专利名称：抗病毒的核苷类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新颖的嘌呤核苷类似物，该类似物作为抗病毒药物是有用的。尤其是，本发明涉及到已改良了药物动力学特性的嘌呤核苷。
背景技术：
在美国，每年有超过一千两百万的新性病患者出现。在美国应报告的前10种疾病中，5种是性病，它们是衣原体病、淋病、梅毒、获得性免疫缺损综合征(AIDS)以及乙型肝炎(HBV)，感染上AIDS和HBV就没有治愈的希望。
在AIDS的病例中，世界卫生组织(WHO)预言到2000年全世界将有4千万的人感染导致AIDS的人类免疫缺陷病毒(HIV)。肝炎感染人数比HIV感染人数多5倍。WHO曾报道说现在还活的人中有20亿人感染了HBV，其中3.5亿人为慢性感染者并处于肝病的死亡阴影之下。
虽然使用新的疗法使得AIDS的死亡率有所下降，但是AIDS仍然是导致29至40岁年龄段的成年人死亡的第二杀手。抗HIV合并疗法是目前给HIV病人使用的标准疗法。现在有11种抗HIV的处方药，这些药物分属3个种类核苷类似物，其中包括齐多夫定、地达诺新、扎西他宾、斯达夫定(stavudine)或拉米夫定(lamivudine)；蛋白酶抑制剂，其中包括印第那韦(indinavir)、纳尔芬那韦(nelfinavir)、沙奎那韦和来顿那韦(ritonavir)；非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTI)类那韦拉品(nevirapine)、地拉韦啶和额发韦任(efavirenz)。与HIV相比，目前仅有少数治疗慢性乙肝病毒感染的疗法获得许可，它们是使用干扰素和拉米夫定，其他的药物目前在进行临床试验，包括泛昔洛韦(famciclovir)、洛布卡韦(lobucavir)和阿德福韦(adefovir)。但许多研究发现，疗程结束后许多病人又旧病复发，而且还对药物产生耐药性。
研究耐药性的发展是当前治疗HIV和HBV的一个热点。耐药性一般是在使用的药物没有足够的能力阻止病毒的复制时产生。如果病毒在药物存在的前提下能够完全复制，那么它就有机会改变自身的结构(即突变)，并且即使有药物存在，其突变体仍能进行复制。一旦突变发生，它马上会悄悄的生长并很快成为该个体中占支配地位的毒株。药物对新病毒株的作用越来越弱。另一研究热点是交互耐药性。交互耐药性是指在进行复制时，对两种药物同时产生的耐药性。一些研究表明，相对于单独使用一种药物，两种药物同时使用，能够延迟病毒对其中的一种或两种药物的耐药性作用的发展。另有一些研究建议同时使用三种药物效果会更好。结果，许多人认为阻止或延迟耐药性的最好方法是进行多药合并治疗。但随着使用药物种类的增加，药物相互作用及产生毒性的危险也会增加。
增进药物效力的一个方法是提高它的药物动力学特性，这对于药物的治疗活性有帮助。药物动力学研究在对生物系统使用一种制剂或药物后的不同时间，是什么因素决定了其生物作用部位化学药物的数目。药物动力学研究包括药物的吸收和分布(生物转运)、药物在个体中可能发生的化学变化(生物转化)以及药物如何贮存在机体中并如何消除。在长期药物治疗中，生物利用度是一个较重要的因素，这是因为它涉及药物被吸收并达到血液的程度，或者说在机体治疗部位利用的程度。生物利用度与药物在体液中的溶出能力有直接关系。
有报道称(-)-β-D-2，6-二氨基嘌呤二氧戊环(DAPD)和(-)-β-D-1，3-二氧戊环鸟嘌呤(DXG)在大多数的细胞体系中对HIV-1有很高的活性，并与拉米夫定有很小的交互耐药性，毒性还很低。然而，这些化合物的药物动力学特性很差，但可能改进。因此，能改进其药物动力学的化合物对于治疗HIV和HBV是很有用的。
发明内容
一方面，本发明提供一种新颖的嘌呤顺式核苷化合物，如式I所示 及其药用的盐。式中
n表示1或2；R4选自H、COOH、CONH2、OH、SH、NH2、NO2、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、卤素、CORa(其中Ra指C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基)或者COORb(其中Rb指C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基)；R3表示H或C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基；X选自H、一磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、被C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C6-10芳基取代的羰基或者 其中每个Rc独立选自H、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基或者羟基保护基团；其中所说的核苷为(-)对映异构体、(+)对映异构体及其混合物(包括外消旋的混合物)。
