的辅助因子》(Co-FactorRequirementforHumanImmunodeficiencyVirusType1EntryintoaCD4-expressingHumanCellLine)，《病毒学杂志》(J.Virol.)，675939-5947(1993)一文中介绍了一个U373细胞衍生的细胞系。U373细胞已通过基因工程技术改造，能表达CD4和与上文相同的LTR-β-半乳糖苷酶。这个细胞系在这里我们称之为U373-MAGI。已经发现U373-MAGI细胞系不能被任何HIV株(M向性或T向性)感染，但在与HeLa细胞融合后却对感染敏感[见上文，Harrington和Geballe]。为构建既能用来检测巨噬细胞向性病毒又能检测T细胞向性病毒的指示细胞系，我们用一个逆转录病毒载体将编码表位标记的88C或88-2B的DNA转染到HeLa-MAGI或U373-MAGI细胞中，分别得到HeLa-MAGI-88C或U373-MAGI-88C细胞系。用抗FLAG的M1抗体对活细胞进行免疫染色或用RT-PCR来证明辅助受体在细胞表面的表达。用于构建HeLa-MAGI-88C和U373-MAGI-88C的88C和88-2B基因与实施例4中介绍的一样，含有编码催乳素信号肽的基因序列，在编码催乳素信号肽的基因后面为编码一个FLAG表位的序列。这段基因插入在逆转录病毒载体pBabe-Puro[Morgenstern和Land，《核酸研究》(NucelicAcidsResearch)，18(12)3587-3596(1990)]上。高滴度的逆转录载体与VSV-G蛋白组成假型病毒，这种假型病毒是按Bartx[Bartx等，《病毒学杂志》(J.Virol.)702324-2331(1996)]所述用瞬时转染的方法制备的。用这种假型病毒感染HeLa-MAGI细胞和U373-MAGI细胞。将能抵抗0.6ug/ml嘌呤霉素(HeLa)或1ug/ml嘌呤霉素(U373)的细胞合并收集，每个合并物中至少含1000个独立的转导子。用原代HeLa-MAGI[见上文，Kimpton和Emerman]细胞的早期传代物(第二代)来制备HeLa-MAGI-88C细胞。按Kimpton和Emerman(见上文)介绍的方法，HIV感染指示细胞系在12孔板中用300ul病毒的10倍梯度血清稀释物在存在30ug/mlDEAE-Dextran的情况下进行。所有HIV株和SIVmac239go来自NIHAIDSReferenceandReagentProgram。原代HIV-27312A[Gao等，《2型人类免疫缺陷病毒的遗传多样性独特序列亚型在病毒生物学上的差异的证据》(GeneticDiversityofHumanImmunodeficiencyvirusType2EvidenceforDistinctSequenceSubtypeswithDifferencesinVirusBiology，)《病毒学杂志》(J.Virol.)，68(11)7433-7447(1992)]和SIVsmPbj1.9[Dewhurst等，《分子克隆的SIVsmm-PBj14的序列分析和急性病理学》(SequenceAnalysisandAcutePathogenicityofMoleularlyClonedSIVsmm-PBj14)，《自然》(Nature)，345636-640(1990)]的分子克隆来自B.Hahn(UAB)处。其它所有SIVmne分离株都从JuljeOverbaugh(U.Washington.Seattle)处获得。克隆原病毒产生的原种用瞬时转染293细胞来制备。其它病毒原种用病毒在人外周血单核细胞或CEMx174细胞(用于SIV原种)中包装来制备。病毒原种用ELISA、p24gag(CoulterImmunology)或p27gag(CoulterImmunology)按厂商提供的标准方法分别归类于HIV-1和HIV-2/SIV。U373-MAGI-88C细胞和U373-MAGI细胞(对照)用一株T-向性的HIV-1(HIVLAI)、一株M-向性的HIV-1(HIVYU-2)、一株SIV分离株(SIVMAC239)的有限稀释物进行感染。通过计算每孔中单位体积的病毒产生蓝色细胞的数目来测量感染能力(表2)。表2a由分子克隆转染293细胞得到的病毒b每毫升的感染单位(IU)是将病毒的稀释物换算成1毫升终体积后，在每孔中产生的蓝色细胞数乘以稀释倍数。感染两天后，将细胞固定，用X-gal染色检测其β-半乳糖苷酶活性。U373衍生的MAGI细胞在37℃染色120分钟，HeLa衍生的MAGI细胞在37℃染色50分钟，非感染细胞的背景染色不会超过每孔大约3个蓝色细胞。只计算深蓝色的细胞，有多个核的合胞体只计算成一个感染细胞。感染滴度为病毒上清稀释物换算成1ml在每孔中产生的蓝色细胞数乘以稀释倍数。HIVYU-2感染U373-MAGI-88C的滴度为2×106，而HIV-1LAI感染U373-MAGI-88C的滴度少于100。特定HIV株对88C的特异性可相差4个数量级。虽然SIVMAC239在U373-MAGI-88C中的感染滴度高达4×105，它仍明显能感染U373-MAGI细胞(表2)。下一步，分析一系列原代非克隆的HIV株和克隆的M向性HIV-1株感染表达88C的指示细胞系的能力。