药物复合物的制造方法

专利名称：药物复合物的制造方法
技术领域：
本发明是关于多糖衍生物和抗肿瘤药等的医药化合物结合形成的药物复合物的制造方法。
背景技术：
在肺癌和消化道癌等的固型癌以及白血病等的血液癌的治疗时使用的抗肿瘤药，通过静脉注射或口服等的给药途径全身性地给药之后，分布到特定的肿瘤部位，通过阻碍或者抑制癌细胞的增殖而发挥治疗效果。但是，经全身给药的抗肿瘤药，因为可以从血中迅速地被肝脏·内皮网状系统摄取，或者迅速地被从尿中排泄，有血中浓度低，向肿瘤部位的分布不充分的情况。并且，对于通常的抗肿瘤药自身来说，存在有以下问题因其向肿瘤部位分布的选择性(肿瘤选择性)低，故抗肿瘤药广泛分布于全身的各种细胞和组织等，对于正常的细胞和组织等也产生细胞毒作用，致使呕吐、发热、或者脱发等的副作用发生率极高。因此，抗肿瘤药在追求其效果的同时亦要追求能够选择性地分布到肿瘤部位的手段的开发。
作为象这样的手段之一，提出了使用具有羧基的多糖衍生物作为药物载体，在该多糖衍生物上结合抗肿瘤药，延迟抗肿瘤药从血中消除的同时，提高向癌组织分布的靶向性的方法。例如，在国际专利W094/19376号中，公开了一种药物复合物，它是在具有羧基的多糖的羧基上结合上肽链(氨基酸数目1～8)，然后进一步通过这个肽链再结合阿霉素、道诺红霉素、丝裂霉素C、或者博来霉素等形成药物复合物。另外，在日本特开平7-84481号中公开了在被羧甲基化的甘露醇葡聚糖衍生物上，通过席夫碱或酰胺键导入了上述抗肿瘤药的药物复合物。这些药物复合物与不结合药物传递载体的抗肿瘤药自身相比，具有优异的抗肿瘤效果，同时毒性和副作用减轻。
另外，对于与使用多元醇化多糖衍生物作为药物传递载体的药物复合物有关的技术来说，有“关于多糖-肽-阿霉素复合物的研究·多糖衍生物的血中稳定性和抗肿瘤效果的关系”(第10次日本DDS学会讲演要旨集，279,1994)；“关于多糖-肽-阿霉素复合物的研究·体内动力学和抗肿瘤效果”(第9次日本药物动态学会年会讲演要旨集，292,1994)；第19次研究开发动向研讨会(医药品机构举办)要旨集，D-9,1995；以及“关于通过多糖载体向肿瘤传递药物的研究”(第12次胶体·界面技术讨论会，日本化学会，讲演要旨集，51,1995)等。
以前，这些的药物复合物，可以将羧甲基プルラン、羧甲基葡聚糖等的含有羧基的多糖衍生物制成钠盐后，让该多糖衍生物的羧基和抗肿瘤药的氨基(或者与抗肿瘤药结合着的肽链的N末端氨基)通过酰胺键结合来制造。因为多糖衍生物的钠盐在有机溶剂中几乎不溶解，要进行此反应，可采用将多糖衍生物的钠盐配制成水或含水的水性有机溶剂的溶液之后，在此溶液中使缩合剂和盐酸盐等形式的抗肿瘤药(或者具有肽链的抗肿瘤药)溶解的方法。
但是，因为在此反应中，脱水缩合反应在含有水的溶剂中进行，产物要得到高收率是不可能的。作为反应原料使用的抗肿瘤药等一般是高价格的物品，从制造成本的观点应寻求能高效率地制造上述药物复合物的方法。另外，在日本特开平6-87746号记载的，作为抗肿瘤药有效的化合物，因为在分子中有内酯环存在，对此将以肽式键合着的化合物进行上述的反应时，在碱及水的存在下内酯环开环，生成的羧基同与抗肿瘤药结合着的肽链的N末端氨基反应，使产物的收率显著地降低，并且得不到均一的药物复合物。为此，应寻求能够避免内酯环开环的化合物生成的反应方法。
发明概述本发明的课题是提供高效率的，将抗肿瘤药及抗炎药等的有效成分，制造成对于肿瘤部位等能够具有靶向性的药物复合物的方法。更具体地说，是让具有羧基的多糖衍生物和抗肿瘤药等的医药化合物或结合了医药化合物的低聚肽等的间隔基进行高效率的反应，提供能够大量并且廉价的制造药物复合物的方法。
本发明者们为了解决上述的课题，进行了深入细致的研究，结果发现具有羧基的多糖衍生物同医药化合物或者结合了医药化合物的间隔基进行反应，使用有机胺的盐代替以前使用的多糖衍生物的钠盐时，多糖衍生物的盐可基本上在非水溶剂中高浓度地溶解，使多糖衍生物同医药化合物或者结合了医药化合物的间隔基的反应能够以很高的收率进行，并且能够使副产物等降低。本发明是基于以上的发现而完成的。
即本发明是提供具有以下特征的方法具有羧基的多糖衍生物和医药化合物的残基，通过含有一个氨基酸的间隔基或者肽式键合的含有2～8个氨基酸的间隔基结合起来的药物复合物；或者具有羧基的多糖衍生物同医药化合物的残基不通过导入该间隔基而直接结合起来的药物复合物的制造方法，具有羧基的多糖衍生物的有机胺的盐同医药化合物或结合了间隔基的医药化合物在非水系统中进行反应。并且在该药物复合物的制造方法中包括以下的工序(1)将具有羧基的多糖衍生物的碱金属盐转换成有机胺的盐的工序；以及(2)该有机胺的盐同医药化合物或结合了间隔基的医药化合物在非水系统中进行反应的工序。
通过本发明的优选方式，能够提供具有羧基的多糖衍生物是羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的上述方法；构成羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的葡聚糖多元醇，在实质上可能完全多元醇化的条件下，处理葡聚糖得到的葡聚糖多元醇为特征的上述方法；羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇是羧甲基葡聚糖多元醇的上述方法；羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇分子量是在5,000～500,000的范围，优选在50,000～450,000的范围，更优选200,000～400,000的范围的羧甲基葡聚糖多元醇，羧甲基化度相当于每个糖残基为0.01～2.0的范围，优选0.1～1.0的范围，更优选0.3～0.5的范围的上述方法；并且医药化合物为抗肿瘤药或者抗炎药的上述方法。
进一步来说，通过本发明的优选方式能够提供医药化合物是能够形成内酯环的化合物的上述方法；在有机胺的盐同医药化合物或结合了医药化合物的间隔基的反应中，使用形成了内酯环的医药化合物或结合了形成内酯环的医药化合物的间隔基的上述方法；以及能够形成内酯环的上述医药化合物是(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3＇,4＇:6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮的上述方法。
附图的简单的说明

图1是表示用本发明的方法制造出的例8的药物复合物的GPC图。
图2是表示用本发明的方法制造出的例8的药物复合物的紫外吸收光谱图。
图3是表示用本发明的方法制造出的例9的药物复合物的GPC图。
图4是表示用本发明的方法制造出的例9的药物复合物的紫外吸收光谱图。
图5是表示用本发明的方法制造出的例10的药物复合物的紫外吸收光谱图。
图6是表示用本发明的方法制造出的例15的药物复合物的GPC图。
图7是表示用本发明的方法制造出的例15的药物复合物的紫外吸收光谱图。
图8是表示用本发明的方法制造出的例28的药物复合物的GPC图。
图9是表示用本发明的方法制造出的例28的药物复合物的紫外吸收光谱图。
图10是表示用本发明的方法制造出的例29的药物复合物的GPC图。
图11是表示用本发明的方法制造出的例29的药物复合物的紫外吸收光谱图。
图12是表示用本发明的方法制造出的例34的药物复合物的GPC图。
图13是表示用本发明的方法制造出的例34的药物复合物的紫外吸收光谱图。
图14是表示用本发明的方法制造出的例39的药物复合物的GPC图。
图15是表示用本发明的方法制造出的例39的药物复合物的紫外吸收光谱图。
图16是表示用本发明的方法制造出的例41的药物复合物的GPC图。
图17是表示用本发明的方法制造出的例41的药物复合物的紫外吸收光谱图。
图18是表示用本发明的方法制造出的例44的药物复合物的GPC图。
图19是表示用本发明的方法制造出的例44的药物复合物的紫外吸收光谱图。
图20是表示用本发明的方法制造出的例15的药物复合物体内动力学的图。图中的各点表示3例的平均值。
发明的优选实施方案由本发明的制造方法制造出的药物复合物，其特征如下具有羧基的多糖衍生物和医药化合物的残基，通过含有一个氨基酸的间隔基或者肽式键合的含有2～8个氨基酸的间隔基为媒介结合起来、或者具有羧基的多糖衍生物同医药化合物的残基不通过导入该间隔基直接结合起来。
包含在药物复合物中的医药化合物的残基，来源于例如抗肿瘤药、抗炎药、抗菌素等的、被应用在包括人在内的哺乳类动物疾病的治疗以及/或者预防的医药化合物，由它们的部分结构构成。但作为该残基来源的医药化合物并不限定在上述的范围。并且，作为医药化合物来说，可以使用能够与多糖衍生物或者间隔基结合有关的、具有1或2个以上的反应性官能团(例如氨基、羧基、羟基、巯基、酯基等)的任何的物质。对于在说明书中所谓的医药化合物的范围，包括它本身是有医药作用的化合物的主要结构形成的由其部分构造组成的化合物，也包括在生物体内能够再生该化合物的前体化合物。
更具体的说，在本说明书内的所谓医药化合物的残基，假定多糖衍生物或者间隔基同医药化合物残基的结合是通过医药化合物中的反应性官能团同多糖衍生物或者间隔基中的反应性官能团之间的反应(例如脱水缩合等)形成的时候，是指在结合后的化合物中存在的源自原先医药化合物的部分结构。例如，医药化合物用D-NH2,D-COOH,D-COOR,D-OH,D-SH,D-CONH2,D-NH-COOR(R是低级烷基等)表示的时候，医药化合物的残基分别可以用D-NH-(D-NH-CO-Q等)，D-CO-(D-CO-NH-Q,D-CO-O-Q,D-CO-S-Q等)，D-CO-(D-CO-NH-Q,D-CO-O-Q,D-CO-S-Q等)，D-O-(D-O-CO-Q,D-O-Q等)，D-S-(D-S-CO-Q,D-S-Q等)，D-CONH-(D-CO-NH-CO-Q等)，D-NH-CO-(D-NH-CO-O-Q,D-NH-CO-NH-Q等)表示(括弧内表示间隔基或多糖衍生物同医药化合物残基的结合，Q表示从间隔基或多糖衍生物中分别除去反应性官能团以及羧基后剩余的部分结构)。间隔基或多糖衍生物同医药化合物残基的结合的种类并不仅限于上述的物质。医药化合物的残基可以与多糖衍生物的羧基、间隔基的N末端氨基或者C末端羧基、或者存在于组成间隔基的氨基酸中的反应性官能团结合。
作为医药化合物的残基来说，可适宜使用例如阿霉素、道诺红霉素、丝裂霉素C、博来霉素、环胞苷、长春新碱、长春碱、甲氨蝶呤、铂类抗肿瘤药(顺铂或其衍生物)、紫杉醇或其衍生物、喜树碱或其衍生物(日本特开平6-87746号公开的抗肿瘤药，优选权利要求2记载的(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3＇,4′:6,7]吲哚嗪基[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮等)等的抗肿瘤药的残基。另外也可适宜例如琥珀酸氢化可的松、琥珀酸泼尼松等的甾体类抗炎药；或者甲灭酸、氟灭酸、双氯芬酸、布洛芬、氨苄噻吡酯等的非甾体抗炎药的残基。
医药化合物的残基可以同多糖衍生物直接结合，也可以通过间隔基结合。作为象这样的间隔基来说，可以使用含有1个氨基酸的间隔基或者肽式键合的含有2～8个氨基酸的间隔基。更具体地说，对于医药化合物的残基同多糖衍生物通过间隔基结合起来的情况，该间隔基有着1个氨基酸的残基(其意义是从氨基酸的氨基以及羧基分别除去1个氢原子以及1个羟基的残基)、或者肽式键合的含有2～8个氨基酸的低聚肽的残基(其意义是从N末端的氨基以及C末端的羧基分别除去1个的氢原子以及1个羟基的残基)的形式。
优选的间隔基是含有2～6个氨基酸的低聚肽的残基。构成间隔基的氨基酸的种类没有特别的限定，可使用例如L-或D-氨基酸、优选L-氨基酸，除α-氨基酸之外，也可以使用β-丙氨酸、ε-氨基己酸、y-氨基酪酸等。象这个样的α-氨基酸以外的氨基酸，在间隔基中优选配置与多糖衍生物接近的位置。
例如使用低聚肽间隔基的时候的结合方向，没有特别的限制，但一般地可以将间隔基的N末端通过酰胺键结合在羧基C1-4的烷基葡聚糖多元醇的羧基上，而将间隔基的C末端结合在医药化合物的氨基上。另外，例如肽间隔基的构成单元中包括着赖氨酸残基，将赖氨酸残基的α-氨基以及ε-氨基各自同其他氨基酸的羧基经酰胺键结合时，因为肽间隔基的两端均变为N末端，结合医药化合物的羧基即成为可能的事情。进一步说，在间隔基中其构成单元包括着1个或1个以上的二氨基化合物或二羧酸化合物的残基(例如乙二氨基等的二氨基的残基和琥珀酸等的二羧酸的残基等)，也可使用两末端为N末端的间隔基以及两末端为C末端的间隔基。
使用由低聚肽组成的间隔基时的氨基酸序列没有特定地限定，但可优选使用例如，间隔基是用-X-Z-表示的二肽的残基(X表示疏水性氨基酸的残基，Z表示亲水性氨基酸的残基，-X-Z-的意义是疏水性氨基酸(X)和亲水性氨基酸(Z)分别以N末端侧以及C末端侧，通过肽式键合起来的二肽的N末端的氨基以及C末端的羧基各自除去1个氢原子以及1个羟基的残基)、或者将该二肽的残基作为部分肽序列适当地用于间隔基。作为疏水性氨基酸来说，可使用例如苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸等；作为亲水性氨基酸来说，可使用例如甘氨酸、丙氨酸等。间隔基也可以有象这个样的二肽残基的重复序列(例如-X-Z-X-Z-,-X-Z-X-Z-X-Z-等)。
使用包括象这个样的二肽结构的间隔基时，间隔基在被认为肽酶丰富的肿瘤部位及炎症部分加水分解，因为在该部位能使医药化合物高浓度地游离，所以包含上述二肽的间隔基和医药化合物结合而形成的结构，是通过本发明的方法制造出来的药物复合物的优选的部分结构。作为医药化合物的残基，对于使用与浓度有依赖关系的具有抗肿瘤作用的抗肿瘤药(随浓度增加抗肿瘤作用增强的抗肿瘤药浓度依赖型的抗肿瘤药，例如阿霉素等)的残基时，特别优选使用用-X-Z-表示的上述由二肽残基组成的间隔基或者包括该二肽的残基在作为部分肽排列的间隔基。
另外，作为医药化合物的残基，对于使用在一定的浓度的，以作用时间的持续作为必须的时间依赖型的抗肿瘤药时，通过使用上述的间隔基有时也能够达到高的抗肿瘤效果，例如在日本特开平6-87746号记载的抗肿瘤药，能够举出优选权利要求2记载的抗肿瘤药。在一般情况，并不限定在上述的间隔基，有必要从抗肿瘤药的作用机制、体内动力学及显示毒性的特点、抗肿瘤药在体内的游离性等方面选择优选的间隔基。另外在一般情况下，对于增殖迅速的癌症来说，优选能够在短时间内游离出高浓度的医药化合物的上述的间隔基。
在以下表示间隔基的具体例子，但被用于本发明的医药复合物的制造方法的间隔基并不仅限定在以下的化合物，象能够给予医药化合物最佳游离速度这样的问题，本专业的人员当然可以适宜地选择。表中，肽序列左边是N末端、在C末端一侧结合医药化合物的残基。D-phe表示D-苯丙氨酸残基，其他的氨基酸表示L-氨基酸。另外游离速度的大小是通过结合了阿霉素的药物复合物对感染Walker256癌大鼠的药效的体现的程度、或者在感染Walker256癌大鼠的肿瘤部位的游离阿霉素的浓度来判定。这些的间隔基中，对于阿霉素来说，优选使用(N末端)-Gly-Gly-Phe-Gly-等的在短时间内能够游离出高浓度的医药化合物的间隔基。
表1(a)游离速度大的间隔基-Leu-Gly--Tyr-Gly--Phe-Gly--Gly-Phe-Gly--Gly-Gly-Phe-Gly--Gly-Phe-Gly-Gly--Phe-Gly-Gly-Gly--Phe-Phe-Gly-Gly--Gly-Gly-Gly-Phe-Gly-(b)游离速度比较大的间隔基-Gly-Gly-Phe-Phe--Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-(c)游离速度比较小的间隔基-Phe-Phe--Ala-Gly--Pro-Gly--Gly-Gly-Gly-Phe-(d)游离速度小的间隔基-Gly--D-Phe-Gly--Gly-Phe--Ser-Gly--Gly-Gly--Gly-Gly-Gly--Gly-Gly-Gly-Gly-
作为构成药物复合物的多糖衍生物部分的具有羧基的多糖衍生物来说，可以使用例如多糖类或者将其经化学或生物学方面的修饰的在分子中具有羧基的任何化合物。例如，除了能够使用透明质酸、果胶、褐藻酸、软骨素、肝素等的多糖类之外，还能够使用プルラン、葡聚糖、甘露聚糖、壳聚糖、旋覆花素、果聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖、マンノグルカン、脱乙酰壳聚糖等的、在多糖的部分或者全部的羟基上导入了具有羧基的官能团的化合物等。例如，可以优选使用将羟基进行羧C1-4烷化后的化合物，及将多元酸的一个羧基与羟基经酯键结合起来的化合物等。另外，也可以使用在将上述多糖类多元醇化之后，导入了具有羧基的官能团的化合物。