本发明的化合物有很好的疗效，尤其是作为抗病毒药。
另一方面，对于一个病毒感染引起疾病的患者，本发明提供了一种治疗方法，该方法包括给患者使用本发明治疗有效量的化合物或组合物。
另一方面，本发明还提供了一种药物制剂，该制剂包含本发明的化合物和药用载体或赋形剂。
另一方面，对于一个病毒感染引起疾病的患者，本发明提供了一种治疗方法，该方法包括给患者使用一种组合，该组合至少包含一种式I的化合物以及一种从核苷类似物、NNRTI或蛋白酶抑制剂中选出的治疗药物。
另一方面，本发明还提供了一种药物制剂，该制剂至少包括一种式I的化合物，至少一种从核苷类似物、NNRTI或蛋白酶抑制剂选出的药物和药用载体或赋形剂。
另一方面，式I化合物的使用可用于滤过性病原体引发的疾病治疗的药剂的生产。
本发明的详细描述一个实施方式中，本发明的化合物包括那些存在于以下实施方案里的化合物，不论是独立的还是组合的。
在一个实施方式中，X表示H，X也可以是 其中，每个Rc独立的选自H、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基或者选自S-酰基硫代乙酯、酰基氧基甲酯或烷基碳酸甲酯的羟基保护基团。另一个实施方式中，X是 其中Rc各选自乙酰基-2-硫乙酯、新戊酰氧基甲酯或异丙氧基羰基氧基甲基酯的羟基保护基团。
在一个实施方式中，n是1。
在另一实施方式中，R3表示H或甲基。
在另一实施方式中，R3表示H。
在另一实施方式中，R4选自H、COOH、CONH2、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基或者COORb(其中Rb表示C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基)。
在另一实施方式中，R4表示H、COOH或C1-6烷基。
在另一实施方式中，R4表示H、COOH、甲基或乙基。
在另一实施方式中，R4表示甲基或乙基。
在另一实施方式中，R4表示COOH。
在另一实施方式中，R4表示H。
在另一实施方式中，R3表示H或甲基，R4表示H。
在另一实施方式中，R4和R3都是H。
在另一实施方式中，本发明的化合物如式(Ia)所示 其中包括药用盐，X、R3和R4如上所述。
本领域的技术人员会明白，式(I)和式(Ia)的化合物包含至少两个手性中心，这些中心用星号标记在通式(I)和(Ia)上。式(I)和(Ia)的化合物存在两种不同的光学异构体〔即(+)或(-)的对映异构体，或者是β-L或β-D异构体〕。本发明中包括所有这些对映异构体及其混合物(包括外消旋的混合物)。从本技术中能得到这些单独的光学异构体或对映异构体，比如手性HPLC、酶拆分和手性助剂，或者能立体选择性的加以合成。
本发明还提供改进了药物动力学特性的化合物。
根据本发明的一个实施方式，本发明还提供改进了生物利用度的化合物。
根据本发明的另一个实施方式，本发明提供了一种治疗由病毒感染引起的疾病的方法，其中包括给患者使用治疗有效量的式I化合物或其药用盐。
根据本发明另一实施方式，本发明提供了一种治疗逆转录病毒引起的疾病的方法，该方法包括给患者使用治疗有效量的式I化合物或其药用盐。
根据本发明的另一实施方案，本发明提供一种治疗HIV感染的方法，该方法包括给患者使用治疗有效量的式I化合物或其药用盐。
根据本发明的另一实施方案，本发明提供一种治疗HBV感染的方法，该方法包括给患者使用治疗有效量的式I化合物或其药用盐。
