抗cd23抗体、抗cd23抗体衍生物及其治疗性应用的制作方法

专利名称：抗cd23抗体、抗cd23抗体衍生物及其治疗性应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及可与CD23(FCεRⅡ)Ⅱ型分子结合的抗体，特别是经改变的抗体，以及这些抗体的制品和含有这些抗体的药物组合物及其在治疗中的应用。
CD23(FCεRⅡ)是C-凝集素家族的一种Ⅱ型分子，该家族另外还包括淋巴细胞归巢受体(MEL-14)和内皮白细胞粘着分子(ELAM-1)。CD23是一种IgE低亲和性受体。人体中有多种类型的造血细胞在其表面表达CD23，如小结树突细胞、B细胞、T细胞和巨噬细胞。CD23分子还以可溶形式存在于生物流体中。可溶性CD23(sCD23)分子是由跨膜受体经蛋白水解而形成。CD23具有多种活性，其中包括介导细胞粘着、调节IgE和组胺的释放、使B细胞免于凋亡以及调节骨髓细胞生长。这些功能活性是通过细胞相关的CD23或sCD23的特异配体相结合而介导的，sCD23则以细胞因子样方式发挥作用(Conrad,D.H.,Annu Rev lmmunol 8,623-645 1990)；Delepesse,G.,et al.,Advlmmnnol 49,149-191(1991)；Bonnefoy,J.Y.,et al.,Curr Opinlmmunol 5,944-47(1993)。
在许多炎性疾病中曾观测到CD23表达的增加。在慢性滑膜炎患者的滑膜活检中可鉴定出CD23，而在类风湿性关节炎患者的血清和滑液中可检测到浓度超出正常范围的sCD23(Bansal,A.S.,Oliver,W.,Marsh,M.N.,Pumphrey,R.S.and Wilson,P.B.,免疫学79,285-289(1993)Hellen,E.A.,Rowlands,D.C.,Hansel,T.T.,Kitas,G.D.,and Crocker,J.J.,临床病理学44,293-296(1991)；Chomarat,P.,Brioloay,J.,Banchereau,J.& Miossec,P.,Arthritis Rheum 86,234-242(1993)；Bansal,A.,et al.,Clin Exp Immunol 89,452-455(1992)；Rezonzew,R.&Newkirk,M.N.,Clin lmmunol Immunopathol71,156-163(1994)。此外，类风湿性关节炎患者体内的血清sCD23水平与疾病状况有关,并且和血清类风湿因子相关(Bansal,A.S.,etal.,Clin Exp Rheumatol 12,281-285(1994)。促炎细胞因子似乎在类风湿性关节炎中尤其重要，而TNF-a和IL-1b则被认为在破坏患有关节炎的关节中发挥主要作用(Brennan,F.M.,Chantry,D.,Jackson,A.,Maini,R.,&Feldman,M.,Lancet 2,244-247(1989)Brennan,F.M.,Maini,R.M.,&Feidman,M.,Br J Rheumatol 31,293-298(1992)。
典型的抗体通常含有两条重链和两条轻链，重链间通过二硫键相互连接。两条轻链则各自通过二硫键与相应的重链连接。两条重链的一端各含有一段可变，后面是许多段恒定。两条轻链则是一端为一个可变，另一端为一个恒定。轻链的可变与重链的可变对齐排列。轻链的恒定则与重链的第一个恒定对齐排列。轻链与重链的恒定并不直接参与抗体与抗原的结合。
每个配对的轻链与重链的可变域可形成抗原结合位点。轻链与重链上的结构域具有相同的总体结构，并且每个结构域均含有一种由序列相对保守的四个区域形成的构架，其间由三个互补决定区(CDR)连接。四个构架区大多采取一种β-折叠构象，CDR则形成环以连接β-折叠结构，在某些情况下也可成为β-折叠结构的一部分。构架区使CDR之间紧密靠近，从而使其与其它结构域的CDR一同形成抗原结合位点。抗体CDR和构架区的测定可参考Kabat et al(“免疫学相关蛋白的序列”US Dept.of Health and Human Services,US GovernmentPrinting Office,1987)。
目前，该领域已建立起完善的将啮齿动物抗体的可变区与人类抗体的恒定区相连接以制备改变抗体的方法(Oi and Morrison(1986)生物技术4,214-212)。在EP-A-0239400中公开了一些人源化抗体，其CDR的来源与抗体可变区构架的来源不同。CDR可来源于啮齿类或灵长类单克隆抗体。抗体的可变区构架和恒定区通常来源于人类抗体。与人针对来源于啮齿动物的抗体等完整外源抗体所产生的免疫应答相比，当这些经改变的抗体给药于人类时不应诱导出同等强度的免疫应答。
目前已产生出抗CD23受体(FCεRⅡ)的鼠单克隆抗体(PCT/EP/95/04109)。但这些单克隆抗体并不能够理想地用于人类的治疗，因为当它们被注射到人类患者体内时可能会具有免疫原性和裂解性。此外，能够与CD23受体结合的商品形式的抗体还可识别CD23受体上表达的不同表位；而表位结合特异性对用于特定用途的抗体的效率具有重要的影响。而且，选择对靶受体具有高亲和力的抗体对治疗有利，因为其所需剂量将少于对相同受体的亲和力较低的单克隆抗体的剂量。
本发明提供了一种含有如下所示各CDR氨基酸序列的经改变的抗体，这些氨基酸序列足以使其能够与造血细胞上表达的CD23(FCεRⅡ)Ⅱ型分子结合轻链RSSKSLLY KDGKTYLN CDRL1(SEQ ID NO:3)LMSTRAS.... CDRL2(SEQ ID NO:5)QQLVEYPFT CDRL3(SEQ ID NO:7)重链GYWMS.......CDRH1(SEQ ID NO:9)EIRLKSDNYATHYAESVKG CDRH2(SEQ ID NO:11)FID.............CDRH3(SEQ ID NO:13)本发明还涉及一种抗体，该抗体能够结合与具有上述CDR的抗体相同的表位。CD23分子等抗原上的表位的定位可采用竞争性抑制测定法。举例来说，FACS竞争性分析法包括将表达该分子的细胞用作靶，用一种荧光染料标记测试抗体，并用第二种不同的着色荧光染料标记已知能够与相同抗原结合的第二抗体。如果两种荧光染料均出现，则两种抗体相互之间不产生竞争性抑制，并认为它们识别的是靶分子上不同的表位。表位作图也可采用肽文库直接结合测定法，该方法是在大头针上表达靶抗原的肽序列，并用上述经荧光染料标记的抗体进行筛选。在表位作图研究中，已证实具有上述CDR的抗体确定了CD23分子上的新表位。因此，本发明提供了一种可对具有上述CDR序列的抗体与造血细胞上表达的CD23(FCεRⅡ)Ⅱ型分子的结合产生竞争性抑制的抗体。
优选对本发明的抗体进行改造，它可以是含有如

图1和2所述的鼠抗体C11重链和轻链可变序列(SEQ ID NO:1和2及SEQ ID NO:46、47、50和51)以及人类恒定区的嵌合抗体，该抗体所含重链及轻链可变序列足以使其能够与CD23分子结合。该抗体也可以是如WO 86/01533所述含有一种抗原结合区和一种非免疫球蛋白区的嵌合抗体。抗原结合区即抗体的轻链可变域和/或重链可变域。典型的嵌合抗体则同时含有轻链和重链可变域。非-免疫球蛋白区-5抗原结合区的C-末端融合。非免疫球蛋白区则一般是一种非免疫球蛋白，但也可以是一种酶区，该酶区可来源于一种已知具有结合特异性的蛋白，或来源于一种蛋白毒素，事实上可来源于任何由基因表达的蛋白。非免疫球蛋白区也可以是糖区。嵌合抗体的两个区可通过一种可裂解的接头序列相连。经改变的抗体也可以是一种双特异性抗体。
经改变的抗体可以是一种人源化抗体，其中的人类构架可含有各CDR氨基酸序列的一种或多种，这些氨基酸序列(如果需要，也可包括构架残基)足以使其能够与CD23分子结合。
本发明所述抗体的CDR以轻链为上述CDR L1-L3，重链为上述CDRH1-H3为宜。不过这些CDR的氨基酸序列可有所改变。各CDR的氨基酸序列可通过氨基酸取代、插入和/或缺失而改变。
因此，每种CDR可含有1或2个氨基酸取代、插入和/或缺失。轻链CDRL3或重链CDRH3中的氨基酸取代、插入和/或缺失可达3个。轻链CDRL1上出现的氨基酸取代、插入和/或缺失可达4个。重链CDRH2上出现的氨基酸取代、插入和/或缺失可达6个。优选的是各CDR的氨基酸序列基本与上文所述各CDR的氨基酸序列同源。
优选地，序列同一性程度应至少为50％，更优选至少为75％。最优选，序列同一性应至少为90％或95％。
但技术人员认为高度的序列同一性并非必要，因为在基本不改变蛋白质的某些性质或不对其产生负面影响的情况下常有多种氨基酸可被具有类似性质的其它氨基酸所取代。这有时被称为“保守”氨基酸改变。因此，甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸通常可相互取代。通常能够相互取代的其它氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)以及半胱氨酸和蛋氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。因此，术语“衍生物”还可包括一种变体，其氨基酸序列含有一个或多个这种相对于所述序列而言的“保守”氨基酸改变。