在这样的多糖衍生物中，优选使用羧C1-4烷基葡聚糖多元醇。羧C1-4烷基葡聚糖多元醇的多元醇化程度没有特别的限定，但构成羧C1-4烷基葡聚糖多元醇的葡聚糖多元醇，优选的是在实际上有可能完全地多元醇化的条件下处理葡聚糖得到的葡聚糖多元醇。
对于制造羧C1-4烷基葡聚糖多元醇来说，使用的葡聚糖的种类没有特别地限定，可以包含任意比例的α-D-1,6-键。例如α-D-1,6-键的比例可以使用85％以上、90％以上、或者95％以上的葡聚糖等。葡聚糖的分子量没有特别地限定，可使用例如从10,000左右到2,000,000左右的化合物，优选50,000左右到800,000左右的化合物。作为构成羧C1-4烷基葡聚糖多元醇的羧C1-4烷基的C1-4烷基来说，可使用直链或者支链的C1-4烷基，具体地说，有甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基等，其中可优选使用甲基。
本发明的方法，在于制造上述的药物复合物，其特征在于，具有羧基的多糖衍生物的有机胺的盐同医药化合物自身、或者具有羧基的多糖衍生物的有机胺的盐同结合了医药化合物的间隔基，在实质上不含有水的有机溶剂中，即在非水体系下进行反应。以下作为本发明的方法的优选实施方案，对于使用羧C1-4烷基葡聚糖多元醇作为多糖衍生物的情况进行具体地说明，但是本发明的范围并不局限于这些实施方案。
对于使用葡聚糖作为起始原料的时候，将远远过量的高碘酸钠和硼氢化钠依次与葡聚糖作用，能够制造实质上将葡聚糖完全地多元醇化的葡聚糖多元醇。然而葡聚糖的多元醇化的方法并不仅限定于上述的方法，研究人员可以采用可能利用的任何的方法。羧C1-4烷基化能够通过例如将氯代醋酸、溴代醋酸、α-氯丙酸、α-甲基-α-氯丙酸、β-氯丙酸、α-甲基-β-氯丙酸、α-氯酪酸、β-氯酪酸、γ-氯酪酸等的卤代C1-4烷基羧酸，优选氯代醋酸与葡聚糖多元醇的羟基反应，将羟基部分或者完全地羧C1-4烷基化。
例如，将葡聚糖多元醇溶解在与反应无关的惰性溶剂中(例如水、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等)，在碱(例如氢氧化钠及氢氧化钾等)的存在下，添加卤代C1-4烷基羧酸或其盐，在冰冷下至100℃左右的温度范围进行数分钟至数日的反应。羧C1-4烷基的导入的程度，通过适宜地选择例如羧C1-4烷基化的反应温度及作为试药使用的卤代C1-4烷基羧酸以及碱的量，能够容易地得以调节，象这样的手段对于研究人员是公知的。对于葡聚糖多元醇的羟基的羧C1-4烷基化的程度没有特别的限定，但是例如相当于构成糖残基的0.01～2.0的范围，优选是0.1～1.0、更优选是0.3～0.5的范围。羧C1-4烷基葡聚糖多元醇的分子量，在用凝胶过滤法测定时，是从5,000～500,000左右，优选50,000～450,000左右，更优选200,000～400,000左右。
象这样制造出的羧C1-4烷基葡聚糖多元醇，被调制成以钠盐或钾盐等的碱金属盐形式的水溶液存在。本发明的方法的特征是，对于象这样的多糖衍生物的羧基来说，在与医药化合物或者同医药化合物的残基结合后的间隔基结合时，用以有机胺的盐的形式的多糖衍生物代替上述的碱金属盐的形式的多糖衍生物。象这种样的以有机胺的盐的形式的多糖衍生物，在不含水的有机溶剂中实际应用时能够以高浓度溶解，因为反应可以在非水系统中进行，所以反应效率可以显著地得到提高。
作为有机胺的盐来说，例如除了能够使用三乙基胺、三甲基胺、三乙醇胺等的脂肪族胺类的盐之外，还能够使用N-甲基吡咯烷、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二甲基氨基吡啶等的脂环式或者芳香族胺类的盐、氯化四甲基铵、氯化四乙基铵等的季铵盐等。由多糖衍生物的钠盐转换成有机胺的盐，可以使用离子交换树脂来进行。例如将羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐溶解于水，上到填充了Bio-Rad AG50W-X2(200-400目，H+型)树脂的柱中，用水洗脱后，添加三乙基胺等的有机胺，能够经冷冻干燥得到。另外，将羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐溶解于水，使其通过三乙基铵型的树脂，也可以经一步工艺进行转换。
医药化合物自身同羧甲基葡聚糖多元醇的羧基的结合、或者结合了医药化合物的间隔基同羧甲基葡聚糖多元醇的羧基的结合，通常可以通过医药化合物具有的反应性的氨基或间隔基的N末端氨基同羧甲基葡聚糖多元醇的羧基经酰胺键结合。另外，医药化合物或者间隔基同羧甲基葡聚糖多元醇的羧基的结合并不限定于上述的方式，也可以用其它的化学键或利用1或1个以上的间隔基的键合。例如，可以通过间隔基C末端的羧基或者医药化合物的羧基同羧甲基葡聚糖多元醇的羧基形成酸酐，另外也可以使用亚乙基二氨基等的二氨基化合物作为间隔基，将各自的羧基与二氨基的各个氨基经酰胺键结合。
通过医药化合物具有的反应活性的氨基或间隔基的N末端氨基同羧甲基葡聚糖多元醇的羧基经酰胺键结合的时候，能够使用通常用于肽链的合成的脱水缩合剂，例如除象N,N＇-二环己基碳化二亚胺(DCC)那样的N,N＇-二环烷基碳化二亚胺类、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDAPC)等的碳化二亚胺衍生物、象1-羟基苯并三唑(HOBT)那样的苯并三唑衍生物之外，还有1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(EEDQ)等。并且也可以通过活性酯法及酰卤化物法等进行反应。
反应实际上是在不含有水的有机溶剂中进行，可以使用能够溶解反应物(羧甲基葡聚糖多元醇的有机胺盐以及医药化合物或结合了医药化合物的间隔基)的任何溶剂。例如，优选使用N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、环丁砜等。医药化合物或者结合了医药化合物的间隔基经过反应导入羧甲基葡聚糖多元醇的医药化合物残基的量没有特别的限定，但是应该从医药化合物残基的物理化学方面的性质、药物复合物的体内动力学、药效、以及毒性等的方面适宜选择。通常能够选择0.1～30重量％，优选1～15重量％左右的范围。被导入了羧甲基葡聚糖多元醇的医药化合物残基的比例，可以通过例如吸光度分析等方法容易地测定。
作为本发明的制造方法的优选实施方案，在日本特开平6-87746号的权利要求书第2项记载的抗肿瘤药的医药化合物，其与低聚肽式键合后，再导入羧甲基葡聚糖多元醇的方法，可用以下的流程图表示，但本发明的方法并不局限于在这个流程图中被表示的方法。在下述流程图中，医药化合物残基的导入量，是例如1～15重量％，优选4～8重量％左右。另外，在下述流程图中，在例示中记载的多元醇的组成单元中只有导入了1个或2个的羧甲基的组成单元，药物复合物的多糖衍生物部分没有通过上述组成单元的反复组合来构成之事，是应该被理解的。


上述流程图中的医药化合物，在酸性水性溶剂中(例如pH3左右)平衡偏向于形成内酯环的化合物(闭环体)；另一方面，在碱性水性溶剂中(例如pH10左右)平衡偏向于形-成内酯环开环的化合物(开环体)，这些是公知的常识，但是导入相应于这样的闭环体及开环体的残基的药物复合物，具有同等的抗肿瘤效果。然而，羧甲基葡聚糖多元醇在同结合了上述医药化合物的间隔基(例如低聚肽·间隔基)进行反应时，如果开环型的反应种类存在于反应系统，在来源于内酯环的羧基同来源于间隔基的氨基之间进行缩合反应，不仅使反应收率显著地降低，而且有时得不到均一的目的药物复合物。象这个样的副反应，在不能达到平衡的非水性系统中可以通过使用闭环体这种反应种类得以避免。因此本发明的方法对包括上述的医药化合物的药物复合物的制造特别地适合。
由本发明的方法制造出的上述药物复合物，对应于医药化合物的残基种类(例如抗肿瘤药或者抗炎药等的医药化合物的残基)，在肿瘤部位及炎症部位等的局部能够得到所希望的医药活性，并且还有能够减低医药化合物自身所具有的毒性的特点。例如，是多糖衍生物部分的羧甲基葡聚糖多元醇作为药物输送的载体有着极其优异的血中滞留性及向肿瘤·炎症部位的积聚性，使上述的药物复合物具有着肿瘤选择性以及炎症部位选择性。另外，因为在肿瘤部位及炎症部位被认为发现了蛋白酶(肽酶)，具有由低聚肽组成的间隔基的药物复合物在其肽链部分可容易地被加水分解，游离出的医药化合物发挥药效。
包含通过本发明的方法制造出来的药物复合物的药物，通常可以用冷冻干燥品等的形式填充入玻璃瓶等，以使用时临时溶解型的注射用或者点滴用制剂等的非口服给药制剂应用于临床，但象这样的药物的制剂形式并不局限于上述的形式。对于上述制剂的制造，例如可以使用助溶剂、pH调节剂、稳定剂等在本行业可以使用的制剂用辅料，制造出医药组合物。上述药物的剂量没有特别的限定，但通常根据构成医药化合物的残基的医药化合物的给药量，药物复合物中被导入的药物化合物的残基量、患者的状态及疾病的种类等来决定。例如，在日本特开平6-87746号权利要求2记载的抗肿瘤药的残基，在用约6重量％左右的比例导入的药物复合物非口服给药时，一般每天以体表面积每1m2约1～500mg左右，优选约10～100mg的范围一次给药，优选每周反复给药3～4次。
实施例以下通过实施例进一步具体地说明本发明，但本发明的范围并不局限于下述的实施例。实施例中，[A-NH-]表示在象日本特开平6-87746号权利要求2记载的医药化合物(在实施例中也叫做“DX-8951”)等的那样的有内酯环的医药化合物中，内酯环是闭环的医药化合物用A-NH2表示的时候的医药化合物残基，其中一例，是在上述的间隔基中用A-NH-表示的基团(形成了内酯环的化合物)。另外，A＇-NH-表示用A-NH-表示的医药化合物残基中的内酯环是以闭环型或开环型的任一种或者它们的混合型存在的物质。
在实施例中，对于没有特别说明的时候，羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化的取代度(相当于每构成糖残基的羧甲基的取代度)，通过将羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐转换成游离型后，溶解于0.1N氢氧化钠水溶液，用0.1N盐酸滴定求出。将羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐的水溶液上Bio-Rad AG50W-x2(H+型)柱，将洗脱液冷冻干燥后作为供试品使用。将此供试品溶解于定量过量的0.1N氢氧化钠水溶液，以酚酞为指示剂，用0.1N盐酸滴定。供试品的取样量为s(mg)、0.1N氢氧化钠水溶液的定量过量为a(ml)、0.1N盐酸的滴定量为b(ml)，羧甲基取代度通过式13.4(a-b)/[s-5.8(a-b)]求出。另外药物的导入量(重量％)，可利用药物的特性吸收由分光光度法(362nm附近)求出。凝胶过滤法按下述的条件进行(柱TSK gel G4000PWXL、洗脱液0.1MNaCl、流速0.8ml/min、柱温40℃)。例1:3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)

将Boc-Gly-Gly-Phe-Gly(600mg)以及N-羟基琥珀酰亚胺(160mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(20ml)，冷却到4℃后，添加N,N＇-二环己基碳化二亚胺(280mg)。在此溶液中加入溶解了日本特开平6-87746号权利要求2记载的医药化合物的甲磺酸盐(600mg在上述专利的实施例50记载的化合物)和三乙基胺(0.16ml)的N,N-二甲基甲酰胺(30ml)溶液，遮光下在室温边搅拌16小时边反应。将此反应液减压干固，残渣用硅胶柱色谱(洗脱液含0.5％醋酸的二氯甲烷∶甲醇=10∶1溶液)精制，得到标题化合物(1.0g)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.40(d,1H,J=8.3Hz),8.10-817(m,2H),7.91-801(m,1H),7.78(d,1H,J=10.75Hz),7.32(s,1H),6.94-6.96(m,1H),6.50(s,1H),5.57(t,1H,J=4.5Hz),5.43(s,2H),5.23(s,2H),3.77(dd,2H,J=5.85Hz,J=8.80Hz),3.70(d,2H,J=4.40Hz),3.65(d,2H,J=5.35Hz),3.56(d,2H,J=5.85),3.15-3.25(m,2H),2.40(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.86(m,2H),1.35(s,9H),0.88(t,3H,J=7.35).Mass(FAB)；m/e854(M+1)例2:3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的合成将Boc-Gly-Gly-Gly-Phe(600mg)以及N-羟基琥珀酰亚胺(160mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(20ml)，冷却到4℃后，添加N,N＇-二环己基碳化二亚胺(280mg)。在此溶液中加入溶解了DX-8951的甲磺酸盐(600mg)和三乙基胺(0.16ml)的N,N-二甲基甲酰胺(30ml)溶液，遮光下在室温边搅拌16小时边反应。将此反应液减压干固，残渣用硅胶柱色谱(洗脱液含0.5％醋酸的二氯甲烷∶甲醇=10∶1溶液)精制，得到标题化合物(700mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.57(d,1H,J=7.8Hz),8.19(d,1H),8.05-8.07(m,2H),7.79(d,1H,J=11.2Hz),7.32(s,1H),7.10(d,2H,J=7.8Hz),6.93-7.03(m,4H),6.51(s,1H),5.52-5.55(m,1H),5.44(s,2H),5.18(d,1H,J=18.5Hz),4.84(d,1H,J=18.5Hz),4.57-4.59(m,1H),3.57-3.71(m,6H),3.15-3.25(m,2H),3.00-3.02(m,1H),2.80-2.90(m,1H),2.40(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.86(m,2H),1.35(s,9H),0.88(t,3H,J=7.35Hz).Mass(FAB)；m/e854(M+1)例3:3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的合成将Boc-Gly-Gly-Gly-Gly(120mg)以及N-羟基琥珀酰亚胺(39mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(20ml)，冷却到4℃后，添加N,N＇-二环己基碳化二亚胺(70mg)。在此溶液中加入溶解了DX-8951的甲磺酸盐(150mg)和三乙基胺(0.039ml)的N,N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液，遮光下在室温边搅拌16小时边反应。将此反应液减压干固，残渣用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇=10∶1溶液)精制，得到标题化合物(100mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.40(d,1H,J=8.3Hz),8.10-8.17(m,2H),7.91-8.01(m,1H),7.78(d,1H,J=10.75Hz),7.32(s,1H),6.94-6.96(m,1H),6.50(s,1H),5.57(t,1H,J=4.5Hz),5.43(s,2H),5.23(s,2H),3.77(dd,2H,J=5.85Hz,J=8.80Hz),3.70(d,2H,J=4.40Hz),3.65(d,2H,J=5.35Hz),3.56(d,2H,J=5.85Hz),3.15-3.25(m,2H),2.40(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.86(m,2H),1.35(s,9H),0.88(t,3H,J=7.35Hz).Mass(FAB)；m/e764(M+1)例4:3＇-N-(Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)三氟醋酸盐的合成