本发明的化合物包括化合物A顺式-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6′-环丙基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环 化合物B顺式-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6′-环丁基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环 化合物C顺式-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6′-〔1-羧基-环丙基氨基〕-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环 在另一实施方式中，本发明的化合物包括化合物A(-)(-)-(2R，4R)-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6′-环丙基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环 化合物B(-)(-)-(2R，4R)-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6′-环丁基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环 化合物C(-)(-)-(2R，4R)-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6’-〔1-羧基-环丙基氨基〕-嘌呤-9’-基)-1，3-二氧戊环 在一个实施方式中，本发明的化合物呈(+)型，至少有95％无(-)型。
在一个实施方式中，本发明的化合物呈(+)型，至少有97％无(-)型。
在一个实施方式中，本发明的化合物呈(+)型，至少有99％无(-)型。
在一个实施方式中，本发明的化合物呈(-)型，至少有95％无(+)型。
在一个实施方式中，本发明的化合物呈(-)型，至少有97％无(+)型。
在一个实施方式中，本发明的化合物呈(-)型，至少有99％无(+)型。
在一个实施方式中，本发明的一个化合物为化合物A。
在一个实施方式中，本发明的一个化合物为化合物A(-)。
本发明还提供一种药用盐。谈到通式(I)和(Ia)的化合物的药用盐，指的是那些从药用的有机或无机酸与碱得来的盐。比如，适合的酸有盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、甲苯-p-磺酸、酒石酸、醋酸、柠檬酸、甲磺酸、蚁酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。其它的酸如草酸不在药用的酸之中，但对于获得本发明的化合物及其药用酸加成盐是有用的中间体。
从适当的碱得到的药用盐包括碱金属(如钠)、碱土金属(如镁)、铵和NR4+(其中R表示C1-4烷基)盐。
以下涉及本发明的化合物，包括通式(I)和(Ia)的化合物以及上面提到的药用盐。
除非有另外的定义，在这里用到的所有的技术和科学的术语和本发明领域中普通技术人员通常所理解的含义相同。所有的出版物、专利申请、专利以及其他的在这里述及的文献都被完整引用。遇到冲突时，目前的说明书包括定义会起作用。另外，这些材料、方法和案例仅仅是说明性的，并没有限制的用意。
在申请书中提到的烷基一词，代表一种未被或已被取代(被卤素、硝基、CONH2、COOH、O-C1-4烷基、O-C2-6链烯基、O-C2-6炔基、羟基、氨基或COOQ，其中的Q表示C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基取代)的直链、支链或环烃基团(如异丙基、乙基、氟己基或环丙基)。烷基也包括一个或更多的氢原子被卤素置换的烷基，氢如果被氟取代则更好(如CF3-或CF3CH2-)。
链烯基和炔基代表一种烷基中含有至少一个不饱和的基团(如烯丙基)。
在有机化学中羟基保护基团是周知的。这种保护基团在T.Greene的著作《有机合成中的保护基团》(Protecting Groups In Organic Synthesis)(John Wiley & Sons，1981)中能找到。羟基保护基团的例子包括但不限于乙酰-2-硫乙酯、新戊酰氧基甲酯和异丙氧基羰基氧基甲酯。
当有硫原子存在，硫原子有不同水平的氧化态——S、SO或SO2。所有这些氧化态均在本发明所述及的范围内。
这里的卤素指氟、氯、溴和碘。如氟代。
本领域的技术人员会明白，用于治疗所需的本发明化合物的量不仅仅随所选的特定化合物而变，而且还随给药途径、要求治疗的疾病性质、患者的年龄和身体状况而变，所有的这些最终取决于主治医师或兽医。通常情况下，比较合适的剂量为每天大概0.1到750mg/每千克体重，0.5到60mg/每千克体重/天比较好，最好是每天1到20mg/每千克体重。