优选的抗体构架及恒定域为人类构架和人类恒定域。优选，抗体重链的可变区构架与人KOL蛋白的相应构架基本同源(Schmidt et al,Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.,364 713-747,1983)。相对于KOL构架的同源性一般为80％或更高，如90％或更高或95％或更高。此外，KOL中构架4的第7位残基以Thr或Leu为宜，优选的为Leu。根据Kabat et al,1987，该残基为KOL的第109位残基。多种氨基酸取代、插入和/或缺失均可出现。例如鼠抗体第49、66、76、77和94位中的一个或多个残基可改变为等价的残基。其它能够使结合恢复的候选构架改变包括第27、30、48、67、71、91和93位氨基酸残基。氨基酸编号均依据上述的Kabat et al。
抗体轻链的可变区构架通常与蛋白HSIGKVII(EMBL数据库Klobeck,H.G.,1986年4月7日提交至EMBL数据文库)的可变域构架基本同源。该序列的第452位存在一个移码。因而第452位碱基(T)缺失可纠正读码框。
构架相对于选定序列的同源性一般为80％或更高，如90％或更高或95％或更高。多种氨基酸取代、插入和/或缺失均可出现。如根据Kabatet al的编号为第64位和/或第71位的氨基酸残基。
本发明还提供一种抗体，该抗体含有如图3和4所示的重链和轻链可变序列(SEQ ID NO:17和18)。
优选该抗体具有天然抗体或其片段的结构。因而该抗体可包含完整抗体、(Fab’)2片段、Fab片段、轻链二聚体或重链二聚体。该抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4等IgG；或IgM、IgA、IgE或IgD或其经修饰的变体。抗体重链的恒定域也可据此加以选择。轻链恒定域可以是κ(Kappa)或λ(lambda)恒定域。
恒定区的选择则依据所需的功能性。一般而言，IgG1可通过与补体结合而显示出溶解能力，并且可介导ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)。若需要一种非细胞毒性封闭抗体，则优选IgG4。但IgG4抗体在生产中不稳定，因而更优选的通常是对更加稳定的IgG1进行改进。建议按EP0307434所述进行改进，优选的修改包括对第235和237位进行改进。因此，本发明提供一种溶解性或非溶解性抗体。
抗体的每条链可通过CDR替换加以制备。人类抗体轻链或重链的可变区CDR可被抗CD23抗体的各CDR取代，其氨基酸序列需足以使该抗体能够与CD23分子结合。人类抗体链超变区编码DNA中的CDR编码区可用编码所需CDR的DNA替代。也可在适当情况下将这种改变的DNA与抗体链恒定域编码DNA相连接。将DNA克隆到表达载体中。再把表达载体引入相容宿主细胞，并在能够使抗体链表达的条件下培养细胞。然后装配以该方式共表达的互补抗体链，以形成人源抗体。
将单克隆抗体人源化一般需四个步骤。即(1)测定起始抗体的轻链及重链可变域的核苷酸序列并预测其氨基酸序列；(2)设计人源化抗体，即决定人源化过程中使用何种抗体构架区；(3)实施真正的人源化方法/技术；以及(4)人源化抗体的转染和表达。
因此，本发明提供一种编码抗体链的DNA序列，该序列可含有以下序列中的一种或多种图3中第70-117位的CDRL1碱基对(SEQ ID NO::4)图3中第163-183位的CDRL2碱基对 (SEQ ID NO::6)图3中第280-306位的CDRL3碱基对 (SEQ ID NO::8)图4中第91-105位的CDRH1碱基对(SEQ ID NO::10)图4中第148-204位的CDRH2碱基对 (SEQ ID NO::12)图4中第301-309位的CDRH3碱基对 (SEQ ID NO::14)或含有图3或4所示序列(SEQ ID NO::17或18和SEQ ID NO:48和49)中的一种或两种。
步骤1测定抗体轻链及重链可变域的核苷酸序列并预测氨基酸序列使抗体人源化只需了解抗体重链及轻链可变域的氨基酸序列。恒定域的序列则无关紧要，因为它们对重构策略并不起作用。测定抗体可变域氨基酸序列的最简单方法是由编码该重链和轻链可变域的克隆cDNA加以测定。
将特定抗体的重链和轻链可变域cDNA进行克隆的方法通常有两种(1)通过传统的cDNA文库，或(2)通过聚合酶链反应(PCR)。这两种方法均为人们所普遍了解。若给定cDNA的核苷酸序列，则能够非常简单地将这些信息翻译成抗体可变域的预测氨基酸序列。在本发明中，啮齿类C11抗体链的核苷酸序列和预测氨基酸序列显示于图1和2(SEQ ID NO::1(重链)和2(轻链)及SEQ ID NO:46和47)。
步骤2设计人源化抗体在决定人源化过程中使用何种人类抗体序列时有若干因素需要考虑。轻链与重链的人源化可相互独立，但其推理基本相似。
该选择过程基于以下基本原理特定抗体的抗原特异性和亲和力主要由可变区CDR的氨基酸序列决定。可变域构架残基作用甚小或无直接作用构架区的主要功能是保持CDR的固有空间定向以识别抗原。因此，若人类可变域构架与啮齿类可变域高度同源，则把来源于该可变域的啮齿类CDR替换到该人类可变域构架中最有可能保持其正确的空间定向。因此，优选的是选择与啮齿类可变域高度同源的人类可变域。
适当人类抗体可变域序列的选择可采用以下方法1．利用计算机程序在所有可获得的蛋白质(和DNA)数据库中搜索与啮齿类抗体可变域的同源性最高的那些人类抗体可变域序列。适当的程序将输出一份列表，其中包括与啮齿类抗体的同源性最高的序列、各序列的同源性百分率以及各序列与啮齿类序列的排列对比。对重链和轻链可变域序列的搜索可独立进行。如果仅包括人类免疫球蛋白序列，则上述分析更容易实现。
2．列出人类抗体可变域序列并进行同源性比较。该比较主要针对CDR的长度，高度可变的重链CDR3则不包括在内。将人类重链及κ(kappa)和λ(lambda)轻链分为亚组；重链分为3个亚组，κ链分为4个亚组，λ链分为6个亚组。各亚组内的CDR大小相似，但各亚组间有所不同。通常从人类亚组中可找到一组与啮齿类抗体CDR的同源性最为接近。然后将带有类似长度CDR的抗体进行氨基酸序列同源性比较，尤其是CDR内的氨基酸序列，另外还包括构架区周围的氨基酸序列。选择同源性最高的人类可变域作为人源化的构架。
步骤3实施真正的人源化方法/技术抗体人源化可根据EP-A-0239400，将所需CDR移植到人类构架上。因此，可先由希望重构其CDR的人类DNA开始，制备出编码所需重构抗体的DNA序列。再将含有所需CDR的啮齿类可变域氨基酸序列与选定的人类抗体可变域序列进行比较。在人类可变域中标记出需要被替换为啮齿类相应残基以使人类可变区能够结合啮齿类CDR的残基。人类序列中可能还有些残基还需要进行取代、添加或缺失。
合成寡核苷酸，该寡核苷酸可用来诱变人类可变域构架，以使其包含所需残基。这些寡核苷酸的大小可视情况而定，方便即可。其长度限制通常只由个人使用的特定合成仪的能力来决定。利用寡核苷酸进行体外定向诱变的方法已众所周知。
作为选择，也可利用WO92/07075的重组聚合酶链反应(PCR)方法来实现人源化。该方法是将CDR剪接到人类抗体的构架区之间。
一般而言，WO92/07075的技术可通过使用一种模板来实现，该模板含有AB和CD两种人类构架区，两种构架区之间的CDR则被供体CDR所替代。引物A和引物B用来扩增构架区AB，引物C和引物D用来扩增构架区CD。而引物B和引物C也可在其5’端各含有一段相当于供体CDR的全部序列或至少其一部分的额外序列。引物B和引物C有部分重叠，重叠的长度需足以使其5’端能够在实施PCR的条件下彼此退火。因此，扩增的AB区和CD区可通过重叠的延伸而发生基因剪接，以在单次反应中产生人源化产物。
步骤4重构抗体的转染和表达在重构抗体的诱变反应之后，可将诱变的DNA与编码轻链或重链恒定区的适当DNA相连接，然后克隆到表达载体内，并转染到宿主细胞中，优选的宿主细胞为哺乳动物细胞。这些步骤可通过常规方式加以实施。因此，重构抗体的制备方法包括(a)制备可复制的第一表达载体，该载体含有一种经操作能与DNA序列相连接的适当启动子，该DNA序列至少编码一种Ig重链或轻链可变域，该可变域含有来源于人类抗体的构架区和本发明所述人源化抗体所必需的CDR；(b)制备可复制的第二表达载体，该载体含有一种经操作能与DNA序列相连接的适当启动子，该DNA序列至少编码各互补Ig轻链或重链的可变域；(c)用制备的第一载体或两种载体一同转化细胞系；以及(d)培养所述转化细胞系，以产生所述的经改变抗体。
优选步骤(a)中的DNA序列可编码人类抗体链的可变域和/或各恒定域。人源化抗体可被回收并纯化。用来产生经改变抗体的转化细胞系可以是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系或无限增殖的哺乳动物细胞系，以淋巴来源的细胞系为宜，如骨髓瘤、杂交瘤、子宫瘤或细胞杂交瘤等细胞系。细胞系中也可包含经Epstein-Barr病毒等病毒转化而无限增殖的正常淋巴细胞，如B细胞。最优选的无限增殖细胞系为骨髓瘤细胞系或其衍生物。所选表达系统为WO87/04462中描述的谷氨酰胺合酶表达系统。