将3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(79mg)溶解于三氟醋酸(3ml)，放置1小时。除去溶剂，分别用甲醇(30ml)2次、乙醇(30ml)2次进行共沸后，残渣用乙醚洗净，得到标题化合物(80mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.59-8.61(m,1H),8.50(d,1H,J=8.3Hz),8.21-8.27(m,2H),7.91-8.01(br,3H),7.81(d,1H,J=11.2Hz),7.32(s,1H),6.50-6.52(br,1H),5.57-5.59(m,1H),5.43(s,2H),5.23(s,2H),3.80-3.82(m,3H),3.70-3.75(m,3H),3.15-3.25(m,2H),2.41(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.86-1.88(m,2H),0.88(t,3H,J=7.35Hz).例5羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐的合成葡聚糖T2000(10g，法鲁玛西亚(フプルマミア)公司制造，平均分子量2,000,000)溶解于0.1M醋酸缓冲液(pH5.5,1000ml)，加入高碘酸钠(33.0g)的水溶液(1000ml)。边遮光边在4℃下搅拌10天后，加乙二醇(7.0ml)，搅拌一夜。反应液在冰冷下用8M氢氧化钠水溶液调节pH至7.5。加入硼氢化钠(14g)溶解后，在室温搅拌一夜。将反应液冰冷却，用醋酸调节至pH5.5，在4℃搅拌1小时后，在冰冷下用8M氢氧化钠水溶液调节pH至7.5。得到的水溶液用バィオマックス-30膜(ミリポァ公司制造)，经超滤法除去低分子组分。将高分子组分冷冻干燥后，得到葡聚糖多元醇。此葡聚糖多元醇在pH3.0处理1小时后，用バィオマックス-50膜除去低分子组分，然后用バィオマックス-100膜除去高分子组分，冷冻干燥，得到精制葡聚糖多元醇(2.0g)。此物质的分子量(凝胶过滤法，葡聚糖标准)是220K。
此精制葡聚糖多元醇(1.8g)加入到在水(45ml)中溶解了氢氧化钠(10.5g)后得到的水溶液中，在室温使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(15g)，使其溶解后，在室温反应20小时。将此反应液用醋酸调节至pH8后，用バィオマックス-10膜经超滤法除去低分子组分。高分子组分冷冻干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(1.8g)。此物质的分子量(凝胶过滤，葡聚糖标准)是330K，羧甲基化度是0.8。
上述的羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(300mg)溶解于水，上Bio-Rad AG50W-X2(200-400目，H+型)柱(1.5×8.6cm)，用水洗脱。在此洗脱液中加入三乙基胺(0.5ml)后，进行冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(380mg)。将羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(各300mg)进行同上述同样的柱处理，得到羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(380mg,400mg)。例6羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐的合成在上述例5得到的葡聚糖多元醇的钠盐(0.15g)，加入到在水(4.5ml)中溶解了氢氧化钠(1.05g)后得到的水溶液中，在室温使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(1.5g)，使其溶解后，在室温反应18小时。将此反应液用醋酸调节至pH8，滴入到90ml的甲醇中之后，加入3M氯化钠水溶液(0.15ml)，析出的沉淀经离心分离(3500rpm,8分钟)收集。此沉淀用甲醇洗净后，溶解在水(5ml)中，加入3M氯化钠水溶液(0.15ml)。将此溶液用米利波阿过滤器(0.45μm)过滤，滤液滴入到35ml的乙醇中，析出的沉淀经离心分离(3500rpm,8分钟)收集。此沉淀用乙醇洗净后，溶解在水中，用透析膜(スペクトラポァ1，透过分子量6,000-8,000)，对纯水透析。透析内液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(0.18g)。此物质相当于每糖残基的羧甲基化度(碱滴定法)是1.2。例7羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐的合成在上述例5得到的精制葡聚糖多元醇(0.2g)，加入到在水(6ml)中溶解了氢氧化钠(0.84g)后得到的水溶液中，在室温使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(1.2g)，使其溶解后，在室温反应18小时。将此反应液用醋酸调节至pH8，滴入到120ml的甲醇中之后，加入3M氯化钠水溶液(0.2ml)，析出的沉淀经离心分离(3500rpm，8分钟)收集。此沉淀用甲醇洗净后，溶解在水(5ml)中，加入3M氯化钠水溶液(0.2ml)。将此水溶液用米利波阿过滤器(0.45μm)过滤，滤液滴入到35ml的乙醇中，析出的沉淀经离心分离(3500rpm，8分钟)收集。此沉淀用乙醇洗净后，溶解在水中，用透析膜(スペクトラポァ1，透过分子量6,000-8,000)，对纯水透析。透析内液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(0.20g)。此物质相当于每糖残基的羧甲基化度(碱滴定法)是0.4。例8羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成在例5得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(380mg，羧甲基化度是0.8)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(30ml)。在此溶液中，顺次加入3＇-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸盐(49mg)的N,N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液、三乙基胺(0.017ml)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(380mg)，在室温边搅拌一夜边反应。此反应液用1M氢氧化钠水溶液调节至pH10后，在25ml的乙醇中每5ml分别滴入。在这个混合物中加入3M氯化钠水溶液(1ml)、乙醚(5ml)，析出的沉淀经离心分离(3500rpm,8分钟)收集。
此沉淀溶解在水中，用透析膜(スペクトラポァ1，透过分子量6,000-8,000)，对纯水透析。透析内液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥。得到的粗品溶解于水(30ml)，用0.1M氢氧化钠水溶液调节至pH9，在37℃处理1小时。此处理液同上述同样地进行透析后，透析内液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤，冷冻干燥，得到标题化合物289mg。本化合物溶解于0.1M氯化钠水溶液，用GPC(柱东ソ-株式会社制TSK Gel PW-4000XL，溶剂0.1MNaCl，流速0.8ml/min)分析出的结果、以及本化合物的紫外吸收光谱(0.1M三醋酸缓冲液，pH9.0,0.25mg/ml)分别表示在图1及图2。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1M三醋酸缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是5.3％(W/W)。例9羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成由3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(50mg)用同例4同样的方法经脱Boc，得到的3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A的三氟醋酸盐，按同例8同样的方法，导入在例5得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(380mg)，合成出标题化合物(300mg)。本化合物溶解于0.1M氯化钠水溶液，用GPC(柱东ソ-株式会社制TSK Gel PW-4000XL，溶剂0.1MNaCl，流速0.8ml/min)分析出的结果、以及本化合物的紫外吸收光谱(0.1Mトリス缓冲液，pH9.0,0.19mg/ml)分别表示在图3及图4。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1Mトリス缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是5.3％(W/W)。例10羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Gly-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成由3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(41mg)用同例4同样的方法经脱Boc化得到的3＇-N-(Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A的三氟醋酸盐，按同例8同样的方法，导入在例5得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(380mg)，合成出标题化合物(190mg)。本化合物的紫外吸收光谱(0.1Mトリス缓冲液，pH9.0,0.34mg/ml)表示在图5。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1Mトリス缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是5.3％(W/W)。例11本发明的药物复合物的抗肿瘤作用将小鼠纤维肉瘤Meth A细胞1×106个移植到BALB/c种的雄性小鼠(7周龄)的右鼠颈(蹊)部皮下，制成感染Meth A癌小鼠(1组7只)。在第7天将溶解于注射用蒸馏水的例9的药物复合物经Meth A癌小鼠的尾静脉内每4天给药4次。在移植后第21天摘出肿瘤，测定重量，肿瘤增殖抑制率由下式算出肿瘤增殖抑制率(％)=[1-(受试品给药组的平均肿瘤重量/对照组的平均肿瘤重量)]×100。其结果，在例9得到的本发明的药物复合物没有发现毒性(体重减轻)，与上述医药化合物自身(没有间隔基以及多糖衍生物)进行比较，抗肿瘤效果大幅度增强。多糖衍生物自身(例5)以及只导入了间隔基的医药化合物残基(由例1的化合物按例4的方法脱BOC化得到的H2N-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸盐)是无效的。
表2受试品化合物给药量(mg/kg)抑制率(％)医药化合物自身 7.5×4 761.875×4 460.9375×436例9的化合物 1.41)× 4940.71)×4590.351)×4 411)医药化合物的换算量例12本发明的药物复合物的抗肿瘤作用按与例11同样的方法作成感染Meth A癌小鼠(1组6只)，在第7天比较将例8以及例9的药物复合物单次给药时的抗肿瘤作用。其结果，抗肿瘤作用的强度为(多糖衍生物)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇＞(多糖衍生物)-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A＇＞医药化合物自身。没有导入间隔基的医药化合物残基与例5的羧甲基葡聚糖多元醇的羧基直接结合的化合物(医药化合物残基的导入量6.2重量％)是无效的。
表3受试品化合物给药量(mg/kg)抑制率(％)医药化合物自身 60 7720 59例8的化合物101)8551)76例9的化合物51)982.51)871)医药化合物的换算量例13羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐的合成葡聚糖T500(10g，法鲁玛西亚公司制造，分子量500K)溶解于0.1M醋酸缓冲液(pH5.5,1000ml)，加入高碘酸钠(33g)的水溶液(1000ml)。边遮光边在4℃下搅拌10天后，加入乙二醇(7.0ml)，搅拌一夜。反应液在冰冷下用8M氢氧化钠水溶液调节pH至7.5。加入硼氢化钠(14g)溶解后，搅拌一夜。将反应液冰冷却，用醋酸调节至pH5.5，在4℃搅拌1小时后，用8M氢氧化钠水溶液调节pH至7.5得到溶液1。另外对于葡聚糖T500(10g，法鲁玛西亚公司制造，分子量500K)，进行上述的连续操作，得到溶液2。进一步对于葡聚糖T250(各10g，法鲁玛西亚公司制造，分子量250K)，进行上述的连续操作，得到溶液3和溶液4。合并这些溶液1～4，用バィオマックス-50膜经限外过滤法除去低分子组分。高分子组分冷冻干燥后，得到葡聚糖多元醇(25g)。此物质的分子量(凝胶过滤法，プルラン标准)是163K。
此葡聚糖多元醇(11g)加入到在水(330ml)中溶解了氢氧化钠(46.2g)后得到的水溶液中，在室温使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(66g)，使其溶解后，在室温反应一夜。将此反应液用醋酸调节至pH9后，用バィオマックス-30膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液冷冻干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(13g)。此物质的分子量(凝胶过滤，プルラン标准)是228K，羧甲基化度是0.4。