所需剂量方便地一次给予，或者间隔一定时间分次服用，比如每天服用两次、三次、四次或更多。
这种化合物能以单位剂型方便地服用，比如每单位剂型含有10到1500mg的活性成分、较方便为20到1000mg以及最方便为50到700mg的活性成分。
理想的情况是所给予的活性成分达到的活性化合物的峰血浆浓度，含量为大约1μM到75μM，2到50μM较好，3到30μM最好。这可通过例如静脉注射溶解有0.1％到5％该活性成分的溶液(可任选用盐水溶解)，或者口服含有大约1到500mg活性成分的药丸来达到。连续输注每小时约0.01到5.0mg/kg的活性成分，或者间歇输注大约0.4到15mg/kg活性成分能达到我们想要的血液水平。
在治疗时，本发明的化合物可用化学原药给药，但最好以药物制剂提供活性成分。本发明还提供一种药物制剂，该制剂中包括式(I)或式(Ia)的化合物或其药用盐加上一种或多种的药用载体，还可以随意的有其它的治疗和(或)预防的成分。载体必须是可接受的，这是指载体必须能和制剂中的其他成分相容，而对其接受者无害。
药物制剂合适的使用方法包括口服、直肠给药、鼻内、局部(包括口颊和舌下)、透皮、阴道或肠道外(包括肌肉、皮下和静脉)，或者使用适当的吸入法或吹入法给药。如果适当，可方便的以独立的剂型给予制剂，并且可以以周知的药剂学领域的任一方法制得。所有的方法均包括使活性化合物与液体载体或与粉碎的固体载体或同时与两者混合(如果需要的话)的步骤，然后按需要使该产品制成所想要的制剂。
适合于口服的药物制剂可方便的以独立的剂型单位提供如胶囊、扁囊剂或药片等每颗含有预定量活性成分的剂型单位；也可以粉末或颗粒；溶液、悬浮液或乳状液提供。活性成分也可以制成丸药、干药糖剂或糊剂的形式。口服的药片和胶囊可含有常规的赋形剂如粘合剂、填充剂、滑润剂、崩解剂或者湿润剂。根据本领域周知的技术，药片可以包衣。口服液体制剂可采取水性或油性悬浮液剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂或酏剂的形式；或者是干品，在给药前与水或其它适合的赋形剂相混合。这些液体制剂可能含有通常的添加剂，如悬浮剂、乳化剂、非水赋形剂(可包括食用油)或防腐剂。
根据本发明制得的化合物还可能配制成供非肠道给药(例如通过注射的方法，如推注或连续输注)，也可能制成单位剂型如安瓿、预装填的针筒、小体积输注液或装入加有防腐剂的多剂量容器。该组合物可能在油性或水性赋形剂中以悬浮液、溶液或乳剂的形式存在，也可能含有用于制剂的物质如悬浮剂、稳定剂或分散剂。活性成分还可以制成粉末状，由灭菌的固体在无菌区制得，或者将溶液冻干，这样，在使用前，用合适的赋形剂如经消毒的无热原质的水进行配制。
对于表皮的局部使用，本发明的化合物能制成软膏、霜或洗剂的形式，也可以制成透皮贴剂。透皮贴剂可包含渗透增强剂如里哪醇、香芹酚、麝香草酚、柠檬醛、薄荷醇和t-茴香脑。加适合的增稠剂和(或)胶凝剂后，软膏和霜可以用水性或油性基质制成。洗剂可以用水性的或油性基质配制，并且通常情况下包含有一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。
适合口中局部给药的制剂包括锭剂(活性成分在增香基质，通常是蔗糖及阿拉伯树胶或西黄芪胶中)、软锭剂(活性成分在惰性基质上如明胶及甘油或蔗糖和阿拉伯树胶中)、漱口剂(活性成分在适合的液体载体中)。
适合于直肠给药的药物制剂中的载体是一种固体，最适合单位剂量栓剂提供。适合的载体包括可可豆脂和本领域中常用到的其他材料，栓剂是将活性成分与软化或熔化的载体掺和后在模中冷却成形而得到。
适合于阴道给药的制剂可为阴道栓、阴道塞、霜、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾剂(其中有活性成分与载体，其比例与本技术适当对映)。
至于鼻内给药，本发明化合物可制成液体喷雾剂或可分散的粉剂或滴剂。滴剂可用水性或非水性基质制成，其中还包括一种以上的分散剂、增溶剂或悬浮剂。液体喷雾剂能方便的用加压包装给药。
本发明化合物的吸入给药可制成吹入器、雾化器或加压包装，或其他能传送气雾剂喷雾。加压包装可含一适合的推进剂，比如二氯二氟甲烷、三氟氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体。加压气雾剂的剂量单位将由所提供的传送计量数量的阀来决定。