尽管用来产生人源化抗体的优选细胞系为哺乳动物细胞系，但作为选择，也可使用任何其它适当的细胞系，如细菌细胞系或酵母细胞系。对单个抗体链而言，可考虑使用来源于细菌菌株的大肠杆菌。将所得抗体进行功能性检测。若功能丧失，则必须返回步骤(2)并对抗体的构架进行修改。
因此，本发明提供一种含有编码本发明所述抗体并适于表达该抗体的DNA的表达载体和由该表达载体转化的宿主细胞。
一旦本发明所述完整抗体、其二聚体、单个轻链和重链，或其它免疫球蛋白形式被表达出来，即可利用该领域的标准方法加以纯化，如硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等(一般可参考Scopes,R.,蛋白质纯化Springer-Verlag,N.Y.(1982))。优选而言，基本纯净的免疫球蛋白应至少具有约90-95％的同质性，最优选的则为药用的98-99％或更高的同质性。一旦抗体被纯化、部分纯化或达到所需同质性，即可将其用于治疗或开发、进行测定或免疫荧光染色等(一般可参考免疫学方法，第Ⅰ和第Ⅱ卷，Lefkovits and Pernis,eds.,Academic Press,New York,N.Y.(1970 and 1981))。
该抗体可通过阻断结合在膜上的CD23与能够和其结合的配体之间的相互作用而发挥作用。对这种阻断作用的研究可采用体外测定法，如放射免疫测定法。该抗体也可通过与可溶性CD23结合而发挥作用。已知结合在膜上的CD23可从细胞表面上裂解而形成许多可溶性片段。这些片段与细胞因子的作用相似，并且在IgE的形成中具有重要作用。因此，在疾病中会表现出可溶性CD23的水平过高。本发明所述抗体可通过与这些片段结合而干扰可溶性CD23调节其作用的能力。本发明所述抗体还可阻止与膜结合的受体的裂解，从而防止可溶性CD23的产生。因此，本发明提供了抗CD23抗体在用于制备阻断可溶性CD23形成的药物中的应用。
所有抗体调节其作用的能力均与其对靶抗原的亲和力相关。本发明所述抗体对CD23受体具有很高的亲和力。优选地，这些抗体的亲和常数均大于1×109Ka Mol-1更优选的则大于1×1010Ka Mol-1。因此，本发明提供能够与CD23受体或可溶性CD23结合并且特征为亲和常数等于或大于1×109Ka Mol-1的抗体。
能够结合CD23受体的抗体可在炎性疾病或自身免疫疾病的治疗或预防中于体内使用。这具有非常重大的意义，因为尽管长期以来始终对这些疾病的根本原因进行研究，但事实是这些疾病中仍有许多很难或根本无法进行有效地治疗。对关节炎而言尤其如此，该疾病通常感染中年人，并使他们不得不过早地放弃工作。对关节炎进行有效地治疗是许多研究小组由来已久的目标。
本发明所述抗体被认为可有效应用于某些疾病的治疗或预防，其中包括关节炎、红斑狼疮、桥本甲状腺炎、多发性硬化、糖尿病、色素层炎、皮炎、牛皮癣、荨麻疹、肾病综合症、肾小球肾炎、炎性肠病、溃疡性结肠炎、Crohn病、Sjogren综合症、过敏症、哮喘，更具体地为过敏性或内源性哮喘、急性哮喘加重、鼻炎、湿疹、GVH、COPD、胰岛素炎、支气管炎(特别是慢性支气管炎)或糖尿病(特别是Ⅰ型糖尿病)。
因此，本发明提供了本发明所述抗体在用于制备治疗任何一种或多种上述病症的药物中的应用。本发明还提供一种用于治疗一种或多种上述病症的方法，该方法包括将治疗有效剂量的本发明所述抗体进行给药。
本发明所述抗体也可有效应用于CD23与各种配体间相互作用的研究，如CD23与CD21之间、CD23与CD11b之间、CD23与CD11c之间、CD23与80-85KDa内皮细胞蛋白(可以是80KDa或85KDa的内皮细胞蛋白)之间，或CD23与115KDa蛋白(被认为与80-85KDa内皮蛋白有关)之间。上述相互作用中的一种或多种被认为可在体内发生。特别优选的是能够阻断这些相互作用的抗体或其它结合剂，因为它们被认为特别适于降低或缓和细胞因子介导的炎性效应。它们可在对抗慢性淋巴细胞白血病等B细胞恶性瘤以及毛细胞白血病中发挥作用。
另一种抗CD23疗法的作用机制也可能涉及对IgE免疫应答的阻断。
本发明所述抗体也可特别有效地应用于过敏性疾病的治疗和预防，其中包括非IgE介导的疾病。它们可应用于溃疡性结肠炎的治疗和预防，也可应用于节段性肠炎的治疗和预防。
本发明所述抗体可单独使用，或与免疫抑制剂结合使用，如甾类、环孢菌素，或抗淋巴细胞抗体等抗体，或更优选的是与耐受性诱导剂、抗自身免疫制剂或抗炎症剂结合使用，如抗CD4抗体(优选的为阻断抗体或非耗损型抗体)等CD4+T细胞抑制剂、抗CD8抗体、抗TNF抗体等TNF拮抗剂，或可溶性TNF受体等TNF抑制剂，或NSAIDs等其它制剂。
本发明所述物质的适当剂量各不相同，这取决于要治疗的疾病或病症、给药途径以及要治疗的个体的年龄和重量等因素。在不受任何特定剂量约束的情况下，例如就肠胃外给药而言，适于对典型成年人进行治疗的本发明所述抗体的日剂量为0.01-20mg/kg(通常如上所示作为药物组合物的成分提供)。更适当的剂量可为0.1-5mg/kg，如0.1-2mg/kg。适当的一单位剂量可为1-400mg。
该抗体也可作为独立给药成分与化学治疗剂或免疫抑制剂协同使用。这些制剂通常包括环孢菌素A或嘌呤类似物(如氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤等)，而其它该领域技术人员所熟知的多种制剂(如环磷酰胺、强的松等)也可使用。
如果需要将能够被抗体结合的细胞裂解，可将本发明所述抗体作为免疫毒素的一部分。免疫毒素可特别有效地用于杀死体外或体内的选定细胞，其特征在于具有两种组分。一种组分为细胞毒性剂，当它附着于细胞或被细胞吸收时通常会对细胞产生致死作用。第二种组分被称为“输送载体”，它提供一种将毒性剂输送到特定类型细胞，如含有癌的细胞的工具。两种组分通常是化学结合在一起的，这可由多种已知的化学方法来实现。举例来说，若细胞毒性剂是一种蛋白质而第二组分为完整的免疫球蛋白，则可利用异双功能交联剂，如SPDP、碳化二亚胺、戊二醛等加以连接。该领域已熟知多种免疫毒素的产生方法，这些方法可在，例如，“单克隆抗体-毒素结合极佳的定向子弹”，Thorpe et al,临床医学中的单克隆抗体，Academic Press,pp.168-190(1982)中找到。
有多种细胞毒性剂适合于在免疫毒素中使用。细胞毒性剂可包括放射性核素，如碘-131、钇-90、铼-188和铋-212；多种化学治疗药物，如去乙酰长春酰胺、氨甲蝶呤、阿霉素和顺铂；以及细胞毒性蛋白，如核糖体抑制蛋白质样美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、蓖麻毒蛋白、白喉毒素、蓖麻毒蛋白A链等，或磷脂酶(如磷脂酶C)等能够对细胞表面起作用的制剂。一般可参考“嵌合毒素”，Olsnes andPhil,Pharmac.Ther.,25:335-381(1982)及“用于癌症检测及治疗的单克隆抗体”，eds.Baldwin and Byers,pp.159-179,224-266,Academic Press(1985)。
免疫毒素的输送组分为本发明所述抗体。优选使用完整的免疫球蛋白或其结合片段，如Fab。免疫毒素中的抗体通常为人类IgA、IgM或IgG的同种型，但如果需要，也可使用其它的哺乳动物恒定区。
本发明进一步提供一种药物组合物，该组合物含有一种药学可接受的载体或稀释剂，并将本发明所述抗体作为其活性成分。该组合物可含有本发明所述免疫毒素。本发明的抗体、免疫毒素和其药物组合物可特别有效地用于肠胃外给药，即皮下、肌内或静脉内给药。
用于肠胃外给药的组合物通常包含一种该抗体的溶液或其溶解于可接受的载体，优选为水性载体中的合剂。有多种水性载体可供使用，如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液均经过灭菌，并且通常不含有颗粒物质。这些组合物可通过众所周知的传统灭菌技术加以灭菌。这些组合物可根据适当生理条件的需要而含有pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等药学可接受的辅助物，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。抗体在这些制剂中的浓度可有很大不同，例如重量比从低于约0.5％，通常为或至少约为1％，到多至15％或20％，其选择主要根据流体的体积、粘度等，以及所选的特定给药方式。
因此，用于肌内注射的典型药物组合物可被配制成含有1ml无菌缓冲水和50mg抗体。用于静脉内输注的典型组合物可被配制成含有250ml无菌Ringer液和150mg抗体。用于制备肠胃外给药组合物的实际方法已为该领域技术人员所了解，或对他们而言是显而易见的，并例如，Remington’s Pharmaceutical Science,15thed.,MackPublishing Company,Easton,Pennsylvania(1980)中有更详细的描述。
本发明的抗体可被冻干以便储存，并在使用前重构于适当载体中。该技术已显示出可有效应用于传统的免疫球蛋白。任何适当的冻干技术和重构技术均可采用。该领域的技术人员都将承认，冻干并重构会导致抗体活性有不同程度的损失(例如对传统的免疫球蛋白而言，IgM抗体的活性损失往往高于IgG抗体)，因而需调整使用量以对此进行补偿。