按上文介绍的方法，用各种HIV株的有限稀释物感染HeLa-MAGI细胞和HeLa-MAGI-88C细胞。两种克隆的M向性病毒HIVJR-CSF和HIVYU-2都能感染HeLa-MAGI-88C细胞而不能感染HeLa-MAGI细胞，这表明两种病毒都需要88C作为辅助受体(见表3，说明c)。但是这两种病毒感染HeLa-MAGI-88C细胞的能力相差很大，HIVYU～2和HIVJR-CSF的滴度分别为6.2×105和1.2×104IU/ml。病毒原种的感染力(表3)是每个物理颗粒的感染单位数量(这里用病毒核心蛋白的数量表示)。另外，在分别制备这两种病毒的原种时还发现，它们的克隆株在感染力方面也相差超过50倍。原代病毒分离株之间感染能力的差别进一步通过分析来自三个分化单位的12株未克隆病毒原种来进行检查(表3)。所用的分化单位A的三个原代分离株、分化单位E的三个原代分离株和三个额外的分化单位B分离株分别来自不同的地理来源。所有九株原代HIV株只能用HeLa-MAGI-88C细胞进行检测而不能使用HeLa-MAGI细胞(表3)。检测到的感染效率从每ngp24gag5个感染单位到超过100个感染单位(表3)。这一结果表明M-向性株的绝对感染能力相差非常大且与所属的分化单位无关。可用来解释这种差异的假说涉及每个病毒株的V3环在同CD4结合后与88C的亲和力。[Trkola等，《自然》(Nature)，384(6605)184-187(1996)；Wu等，《自然》(Nature)，384(6605)179-183(1996)]。表3</tables></tables>aHIV-1YU-2和HIV-1JR-CSF用其分子克隆转染获得。其它病毒用感染异源外周血单核细胞制备的非克隆病毒原种粗上清物进行检测。b分化单位按Myers等人在1995年对envgene所作的定义来源国家是指获取病毒分离物的HIV阳性个体的国籍。(WorldHealthOrganizationViralIsolateProgran)c每毫升的感染单位(IU)指病毒上清稀释物换算成1ml后在每孔中产生的蓝色细胞数目乘以稀释倍数。除HIV-1LAI外，所有病毒在不表达88C的HeLa-MAGI细胞中检测时，感染单位均少于10IU/ml。HIV-1LAI是一种T向性病毒株，它在表达和不表达88C的HeLa-MAGI细胞中检测时，滴度均为2.8×105。d感染力是每ngp24gag含有的感染单位(用第5列去除第4列)。对HeLa-MAGI-88C细胞检测HIV-2及其它SIV株的能力也进行了测定。有报导说HIV-2Rod可用融合素作为辅助受体，甚至在缺少CD4时也是如此[Enders等，《细胞》(Cell)87(4)745-756(1996)]。HIV-2Rod可以感染HeLa-MAGI细胞。但在HeLa-MAGI-88C细胞中，其感染能力至少增强10倍(表4)。HeLa细胞能内源表达融合素。这样，HIV-2Rod的分子克隆就具有双相性，不仅能用CXCR4作为其辅助受体，还可使用88C。与此相似，HIV-27312A的一个原代株可感染HeLa-MAGI-88C细胞而不能感染HeLa-MAGI细胞，说明与HIV-1的原代株一样，它也将88C用作受体。表4病毒株a参考文献HeLa-HeLa-MAGIHeLa-MAGIMAGI-88C上的滴度-88C上的感染力c上的滴度(IU/ml(IU/ml)bHIV-2ROD9(Guyader等，1987)967590013HIV-27312A(Gao等，1994)＜30650017SIVMAC239(Naidu等，1988)＜302090090SIVMNEc18(Overbaugh等，1991)＜301570019SIVMne170(Rudensey等，1995)＜301070027SIVSMPbj1.9(Dewhurst等，1990)＜30776NDdSIVAGM9063(Hirsch等，1995)＜3050＜1aHIV-2原种。SIVSMPbj1.9和SIVAGM9063用其分子克隆在293细胞中转染后直接进行检测。其它病毒用其分子克隆在CEMx174细胞中转染并进行扩增得到。b每毫升的感染单位(IU)指病毒上清稀释物换算成1ml后在每孔中产生的蓝色细胞数目乘以稀释倍数。这组试验中的所有病毒在HeLa-MAGI-88-2B细胞中均为阴性。c感染力是用ELISA测定的每ngp27gag含有的感染单位(在表达88C的细胞中)。dND未确定。所有检测了的SIV菌株都不能感染HeLa-MAGI细胞(表4)，也不能感染表达88-2B的HeLa-MAGI细胞。这说明SIV在U373细胞中所用的辅助受体在HeLa细胞中不表达，这种受体也不是88-2B。所有检测了的SIV菌株都能某种程度地感染HeLa-MAGI-88C细胞(表3)，这说明所有检测了的SIV菌株至少将88C用作它们的一个辅助受体。在过去，HIV的M向性和T向性菌株分类常常与另一种称呼相关，即分别称为“非合胞体诱导型(NSI)”和“合胞体诱导型(SI)”。这里介绍的基于细胞系的试验对合胞体形成很敏感。受感染的细胞可形成大小不一含有多个核的感染灶。[Kimpton或Emerman，见上文]。用多种不同的病毒株与U373-MAGI-88C或HeLa-MAGI-88C所做的实验显示，这种SI/NSI称法是没有意义的，因为所有病毒株在存在正确的辅助因子时，都能形成合胞体。