上述的羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(600mg)溶解于水，上Bio-Rad AG5W-X2(200-400目，H+型)柱(直径44mm，长210mm)，用水洗脱。在此洗脱液中加入三乙基胺(0.93ml)后，进行冷冻干燥，得到标题化合物(690mg)。例14:3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)三氟醋酸盐的合成将在例1得到的3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(79mg)溶解于三氟醋酸(3ml)，放置1小时。除去溶剂，依次用甲醇(30ml)、乙醇(30ml)分别进行共沸2次之后，残渣用乙醇洗净，得到标题化合物(80mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.53(d,1H,J=8.3Hz),8.40-8.48(m,2H),8.28(d,1H,J=8.3Hz),7.95-8.07(br,3H),7.81(d,1H,J=10.2Hz),7.30-7.37(m,2H),7.15-7.30(m,5H),6.50-6.55(br,1H),5.50-5.57(m,1H),5.41(d,2H,J=7.82Hz),5.25(s,2H),4.55-4.62(m,1H),3.55-3.92(m,6H),3.15-3.25(br,2H),2.98-3,03(m,1H),2.73-2.82(m,1H),2.40(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.84-1.92(m,2H),0.88(t,3H,J=7.35Hz).例15羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成将在例13得到的羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(400mg)转换成三乙基铵盐(470mg)，溶解于N,N-二甲基甲酰胺(30ml)。在此溶液中，顺次加入在例14得到的3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸盐(62mg)的N,N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液、三乙基胺(0.02ml)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(470mg)，遮光下在室温边搅拌一夜边反应。此反应液每5ml在各10ml的乙醇中滴入。在此液中加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀经离心分离收集。此沉淀溶解在0.5M氯化钠水溶液中，冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节至pH9，用透析膜(スペクトラポァ1，透过分子量6,000-8,000)，对纯水透析。透析内液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到标题化合物(600mg)。本化合物溶解于0.1M氯化钠水溶液，用GPC(柱东ソ-株式会社制TSK Gel PW-4000XL，溶剂0.1MNaCl，流速0.8ml/min)分析出的结果、以及本化合物的紫外吸收光谱(0.1Mトリス缓冲液，pH9.0,0.1mg/ml)分别表示在图6及图7。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1Mトリス缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是5.8％(W/W)。例16:3＇-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2=DX-8951)三氟醋酸盐的合成将在例2得到的3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(79mg)溶解于三氟醋酸(3ml)，放置1小时。除去溶剂，依次用甲醇(30ml)、乙醇(30ml)分别进行共沸2次之后，残渣用乙醚洗净，得到标题化合物(80mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.62-8.66(m,2H),8.23(d,1H,J=8.3Hz),8.18-8.20(m,1H),7.98-8.10(br,2H),7.79(d,1H,J=10.7Hz),7.32(s,1H),7.09(d,2H,J=7.3Hz),6.93-7.03(m,4H),6.50-6.60(br,1H),5.52-5.55(m,1H),5.44(s,2H),5.18(d,1H,J=18.5Hz),4.80(d,1H,J=18.5Hz),4.57-4.59(m,1H),3.57-3.71(m,6H),3.15-3.25(m,2H),3.00-3.02(m,1H),2.80-2.90(m,1H),2.50(s,3H),2.05-2 25(m,1H),1.86-2.00(m,2H),0.88(t,3H,J=7.35Hz).例17羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成将在例13得到的羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(1.0g)转换成三乙基铵盐(1.2g)，溶解于N,N-二甲基甲酰胺(90ml)。在此溶液中，顺次加入在例16得到的3＇-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸盐(158mg)的N,N-二甲基甲酰胺(15ml)溶液、三乙基胺(0.05ml)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(1.2g)，遮光下在室温边搅拌一夜边反应。此反应液每5ml在各10ml的乙醇中滴入。在此液中加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀经离心分离收集。此沉淀溶解在0.5M氯化钠水溶液中，冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节至pH9，用透析膜(スペクトラポァ1，透过分子量6,000-8,000)，对纯水透析。透析内液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到标题化合物(1.4g)。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1Mトリス缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是5.2％(W/W)。例18:Boc-Gly-Phe-Leu-OH的合成在50％二噁烷水溶液(48ml)中加入H-Gly-Phe-Leu-OH(3.0g)，冰冷却。在此溶液中加入含有1N氢氧化钠水溶液(9.45ml)和(Boc)2O(2.27g)的二噁烷(24ml)溶液，搅拌一夜。在反应液中加入1N盐酸(9.45ml)，馏去溶剂。得到的残渣用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇=5∶1溶液)精制，得到标题化合物(2.5g)。例19:Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OBzl的合成将在例18得到的Boc-Gly-Phe-Leu-OH(2.4g)以及N-羟基琥珀酰亚胺(656mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(50ml)，在4℃冷却后，添加N,N’-二环己基碳化二亚胺(1.17g)，搅拌2小时。在此溶液中加入溶解了H-Gly-OBzl的甲苯磺酸盐(1.9g)和三乙基胺(0.79ml)的N,N-二甲基甲酰胺(40ml)溶液，在室温边搅拌16小时边进行反应。此反应液减压干固，残渣用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇=50∶1)精制，得到标题化合物(2.0g)。1H-NMR(DNSO-d6)δ:8.20-8.30(m,1H),8.12(d,1H,J=8.3Hz),7.83(d,1H,J=8.3Hz),7.32-7.37(m,5H),6.89-6.95(m,1H),5.12(s,1H),4.52-4.59(br,1H),4.34(dd,1H,J=7.3Hz,J=15.1Hz),3.93(dd,1H,J=5.5Hz,J=17.2Hz),3.84(dd,1H,J=5.5Hz,J=17.2Hz),3.54(dd,1H,J=5.9Hz,J=16.7Hz),3.42(dd,J=5.9Hz,J=16.7Hz)3.00(dd,1H,J=4.4Hz,13.7Hz),2.78(dd,1H,J=8.8Hz,J=13.2Hz),1.50-1.65 (m,1H).1.45(t,2H,J=7.3Hz),1.36(s,9H),0.86(d.3H,J=6.4Hz),0.82(d,3H,J=6.4Hz)。例20:Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OH的合成将在例19得到的Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OBzl(1.7g)在醋酸乙酯(30ml)和甲醇(30ml)的混合溶剂中使其溶解后，加入5％Pd-C(1.5g)，进行接触还原。过滤反应液，滤液减压干燥成固体，得到标题化合物(1.15g)。例21:3＇-N-(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的合成将在例20得到的Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OH(200mg)以及N-羟基琥珀酰亚胺(58mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(5ml)，在4℃冷却后，添加N,N-二环己基碳化二亚胺(104mg)使其溶解。在此溶液中加入溶解了DX-8951的甲烷磺酸盐(224mg)和三乙基胺(0.059ml)的N,N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液，在避光条件下室温边搅拌16小时边进行反应。此反应液减压干燥成固体，得到的残渣用硅胶柱色谱(洗脱液含有0.5％醋酸的二氯甲烷∶甲醇=10∶1溶液)精制，得到标题化合物(200mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.35(d,1H,J=7.8Hz),8.08-8.18(m,2H),7.75-7.85(m,2H),7.32(s,1H),7.10(d,2H,J=6.8Hz),7.08-7.13(m,3H),6.85-6.95(br,1H),6.40-6.65(br,1H),5.52-5.55(m,1H),5.46(d,1H,J=18.5Hz),5.37(d,1H,J=18.5Hz),5.24(s,2H),4.44-4.52(m,1H),4.15-4.25(m,1H),3.68-3.72(m,2H),3.40-3.52(m,2H),3.15-3.25(br,2H),2.85-2.95(m,1H),2.65-2.75(m,1H),2.40(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.80-1.91(m,2H),1.50-1.65(m,1H),1.45(t,2H,J=7.3Hz),1.35(s,9H),0.88(t,3H,J=7.4),0.86(d,3H,J=6.4Hz),0.82(d,3H,J=6.4Hz).例22:3＇-N-(Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)三氟醋酸盐的合成将在例21得到的3＇-N-(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(97mg)溶解于三氟醋酸(3ml)，放置1小时。除去溶剂，依次分别用甲醇(30ml)、乙醇(30ml)各共沸2次后，残渣用乙醚洗净，得到标题化合物(95mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.57(d,1H,J=83Hz),8.47(d,1H,J=8.3Hz),8.32(d,1H,J=7.8Hz),8.17(t,1H,J=5.5Hz),7.81-7.91(br,3H),7.79(d,1H,J=10.7Hz),7.32(s,1H),7.21-7.23(m,5H),7.12-7.17(m,1H),6.45-6.55(br,1H),5.57(q,1H,J=4.4Hz),5.43(d,1H,J=16.1Hz),5.34(d,1H,J=16.1Hz),5.23(s,2H),4.67(dt,1H,J=4.0Hz,J=9.0Hz),4.31(dd,1H,J=8.5Hz,J=15.0Hz),4.0-4.4(br,1H),3.74-3.76(m,2H),3.56(dd,1H,J=6.0Hz,J=16.0Hz),3.41(dd,1H,J=6.0Hz,J=16.0Hz),3.17-3.19(br,2H),3.02(dd,1H,J=4.0Hz,J=14.0Hz),2.70(dd,1H,J=10.0Hz,J=14.0Hz),2.40(s,3H),2.05-2.15(m,1H),1.85(dt,2H,J=7.0Hz,J=14.0Hz),1.50-1.55(m,1H),1.45(t,2H.J-6.0Hz),1,35(s,9H),0.88(t,3H,J=7.4),0.85(d,3H,J=6.4Hz),(0.80(d,3H,J=6.4Hz)例23羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Phe-Leu-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成将在例13得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(690mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(50ml)。在此溶液中，顺次加入在例22中得到的3＇-N-(Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸盐(95mg)的N,N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液、三乙基胺(0.03ml)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(690mg)，在室温边搅拌一夜边进行反应。此反应液的每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀经离心分离收集。此沉淀溶解在0.5M氯化钠水溶液中，冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节至pH9，用透析膜(スペクトラポァ1，透过分子量6,000-8,000)，对纯水透析。透析内液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，滤液冷冻干燥，得到标题化合物(600mg)。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1Mトリス缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是4.8％(W/W)。例24羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐的合成葡聚糖T500(50g，法鲁玛西亚公司制造，分子量500K)溶解于0.1M醋酸缓冲液(pH5.5,5000ml)，加入高碘酸钠(165.0g)的水溶液(5000ml)。边遮光边在4℃下搅拌10天后，加乙二醇(35.0ml)，搅拌一夜。反应液用8M氢氧化钠水溶液调节pH至7.5。加入氢化硼钠(70g)溶解后，搅拌一夜。将反应液冰冷却，用醋酸调节至pH5.5，在4℃搅拌1小时后，用8M氢氧化钠水溶液调节pH至7.5。得到的水溶液用バィオマックス-50膜经限外过滤法除去低分子组分。高分子组分冷冻干燥后，得到葡聚糖多元醇(27.1g)。此物质的分子量(凝胶过滤法，プルラン标准)是140K。
此葡聚糖多元醇(5g)加入到在水(150ml)中溶解了氢氧化钠(21g)后得到的水溶液中，在室温使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(30g)，使其溶解后，在室温反应一夜。将此反应液用醋酸调节至pH8后，用バィオマックス-50膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液冷冻干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(5.6g)。此物质的分子量(凝胶过滤，プルラン标准)是263K，羧甲基化度是0.4。