在治疗医师选定剂量水平和方式的情况下，可将该组合物进行单次或多次给药。在任何情况下，药用制剂提供的本发明所述抗体的量均应足以对患者进行有效的治疗。
本发明所述抗体在体外可进一步具有广泛的实用性。举例来说，典型的抗体可用于T细胞分型、带有特定CD23抗原的细胞或受体片段的分离，或疫苗制备等。
用于诊断的抗体可以是标记抗体或未标记抗体。未标记抗体可与能够同人源化抗体反应的其它标记抗体(第二抗体)结合使用，如对人类免疫球蛋白恒定区具有特异性的抗体。作为选择，也可直接将抗体标记。有多种标记可以采用，如放射性核素、荧光染料、酶、酶底物、酶辅助因子、酶抑制剂、配体(特别是半抗原)等。有多种免疫测定方法可以采用，这些方法均为该领域技术人员所熟知。
也可提供试剂盒，用于在细胞活性预防或检测中与受试者的抗体一同使用，或用于检测选定抗原的存在情况。因此，本发明的抗体通常以冻干形式置于容器中，它可单独提供，或与对所需类型的细胞具有特异性的附加抗体一同提供。试剂盒中的抗体可以与一种标记或毒素结合，也可不结合，试剂盒中还可包含缓冲液，如Tris、磷酸盐、碳酸盐等，和稳定剂、杀生物剂、诸如血清白蛋白等的惰性蛋白，等等，以及一套使用说明书。这些物质的提供量通常少于活性抗体重量的约5％，而根据抗体的浓度，这些物质的总提供量通常至少约为重量的0.001％。为了稀释活性成分，往往需要含有一种惰性增充剂或赋形剂，其中赋形剂的提供量可约为总组合物重量的1-99％。若在测定中需使用一种能够与嵌合抗体结合的第二抗体，则该第二抗体通常置于单独的小瓶中提供。该第二抗体通常与一种标记结合，并且其配制方式类似于上述的抗体制剂。
附1显示鼠C11重链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列。
图2显示鼠C11轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列。
图3显示人源化抗CD23抗体的重链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列。
图4显示人源化抗CD23抗体的轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列。
图5显示嵌合CD23 IgG1m的50％最大结合值。
图6显示人源化CD23 IgG1m的50％最大结合值。
以下实施例对本发明加以说明鼠抗CD23单克隆抗体C11的克隆与测序一般方法如果不另加说明，则均采用以下标准方法和条件。厂商推荐的方法中可适用的地方均被采用。限制性消化及其它常规的分子生物学方法基本上是按照Maniatis et al(“分子克隆-实验室手册”第二版，冷泉港出版社)所述加以实施。
PCR的实施使用一种可编程热循环仪(Trio；Biometra)。典型的100μl反应物中含有溶解在厂商提供的缓冲液中的2.5单位AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer-Cetus)；dATP、dCTP、dGTP、dTTP各250μM；扩增引物1μM，以及模板DNA。如果不另加说明，则均采用以下循环说明步骤095℃5分钟步骤195℃1分钟步骤250℃1分钟，以0.4℃/s的速度进入步骤3步骤372℃1分钟，返回步骤1，重复30次循环步骤472℃5分钟DNA测序的实施采用双脱氧终止法，并使用测序酶v2系统(USB,Cambridge,UK)或荧光染料终止系统(ABI)。
DNA的凝胶纯化是通过低熔点琼脂糖凝胶(NuSieve GTG,FMC,Rockland,ME)上的反应分离而得以实现。在紫外光下切下选定的片段，并利用Wizard PCR Preps试剂盒(Promega,Southampton,UK)回收DNA。
抗体链上氨基酸残基的编号采用Kabat et al(“免疫学相关蛋白的序列”US Dept.of Health and Human Services,US GovernmentPrinting Office,1991)的方案。
由C11杂交瘤制备cDNA从C11细胞的生长培养物中提取RNA。将含有1.3×107个细胞的培养物离心，并收集细胞沉淀和上清液进行分析。通过免疫学方法(ISO1试剂盒；Sigma,Poole,UK)测试上清液中各种同种型鼠免疫球蛋白的存在情况，发现C11单克隆抗体为IgG1同种型。
通过连续使用总RNA分离试剂盒(Stratagene,Cambridge,UK)(产生总RNA)和mRNA纯化试剂盒(Dynal,Oslo,Norway)从细胞沉淀中分离出信使RNA。然后利用Superscript PreamplificationSystem(BRL,Paisley,Scotland,UK)将mRNA和总RNA中的一部分转变为单链cDNA。将所得cDNA的等分试样用于PCR，以单独扩增出C11免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区。
C11重链可变区的克隆与测序利用Bendig and Jones(Bio/Technology 9:88-89)的变化方法克隆重链，其中，为了扩增整个可变区而在PCR中使用了12对重链信使RNA中的信号肽区具有特异性的正向引物和1对小鼠γ1恒定区具有特异性的反向引物。PCR则单独进行了12次，每次将一种正向引物与γ1反向引物结合使用，而不是在单次反应中加入所有12种正向引物。这些反应采用的退火温度均为42.5℃(上述方案中的步骤2)。
在琼脂糖凝胶上分析各反应样品，仅在使用MHV11正向引物的反应中发现了预定大小的一条带。根据该结果，利用MHV11和γ1反向引物进行了两次PCR，其使用的cDNA分别来自mRNA和总RNA。两次独立的PCR可作为克隆材料的来源，其使用的是该领域熟知的普通设备，以避免Taq聚合酶造成核苷酸错误掺入而导致序列出错。
用XmaⅠ和SalⅠ消化所得的PCR片段，凝胶纯化，然后将其克隆到pUC18中。将各PCR的多个克隆的插入片段测序，发现其序列相同，这表明序列中不含有由PCR方法引入的错误。可变区的完整序列显示于图1(SEQ ID NO:1)，该序列与Kabat的ⅢC组重链共有序列非常吻合。
C11轻链可变区的克隆与测序用类似方法将C11轻链可变区克隆，使用的一套引物为11种对轻链信息的信号肽区具有特异性的正向引物和1种对小鼠κ恒定区具有特异性的反向引物(Bendig and Jones,前引书)。此外，由于我们此前测定出该组引物不能够有效地扩增所有的小鼠κ轻链，因此我们加入了另一种引物(序列5’ACTAGTCGACATGAAGTTTCCTTCTCAACTTCTGCTC3’)，文中称为MKV12(SEQ ID NO:41)。如上所述单独进行PCR，每次使用一种正向引物和κ恒定区反向引物，并通过琼脂糖凝胶电泳分析结果。
有三个反应产生了预定大小的产物。用SalⅠ和XmaⅠ将其分别消化，然后纯化，并克隆到pUC18中，所得克隆分别称为VKI、VKJ和VKK。将其进行部分测序以确定同一性。VKI克隆的部分测序结果显示出与来源于MOPC21骨髓瘤的轻链的已知序列相同，该序列在CDR3中存在移码(Genbank M35669)，因此放弃VKI。包括CDR3在内的VKK克隆部分测序结果显示出与经过多产重排的MOPC21轻链(Genbank J00560,J00552)相同。该结果本身不能排除VKK克隆来源于正确C11轻链的可能性，因为两种轻链均可参与种系构型中的CDR3，但杂交瘤的骨髓瘤父本已知为MOPC21来源，并且已鉴定出另一种与MOPC21相关的序列(VKI克隆)，因此认为VKK克隆不大可能是正确的克隆。
VKJ克隆被认为最有可能代表了真正的C11轻链可变区，因为其部分测序结果与Genbank中的任何序列均不相同。对VKJ进行完全测序，发现它是一个具有全部功能的轻链序列，不存在移码，它最有可能使用了VK167或VK24基因，因而归类为非典型的KabatⅡ组序列。VKJ克隆的完整序列显示于图2(SEQ ID NO:2)。另外还利用产生VKJ克隆的一对引物进行了独立的第二次PCR，并如上所述将克隆的产物测序，以排除VKJ序列含有PCR错误的可能性。由第二次扩增得到的克隆具有与最初的VKJ克隆相同的序列。
利用上述VK和VH构建出嵌合抗体，由此获得了VKJ含有C11轻链可变区的明确证据。该抗体显示出可结合CD23。
嵌合抗体的设计为了证明被克隆和测序的是正确的重链与轻链可变区而构建了嵌合抗CD23抗体。扩增重链可变区使用的是来源于cDNA文库的克隆。正向引物含有5’克隆位点(HindⅢ)、5’非翻译序列，其中包括一段功能性Kozac信号，还含有鼠重链可变区的前6个密码子。反向引物则经过设计，在构架4中加入了SpeⅠ位点，并以正确的读码框融合到人γ1恒定区中。利用这些引物产生了一种430个碱基对的产物。