这些实验显示，合胞体形成更像是标志感染细胞表面存在一个合适辅助受体而不是用来指示相性。用文献中报导的非合胞体形成SIV株，特别是SIVMAC239、SIVMNEc18和SIVMNE170感染Hela-MAGI-88细胞引人注目，是因为它们在单层细胞中诱导的合胞体比任何其它HIV株诱导的合胞体要大得多。实施例8制备能特异性识别88C的鼠单克隆抗体。这些抗体用对应于88C氨基端20个氨基酸的短肽免疫小鼠而产生，按产品说明将短肽与匙孔血红蛋白(KLH)结合(Pierce，ImjectmaleimideactivatedKLH)，用福氏完全佐剂乳化，注射给5只小鼠。以三周为间隔，将结合好的短肽加在福氏不完全佐剂中进行两次辅助注射。在最后一次注射10天后，取这5只小鼠的血清用ELISA法检测其与20氨基酸肽的免疫反应性。另外，用流式细胞仪(FACS)测血清与293细胞表面表达的完整88C受体的免疫反应性。抗88C活性最高的小鼠选用来进行脾细胞融合，并按标准方法生产单克隆抗体。建立了5个单克隆细胞系(227K、227M、227N、227P、227R)，ELISA证明它们产生的抗体能识别前面所说的短肽，FACS证明它们产生的抗体可识别293细胞的88C蛋白。每种抗体都只与表达88C的293细胞反应，而不能与表达关系密切的MCP受体(CCCKR-2)的293细胞反应。这些抗体也能识别COS细胞中瞬时表达的88C。还制备了抗88C的兔多克隆抗体。用前面介绍的方法给两只兔注射结合好的氨基端短肽。并用结合好的氨基端短肽对兔进行四次辅助注射以加强免疫。用表达88C的293细胞对每只兔的血清(2337J和2470J)进行FACS检测。这两种血清都能特异性识别293细胞表面的88C。检测了上述5种单克隆抗体阻断SIV感染细胞的能力，SIV是与HIV关系密切的猿猴免疫缺陷病毒[Lehner等，《自然医学》(NatureMedicine)，2767(1996)]。猿猴CD4+T细胞在通常情况下对SIV感染敏感。在存在1∶5稀释的抗88C单克隆抗体二清的情况下，将CD4+T细胞与SIVmac32HJ5克隆一起温育。通过在第9天用RT检测和定量法(Quan-T-RT分析试剂盒，Amersham，ArlingtonHeights，IL)检测反转录酶活性来确定SIV的感染。有四种抗体能阻断SIV的感染抗体227K的阻断率为53％；抗体227M的阻断率为59％；抗体227N的阻断率为47％、抗体227P的阻断率为82％。抗体227R不能阻断SIV的感染。这五种抗人88C氨基端短肽的单克隆抗体与恒河猴88C(见SEQIDNO；X)的反应能力也进行了检测(恒河猴88C与人88C在氨基端短肽区域内有两个氨基酸不同)。将人88C和恒河猴88C的编码区克隆到表达载体pcDNA3(Invitrogen)中。将这些表达质粒用DEAE法转染COS细胞。用空载体作为阴性对照。转染三天后，收集细胞，与五种抗88C单克隆抗体一起温育，并进行FACS分析。结果表明五种抗体中有四种(227K、227M、227N、227P)能识别恒河猴88C，有一种(227R)不能识别。这五种抗体都能识别转染的人88C，且都不与用空载体转染的细胞发生交叉反应。实施例9其它方法也可用来鉴定本发明的趋化因子受体配体和调节剂。在一个实施方案中，本发明包括配体的直接分析。将可检测的标记待测化合物与携带趋化因子受体功能结构的膜制备物进行作用。例如，用编码一种趋化因子受体的表达载体转染HEK-293细胞或组织培养细胞。然后用表达趋化因子受体的转染细胞制备试验用的膜制备物。将膜制备物与125I标记的待测化合物(即趋化因子)作用，在适当的条件下温育(如37℃、10分钟)。然后用真空抽滤的方法将结合有待测化合物的膜物质收集到滤膜上，洗去未结合的待测化合物。用液闪分光光度计测量滤膜上结合的待测化合物的放射性。待测化合物的特异性可用下面方法进行证明。在加有浓度不断增加的非标记待测化合物情况下重复上述试验，观测受体结合的竞争水平。这些结合试验还可用来鉴定趋化因子受体结合的调节剂。这时可对前述结合试验作如下修改除标记的待测化合物外，还加入一种可能的调节剂与膜制备物进行作用。膜上标记水平的升高说明这种调节剂是一种激活剂；如果膜上标记水平降低，则说明这种调节剂是趋化因子受体结合活性的抑制剂。在另一个实施方案中，本发明还包括鉴定受体的配体的间接试验，这种间接试验利用趋化因子受体与G蛋白的偶联性来鉴定受体的配体。正如Linder等的综述[Linder，《(美国科学》(Sci.Am.)，26756-65(1992)]所介绍的那样，在信号传导过程中，激活的受体与一种G蛋白相互作用并使G蛋白活化，G蛋白通过GDP与GTP交换而活化。随后G蛋白结合的GTP水解使G蛋白失活。因此检测G蛋白的活性试验可通过监测[γ-32P]-GTP释放32Pi来完成。例如，将带有本发明质粒的大约5×107个HEK-293细胞在MEM+10％FCS中培养。在培养基中补加5mCi/ml[32P]-磷酸钠培养2小时使细胞内核苷酸库获得标记。然后用低磷酸等渗缓冲液洗涤细胞。将一份洗涤后的细胞与一种待测化合物作用，另取一份洗涤后细胞不与待测化合物作用，但接受相同的处理。温育一段时间后(如10分钟)，将细胞离心收集并裂解。以1MLiCl作展层剂用薄层层析使核苷酸化合物分离。标记的GTP和GDP用众知的共展层标准方法来鉴定。