上述的羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(2.0g)溶解于水，上Bio-RadAG50W-X2(200-400目，H+型)柱(直径44mm，长210mm)，用水洗脱。在此洗脱液中加入三乙基胺(4ml)后，进行冷冻干燥，得到标题化合物(2.2g)。例25羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐的合成将在例24得到的羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(1.0g)溶解于水，上Bio-Rad AG50W-X2(200-400目，Me3NH+型)柱，用水洗脱。冷冻干燥此洗脱液，得到标题化合物(950mg)。例26:3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)盐酸盐的合成用与例14同样的方法从3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(400mg)得到的3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A三氟醋酸盐溶解于水-MeOH(1∶4)中，上Bio-Rad AG1-X8(200-400目、C1-型)柱(1.5cm×8.6cm)，用上述溶剂洗脱。浓缩此洗脱液后，冷冻干燥，得到标题化合物(310mg)。1H-NMR(DMS0-d6)δ:8.53(d,1H,J=8.5Hz),8.46-8.48(m,1H),8.37-8.39(m,1H),7.95(d,1H,J=8.0Hz),7.80(s,3H),7.78(d,1H,J=11.1Hz),7.34(s,1H),7.14-7.24(m,5H),6.50(s,1H),5.56-5.60(m,1H),5.35-5.40(m,2H),5.24(s,2H),4.51-4.56(m,1H),3.86(dd,J=4.8,13.5Hz,1H),3.68-3.79(m,3H),3.54(s,2H),3.15-3.22(m,2H),3.01(dd,J=5.6,13.5Hz,1H),2.78(dd,J=9.6,3.5Hz,1H),2.41(s,3H),2.12-2.23(m,2H),1.81-1.89(m,2H),0.88(t,3H,J=72Hz).Mass(FAB)；m/e753(M+1)例27羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成将在例25得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三甲基铵盐(0.1g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(6ml)。在此溶液中，顺次加入在例26中得到的3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)NH-A(A-NH2=DX-8951)的盐酸盐(24mg)的N,N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液、三乙基胺(5μl)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(0.1g)，在室温边搅拌一夜边进行反应。此反应液的每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀经离心分离(3500rpm,8分钟)收集。此沉淀溶解在0.5M氯化钠水溶液中，冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节至pH9，得到的水溶液用バィオマックス-30膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到标题化合物(90mg)。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1Mトリス缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是11％(W/W)。例28羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成将在例25得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三甲基铵盐(0.1g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(6ml)。在此溶液中，顺次加入在例26中得到的3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的盐酸盐(36mg)的N,N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液、三乙基胺(8μl)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(0.1g)，在室温边搅拌一夜边进行反应。此反应液的每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀经离心分离(3500rpm,8分钟)收集。此沉淀溶解在0.5M氯化钠水溶液中，冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节至pH12。得到的水溶液用バィオマックス-30膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到标题化合物(80mg)。本化合物溶解于0.1M氯化钠水溶液，用GPC(柱东ソ-TSK Gel PW-4000XL，溶剂0.1MNaCl，流速0.8ml/min)分析出的结果、以及本化合物的紫外吸收光谱(0.1Mトリス缓冲液，pH9.0,36μg/ml)分别表示在图8及图9。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1Mトリス缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是15％(W/W)。例29羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成葡聚糖T250(20g,EXTRASYNTHESE制，平均分子量为250K)溶解于0.1M醋酸缓冲液(pH5.5,2000ml)，加入高碘酸钠(66.0g)的水溶液(2000ml)。边遮光边在4℃下搅拌10天后，加乙二醇(14.0ml)，搅拌一夜。反应液在冰冷下用8M氢氧化钠水溶液调节pH至7.5。加入硼氢化钠(28g)溶解后，在室温搅拌一夜。将反应液冰冷却，用醋酸调节至pH5.5，在4℃搅拌1小时后，在冰冷下用8M氢氧化钠水溶液调节pH至7.5。得到的水溶液用バィオマックス-30膜经限外过滤法除去低分子组分，得到没有通过膜的残留溶液1。另外，葡聚糖T250(50g,EXTRASYNTHESE制，平均分子量为250K)溶解于0.1M醋酸缓冲液(pH5.5,5000ml)，加入高碘酸钠(165g)的水溶液(5000ml)。边遮光边在4℃下搅拌10天后，加乙二醇(35.0ml)，搅拌一夜。反应液在冰冷下用8M氢氧化钠水溶液调节pH至7.5。加入硼氢化钠(70g)溶解后，在室温搅拌一夜。将反应液冰冷却，用醋酸调节至pH5.5，在4℃搅拌1小时后，在冰冷下用8M氢氧化钠水溶液调节pH至7.5。得到的水溶液用バィオマックス-30膜经限外过滤法除去低分子组分，得到没有通过膜的残留溶液2。合并残留溶液1和残留溶液2，经限外过滤法将通过バィオマックス-50膜的组分用バィオマックス-30膜除去低分子组分，冷冻干燥后，得到葡聚糖多元醇(25.7g)。此物质的分子量(凝胶过滤法，プルラン标准)是47K。
此葡聚糖多元醇(5g)加入到在水(150ml)中溶解了氢氧化钠(35g)后得到的水溶液中，在室温使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(50g)，使其溶解后，在室温反应18小时。将此反应液用醋酸调节至pH8后，用バィオマックス-50膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液冷冻干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(7.2g)。此物质的分子量(凝胶过滤，プルラン标准)是127K，羧甲基化度是0.8。这个羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(2.2g)溶解于水，上Bio-Rad AG50W-X2(200-400目，H+型)柱(直径44mm，长210mm)，用水洗脱。在此洗脱液中加入三乙基胺(4ml)后，进行冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(2.69g)。
将这个羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(2.67g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(200ml)。在此溶液中，顺次加入在N,N-二甲基甲酰胺(10ml)中溶解了由和例2同样的方法合成出的3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(350mg)，经用和例16同样的方法脱Boc化后得到的3＇-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A的三氟醋酸盐和三乙基胺(0.116ml)得到的溶液、在N,N-二甲基甲酰胺(10ml)中溶解了1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(2.67g)得到的溶液，在室温边搅拌一夜边进行反应。在此反应液中加入3M氯化钠水溶液(100ml)，每8ml滴入到各30ml的乙醇中。在此液中分别加入3M氯化钠水溶液(1ml)、乙醚(5ml)，析出的沉淀经离心分离(3500rpm,8分钟)收集。此沉淀用丙酮洗净后，溶解于水，加入3M氯化钠水溶液(10ml)后，用0.1M氢氧化钠水溶液调节至pH9，在37℃处理1小时。此处理液用バィオマックス-10膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到标题化合物(2.30g)。本化合物溶解于0.1M氯化钠水溶液，用GPC(柱东ソ-TSK Gel PW-4000XL，溶剂0.1MNaCl，流速0.8ml/min)分析出的结果、以及本化合物的紫外吸收光谱(0.1Mトリス缓冲液，pH9.0,0.20mg/ml)分别表示在图10及图11。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1Mトリス缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是5.8％(W/W)。例30羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐的合成在葡聚糖T10(20g，法鲁玛西亚公司制造，分子量10K)的0.1M醋酸缓冲液(pH5.5)溶液(2000ml)中，加入高碘酸钠(66.0g)的水溶液(2000ml)。边遮光边在4℃下搅拌10天后，加乙二醇(14.0ml)，搅拌一夜。反应液在冰冷下用8M氢氧化钠水溶液调节pH至7.5。加入硼氢化钠(28g)溶解后，在室温搅拌一夜。将反应液冰冷却，用醋酸调节至pH5.5，在4℃搅拌1小时后，在冰冷下用8M氢氧化钠水溶液调节pH至7.5。得到的水溶液用バィオマックス-5膜(ミリポァ公司制造)经限外过滤法除去低分子组分，没有通过膜的残留溶液再通过バィオマックス-30膜。得到的滤液冷冻干燥后，得到葡聚糖多元醇(8.0g)。此物质的分子量(凝胶过滤法，プルラン标准)是13K。
此葡聚糖多元醇(3.7g)加入到在水(111ml)中溶解了氢氧化钠(25.9g)后得到的水溶液中，在室温使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(37g)，使其溶解后，在室温反应20小时。将此反应液用醋酸调节至pH8后，用バィオマックス-5膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液冷冻干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(6.2g)。此物质的分子量(凝胶过滤，プルラン标准)是37K，羧甲基化的取代度是0.9。
将此羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(6.0g)溶解于水，上Bio-RadAG50W-X2(200-400目，H+型)柱，用水洗脱。在此洗脱液中加入三乙基胺(9.3ml)后，进行冷冻干燥，得到标题化合物(7.2g)。例31羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐的合成在例30得到的葡聚糖多元醇(3.9g)加入到在水(117ml)中溶解了氢氧化钠(16.3g)后得到的水溶液中，在室温使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(23.4g)使其溶解后，在室温反应18小时。将此反应液用醋酸调节至pH8后，用バィオマックス-5膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液冷冻干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(5.0g)。此物质的分子量(凝胶过滤，プルラン标准)是28K，羧甲基化度是0.5。这个羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(4.8g)与例30同样的转换成三乙基铵盐，得到标题化合物(5.6g)。例32羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐的合成在葡聚糖4(20g,フナコシ公司制造，平均分子量4K-6K)的0.1M醋酸缓冲液(pH5.5)溶液(2000ml)中，加入高碘酸钠(66.0g)的水溶液(2000ml)。边遮光边在4℃下搅拌10天后，加乙二醇(14.0ml)，搅拌一夜。反应液在冰冷下用8M氢氧化钠水溶液调节pH至7.5。加入硼氢化钠(28g)溶解后，在室温搅拌一夜。将反应液冰冷却，用醋酸调节至pH5.5，在4℃搅拌1小时后，在冰冷下用8M氢氧化钠水溶液调节pH至7.5。得到的水溶液用バィオマックス-3膜(ミリポァ公司制造)经限外过滤法除去低分子组分。得到的滤液冷冻干燥后，得到葡聚糖多元醇(6.0g)。此物质的分子量(凝胶过滤法，プルラン标准)是9K。此葡聚糖多元醇(2.7g)加入到在水(81ml)中溶解了氢氧化钠(18.9g)后得到的水溶液中，在室温使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(27g)，使其溶解后，在室温反应20小时。将此反应液用醋酸调节至pH8后，用バィオマックス-5膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液冷冻干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(4.2g)。此物质的分子量(凝胶过滤，プルラン标准)是20K，羧甲基化度是0.9。
此羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(4.0g)与例30同样转换成三乙基铵盐，得到标题化合物(4.8g)。例33羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐的合成在例32得到的葡聚糖多元醇(2.7g)加入到在水(81ml)中溶解了氢氧化钠(11.3g)后得到的水溶液中，在室温使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(16.2g)使其溶解后，在室温反应18小时。将此反应液用醋酸调节至pH8后，用バィオマックス-5膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液冷冻干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(2.7g)。此物质的分子量(凝胶过滤，プルラン标准)是16K，羧甲基化度是0.5。这个羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(2.7g)与例30同样的转换成三乙基铵盐，得到标题化合物(3.1g)。例34羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成将在例30得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(1.5g)溶解于N,N-z二甲基甲酰胺(90ml)。在此溶液中，顺次加入三乙基胺(0.07ml)和3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸盐(210mg)的N,N-二甲基甲酰胺(40ml)溶液、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(1.5g)，在室温边搅拌一夜边进行反应。将此反应液每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中分别加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀经离心分离(3500rpm,8分钟)收集。此沉淀溶解于0.5M氯化钠水溶液，在冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节至pH9。得到的水溶液用バィオマックス-3膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到标题化合物(1.3g)。本化合物溶解于0.1M氯化钠水溶液，用GPC(柱东ソ-TSK Gel PW-4000XL，溶剂0.1MNaCl，流速0.8ml/min)分析出的结果、以及本化合物的紫外吸收光谱(0.1Mトリス缓冲液，pH9.0,65μg/ml)分别表示在图12及图13。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1Mトリス缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是6.4％(W/W)。例35羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成将在例31得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(1.2g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(90ml)。在此溶液中，顺次加入三乙基胺(0.056ml)和3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸盐(168mg)的N,N-二甲基甲酰胺(30ml)溶液、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(1.2g)，在室温边搅拌一夜边进行反应。将此反应液每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中分别加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀经离心分离(3500rpm,8分钟)收集。此沉淀溶解于0.5M氯化钠水溶液，在冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节至pH9。得到的水溶液用バィオマックス-3膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到标题化合物(1.0g)。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1Mトリス缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是4.8％(W/W)。例36羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成将在例32得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(1.2g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(90ml)。在此溶液中，顺次加入三乙基胺(0.056ml)和3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸盐(168mg)的N,N-二甲基甲酰胺(30ml)溶液、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(1.2g)，在室温边搅拌一夜边进行反应。将此反应液每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中分别加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀经离心分离(3500rpm,8分钟)收集。此沉淀溶解于0.5M氯化钠水溶液，在冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节至pH9。得到的水溶液用バィオマックス-3膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到标题化合物(1.0g)。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1M三醋酸缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是5.9％(W/W)。例37羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成将在例33得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(1.5g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(90ml)。在此溶液中，顺次加入三乙基胺(0.07ml)和3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸盐(210mg)的N,N-二甲基甲酰胺(40ml)溶液、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(1.5g)，在室温边搅拌一夜边进行反应。将此反应液每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中分别加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀经离心分离(3500rpm,8分钟)收集。此沉淀溶解于0.5M氯化钠水溶液，在冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节至pH9。得到的水溶液用バィオマックス-3膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到标题化合物(1.3g)。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1Mトリス缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是4.6％(W/W)。例38:Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A(A-NH2=DW-8286)的合成Boc-Gly-Gly-Phe-Gly(42mg)以及N-羟基琥珀酰亚胺(12mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(2ml)，在4℃冷却后，加入N,N＇-二环己基碳化二亚胺(22mg)。在此溶液中加入溶解了用下述式

表示的化合物[(1s,9s)-1-氨基-5-氯-9-乙基-2,3-二氢-9-羟基-1H,12H-苯并[de]吡喃[3＇,4＇:6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮DW-8286]的盐酸盐(50mg)和三乙基胺(0.01ml)的N,N-二甲基甲酰胺(6ml)溶液，遮光，在室温边搅拌16小时边进行反应。此反应液减压干固，残渣用硅胶柱色谱(洗脱液含有0.5％醋酸的二氯甲烷∶甲醇=10∶1溶液)精制，得到标题化合物(27mg)。1H-NMR(CDCl3)δ:8.10-8.20(br,1H),7.95-8.05(br,1H),7.70-7.80(br,2H),7.50-7.60(br,1H),7.40-7.50(br,1H),7.10-7.25(m,5H),7.05-7.15(br,1H),5.85-5.95(br,1H),5.50-5.60(br,1H),5.40-5.50(m,1H),5.25-5.35(m,1H),5.05-5.15(m,1H),4.90-5.00(m,1H),4.70-4.80(br,1H),4.10-4.25(br,2H),3.60-3.90(m,4H),3.10-3.40(m,3H),2.95-3.05(br,1H),2.15-2.30(br,1H),1.75-1.90(br,2H),1.39(s,9H),0.80-1.00(m,3H).例39羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DW-8286)的合成将在例24得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(175mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(20ml)。在此溶液中，顺次加入在N,N-二甲基甲酰胺(5ml)中溶解了由例38得到的3＇-N-Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DW-8286)(27mg)经用和例4同样的方法脱Boc化后得到的3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A的三氟醋酸盐(29mg)和三乙基胺(9μl)得到的溶液、及1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(175mg)，在室温边搅拌一夜边进行反应。此反应液的每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中分别加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀经离心分离(3500rpm,8分钟)收集。此沉淀溶解于0.5M氯化钠水溶液，在冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节至pH9。得到的水溶液用バィオマックス-30膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到标题化合物(135mg)。本化合物溶解于0.1M氯化钠水溶液，用GPC(柱东ソ-TSK Gel PW-4000XL，溶剂0.1MNaCl，流速0.8ml/min)分析出的结果、以及本化合物的紫外吸收光谱(0.1Mトリス缓冲液，pH9.0,99μg/ml)分别表示在图14及图15。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1Mトリス缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是6.1％(W/W)。例40:3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DW-8089)的合成Boc-Gly-Gly-Phe-Gly(163mg)以及N-羟基琥珀酰亚胺(45mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(10ml)，在4℃冷却后，加入N,N＇-二环己基碳化二亚胺(79mg)。在此溶液中加入溶解了用下述式

表示的化合物[(1s,9s)-1-氨基-9-乙基-2,3-二氢-9-羟基-1H,12H-苯并[de]吡喃[3＇,4＇:6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮DW-8089]的甲苯磺酸盐(170mg)和三乙基胺(0.054ml)的N,N-二甲基甲酰胺(30ml)溶液，遮光，在室温边搅拌一夜边进行反应。此反应液减压干固，残渣用硅胶柱色谱(洗脱液含有0.5％醋酸的二氯甲烷∶甲醇=94∶6溶液)精制，得到标题化合物(100mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.51(d,1H,J=8.5Hz),8.41(t,1H,J=5.6Hz),8.29(s,1H),8.17(d,1H,J=8.0Hz),8.03(d,1H,J=8.0Hz),7.90(dd,1H,J=4.8,5.6Hz),7.79(t,1H,J=5.6Hz),7.53(d,1H,J=7.2Hz),7.36(s,1H),7.13-7.25(m,5H),6.94-6.95(m,1H),5 60-5.63(m,1H),5.36-5.47(m,2H),5.21-5.30(m,2H),4.42-4.47(m,1H),3.63-3.96(m,3H),3.51-3.59(m,3H),3.31-3.40(m,1H),3.09-3.21(m,1H),3.02(dd,1H,J=4.8,13.5Hz),2.76-2.81(m,1H),2.13-2.17(m,2H),1.85-1.90(m,2H),1.37(s,9H),0.89(t,3H,J=8.0Hz).Mass(FAB)；m/e 822(M+1)例41羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DW-8089)的合成将在例24得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(1.6g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(60ml)。在此溶液中，顺次加入在N,N-二甲基甲酰胺(20ml)中溶解了由例40得到的3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DW-8089)(200mg)经用和例4同样的方法脱Boc化后得到的3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A的三氟醋酸盐和三乙基胺(0.07ml)得到的溶液、及1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(1.6g)，在室温边搅拌一夜边进行反应。此反应液的每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中分别加入3M氯化钠水溶液(2.5ml)、乙醚(25ml)，析出的沉淀经离心分离(2500rpm,8分钟)收集。此沉淀用乙醇洗净后，溶解于水，加入3M氯化钠水溶液(20ml)，用0.1M氢氧化钠水溶液调节至pH9。得到的水溶液用バィオマックス-10膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到标题化合物(1.20g)。本化合物溶解于0.1M氯化钠水溶液，用GPC(柱东ソ-TSK GelPW-4000XL，溶剂0.1MNaCl，流速0.8ml/min)分析出的结果、以及本化合物的紫外吸收光谱(0.1Mトリス缓冲液，pH9.0,0.26mg/ml)分别表示在图16及图17。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1Mトリス缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是5.0％(W/W)。例42羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐的合成将葡聚糖T150(20g，法鲁玛西亚公司制造，分子量150K)溶解于0.1M醋酸缓冲液(pH5.5,2000ml)，加入高碘酸钠(66.0g)的水溶液(2000ml)。边遮光边在4℃下搅拌10天后，加乙二醇(14.0ml)，搅拌一夜。反应液在冰冷下用8M氢氧化钠水溶液调节pH至7.5。加入硼氢化钠(28g)溶解后，在室温搅拌一夜。将反应液冰冷却，用醋酸调节至pH5.5，在4℃搅拌1小时。在冰冷下用8M氢氧化钠水溶液调节pH至7.5。得到的水溶液用バィオマックス-5膜(ミリポァ公司制造)经限外过滤法一直浓缩到500ml，得到溶液1。另外对于葡聚糖T110(20g)进行上述的一连串的操作，得到溶液2。混合溶液1和溶液2，混合溶液的pH调节至3.0，在40℃置于恒温箱4小时后，调节pH至7，得到含有被低分子化的葡聚糖多元醇的溶液。使其通过バィオマックス-30膜，接着用バィオマックス-5膜脱盐后，冷冻干燥，得到葡聚糖多元醇(4.6g)。此物质的分子量(凝胶过滤法，プルラン标准)是17K。