重链抗CD23嵌合体PCR寡核苷酸5’gAT gAA gCT TTA CAg TTA CTC AgC ACA CAg gAC CTC ACC ATg gATTTT ggg CTg ATT 3’ SEQ ID 195’gAT ggA CTA gTg TCC CTT ggC CCC A3’SEQ ID 20为了产生嵌合轻链而构建了用于扩增抗CD23轻链可变区的引物，该引物含有5’克隆位点(HindⅢ)、5’非翻译序列，其中包括一段功能性Kozac信号，还含有鼠轻链可变区的前6个密码子。反向引物则含有一个BsiW1位点和用于指定氨基酸的反密码子。冗余密码子采用标准方案Y=T或C；K=T或G；V=A、G或C。获得的产物为420个碱基对。
轻链抗CD23嵌合体PCR寡核苷酸5’gAT gAA gCT TTA CAg TTA CTC AgC ACA CAg gAC CTC ACC ATg AggTTC TCT gTT CAg 3’ SEQ ID 215’gAT gCg TAC gTY TKA TYT CCA VCT TKG T3’SEQ ID 22(and SEQ IDNOS 42至45和52和53)TRKIELKTR V纯化重链PCR产物，并用HindⅢ和SpeⅠ酶切，然后克隆后经HindⅢ和SpeⅠ酶切的pUC载体中，其中包含一段人类γ1恒定区。使用的人类恒定区为Reichmann L et al(1988)自然322,323-327中描述的IgG1重链，其cDNA序列则如Page,M.J.and Sydenham,M.A.(1991)Biotechnology 9,64-68以及Crowe J.S.et al ClinicalExp Immunol(1992)87-105所述。
用HindⅢ和EcoRⅠ从pUC载体中切出可变区和恒定区，并将其克隆到pEE6表达载体的HindⅢ-EcoRⅠ位点中，该载体来自Celltech(Stephens & Cockett and Nucl.Acids.Res.(1989),17,7110)。
对重链嵌合体测序后，发现其5’端序列丢失了100个碱基对。在检查鼠重链可变序列时发现了一个内部HindⅢ位点。为了在PGR产物中产生完整的重链可变序列，用HindⅢ消化PCR产物并将100个碱基对的小片段克隆到经HindⅢ消化的pEE6中，其中含有嵌合抗CD23重链。
纯化轻链PCR产物，然后用HindⅢ和BsiW1酶切，再连接到含有人类κ恒定区的pUC载体中。使用的人类κ恒定区在Reichmann et al自然1988(见上文)中有所描述。用HindⅢ和EcoRⅠ从pUC载体中切出轻链可变区和恒定区。将该片段克隆到pEE12表达载体的HindⅢ-EcoRⅠ位点中，该载体来自Celltech(Bebbington andHentschel,DNA克隆，第3卷，第8章，IRL PRESS 1987)。
以BglⅡ-SalⅠ盒的形式分离出嵌合重链，并将其插入到pEE12轻链质粒的BamHⅠ-SalⅠ位点，使轻链和重链基因处在同一质粒中。
在COS细胞(保猴肾细胞)中瞬时表达含有嵌合CD23的最终表达质粒，方法如下。根据厂商的推荐方案将Transfectam(Promega)重构为1mg/ml。转染前一天在6孔板(Costar)中每孔铺上总体积为2.5ml的培养基，其中含有5.0×105个细胞。所用培养基为Dulbecco’s改良的Eagle培养基(Gibco/BRL)和10％经透析的胎牛血清(Hyclone)。将板置37℃下保温过夜。在6孔板中的每孔将0.5ml无血清培养基加入无菌聚苯乙烯小容器中，并加入20μl Transfectam，然后缓缓摇动。在要转染的每孔中，将4μg质粒DNA加入0.5ml溶于无血清培养基的Transfectam液，然后充分混合，并于室温下放置约10分钟，此时制备用于转染的细胞。从要转染的细胞中吸出培养基，每孔用5ml预热的无血清培养基将细胞小心清洗1或2次，然后每孔加入0.5ml无血清培养基。将此前制备好的DNA/Transfectam溶液每孔加0.5ml，加完各孔后，将板轻柔摇动以确保混匀。将板放回恒温箱保温4小时。在转染液中加入2ml完全培养基(血清浓度为正常值的1.5倍)。再将板放回恒温箱保温3天，从板中收集培养基，并测定抗体活性。
嵌合抗体在ELISA测定中显示出与sCD23结合。检测sCD23结合的ELISA测定是用100μl/孔以2μg/ml浓度溶于35mM NaHCO3、15mMNa2CO3,pH9.3的sCD23包被EIA/RIA板(Costar)，并于4℃过夜。用150mM NaCl、50mM Trizma碱、0.1％(v/v)吐温20,pH7.4(TBS/吐温)将板清洗3次，用100μl/孔溶于TBS/吐温的2％牛血清白蛋白在22℃下封闭1-2小时，再用TBS/吐温清洗3次。
在96孔板的一部分孔中加入100μl/孔的鼠杂交瘤C11上清液的稀释液，在96孔板的其它部分孔中加入在COS细胞上清液中瞬时表达的嵌合抗CD23抗体稀释液。将来自SigmaA4416的山羊抗小鼠IgG(全分子)过氧化物酶结合物以1∶1000的比例稀释于PBS/BSA(牛血清白蛋白)(1％)，并用来检测鼠C11抗体。将抗人κ轻链(结合的和游离的)过氧化物酶结合物(Sigma A-7164)以1∶5000的比例稀释于PBS/BSA(1％)，并用来检测嵌合抗CD23抗体。抗CD23嵌合体在结合sCD23的ELISA测定中显示出阳性结果。
抗CD23嵌合体在检测与膜CD23结合的FACS测定中也显示出阳性结果。这些数据证明了克隆并测序的是正确的鼠C11重链与轻链可变区。然后用这些鼠序列来开发人源化抗CD23抗体。
人源化重链基因和轻链基因的构建根据Lewis and Crowe(基因101,297-302,1991)的方法构建人源化重链和轻链。
(ⅰ)轻链将小鼠可变区构架序列与GenBank数据库中的人类构架序列进行比较。
比较人类轻链构架序列与小鼠抗人抗CD23轻链可变构架序列的同源性。选择同源性最高的构架作为PCR重叠延伸的模板；该构架为基因座HSIGKVII 490bp mRNA定义人类κ免疫球蛋白前导肽和可变区的重排DNA来源人类作者Klobeck,H.G.et al.人类VκⅡ种系基因对轻链多样性的影响，自然，309,73-76,1984检验小鼠构架与人构架中同一位置不同的各氨基酸。由于人类残基的免疫原性要低于小鼠残基，因而若不影响与抗原的结合则保留人类氨基酸。确认可影响结合的特定残基必须根据其它抗体-抗原结合的资料进行推测。从已发表的资料来看，重链构架中第71、91和94位残基显示出对抗原结合有影响(Tramontano,A.,Chothia,C.,andA.M.Lesk，分子生物学杂志，215,175-182,1990；Kettleborough,C.A.,Saldanha,J.,Heath,V.J.,Morrison,C.J.and M.M.Bendig,蛋白质工程，4,773-783,1991)。因此，人源化构架中的这些残基应与小鼠构架中的相同。各氨基酸的变化均考虑到其大小、疏水性、亲水性及电荷。如果人类氨基酸在这些特性方面与小鼠氨基酸相似，则在该位点使用人类氨基酸。
在小鼠轻链可变区构架序列与同源性最高的人类轻链可变区序列之间有13处不同。其中没有一处是保留小鼠的残基。产生出人源化轻链可变序列，并利用GCG程序找出下列酶的沉默位点AccⅠ；HaeⅠ；NheⅠ；PvuⅡ；XbaⅠ；XhoⅠ；XmaⅠ在不改变氨基酸序列的情况下对核苷酸序列进行改变，使其含有这些限制性酶切位点。这些位点的存在能够更易于对PCR克隆进行片段剪切和粘接。
利用剪接重叠PCR方法(Crowe,et al见上文)在含有选定人轻链构架序列的已有模板(如GSIGKVII Klobek,H.G.et al自然(1984)309,73-76)中移植小鼠轻链CDR，以产生人源化轻链可变区。编码人源化轻链可变序列的质粒的产生方法如下将用于转录的Kozac序列和信号序列(MGWSCIILFLVATATGVHS SEQID NO:15)加入到轻链模板序列中。在用于克隆的PCR产物的5’端加入HindⅢ位点，3’端加入BswiⅠ位点。用于PCR重叠延伸的寡核苷酸为AL:SEQ ID NO:23 5’gAT CAAgCT TCT CTA CAg TTA CTg AgC ACA 3’BL:SEQ ID NO:24.5’AAT CAA gTA TgT CTT CCC ATC CTT ATA CAggAg ACT CTT ACT CgA gCg ACA ggA gAT ggA ggC 3’CL:SEQ ID NO:25.5’CgC TCg AgT AAg AgT CTC CTg TAT AAg gAT gggAAg ACA TAC TTg AAT Tgg TAC CTg CAg AAg 3’DL:SEQ ID NO:26.5’TgA TgC CCg ggT ggA CAT CAA ATA gAT CAg gAgCTg 3’EL:SEQ ID NO:27.5’TTg ATg TCC ACC Cgg gCA TCA ggg gTC CCT gACAgg 3’FL:SEQ ID NO:28.5’AgC CAC CTg ACg TTT gAT CTC CAC CTT ggTCCC TTggCC gAA CgT gAA Tgg ATA CTC TAC CAg CTg TTg ACA gTA ATA AACCCC 3’在可编程加热部件(Perkin Elmer,GeneAmp 9600)中进行PCR反应(Saiki et al.科学239,487-491,1988)，反应采用25次温度循环(94℃为1分钟，50℃为2分钟，72℃为3分钟)，最后是72℃为5分钟。根据厂商的推荐方案，50μl反应缓冲液中使用了引物(浓度均为40μM)、一定量的模板和2.5单位Taq聚合酶(Perkin ElmerCetus)。