本发明化合物也可以以干粉组合物的方式吸入给药或吹入给药，例如，由该化合物与一种合适的粉末基质如乳糖或淀粉组成的粉末混合物。粉末状组合物也有可能以单位剂型的形式，比如以胶囊或药筒或如明胶或泡罩包装的形式提供，通过吸入器或吹入器可以将粉末状药品给予患者粉剂。
需要时上面描述的制剂可用于适应持续地释放活性成分。
本发明的化合物也可以与其它的抗病毒剂合并使用。
在一个实施方式中，本发明的合并用药包括在以下实施方式中独立或是并用的药物。
在一个实施方式中，本发明的化合物可能与其它的至少一种抗病毒剂共同使用，这些药物选自核苷类似物、NNRTI或蛋白酶抑制剂。
在一个实施方式中，核苷类似物是1，3-氧硫杂戊环(oxathiolane)类似物。
在另一实施方式中，1，3-氧硫杂戊环类似物是拉米夫定、蔻韦拉休(coviracil)或2-羟甲基-4-(胞嘧啶-1′-基)-1，3-氧硫杂戊环。
在另一实施方式中，1，3-氧硫杂戊环类似物是2-羟甲基-4-(胞嘧啶-1′-基)-1，3-氧硫杂戊环。
在另一实施方式中，1，3-氧硫杂戊环类似物是2R-羟甲基-4R-(胞嘧啶-1′-基)-1，3-氧硫杂戊环。
在另一实施方式中，1，3-氧硫杂戊环类似物是2S-羟甲基-4S-(胞嘧啶-1′-基)-1，3-氧硫杂戊环。
在一个实施方式中，本发明的化合物能与至少一种其他抗病毒剂共同应用，这些药物选自齐多夫定、地达诺新、扎西他宾、斯达夫定、拉米夫定、那韦拉品、地拉韦啶、额发韦任、印第那韦、纳尔芬那韦、沙喹那韦或来顿那韦。
在一个实施方式中，本发明的化合物能与至少一种其他抗病毒剂共同应用，这些药物选自那韦拉品、额发韦任、齐多夫定、斯达夫定或拉米夫定。
在一个实施方式中，本发明的化合物能与至少一种其他抗病毒剂共同应用，这些药物选自额发韦任、齐多夫定、斯达夫定或拉米夫定。
在一个实施方式中，本发明的化合物能与至少一种其他抗病毒剂共同应用，这些药物选自额发韦任、齐多夫定或拉米夫定。
在一个实施方式中，本发明的化合物能与额发韦任、齐多夫定或拉米夫定共同应用。
在一个实施方式中，本发明的化合物能与至少一种抗病毒剂共同应用，这些药物选自那韦拉品、齐多夫定、斯达夫定或拉米夫定。
在一个实施方式中，本发明的化合物能与那韦拉品、齐多夫定、斯达夫定和拉米夫定共同应用。
在一个实施方式中，本发明的化合物能与至少一种其他抗病毒剂共同应用，这些药物选自齐多夫定、斯达夫定或拉米夫定。
在一个实施方式中，本发明的化合物能与齐多夫定、斯达夫定或拉米夫定共同应用。
在一个实施方式中，本发明的化合物能与齐多夫定共同应用。
在一个实施方式中，本发明的化合物能与斯达夫定共同应用。
在一个实施方式中，本发明的化合物能与拉米夫定共同应用。
在一个实施方式中，本发明的化合物能与那韦拉品共同应用。
在一个实施方式中，本发明的化合物能与额发韦任共同应用。
上面所提到的合并用药可以药物制剂的形式方便的提供，并且药物制剂中包含有如上面定义的合并用药以及药用载体(构成本发明的另一方面)。
这些合并用药的各成分可以连续给药，也可以同时给药，可以用独立的药剂或者复方将药给药。
当化合物(I)和(Ia)或其药用盐与对同一病毒有活性的另一种治疗剂合并使用时，每一化合物的剂量可以与其单独使用时的剂量相同，也可以不同。本领域的技术人员都会知道使用适当的剂量。
本领域的技术人员都会知道本发明化合物与另一治疗剂的比例。例如，有人会使用本发明化合物与另一治疗剂的约比例从1∶1到1∶50的比例。在另一实施方式中，有人会用约1∶1到1∶30的比例；在另一实施方式中，有人会使用约1∶1到1∶20的比例；在另一实施方式中，也有人令使用约1∶1到1∶15的比例；又一实施方式中，比例会是约1∶1到1∶10；另一实施方式中，比例是约1∶1到1∶5；另一实施方式中，比例是1∶1到1∶3。如果再加入另一治疗剂，那么比例随之而改变。
本发明的化合物可如下制备下面的例子是用来对本发明的的各种实施方式举例说明，而不应认为是对本根据上面的步骤可以合成目标化合物步骤a式1的2-苯甲酰氧基-乙醛与式2的(R)-(+)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-羧酸甲酯在对甲苯磺酸(PTSA)的存在下，通过转酮缩醇化反应，生成式3的2-苯甲酰氧基甲基-1，3-二氧戊环-4-羧酸甲酯，它是一种顺反异构体的混合物，顺式与反式的比例为3∶1。
步骤b使用氢氧化锂将式3的羧酸甲酯选择性地水解，得到式4a和4b相应的酸类衍生物，用快速层析法将混合物分离，各异构体随后单独使用。
步骤c用四乙酸铅处理4a，其含羧基的部分随即转变为一个乙酰氧基离去基团。