然后用本领域标准的放射性自显影技术对标记的GTP和GDP进行计量。相对高水平的32P标记的GDP说明待测化合物是一种配体。这种GTP水解试验也可用于鉴定趋化因子受体结合的调节剂。在存在一种可能的调节剂的情况下进行前述试验。GTP水解相对增加而导致的32P标记GDP信号增强说明受体活性相对升高，因此这种信号增强表明该可能的调节剂是一种激活剂。而与之相反，32P标记GDP的信号相对减弱表明受体活性降低。因而说明该可能的调节剂是一种趋化因子受体结合活性的抑制剂。G蛋白效应分子(如腺苷酸环化酶、磷脂酶C、离子通道和磷酸二脂酶)的活性也可用于试验。用于检测这些效应分子活性的试验在前面已做过介绍。例如，腺苷酸环化酶催化环腺苷酸单磷酸(cAMP)的合成，它可被G蛋白活化。配体与一种趋化因子受体结合，会活化一种G蛋白，而后者又会活化腺苷酸环化酶。因此通过监测本发明的重组宿主细胞中cAMP的水平，就可以检测配体与趋化因子受体的结合。运用本领域众知的合适对照，可以将细胞内cAMP水平的升高归因于配体诱导的受体活性升高，从而来鉴定配体。同样，运用本领域众知的对照，可用cAMP浓度的相对减少来间接鉴定受体活性的抑制剂。cAMP的浓度可用商业化的酶联免疫试验进行测量。例如，BioTrak试剂盒提供竞争免疫试验的试剂。(Amersham，Inc.，ArlintonHeights，IL)。按厂商推荐的方法使用这一试剂盒，可设计一个非标记cAMP与辣根过氧化物酶结合的cAMP的竞争试验。例如非标记的cAMP可由表达有本发明的趋化因子受体的活化细胞中获得。这两种化合物竞争性地与一种固定的抗cAMP抗体结合。在竞争反应完成后，以四甲基联苯胺/H2O2为底物，用酶法通过检测在450nm处有色反应产物的出现，来测量固定的辣根过氧化物酶-cAMP结合物。运用本领域的标准技术，可用这一结果来计算非标记cAMP的水平。除可用于鉴定能与趋化因子受体结合的配体外，cAMP试验还可用于鉴定趋化因子受体结合的调节剂。使用本发明的重组宿主细胞，除多加一种可能的趋化因子受体活性的调节剂外，按前面所述的方法进行试验。在使用本领域众知对照的情况下，细胞内cAMP水平的相对升高或降低反映了腺苷酸环化酶活性的激活或抑制，而腺苷酸环化酶的活性水平又反映了所研究趋化因子受体的相对活性。趋化因子受体活性水平的相对升高，说明待测调节物是一个激活剂，而趋化因子受体活性水平的相对降低，说明待测调节物是一个趋化因子受体活性的抑制剂。尽管本发明以具体实施方案的形式进行了叙述，但应当理解本领域的技术人员可对之进行变化和修改。因此，本发明仅受所附权利要求的限定。序列表(1)一般信息(i)申请人ICOSCorporation.2202120thAvenueS.E.Bothell，WA98201(ii)发明名称趋化因子受体的材料与方法(iii)序列数20(iv)通讯地址(A)联系人Marshall，O’Tool，Gerstein，Murry&amp;Borun(B)街道6300SearsTower，233S.WackerDrive(C)城市Chicago(D)州Illinois(E)国家USA(F)邮政编码60606(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBMPC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease#1.0，1.30版(vi)现申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)律师/事务所信息(A)姓名Noland，GretaE.(B)登记号35,302(C)参考/备案号27866/33670(ix)电讯信息(A)电话312-474-6300(B)传真312-474-0448(2)序列1(SEQIDNO1)信息(i)序列特征(A)长度3383碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置55…1110(ix)特征(A)名称/关键misc-特征(B)其它信息/＝“88C多核苷酸和氨基酸序列”(xi)序列表述序列1(SEQIDNO1)AGAAGAGCTGAGACATCCGTTCCCCTACAAGAAACTCTCCCCGGGTGAACAAGATG57Met1GATTATCAAGTGTCAAGTCCAATCTATGACATCAATTATTATACATCG105AspTyrGlnValSerSerProIleTyrAspIleAsnTyrTyrThrSer51015GAGCCCTGCCAAAAAATCAATGTGAAGCAAATCGCAGCCCGCCTCCTG153GluProCysGlnLysIleAsnValLysGlnIleAlaAlaArgLeuLeu202530CCTCCGCTCTACTCACTGGTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGGCAACATG201ProProLeuTyrSerLeuValPheIlePheGlyPheValGlyAsnMet354045CTGGTCATCCTCATCCTGATAAACTGCAAAAGGCTGAAGAGCATGACT249LeuValIleLeuIleLeuIleAsnCysLysArgLeuLysSerMetThr50556065GACATCTACCTGCTCAACCTGGCCATCTCTGACCTGTTTTTCCTTCTT297AspIleTyrLeuLeuAsnLeuAlaIleSerAspLeuPhePheLeuLeu707580ACTGTCCCCTTCTGGGCTCACTATGCTGCCGCCCAGTGGGACTTTGGA345ThrValProPheTrpAlaHisTyrAlaAlaAlaGlnTrpAspPheGly859095AATACAATGTGTCAACTCTTGACAGGGCTCTATTTTATAGGCTTCTTC393AsnThrMetCysGlnLeuLeuThrGlyLeuTyrPheIleGlyPhePhe100105110TCTGGAATCTTCTTCATCATCCTCCTGACAATCGATAGGTACCTGGCT441SerGlyIlePhePheIleIleLeuLeuThrIleAspArgTyrLeuAla115120125GTCGTCCATGCTGTGTTTGCTTTAAAAGCCAGGACGGTCACCTTTGGG489ValValHisAlaValPheAlaLeuLysAlaArgThrValThrPheGly130135140145GTGGTGACAAGTGTGATCACTTGGGTGGTGGCTGTGTTTGCGTCTCTC537ValValThrSerValIleThrTrpValValAlaValPheAlaSerLeu150155160CCAGGAATCATCTTTACCAGATCTCAAAAAGAAGGTCTTCATTACACC585ProGlyIleIlePheThrArgSerGlnLysGluGlyLeuHisTyrThr165170175TGCAGCTCTCATTTTCCATACAGTCAGTATCAATTCTGGAAGAATTTC633CysSerSerHisPheProTyrSerGlnTyrGlnPheTrpLysAsnPhe180185190CAGACATTAAAGATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTC681GlnThrLeuLysIleValIleLeuGlyLeuValLeuProLeuLeuVal195200205ATGGTCATCTGCTACTCGGGAATCCTAAAAACTCTGCTTCGGTGTCGA729MetValIleCysTyrSerGlyIleLeuLysThrLeuLeuArgCysArg210215220225AATGAGAAGAAGAGGCACAGGGCTGTGAGGCTTATCTTCACCATCATG777AsnGluLysLysArgHisArgAlaValArgLeuIlePheThrIleMet230235240ATTGTTTATTTTCTCTTCTGGGCTCCCTACAACATTGTCCTTCTCCTG825IleValTyrPheLeuPheTrpAlaProTyrAsnIleValLeuLeuLeu245250255AACACCTTCCAGGAATTCTTTGGCCTGAATAATTGCAGTAGCTCTAAC873AsnThrPheGlnGluPhePheGlyLeuAsnAsnCysSerSerSerAsn260265270AGGTTGGACCAAGCTATGCAGGTGACAGAGACTCTTGGGATGACGCAC921ArgLeuAspGlnAlaMetGlnValThrGluThrLeuGlyMetThrHis275280285TGCTGCATCAACCCCATCATCTATGCCTTTGTCGGGGAGAAGTTCAGA969CysCysIleAsnProIleIleTyrAlaPheValGlyGluLysPheArg290295300305AACTACCTCTTAGTCTTCTTCCAAAAGCACATTGCCAAACGCTTCTGC1017AsnTyrLeuLeuValPhePheGlnLysHisIleAlaLysArgPheCys310315320AAATGCTGTTCTATTTTCCAGCAAGAGGCTCCCGAGCGAGCAAGCTCA1065LysCysCysSerIlePheGlnGlnGluAlaProGluArgAlaSerSer325330335GTTTACACCCGATCCACTGGGGAGCAGGAAATATCTGTGGGCTTG1110ValTyrThrArgSerThrGlyGluGlnGluIleSerValGlyLeu340345350TGACACGGACTCAAGTGGGCTGGTGACCCAGTCAGAGTTGTGCACATGGCTTAGTTTTCA1170TACACAGCCTGGGCTGGGG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O14)信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(ix)特征(A)名称/关键misc-特征(B)其它信息/＝“88C-r3”(xi)序列表述序列14(SEQIDNO14)TAAGCCTCACAGCCCTG