首先进行3种初步PCR反应，每种反应使用10ng模板，并且分别使用AL与BL、CL与DL、EL与FL的引物对。根据厂商的推荐方案利用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen Ltd,Surrey,UK，产品编号28104)将这些PCR反应的产物，片段ABL、CDL和EFL分别纯化。利用各纯化产物的十分之一将ABL与CDL片段连接，并用AL和DL引物将其进行重组PCR反应。如上所述将该反应的产物，ADL片段纯化，并利用AL和FL引物将该产物的十分之一与纯化EFL的十分之一共同进行重组PCR反应。根据厂商的推荐方案将最终的人源化轻链重组PCR产物AFL连接到“TA克隆试剂盒”(Invitrogen BV,Leek,the Neterland,产品编号K2000-01)的pCRTMⅡ中。利用ABI荧光测序仪测定质粒分离物的序列。
(ⅱ)重链确定与小鼠重链构架序列的同源性最高的人类重链构架序列。数据库中同源性最高的重链序列为基因座HUMSIGVS 423bp mRNA定义人类Ig mu-链mRNA V3b-D-J4区5’端来源由人类cDNA转录的mRNA作者Sanz,Ⅰ.et al.人类自身抗体的VH序列。自身抗体可能是种系基因的非变异拷贝的证据。免疫学杂志142,883-887,1989。
在小鼠重链可变区构架序列与同源性最高的人类重链可变区序列的氨基酸序列之间有17处不同。第49、66、76、77和94位这5个位置的小鼠氨基酸被保留。其它所有用于人源化重链构架的位置均为人类氨基酸。
产生人源化重链可变序列文档，并利用GCG程序找出下列酶的沉默位点EagⅠ；NheⅠ；XbaⅠ；XhoⅠ；XmaⅠ在不改变氨基酸序列的情况下对核苷酸序列进行改变，使其含有这些限制性酶切位点。这些位点的存在能够更易于对PCR克隆进行片段剪切和粘接。
在人源化重链可变区序列的5’端加入用于克隆的HindⅢ限制性位点、用于起始转录的Kozac序列和用于蛋白分泌的鼠信号序列(MAWVWTLLFLMAAAQSAQA-SEQ ID NO:16)。在3’端加入用于克隆的SpeⅠ限制性位点。
利用长重叠寡核苷酸经PCR产生带有小鼠CDR的人源化重链可变区构架。共合成了8种约60个碱基对的寡核苷酸，其中有15个碱基对的重叠。这些寡核苷酸如下AH:SEQ ID NO 29.5’ACA CgA AgC TTC ACC ATg gCT Tgg gTg Tgg ACCTTg CTA TTC CTg ATg gCg gCC gCC CAA 3’BH:SEQ ID NO 30:5’CTT TAC CAA gCC TCC CCC AgA CTC CAC CAgCTg CAC CTC TgC TTg ggC ACT TTg ggC ggC CgC CAT 3’CH:SEQ ID NO 31:5’TTg gTA AAg CCC ggg ggg TCC CTT AgA CTC TCCTgT gCA gCT AgC ggA TTC ACT TTC AgT 3’DH:SEQ ID NO 32:5’CCC CTT CCC Tgg AgC CTg gCg gAC CCA ggA CATCCA gTA gCC ACT gAA AgT gAA TCC gCT 3’EH:SEQ ID NO 33:5’ggg AAg ggg CTC gAg Tgg gTT gCT gAA ATT AgATTg AAA TCT gAT AAT TAT gCA ACA CAT 3’FH:SEQ ID NO 34:5’ATC ATC TCT TgA gAT ggT gAA TTT CCC CTT CACAgA CTC CgC ATA ATg TgT TgC ATA ATT 3’GH:SEQ ID NO 35:5’ATC TCA AgA gAT gAT TCA AAA TCT AgA CTg TATCTg CAA ATg AAC AgC CTg AAA ACC gAg gAC ACA 3’HH:SEQ ID NO 36:5’ggT gAC TAg TgT TCC CTg gCC CCA gTC TAT gAAATC TgT ACA gTA ATA CAC ggC TgT gTC CTC ggT TTT 3’利用重组PGR将鼠CDR移植到模板中。PCR的实施采用可编程热循环仪(Trio；Biometra)。在50μl反应物中含有溶在厂商提供的缓冲液中的2.5单位AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer-Cetus,Beaconsfield,UK)，该缓冲液提供了扩增所需的最佳pH和离子强度(10mM Tris-HCl,pH8.3,50mM KCl和1.5mM MgCl2)，另外还含有dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μM以及1μg/μl的扩增引物。在加热部件中将样品加热到94℃，保持2分钟，然后在16000×G下离心30秒。将样品置冰上1分钟，然后在每个样品中加入Taq聚合酶及一滴矿物油。摇动样品，然后在16000×G下离心30秒。将样品置于热循环仪中，设定的程序如下步骤194℃,1分钟步骤250℃,2分钟，以0.4℃/s的速度进入步骤3步骤372℃,3分钟，返回步骤1，重复25次循环首先进行7种初步PCR反应，每种反应使用1μg/μl的各引物，并且分别结合使用AH和BH、CH和DH、EH和FH、GH和HH；AH、BH、CH和DH；EH、FH、GH和HH；AH、BH、CH、DH、EH、FH、GH和HH的引物。利用1μl初步PCR反应产物的等分试样并结合引物(1μg/l)进行与初步PCR反应所述条件相同的PCR反应，以产生出全长重链可变区。将初步PCR反应的AFH和EHH片段、AHH片段、ABH、GHH和AHH片段、ABH、CDH、EFH和GHH片段，ABH、CDH、EFH、GHH和AHH片段与AH和HH引物结合。所有PCR反应均产生了全长片段。根据厂商的推荐方案利用Wizard PCRPreps DNA纯化系统(Promega)将来源于ABH、GHH和AHH反应的人源化重链可变区PCR产物纯化。纯化产物用HindⅢ和SpeⅠ酶切，然后克隆到含有变异IgG1恒定区的pUC载体(见下文)中。人源化抗体的构建将人源化重链可变区PCR产物用HindⅢ和SpeⅠ酶切，然后克隆到含有变异IgG1恒定区的pUC载体(见下文)中。该克隆的可变区序列如图3和4(SEQ ID NO:17和18)。选择含有正确人源化重链可变区氨基酸序列的克隆。与模型人源化重链可变区序列相比，该克隆具有一个沉默核苷酸变化。
人源化重链恒定区使用了一种带有突变的IgG1，以消除与Clq和Fc的结合。这些突变根据的是以下两篇文献Duncan,A.R.and Winter,G.通过表面扫描确定抗体上Clq结合位点的位置。自然332,738-740,1988和Duncan,A.R.,Woolf,J.M.,Partridge,L.J.,Burton,D.R.and Winter,G.IgG上人类FcR1结合位点的定位。自然332,563-564,1988。
突变的残基在Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.M.,Gottesman,K.S.and C.Foeller,1991,免疫学相关蛋白的序列，第1卷，第680页中有所描述。
为了创建不具有细胞毒性的IgG1同种型，对IgG1进行了如下变化248 Leu(CTg)变为Ala(gCg)以及250 Gly(ggA)变为Ala(gCA)。
这些突变是通过对人类IgG1的定向诱变而实现，方法如下
用于产生带有突变的IgG1的恒定区PCR寡核苷酸为SEQ ID 37 Ac gCT gCT CCT TTT AAg CTT Tgg ggT CAA ggC TCA CTA gTCACA gTC TCCSEQ ID 38 Bc TgA Cgg TgC CCC CgC gAg TTC AggSEQ ID 39 Cc CCT gAA CTC gCg ggg gCA CCg TCASEQ ID 40 Dc AAg CTT CCg TCg AAT TCA TTT ACC Cgg AgA GAg寡核苷酸Ac含有Hind/SpeⅠ位点。寡核苷酸BC和CC在第248及250位有突变。寡核苷酸Dc含有EcoRⅠ位点。利用寡核苷酸AC和BC并以克隆的人类IgG1恒定区为模板(Reichmann,L.,Clark,M.,Valdmann,H.,and Winter,G.(1988)重构人类抗体用于治疗，自然322,323-327)经PCR产生AB片段，PCR的条件在本发明的一般方法部分有详细描述。利用寡核苷酸CC和DC产生CD片段，PCR条件及引物与AB所用相同。利用Wizard PCR Preps DNA纯化系统(Promega)纯化PCR片段AB和CD。将PCR片段AB(5.0μl)和CDC(5.0μl)与寡核苷酸AC和DC结合，以产生含有带突变的IgG1恒定区的ADC片段。用Wizard PCRPreps DNA纯化系统(Promega)纯化ADC片段，并将其用HindⅢ和EcoRⅠ消化，然后连接到经HindⅢ-EcoRⅠ消化的含有人源化抗CD23重链可变区的pEE6质粒中。