此葡聚糖多元醇(2.5g)加入到在水(75ml)中溶解了氢氧化钠(17.5g)后得到的水溶液中，在室温使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(25g)，使其溶解后，在室温反应20小时。将此反应液用醋酸调节至pH9后，用バィオマックス-5膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液冷冻干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(4.0g)。此物质的分子量(凝胶过滤，プルラン标准)是45K,CM化度是0.9。
这个羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(3.7g)溶解于水，上Bio-RadAG50W-X2(200-400目，H+型)柱，用水洗脱。在此洗脱液中加入三乙基胺(5.8ml)后，进行冷冻干燥，得到标题化合物(4.4g)。例43羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成将在例42得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(4.4g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(300ml)。在此溶液中，顺次加入含有三乙基胺(0.19ml)和3＇-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸盐(580mg)的N,N-二甲基甲酰胺(45ml)溶液、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(4.4g)，遮光，在室温边搅拌一夜边进行反应。将此反应液用lM氢氧化钠水溶液调节至pH10后，每5ml滴入到各25ml的乙醇中。在此液中分别加入3M氯化钠水溶液(1ml)、乙醚(5ml)，析出的沉淀经离心分离(3500rpm,8分钟)收集。此沉淀溶解于水，用透析膜(スペクトラポァ1，透过分子量6,000-8,000)，向纯水透析，透析内液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到标题化合物(3.4g)。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1Mトリス缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是4.6％(W/W)。例44:α-甲基羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成在例42得到的葡聚糖多元醇(2g)，加入到在水(60ml)中溶解了氢氧化钠(14g)后得到的水溶液中，在室温使其溶解。在此溶液内冰冷下加入α-溴代丙酸(19ml)并使其溶解后，在室温下反应18小时。此反应液在冰冷下用醋酸调节至pH8，用バィオマックス-50膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液冷冻干燥后，得到α-甲基羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(2.95g)。此物质的分子量(凝胶过滤法，プルラン标准)是45K。相当于糖残基的α-甲基羧甲基化度，以羧甲基葡聚糖多元醇为标准，由下述的方法求出。将α-甲基羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐的水溶液上Bio-Rad AG50W-X2(H+型)柱，洗脱液冷冻干燥后用作供试品。此供试品溶解于定量过量0.1N氢氧化钠水溶液，以酚酞为指示剂用0.1N盐酸滴定。供试品的取样量为s(mg)、0.1N氢氧化钠水溶液的准确加入量为a(ml)、0.1N盐酸的滴定量为b(ml)，α-甲基羧甲基化度通过式13.4(a-b)/[s-7.2(a-b)]求出。其结果α-甲基羧甲基化度是0.8。
将此α-甲基羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(2.2g)溶解于水，上Bio-Rad AG50W-X2(200-400目，H+型)柱(直径44mm，长210mm)，用水洗脱。在此洗脱液中加入三乙基胺(4ml)后，进行冷冻干燥，得到α-甲基羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(2.69g)。
将这个α-甲基羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(2.68g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(60ml)。在此溶液中，顺次加入在N,N-二甲基甲酰胺(10ml)中溶解了由和例2同样的方法合成出的3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(350mg)经用和例16同样的方法脱Boc化后得到的3＇-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A的三氟醋酸盐和三乙基胺(0.116ml)得到的溶液、及在N,N-二甲基甲酰胺(10ml)中溶解了1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(2.68g)得到的溶液，在室温边搅拌一夜边进行反应。在此反应液中加入3M氯化钠水溶液(40ml)，每6ml滴入到各30ml的乙醇中。在此液中分别加入3M氯化钠水溶液(1ml)、乙醚(5ml)，析出的沉淀经离心分离(3500rpm,8分钟)收集。此沉淀用丙酮洗净后，溶解于水，加入3M氯化钠水溶液(10ml)后，用0.1M氢氧化钠水溶液调节至pH9，在37℃处理1小时。此处理液用バィオマックス-10膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到标题化合物(2.15g)。本化合物溶解于0.1M氯化钠水溶液，用GPC(柱东ソ-TSK Gel PW-4000XL，溶剂0.1MNaCl，流速0.8ml/min)分析出的结果、以及本化合物的紫外吸收光谱(0.1Mトリス缓冲液，pH9.0,0.21mg/ml)分别表示在图18及图19。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1Mトリス缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是5.9％(W/W)。例45:3＇-N-(Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DW-8951)三氟醋酸盐的合成将Phe-Gly-OBzl的p-甲苯磺酸盐(3.06g)、Boc-Gly-OH(1.10g)、N-羟基琥珀酰亚胺(941mg)、N-甲基吗啉(0.725ml)、N,N-二甲基甲酰胺(40ml)的混合物在4℃冷却后，加入N,N＇-二环己基碳化二亚胺(1.56g)。在室温边搅拌一夜边进行反应，反应液减压干固。残渣用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇=98∶2溶液)精制，得到 Boc-Gly-Phe-Gly-OBzl(1.93g)。1H-NMR(DMSO d6)δ:8.52(dd,1H,J=5.6,6.4Hz),7.97(d,1H,J=8.8Hz),7.30-7.39(m,5H),7.15-7.26(m,5H),6.83(t,1H,J=5.6Hz),5.14(s,1H),4.52-4.57(m,1H),3.87-3.96(m,2H),3.57(dd,1H,J=5.6,16.7Hz),3.43(dd,1H,J=5.6,16.7Hz),3.01(dd,1H,J=4.8,14.3Hz),2.77(dd,1H,J=5.6,14.3Hz),1.37(s,9H).
得到的Boc-Gly-Phe-Gly-OBzl(1.78g)溶解于醋酸乙酯(60ml)，在5％-Pd-C(1.8g)存在下，接触还原24小时。滤除催化剂，滤液减压浓缩，得到Boc-Gly-Phe-Gly-OH(1.41g)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.35(t,1H,J=5.6Hz),7.94(d,1H,J=8.8Hz),7.15-7.26(m,5H),6.85(dd,1H,J=5.6,6.4Hz),4.52-4.58(m,1H),3.76(d,2H,J=5.6Hz),3.56(dd,1H,J=6.4,16.7Hz),3.43(dd,1H,J=5.6,16.7Hz),3.03(dd,1H,J=5.0,13.5Hz),2.79(dd,1H,J=9.5,13.5Hz),1.37(s,9H).在上面得到的Boc-Gly-Phe-Gly-OH(500mg)以及N-羟基琥珀酰亚胺(161mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(10ml)。在此溶液中加入溶解了DX-8951的甲磺酸盐(530mg)和三乙基胺(0.146ml)的N,N-二甲基甲酰胺(50ml)溶液，在4℃冷却后，加入N,N＇-二环己基碳化二亚胺(268mg)。遮光下在室温边搅拌一夜边进行反应。反应液减压干固，残渣用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇=96∶4溶液)精制，得到3＇-N-(Boc-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(100mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.39(d,1H,J=8.0Hz),8.34(t,1H,J=5.6Hz),7.98(d,1H,J=7.2Hz),7.78(d,1H,J=10.3Hz),7.33(s,1H),7.13-7.24(m,5H),6.80(dd,1H,J=5.6,6 4Hz),5.55-5.61(m,1H),5.44(d,1H,J=16.0Hz),5.41(d,1H,J=16.0Hz),5.25(s,2H),4.43-4.46(m,1H),3.69-3.79(m,2H),3.50(dd,1H,J=5.6,16.7Hz),3.41(dd,1H,J=5.6,16.7Hz),3.16-3.19(m,2H),2.98(dd,1H,J=4.8,14.3Hz),2.79(dd,1H,J=9.5,14.3Hz),2.41(s,3H),2.19-2.25(m,1H),2.10-2.15(m,1H),1.82-1.90(m,2H),1.35(s,9H),0.88(t,3H,J=8.0Hz).Mass(FAB)；m/e797(M+1)得到的3＇-N-(Boc-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(100mg)溶解于三氟醋酸(3ml)，放置1小时。除去溶剂，依次分别用甲醇(30ml)、乙醇(30ml)各共沸2次后，残渣用乙醚洗净，得到标题化合物(80mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.52-8.62(m,1H),7.94(s,3H),7.79(t,1H,J=11.1Hz),7.34(s,1H),7.15-7.27(m,5H),6.52(s,1H),5.57-5.61(m,1H),5.36-5.46(m,2H),5.24(s,2H),4.66-4.70(m,1H),3.69-3.81(m,2H),3.61-3.68(m,1H),3.40-3.47(m,1H),3.15-3.23(m,1H),3.01(dd,1H,J=4.0,13.5Hz),2.77(dd,1H,J=9.5,13.5Hz),2.12-2.23(m,2H),1.81-1.91(m,2H),0.89(t,3H,J=7.2Hz).Mass(FAB)；m/e697(M+1)例46:3＇-N-(Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)三氟醋酸盐的合成Boc-Phe-Gly(771mg)以及N-羟基琥珀酰亚胺(300mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(10ml)。在此溶液中加入溶解了DX-8951的甲磺酸盐(1058mg)和三乙基胺(0.293ml)的N,N-二甲基甲酰胺(50ml)溶液，在4℃冷却后，加入N,N＇-二环己基碳化二亚胺(494mg)。遮光下在室温边搅拌一夜边进行反应。反应液减压干固，残渣用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇=98∶2溶液)精制，得到3＇-N-(Boc-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(1.20g)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.29(d,1H,J=8.0Hz),8.21(t,1H,J=4.8Hz),7.76(d,1H,J=10.3Hz),7.32(s,1H),7.13-7.25(m,5H),6.92(d,1H,J=7.2Hz),6.49(s,1H),5.56-5.61(m,1H),5.44(d,1H,J=15.9Hz),5.38(d,1H,J=15.9Hz),5.25(s,2H),4.08-4.12(m,1H),3.78(d,1H,J=4.8Hz),3.16-3.25(m,2H),2.99(dd,1H,J=4.0,13.5Hz),2.72(dd,1H,J=10.3,13.5Hz),2.40(s,3H),2.09-2.35(m,2H),1.80-1.91(m,2H),1.16(s,9H),0.88(t,3H,J=8.0Hz).Mass(FAB)；m/e741(M+1)在上面得到的3＇-N-(Boc-Phe-Gly)-NH-A(170mg)溶解于三氟醋酸(4ml)，放置1小时。除去溶剂，依次分别用甲醇(10ml)、乙醇(10ml)各共沸2次后，残渣用乙醚洗净，得到标题化合物(100mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.88(t,1H,J=4.8Hz),8.68(d,1H,J=8.7Hz),8.05-8.15(m,3H),7.79(d,1H,J=11.1Hz),7.26-7.36(m,5H),6.52(d,1H,J=7.2Hz),5.57-5.62(m,1H),5.43(d,1H,J=15.9Hz),5.38(d,1H,J=15.9Hz),5.19-5.28(m,1H),4.10-4.18(m,1H),3.93(dd,1H,J=4.8,16.7Hz),3.82(dd,1H,J=4.8,16.7Hz),3.17-3.24(m,2H),3.14(dd,1H,J=4.8,13.5Hz),2.95(dd,1H,J=8.0,13.5Hz),2.42(s,3H),2.14-2.25(m,2H),1.83-1.91(m,2H),0.89(t,3H,J=8.0Hz).Mass(FAB)；m/e640(M+1)例47:3＇-N-Gly-NH-A(A-NH2=DX-8951)三氟醋酸盐的合成DX-8951的甲烷磺酸盐(530mg)和三乙基胺(0.28ml)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(10ml)，在4℃冷却后，加入Boc-Gly的N-羟基琥珀酰亚胺酯(327mg)。遮光下在室温边搅拌一夜边进行反应。反应液减压干固，残渣用硅胶柱色谱(洗脱液二氯甲烷∶甲醇=98∶2溶液)精制，得到3＇-N-(Boc-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(500mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.38(d,1H,J=8.3Hz),7.77(d,1H,J=10.7Hz),7.31(s,1H),6.89-6.91(m,1H),6.49(s,1H),5.55-5.59(m,1H),5.45(d,1H,J=16.1Hz),5.38(d,1H,J=16.1Hz),5.27(d,1H,J=19.0Hz),5.18(d,1H,J=19.0Hz),3.50-3.62(m,2H),3.15-3.19(m,2H),2.41(s,3H),2.18-2.24(m,1H),2.08-2.12(m,1H),1.81-1.91(m,2H),1.31(s,9H),0.87(t,3H,J=8.0Hz).Mass(FAB)；m/e 593(M+1)在上面得到的3＇-N-(Boc-Gly)-NH-A(100mg)溶解于三氟醋酸(2ml)，放置1小时。除去溶剂，依次分别用甲醇(10ml)、乙醇(10ml)各共沸2次后，残渣用乙醚洗净，得到标题化合物(70mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.88(d,1H,J=8.8Hz),8.08(s,3H),7.81(d,1H,J=11.2Hz),7.34(s,1H),6.52(s,1H),5.63-5.67(m,1H),5.45(d,1H,J=16.7Hz),5.40(d,1H,J=16.7Hz),5.36(d,1H,J=19.1Hz),5.25(d,1H,J=19.1Hz),3.56(s,2H),3.11-3.19(m,2H),2.43(s,3H),2.23-2.28(m,1H),2.11-2.19(m,1H),1.81-1.91(m,2H),0.88(t,3H,J=8.0Hz).Mass(FAB)；m/e 493(M+1)例48羧甲基葡聚糖多元醇的三甲基铵盐的合成将葡聚糖T500(50g，法鲁玛西亚公司制造，分子量500K)溶解于0.1M醋酸缓冲液(pH5.5,5000ml)，加入高碘酸钠(165.0g)的水溶液(5000ml)。边遮光边在4℃下搅拌10天后，加乙二醇(35.0ml)，搅拌一夜。反应液用8M氢氧化钠水溶液调节pH至7。加入氢化硼钠(70g)溶解后，搅拌一夜。将反应液冰冷却，用醋酸调节至pH5.5，在4℃搅拌1小时。用8M氢氧化钠水溶液调节pH至7.5。得到的水溶液用バィオマックス-50膜经限外过滤法进行脱盐。没有通过膜的残留溶液冷冻干燥，得到葡聚糖多元醇(20.2g)。此物质的分子量(凝胶过滤法，プルラン标准)是159K。
此葡聚糖多元醇(7.5g)加入到在水(225ml)中溶解了氢氧化钠(31.5g)后得到的水溶液中，在室温使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(45g)，使其溶解后，在室温反应一夜。将此反应液用醋酸调节至pH8后，用バィオマックス-50膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液冷冻干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(8.5g)。此物质的分子量(凝胶过滤，プルラン标准)是274K，羧甲基化度是0.4。这个羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(2.0g)溶解于水，上Bio-Rad AG50W-X2(200-400目，H+型)柱(直径44mm，长度210mm)，用水洗脱。在此洗脱液中加入三乙基胺(4ml)后，进行冷冻干燥，得到标题化合物(2.2g)。例49羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成将在例48得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(200mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(7ml)。在此溶液中，顺次加入在例45得到的3＇-N-(Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸盐(41mg)的N,N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液、三乙基胺(0.014ml)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(100mg)，在室温边搅拌一夜边进行反应。将此反应液的每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中分别加入3M氯化钠水溶液(2.0ml)、乙醚(25ml)，析出的沉淀经离心分离(3500rpm,8分钟)收集。此沉淀溶解于0.5M食盐水溶液，冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节pH至9。得到的水溶液用バィオマックス-50膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到标题化合物(190mg)。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1Mトリス缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是4.5％(W/W)。例50羧甲基葡聚糖多元醇-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成在例24得到的羧甲基葡聚糖多元醇的钠盐(2.5g)溶解于水，上Bio-Rad AG 50W-X2(200-400目，Et3NH+型)柱，用水洗脱。此洗脱液进行冷冻干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(2.5g)。
将此羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(200mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(12ml)。在此溶液中，顺次加入在例46得到的3＇-N-(Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸盐(42mg)和三乙基胺(0.016ml)的N,N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(200mg)，遮光，在室温边搅拌一夜边进行反应。在此反应液中加入水(300ml)，用超滤膜10K(フィルトロン公司制造)进行超滤。没有通过膜的残留溶液用0.1N氢氧化钠水溶液调节pH至10，使其通过过滤膜(0.16μm,フィルトロン公司制造)。通过后的溶液用バィオマックス-50膜经限外过滤法脱盐，接着用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到标题化合物(180mg)。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1Mトリス缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是6.1％(W/W)。例51羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成将在例48得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基铵盐(370mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(10ml)。在此溶液中，顺次加入在例47得到的3＇-N-Gly-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸盐(57mg)的N,N-二甲基甲酰胺(3ml)溶液、三乙基胺(0.027ml)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(185mg)，在室温边搅拌一夜边进行反应。将此反应液的每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中分别加入3M氯化钠水溶液(2.0ml)、乙醚(25ml)，析出的沉淀经离心分离(3500rpm,8分钟)收集。此沉淀溶解于0.5M食盐水溶液，冰冷下用0.1M氢氧化钠水溶液调节pH至9。得到的水溶液用バィオマックス-50膜经限外过滤法脱盐。没有通过膜的残留溶液用米利波阿过滤器(0.22μm)过滤后，冷冻干燥，得到标题化合物(290mg)。本化合物的医药化合物残基的含量根据在0.1Mトリス缓冲液(pH9.0)中的362nm处的吸收度进行定量时是0.5％(W/W)。例52本发明的药物复合物的抗肿瘤作用按与例11同样的方法作成感染Meth A癌小鼠(1组6只)，对于例15的药物复合物用与例12同样的方法考察其单次给药时的抗肿瘤作用。其结果，例15的药物复合物与例12的医药化合物自身相比，显示出显著增强的抗肿瘤作用效果和有效用量范围的扩大。受试品化合物给药量(mg/kg)1)抑制率(％)例15的化合物 10 1005 992.5 951.25831)医药化合物的换算量例53本发明的药物复合物的抗肿瘤作用将人胃癌SC-6的肿瘤块移植到裸鼠(BALB/c-nu/nu，雄性)的右鼠膝(径)部皮下，制成感染SC-6癌裸鼠(1组5只)。在移植后第24天将溶解于注射用蒸馏水的例15的药物复合物经静脉内单次给药，与医药化合物自身比较抗肿瘤作用。其结果，例15的药物复合物与医药化合物自身相比，没有出现中毒死亡，发挥出了高效的抗肿瘤效果。受试品化合物 给药量(mg/kg) 抑制率(%) 死亡小鼠数/使用小鼠数医药化合物自身 60 982/515 610/5例15的化合物 81)100 0/521)710/51)医药化合物的换算量例54本发明的药物复合物的抗肿瘤作用按与例53同样的方法制成感染人肺癌QG-90癌裸鼠(1组5只)。在移植后第16天将溶解于注射用蒸馏水的例15的药物复合物经静脉内单次给药，与医药化合物自身比较抗肿瘤作用。其结果，例15的药物复合物与医药化合物自身相比，显示出显著增强的抗肿瘤作用效果和有效用量范围的扩大。被测化合物给药量(mg/kg) 抑制率(％)死亡小鼠数/使用小鼠数医药化合物自身 50 60 0/512.5 51 0/5例15的化合物 71)98 0/51.751)97 0/51)医药化合物的换算量例55本发明的药物复合物的抗肿瘤作用按与例11同样的方法制成感染Meth A癌小鼠(1组6只)。用和例12同样的方法，将例41的药物复合物单次给药时的抗肿瘤作用与医药化合物自身进行比较。其结果，例41的药物复合物与医药化合物自身相比，显示出显著增强的抗肿瘤作用效果和有效用量范围的扩大。
被测化合物给药量(mg/kg)抑制率(％)医药化合物自身 100 6450 5625 34例41的化合物 251)9912.51)956.251)813.1251)611)医药化合物的换算量例56本发明的药物复合物的抗肿瘤作用按与例11同样的方法制成感染Meth A癌小鼠(1组6只)。用和例12同样的方法，考察例29、例43以及例44的各药物复合物分别单次给药时的抗肿瘤作用。
其结果，任一的药物复合物均显示出高效的抗肿瘤作用效果和宽广的有效用量范围。
被测化合物给药量(mg/kg)1)抑制率(％)例29的化合物3099209910895 79例43的化合物100 94809240822075例44的化合物100 968094409720751)医药化合物的换算量例57本发明的药物复合物的体内动力学按与例11同样的方法制成感染Meth A癌小鼠，对于例15的药物复合物，用和例12同样的方法单次给药(10mg/Kg医药化合物换算量)，考察药物复合物在各组织内的浓度分布。其结果，例15的药物复合物显示出高的血中滞留性、对肿瘤组织的高度靶向性以及对于肝脏和小肠的高度选择性。结果见图20。
工业应用可能性具有羧基的多糖衍生物同医药化合物或结合了间隔基的医药化合物之间的反应能够以高收率地进行，而且在同具有内酯环的医药化合物等进行反应的时候，因为能够抑制副反应，所以作为药物复合物的制造方法是极其有用的。
权利要求
1．药物复合物的制造方法，是具有羧基的多糖衍生物和医药化合物的残基，通过含有一个氨基酸的间隔基或者肽式键合的含有2～8个氨基酸的间隔基结合起来的药物复合物、或者具有羧基的多糖衍生物同医药化合物的残基不通过导入该间隔基直接结合起来的药物复合物的制造方法，其特征在于，具有羧基的多糖衍生物的有机胺的盐同医药化合物或结合了医药化合物的间隔基在非水系统中进行反应。
2．药物复合物的制造方法，是具有羧基的多糖衍生物和医药化合物的残基，通过含有一个氨基酸的间隔基或者肽式键合的含有2～8个氨基酸的间隔基结合起来的药物复合物、或者具有羧基的多糖衍生物同医药化合物的残基不通过导入该间隔基直接结合起来的药物复合物的制造方法，其包括以下工序(1)将具有羧基的多糖衍生物的碱金属盐转换成有机胺的盐的工序；以及(2)该有机胺的盐同医药化合物或结合了医药化合物的间隔基在非水系统中进行反应的工序。
3．根据权利要求1或2记载的方法，其中具有羧基的多糖衍生物是羧C1-4烷基葡聚糖多元醇。
4．根据权利要求3记载的方法，其特征在于构成羧C1-4烷基葡聚糖多元醇的葡聚糖多元醇，是在实质上可能完全多元醇化的条件下，处理葡聚糖后得到的葡聚糖多元醇。
5．根据权利要求3或4记载的方法，其中羧C1-4烷基葡聚糖多元醇是羧甲基葡聚糖多元醇。
6．根据权利要求1至5的任一项记载的方法，其中医药化合物是抗肿瘤药或者抗炎药。
7．根据权利要求1至5的任一项记载的方法，其中医药化合物是能形成内酯环的医药化合物。
8．根据权利要求1至7的任一项记载的方法，其中在有机胺的盐同医药化合物或结合了医药化合物的间隔基的反应中，使用形成了内酯环的医药化合物或结合了形成内酯环的医药化合物的间隔基。
9．根据权利要求8记载的方法，其中能形成内酯环的权利要求7记载的医药化合物是(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3′,4′:6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮。
10．具有羧基的多糖衍生物的有机胺的盐，用于具有羧基的多糖衍生物和医药化合物的残基，通过含有一个氨基酸的间隔基或者肽式键合的含有2～8个氨基酸的间隔基结合起来的药物复合物、或者具有羧基的多糖衍生物同医药化合物的残基不通过导入该间隔基直接结合起来的药物复合物的制造中。
全文摘要
一种药物复合物的制造方法，是具有羧基的多糖衍生物和医药化合物的残基，通过含有一个氨基酸的间隔基或者肽式键合的含有2～8个氨基酸的间隔基结合起来的药物复合物、或者具有羧基的多糖衍生物同医药化合物的残基不通过导入该间隔基直接结合起来的药物复合物的制造方法，其特征是，具有羧基的多糖衍生物的有机胺的盐同医药化合物或结合了医药化合物的间隔基在非水系统中进行反应。具有羧基的多糖衍生物同结合了间隔基的医药化合物等之间的反应可以获得较高的收率，而且在同具有内酯环的医药化合物等进行反应的时候，可以抑制副反应。
文档编号A61K47/48GK1227500SQ97197115
公开日1999年9月1日 申请日期1997年6月5日 优先权日1996年6月6日
发明者井上和泓, 洲崎浩, 池田政浩 申请人:第一制药株式会社