(2)序列15(SEQIDNO15)信息(i)序列特征(A)长度28碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(ix)特征(A)名称/关键misc-特征(B)其它信息/＝“CCCKR1(2)-5引物”(xi)序列表述序列15(SEQIDNO15)CGTAAGCTTAGAGAAGCCGGGATGGGAA(2)序列16(SEQIDNO16)信息(i)序列特征(A)长度25碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(iv)反义链是(ix)特征(A)名称/关键misc-特征(B)其它信息/＝“CCCKR1-3引物”(xi)序列表述序列16(SEQIDNO16)GCCTCTAGAGTCAGAGACCAGCAGA(2)序列17(SEQIDNO17)信息(i)序列特征(A)长度28碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列表述序列17(SEQIDNO17)GACAAGCTTCACAGGGTGGAACAAGATG(2)序列18(SEQIDNO18)信息(i)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列表述序列18(SEQIDNO18)GTCTCTAGACCACTTGAGTCCGTGTCA(2)序列19(SEQIDNO19)信息(i)序列特征(A)长度1059碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线型(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键CDS(B)位置1…1056(xi)序列表述序列19(SEQIDNO19)ATGGACTATCAAGTGTCAAGTCCAACCTATGACATCGATTATTATACA48MetAspTyrGlnValSerSerProThrTyrAspIleAspTyrTyrThr151015TCGGAACCCTGCCAAAAAATCAATGTGAAACAAATCGCAGCCCGCCTC96SerGluProCysGlnLysIleAsnValLysGlnIleAlaAlaArgLeu202530CTGCCTCCGCTCTACTCACTGGTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGGCAAC144LeuProProLeuTyrSerLeuValPheIlePheGlyPheValGlyAsn354045ATACTGGTCGTCCTCATCCTGATAAACTGCAAAAGGCTGAAAAGCATG192IleLeuValValLeuIleLeuIleAsnCysLysArgLeuLysSerMet505560ACTGACATCTACCTGCTCAACCTGGCCATCTCTGACCTGCTTTTCCTT240ThrAspIleTyrLeuLeuAsnLeuAlaIleSerAspLeuLeuPheLeu65707580CTTACTGTCCCCTTCTGGGCTCACTATGCTGCTGCCCAGTGGGACTTT288LeuThrvalProPheTrpAlaHisTyrAlaAlaAlaGlnTrpAspPhe859095GGAAATACAATGTGTCAACTCTTGACAGGGCTCTATTTTATAGGCTTC336GlyAsnThrMetCysGlnLeuLeuThrGlyLeuTyrPheIleGlyPhe100105110TTCTCTGGAATCTTCTTCATCATCCTCCTGACAATCGATAGGTACCTG384PheSerGlyIlePhePheIleIleLeuLeuThrIleAspArgTyrLeu115120125GCTATCGTCCATGCTGTGTTTGCTTTAAAAGCCAGGACAGTCACCTTT432AlaIleValHisAlaValPheAlaLeuLysAlaArgThrValThrPhe130135140GGGGTGGTGACAAGTGTGATCACTTGGGTGGTGGCTGTGTTTGCCTCT480GlyValValThrSerValIleThrTrpValValAlaValPheAlaSer145150155160CTCCCAGGAATCATCTTTACCAGATCTCAGAGAGAAGGTCTTCATTAC528LeuProGlyIleIlePheThrArgSerGlnArgGluGlyLeuHisTyr165170175ACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACAGTCAGTATCAATTCTGGAAGAAT576ThrCysSerSerHisPheProTyrSerGlnTyrGlnPheTrpLysAsn180185190TTTCAGACATTAAAGATGGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTT624PheGlnThrLeuLysMetValIleLeuGlyLeuValLeuProLeuLeu195200205GTCATGGTCATCTGCTACTCGGGAATCCTGAAAACTCTGCTTCGGTGT672ValMetValIleCysTyrSerGlyIleLeuLysThrLeuLeuArgCys210215220CGAAACGAGAAGAAGAGGCACAGGGCTGTGAGGCTTATCTTCACCATC720ArgAsnGluLysLysArgHisArgAlaValArgLeuIlePheThrIle225230235240ATGATTGTTTATTTTCTCTTGTGGGCTCCCTACAACATTGTCCTTCTC768MetIleValTyrPheLeuLeuTrpAlaProTyrAsnIleValLeuLeu245250255CTGAACACCTTCCAGGAATTCTTTGGCCTGAATAATTGCAGTAGCTCT816LeuAsnThrPheGlnGluPhePheGlyLeuAsnAsnCysSerSerSer260265270AACAGGTTGGACCAAGCCATGCAGGTGACAGAGACTCTTGGGATGACA864AsnArgLeuAspGlnAlaMetGlnValThrGluThrLeuGlyMetThr275280285CACTGCTGCATCAACCCCATCATCTATGCCTTTGTCGGGGAGAAGTTC912HisCysCysIleAsnProIleIleTyrAlaPheValGlyGluLysPhe290295300AGAAACTACCTCTTAGTCTTCTTCCAAAAGCACATTGCCAAACGCTTC960ArgAsnTyrLeuLeuValPhePheGlnLysHisIleAlaLysArgPhe305310315320TGCAAATGCTGTTCCATTTTCCAGCAAGAGGCTCCCGAGCGAGCAAGT1008CysLysCysCysSerIlePheGlnGlnGluAlaProGluArgAlaSer325330335TCAGTTTACACCCGATCCACTGGGGAGCAGGAAATATCTGTGGGCTTG1056SerValTyrThrArgSerThrGlyGluGlnGluIleSerValGlyLeu340345350TGA1059(2)序列20(SEQIDNO20)的信息(I)序列特征(A)长度352氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓朴构型线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列表述序列20(SEQIDNO20)MetAspTyrGlnValSerSerProThrTyrAspIleAspTyrTyrThr151015SerGluProCysGlnLysIleAsnValLysGlnIleAlaAlaArgLeu202530LeuProProLeuTyrSerLeuValPheIlePheGlyPheValGlyAsn354045IleLeuValValLeuIleLeuIleAsnCysLysArgLeuLysSerMet505560ThrAspIleTyrLeuLeuAsnLeuAlaIleSerAspLeuLeuPheLeu65707580LeuThrValProPheTrpAlaHisTyrAlaAlaAlaGlnTrpAspPhe859095GlyAsnThrMetCysGlnLeuLeuThrGlyLeuTyrPheIleGlyPhe100105110PheSerGlyIlePhePheIleIleLeuLeuThrIleAspArgTyrLeu115120125AlaIleValHisAlaValPheAlaLeuLysAlaArgThrValThrPhe130135140GlyValValThrSerValIleThrTrpValValAlaValPheAlaSer145150155160LeuProGlyIleIlePheThrArgSerGlnArgGluGlyLeuHisTyr165170175ThrCysSerSerHisPheProTyrSerGlnTyrGlnPheTrpLysAsn180185190PheGlnThrLeuLysMetValIleLeuGlyLeuValLeuProLeuLeu195200205ValMetValIleCysTyrSerGlyIleLeuLysThrLeuLeuArgCys210215220ArgAsnGluLysLysArgHisArgAlaValArgLeuIlePheThrIle225230235240MetIleValTyrPheLeuLeuTrpAlaProTyrAsnIleValLeuLeu245250255LeuAsnThrPheGlnGluPhePheGlyLeuAsnAsnCysSerSerSer260265270AsnArgLeuAspGlnAlaMetGlnValThrGluThrLeuGlyMetThr275280285HisCysCysIleAsnProIleIleTyrAlaPheValGlyGluLysPhe290295300ArgAsnTyrLeuLeuValPhePheGlnLysHisIleAlaLysArgPhe305310315320CysLysCysCysSerIlePheGlnGlnGluAlaProGluArgAlaSer325330335SerValTyrThrArgSerThrGlyGluGlnGluIleSerValGlyLeu340345350权利要求1.