将恒定区测序以证实产生了突变。将含有这些突变的片段转移到含有人源化抗CD23重链可变区的pEE6表达质粒中。
用HindⅢ和BsiW1酶切人源化轻链可变区PCR产物，然后克隆到上文所述含有人源化κ轻链恒定区的pEE6表达质粒中。利用ABI荧光测序仪将该克隆测序，并选出含有正确人源化轻链可变区氨基酸序列的克隆。
将来源于pEE6质粒的含有人源化重链抗CD23的BglⅡ-SalⅠ片段连接到含有人源化轻链抗CD23的pEE12质粒的BamHⅠ-SalⅠ位点中，以产生同时含有人源化重链抗CD23及轻链抗CD23的质粒。测定最终表达质粒中人源化重链可变区和恒定区以及人源化轻链可变区和恒定区的序列。人源化抗体的瞬时表达将含有人源化抗CD23的质粒转染到COS细胞中，并利用与上文嵌合抗体所用相同的方案进行瞬时表达。将含有人源化抗CD23的表达质粒转染到COS细胞中，并按照嵌合抗CD23瞬时表达的方案进行瞬时表达。
利用上文所述sCD23 ELISA方法测定实现与sCD23的半最大结合值所需的嵌合抗CD23抗体及人源化抗CD23抗体的浓度。将405nm下的吸光度对抗体的浓度范围作图，以产生“拟合优度”或相关系数为1的S形曲线。吸光度的读取使用的是Molecular Devices平板阅读仪(Menlo Park,Calif.,USA)，然后利用Softmax(Molecular DevicesCorp)软件以对数-分对数算法计算出最佳的拟合，并显示出曲线、方程参数和相关系数。曲线拟合法的论述可参考由Wilfrid R Butt编写、由Marcel Dekker,Inc.,New York于1984年出版的《免疫测定实用方法》一书中R P Channing Rogers的“测定的数据分析与质量控制实践入门”。对数-分对数逻辑方程的曲线拟合算法则是根据Levenberg-Marquardt的方法。该方法的论述可参考由William HPress、Brian P Flannery、Saul A Teukolski和William T Vetterling编写、由Cambridge University Press,New York于1988年出版的《科学计算方法》一书中的“数学原理”部分。以ng/ml为单位的x值根据以下方程计算x=c×[a-y][y-d]1/b]]>y+d-c2]]>其中d为渐近线位于x轴高位值时的相应y值，a为渐近线位于x轴低位值时的相应y值，c为a和d中点的相应x值，b表明曲线从其中央渐近线过渡的速度，通常为1。
嵌合抗CD23对sCD23的50％最大结合值为16.28ng/ml(见图5)。人源化抗CD23的50％最大结合常数为15.03ng/ml(见图6)。该数据表明，人源化抗CD23与含有完整小鼠C11可变区的嵌合抗CD23的结合能力相同。
稳定表达利用来自Celltech的谷氨酰胺合酶基因扩增系统选出可稳定表达人源化抗CD23的细胞系。其采用的基本系统如Bebbington et al,1992,生物技术10,169-175所述。该系统是利用电穿孔将含有仓鼠谷氨酰胺合酶编码cDNA及抗体重链和轻链编码cDNA的线性表达载体引入哺乳动物细胞而产生出稳定的细胞系，其仓鼠谷氨酰胺合酶编码cDNA受到SV40早期启动子及SV40剪接信号和多腺苷酸化信号的控制。然后选出能够在无谷氨酰胺培养基上生长的转染细胞。在含有2mM谷氨酰胺(GIBCO/BRL)和10％胎牛血清(Hyclone)的Iscove’s改良的Dulbecco’s培养基(Sigma)(非选择性培养基)中培养用于产生人源化抗CD23稳定细胞系的NSO(非免疫球蛋白分泌性小鼠骨髓瘤B细胞)。按下列方法产生抗CD23细胞系。用FsPl(New England Biolabs)将含有人源化抗CD23的表达质粒(40μg)消化为线性，乙醇沉淀，并重悬在50μl无菌水中。对处于指数增长期的NSO细胞计数。将细胞(107)离心并置磷酸缓冲盐溶液(PBS)中清洗一次。将细胞重悬在950μl无菌PBS中。在置于冰上的电穿孔样品池(0.4mm,Bio-Rad)中加入DNA，然后加入细胞。将样品池置于Bio-Rad电穿孔仪中，并连续施加两次1500伏、3μF的脉冲。取出样品池并置于冰上。用非选择性培养基将细胞稀释为104、103和102细胞/孔，并铺在96孔板中，每孔50μl。次日在每孔中加入150μl含有60μg/ml谷氨酸(Sigma)、60μg/ml天冬酰胺(Sigma)、及腺嘌呤核苷(Sigma)、鸟嘌呤核苷(Sigma)、胞嘧啶核苷(Sigma)、尿嘧啶核苷(Sigma)和胸腺嘧啶核苷(Sigma)各7μg/ml，以及10％胎牛血清(Hyclone)的Iscove’sDulbecco’s改良培养基(Sigma)(选择性培养基)。将板放回37℃恒温箱，并放置到出现明显的细胞死亡，然后分离出仍存活的克隆。
从铺满细胞的96孔板中将克隆转移到24孔板的一个孔中，若干天后用24孔板中铺满细胞的孔接种25cm2三角瓶。每次扩增是在用过的培养基中加入新鲜的选择性培养基。使三角瓶内生长的培养物保持在105-106细胞/ml。共对144个克隆的比生产率(SPR)进行了测量，以比较各克隆的抗体产量，由此选出最高产的克隆作为生产用品系。SPR的测量是从铺满的三角瓶中取出106个细胞，用PBS清洗细胞，然后将细胞加到10ml新鲜培养基中，于37℃保温24小时。利用ELISA确定抗体的产量。
利用ELISA测定法对克隆进行人类IgG产量的首次筛选，方法如下。用溶于35mM NaHCO3、15mM Na2CO3、pH9.3的5μg/ml山羊抗人IgG(Jackson Immunoresearch Labs编号109-001-003)包被EIA/RIA板(Costar)，每孔使用100μl，置4℃过夜。用150mM NaCl、50mM Trizma碱、0.1％(v/v)吐温20、pH7.4(TBS/吐温)将板清洗3次，在22℃下用100μl/孔溶于TBS/吐温的2％牛血清白蛋白封闭1-2小时，再用TBS/吐温清洗3次。在孔中加入100μl样品上清液，对照则加入100μl对照培养基，其中含有标准的(1000ng/ml-1ng/ml)对照Campath-1H IgG(Page,M J and Sydenham(见上文))，每样各三份，并置4℃保温过夜。用TBS/吐温将板清洗5次，再加入100μl稀释度为1∶5000的山羊抗人碱性磷酸酶结合物(Jackson Immunoresearch Labs#109-055-088)，然后于22℃保温2小时或于4℃保温过夜。用TBS/吐温将板清洗5次，再加入100μl溶于底物缓冲液的3mM pNPP(Sigma104-0)，然后用微量滴定板阅读仪(Molecular Devices)在405nm下读板，使用的动力学程序为20分钟。直接用程序计算并显示出标准曲线和样品的IgG浓度。SPR表示为μg/106细胞/24小时。144个克隆的SPR范围为14-0μg/106细胞/24小时。利用上述ELISA测定法对至少表达5μg/106细胞/24小时的克隆进行结合sCD23的测试。嵌合CD23则作为这些测试的标准。
补体裂解及ADCC测定通过流式细胞光度计用FITC标记的人源化抗CD23来证实表面CD23可在RPMI8866细胞上表达。利用FITC标记的人源化抗CDw52抗体(hCD52)对该细胞进行染色，发现该细胞呈CD52表达阴性。相比之下，Wein133细胞为hCD52染色阳性，但是呈抗CD23阴性。
根据已描述的方法(Blomberg,K,1993,J Immunol.Methods.168,267；Patel et al,1995,J.Immunol.,Methods,184,29)用二乙烯三胺五乙酸铕(Eu/DTPA)将RPMI8866细胞染色，而Wein细胞则用二乙烯三胺五乙酸钐(Sm/ETPA)标记。然后于存在NHS作为补体来源的情况下用hCD52或抗CD23裂解标记的Wein133细胞与RPMI8866细胞的1∶1混合物。hCD52使补体通过经典途径活化，从而导致Sm/DTPA释放。而存在抗CD23的情况下没有Sm/DTPA释放。该数据证实了只有hCD52可诱导Wein133细胞裂解，抗CD23则无此功能。该数据进一步证实，可通过激活补体途径来促使细胞裂解。不出所料，hCD52没有导致Eu/DTPA从RPMI8866中释放。尽管RPMI8866细胞可表达CD23,但抗CD23没能导致Eu/DTPA释放，这表明该抗体不能使补体活化。
于存在周围血单核细胞(PBMC)的情况下尝试用抗CD23或hCD52通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来裂解标记的Wein133与RPMI8866的1∶1混合物。hCD52导致了Sm/DTPA的释放，而抗CD23没有此结果，这证明了只有抗CD23不能介导Wein133细胞的ADCC裂解。这并不令人惊讶，因为Wein133细胞不表达CD23。这两种抗体均不能导致Eu/DTPA释放。这表明，尽管利用流式细胞光度计证实了CD23可在RPMI8866细胞上表达，但使用抗CD23不能检测到ADCC介导的细胞裂解。