步骤d以三氟甲磺酸三甲基甲硅烷酯(TMSTf)为活化剂，式4a的(2R)-2-苯甲酰氧基甲基-1，3-二氧戊环-4-醋酸酯与甲硅烷基化的2-氨基-6-氯嘌呤偶联，得到核苷类似物6a和6b的顺反异构体混合物，顺反比例为1.2∶1。用快速层析法分离混合物，各异构体单独使用于下步。
步骤e用环丙胺的乙醇溶液处理式6a的(-)-(2R，4R)-2-苯甲酰氧甲基-4-(2′-氨基-6′-氯-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环，产生相应的(-)-(2R，4R)-2-苯甲酰氧基甲基-4-(2′-氨基-6′-环丙基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环(式7)，有良好的收率。
步骤f将(-)-(2R，4R)-2-苯甲酰氧基甲基-4-(2′-氨基-6′-环丙基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环(式7)与氨的甲醇溶液反应，去除苯甲酰保护基团，并得到有良好收率的想要的(-)-(2R，4R)-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6′-环丙基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环(A)。
具体实施例方式
实施例12-(R，S)-苯甲酰氧基甲基-1，3-二氧戊环-4-(R)-羧酸甲酯 在80℃的2，3-O-异亚丙基-D-甘油酸甲酯(Fluka公司，商品目录第59449号)(9.76g，60.9mmol，1eq.)与苯甲酰氧基乙醛(10g，60.9mmol，1eq.)的甲苯(20ml)溶液中加入p-甲苯磺酸(460mg，2.4mmol，4mol％)，反应烧瓶保持在真空中反应1小时，在这段时间里收集馏出物(80-85℃)。剩余物冷却到室温，以硅胶为固相载体、己烷/乙酸乙酯为洗脱剂进行柱层析，产生13.2g(81％)的如标题所述的化合物。该化合物是混合物，顺式异构体与反式异构体的比为3∶1。
顺式异构体1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.75(s，3H，CH3)；4.15(dd，1H，C5-CH)，4.30(dd，1H，C5-CH)； 4.5(m，2H，CH2-O-CO-C6H5)；4.7(m，1H，C4-CH)； 5.4(t，1H，C2-CH)；7.45-8.1(m，5H，Ar-CH).
反式异构体
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)3.8(s，3H，CH3)；4.1(dd，1H，C5-CH)；4.35(dd，1H，C5-CH)；4.45(m，2H，CH2-O-CO-C6H5)；4.75(m，1H，C4-CH)； 5.5(t，1H，C2-CH)；7.45-8.1(m，5H，Ar-CH).
实施例2(2R，4R)-2-苯甲酰氧基甲基-1，3-二氧戊环-4-羧酸；(2S，4R)-2-苯甲酰氧基甲基-1，3-二氧戊环-4-羧酸； 在2-(R，S)-苯甲酰氧基甲基-1，3-二氧戊环-4-(R)-羧酸甲酯(411g，1.54mmol，1eq.，顺式与反式异构体比为2∶1的混合物)在四氢呋喃-水中的溶液(THF与水比例是1∶1)中加入氢氧化锂(64.8g，1.54moles，1eq.)(氢氧化锂在30分钟内逐渐加入)，使反应烧瓶温度保持在30℃以下。90分钟后，在真空条件下去除四氢呋喃，滴加30％(w/w)硫酸，使水溶液酸化到pH为2.5-3.2。然后用二氯甲烷(4×400ml)抽提。合并的有机相用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，浓缩后得到380g的暗色油状物。以硅胶为固相载体、2％乙酸的二氯甲烷溶液对异构体混合物进行柱层析，得到220g的顺式异构体(56.5％)和116g的反式异构体(30％)。各异构体在下一步试验中将单独使用。
顺式异构体(2R，4R)-2-苯甲酰氧基甲基-1，3-二氧戊环-4-羧酸1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.2(t，1H，C5-H)；4.4(m，1H)；4.5(m，1H)； 4.7(m，2H)；5.4(t，1H，C2-CH)； 7.45-8.1(m，5H，Ar-CH)；7.2-8.0(bs，1H，COOH).