一种编码列于SEQIDNO4的趋化因子受体88-2B的氨基酸序列的纯化和分离的多核苷酸。2.权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是DNA。3.权利要求2的多核苷酸，其中多核苷酸是基因组DNA。4.权利要求2的多核苷酸，其中多核苷酸是cDNA。5.权利要求1的多核苷酸，该多核苷酸为完全或部分化学合成的DNA。6.权利要求2的多核苷酸的RNA转录物。7.权利要求4的cDNA，该cDNA包含SEQIDNO3的DNA。8.一种含有权利要求2的DNA并具有生物功能的DNA载体。9.权利要求8的载体，其中所说的DNA经基因操作与一段DNA表达调控序列相连。10.一种稳定转化或转染了权利要求1的DNA并能表达所说的DNA的宿主细胞。11.一种产生88-2B多核苷酸的方法，该方法的步骤包括使权利要求10的宿主细胞在合适的营养培养基中生长并从所说的细胞或培养基中分离所说的多核苷酸。12.一种编码88-2B多肽的多核苷酸，其中所说的多核苷酸能在严格的杂交环境下与SEQIDNO3的多核苷酸杂交。13.一种包含SEQIDNO4中列出的趋化因子受体88-2B的氨基酸序列的纯化和分离的多肽。14.一种特异性结合含有SEQIDNO4列出的88-2B氨基酸序列的多肽的抗体产物。15.一种产生权利要求14中抗体产物的杂交瘤。16.一种编码列于SEQIDNO2的趋化因子受体88C的氨基酸序列的纯化和分离的多核苷酸。17.权利要求16的多核苷酸，其中多核苷酸是DNA。18.权利要求17的多核苷酸，其中多核苷酸是基因组DNA。19.权利要求17的多核苷酸，其中多核苷酸是cDNA。20.权利要求16的多核苷酸，该多核苷酸为完全或部分化学合成的DNA。21.权利要求17的多核苷酸的RNA转录物。22.权利要求19的cDNA，该cDNA包含SEQIDNO1的DNA。23.一种含有权利要求17的DNA并具有生物功能的DNA载体。24.权利要求23的载体，其中所说的DNA经基因操作与一段DNA表达调控序列相连。25.一种稳定转化或转染了权利要求16的DNA并能表达所说的DNA的宿主细胞。26.一种产生88C多核苷酸的方法，该方法的步骤包括使权利要求25的宿主细胞在合适的营养培养基中生长并从所说的细胞或培养基中分离所说的多核苷酸。27.一种编码88C多肽的多核苷酸，所说的多核苷酸能在严格的杂交环境下与SEQIDNO1的多核苷酸杂交。28.一种包含SEQIDNO2中列出的趋化因子受体88C的氨基酸序列的纯化和分离的多肽。29.一种特异性结合含有SEQIDNO2列出的88C氨基酸序列的多肽的抗体产物。30.一种产生权利要求29中抗体产物的杂交瘤。31.杂交瘤细胞系227K。32.杂交瘤细胞系227M。33.杂交瘤细胞系227N。34.杂交瘤细胞系227P。35.杂交瘤细胞系227R。36.一种编码列于SE0IDNO20的恒河猴趋化因子受体88C的氨基酸序列的纯化和分离的多核苷酸。37.权利要求36的多核苷酸，其中多核苷酸是DNA。38.权利要求37的多核苷酸，其中多核苷酸是基因组DNA。39.权利要求37的多核苷酸，其中多核苷酸是cDNA。40.权利要求36的多核苷酸，该多核苷酸为完全或部分化学合成的DNA。41.权利要求37的多核苷酸的RNA转录物。42.权利要求39的cDNA，该cDNA包含SEQIDNO1的DNA。43.一种含有权利要求37的DNA并具有生物功能的DNA载体。44.权利要求43的载体，其中所说的DNA经基因操作与一段DNA表达调控序列相连。45.一种稳定转化或转染了权利要求36的DNA并能表达所说的DNA的宿主细胞。46.一种产生恒河猴88C多核苷酸的方法，该方法的步骤包括使权利要求45的宿主细胞在合适的营养培养基中生长并从所说的细胞或培养基中分离所说的多核苷酸。47.一种编码88C多肽的多核苷酸，其中所说的多核苷酸能在严格的杂交环境下与SEQIDNO19的多核苷酸杂交。48.一种包含SEQIDNO20中列出的恒河猴趋化因子受体88C的氨基酸序列的纯化和分离的多肽。49.一种特异性结合含有SEQIDNO20列出的88C氨基酸序列的多肽的抗体产物。50.一种产生权利要求49中抗体产物的杂交瘤。全文摘要本发明提供编码趋化因子受体88－2B或88C的多核苷酸,并提供重组生产这两种细胞因子受体的材料和方法。本发明还提供用这两种多核苷酸方便地鉴别趋化因子受体配体和调节因子的试验方法。受体片断、配体、调节因子和抗体可用于检测和治疗与趋化因子受体相关的疾病,如动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、肿瘤生长抑制、哮喘、病毒感染、艾滋病及其它炎症情况。文档编号A61P29/00GK1183805SQ96193333公开日1998年6月3日申请日期1996年12月20日优先权日1995年12月20日发明者P·W·格雷,V·L·施维卡尔特,C·J·拉波尔特申请人:艾科斯有限公司