动力学分析在Biacore Biosensor上评定人源化抗CD23与CD23抗原结合的结合率、解离率和解离率常数。简单地说，将纯化的重组CD23抗原固定在CM5传感器表面。利用1-乙基-3(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺(EDCO)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化葡聚糖表面的羧基。然后将重组CD23加在表面上开始固定。然后加入乙醇胺以淬灭残基的活性基团。实时检测抗CD23与固定的CD23的结合，并估计结合率(M-1see-1)。另外还检测CD23与抗CD23复合物的解离，并估计解离率(sec-1)。由结合率和解离率计算出解离常数(nM)。由6组抗CD23获得的数据显示，结合率为1.5-1.85×106M-1see-1，解离率为1-2×10-5sec-1。并发现抗CD23的解离常数为8-12pM。测出的亲和常数约为9×1010Kamol-1。
序列表<110>Glaxo Group Limited.
Bonnefoy,Jean-YvesEllis,Jonathan H<120>抗体<130>PG3433<140><141><150>GB 9809839.5<151>1998-05-09<160>53<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>415<212>DNA<213>鼠肌肉<220><221>CDS<222>(3)..(413)<400>1aa gct tta cag tta ctc agc aca cag gac ctc acc atg gat ttt ggg47Ala Leu Gln Leu Leu Ser Thr Gln Asp Leu Thr Met Asp Phe Gly1 5 10 15ctg att ttt ttt att gtt ctt tta aaa ggg gtc cag agt gaa gtg aag 95Leu Ile Phe Phe Ile Val Leu Leu Lys Gly Val Gln Ser Glu Val Lys20 25 30ctt gag gag tct gga gga ggc ttg gtg caa cct gga gga tcc atg aaa 143Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Met Lys35 40 45ctc tcc tgt gta gcc tct gga ttt act ttc agt ggc tac tgg atg tct 191Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp Met Ser50 55 60tgg gtc cgc cag tct cca gag aag ggg ctt gag tgg gtt gct gaa att 239Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile65 70 75aga ttg aaa tct gat aat tat gca aca cat tat gcg gag tct gtg aaa 287Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser Val 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Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro275 280 285Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr290 295 300Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val305 310 315 320Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala325 330 335Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg340 345 350Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly355 350 365Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro370 375 380Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser385 390 395 400Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln405 410 415Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His420 425 430Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435 440
权利要求
1．一种抗体，该抗体含有足够的如下所示的各CDR氨基酸序列使其能够与造血细胞上表达的CD23(FCεRⅡ)Ⅱ型分子结合RSSKSLLYKDGKTYLNCDRL1(SEQ ID NO:3)LMSTRAS CDRL2(SEQ ID NO:5)QQLVEYPFT CDRL3(SEQ ID NO:7)GYWMS CDRH1(SEQ ID NO:9)EIRLKSDNYATHYAESVKG CDRH2(SEQ ID NO:11)FID....... CDRH3(SEQ ID NO:13)
2．一种抗体，该抗体可与造血细胞上表达的CD23(FCεRⅡ)Ⅱ型分子或可溶性CD23结合，其亲和常数等于或大于1×109Ka Mol-1。
3．一种抗体，该抗体可竞争性抑制具有权利要求1所述CDR序列的抗体与造血细胞上表达的CD23(FCεRⅡ)Ⅱ型分子的结合。
4．以上权利要求之一的抗体，该抗体为经改变的抗体。
5．权利要求4的抗体，该抗体为人源化抗体。
6．以上权利要求之一的抗体，其中重链的构架在第49、66、76、77和94位中的任何位置含有来源于鼠抗体的氨基酸残基。
7．以上权利要求之一的抗体，其中轻链的构架在第64位含有来源于鼠抗体的氨基酸残基。
8．一种抗体，该抗体含有SEQ ID NO:1和2中的一种或两种氨基酸序列。
9．一种抗体，该抗体含有SEQ ID NO:17和18中的一种或两种氨基酸序列。
10．以上权利要求之一的抗体，其中根据Kabat的编号系统恒定区第235位为Ala并且第237位为Ala。
11．以上权利要求之一的抗体，该抗体用于人类的治疗。
12．权利要求1-10之一的抗体在用于制备治疗下列病症的药物中的应用，所述病症选自关节炎、红斑狼疮、桥本甲状腺炎、多发性硬化、糖尿病、色素层炎、皮炎、牛皮癣、荨麻疹、肾病综合症、肾小球肾炎、炎性肠病、溃疡性结肠炎、Crohn病、Sjogren综合症、过敏症、过敏性哮喘、内源性哮喘、急性哮喘加重、鼻炎、湿疹、GVH、COPD、胰岛素炎、支气管炎(特别是慢性支气管炎)或糖尿病(特别是Ⅰ型糖尿病)、B细胞恶性瘤。
13．可与造血细胞上表达的CD23(FCεRⅡ)Ⅱ型分子结合的抗体在用于阻断可溶性CD23形成的药物中的用途。
14．权利要求13的抗体的用途，其中该抗体为权利要求1-10之一的抗体。
15．一种编码抗体链的DNA序列，该序列可含有以下序列中的一种或多种图3中第70-117位的CDRL1碱基对 (SEQ ID NO::4)图3中第163-183位的CDRL2碱基对(SEQ ID NO::6)图3中第280-306位的CDRL3碱基对(SEQ ID NO::8)图4中第91-105位的CDRH1碱基对 (SEQ ID NO::10)图4中第148-204位的CDRH2碱基对(SEQ ID NO::12)图4中第301-309位的CDRH3碱基对(SEQ ID NO::14)
16．编码抗体链的DNA序列，该序列可含有SEQ ID NO:1和2的序列的编码序列中的一种或两种。
17．编码抗体链的DNA序列，该序列可含有SEQ ID NO:17和18的序列中的一种或两种。
18．一种药用制剂，该制剂含有如权利要求1-10之一所定义的抗体以及一种药学可接受的赋形剂。
19．一种药用制剂，该制剂含有与一种免疫调节剂或抗炎剂结合的如权利要求1-10之一所定义的抗体以及一种药学可接受的赋形剂。
全文摘要
本发明涉及可与CD23(FCεRⅡ)Ⅱ型分子结合的抗体,特别是经改变的抗体,包括能够与CD23(FCεRⅡ)Ⅱ型分子结合并且特征为亲和常数等于或大于1×10
文档编号A61K39/395GK1308676SQ9980845
公开日2001年8月15日 申请日期1999年5月7日 优先权日1998年5月9日
发明者J·Y·M·P·邦尼福伊, S·J·克罗维, J·H·埃利斯, N·T·拉普森, J·舍林 申请人:葛兰素集团有限公司