反式异构体(2S，4R)-2-苯甲酰氧基甲基-1，3-二氧戊环-4-羧酸1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.15(dd，1H，C5-H)；4.4(t，1H，C5-H)；4.45(m，2H，CH2-OCOC6H5)；4.8(dd，1H，C4-CH)；5.6(t，1H，C2-CH)；7.45-8.1(m，5H，Ar-CH)；8.3-8.8(bs，1H，COOH).
实施例3(2R)-2-苯甲酰氧基甲基-4-(R，S)-乙酰氧基-1，3-二氧戊环 往(2R，4R)-2-苯甲酰氧基甲基-1，3-二氧戊环-4-羧酸(130g，0.515moles，1eq.)和吡啶(60ml，0.741moles，1.44eq.)的乙腈溶液(4℃)中，用20分钟逐渐加入四乙酸铅(分析值95％，300g，0.678moles，1.25eq.)。在室温条件下不停的搅拌反应混合物18小时。过滤去除无机物，滤液倒到2升的重碳酸钠饱和溶液然后加入固体的重碳酸钠(pH7-8)。分离有机相，水相用乙酸乙酯抽提3次，每次400ml。这样，有机相合并后浓缩。以硅胶为固相载体、己烷/乙酸乙酯为洗脱剂进行柱层析，得到93.5g(68％)的标题里提到的化合物。这是一种混合物，其中顺式和反式异构体的比例为2∶1。得到的混合物在下一步用到。
顺/反式异构体1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)2.0，2.15(s，3H，CH3)；4.05-4.45(m，4H，CH)；5.45，5.55(t，1H，C2-CH)；6.4，6.45(dd，1H，C4-CH)；7.45-8.1(m，5H，Ar-CH)；实施例4(2R，4R)和(2R，4S)-2-苯甲酰氧基甲基-4-(2′-氨基-6′-氯-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环 将2-氨基-6-氯-嘌呤(4.15g，1.3eq)的50ml六甲基二硅氮烷(HMDS，其中含有100mg硫酸铵)溶液回流加热3小时，此后澄清的溶液在真空中蒸发至干。用100ml无水1，2-二氯乙烷溶解剩余物。经与苯(30ml)的两次共同蒸发，(2R)-2-苯甲酰氧基甲基-4-乙酰氧基-1，3-二氧戊环(5g)被蒸干，然后将其溶解在100ml的无水1，2-二氯乙烷中。该溶液随后转入到含有甲硅烷基化的2-氨基-6-氯-嘌呤溶液的反应烧瓶，混合物放在60℃预热的油浴中15分钟，随后加入三氟甲磺酸三甲基甲硅烷酯(TMS-Tf，3.8ml，1.1eq.)。在氮气下回流加热混合物3小时，溶液变成褐色。薄层色谱法(用于糖的展开溶剂是7∶3的己烷∶乙酸乙酯，用于产物的展开溶剂是1∶4的己烷∶乙酸乙酯)分析显示糖消失(反应完全)，存在两个分得很开的斑点，分别是顺式和反式异构体的产物。将反应混合物冷却到室温后倒到100ml饱和重碳酸钠溶液中并搅拌10分钟。收集有机层，水层用二氯甲烷抽提两次，每次50ml。合并的有机溶液用水和盐水洗涤，并和往常一样用硫酸镁干燥。溶剂被蒸发至干成泡沫(7g)。粗品的H-NMR表明反应并没有混有其它的杂质，得到的顺式与反式异构体比例为1.2∶1。粗品通过硅胶柱层析加以纯化，先后用7∶3、1∶1和2∶3的己烷∶乙酸乙酯梯度洗脱，得到2.5g泡沫状的反式异构体(其极性较小，为α端基异构体，用EtOH结晶)、3g顺式同分异构体泡沫(其极性较大，为β端基异构体，用EtOH结晶)和0.3g泡沫状顺式较多的顺式和反式的混合物，总得率为82％。
反式异构体(+)-(2R，4S)-2-苯甲酰氧基甲基-4-(2′-氨基-6′-氯-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环Rf＝0.40(己烷∶乙酸乙酯＝3∶7)[αD]+21.16°(CH2Cl2，浓度是0.293)1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.45-4.55(m，4H ；C5-H2，C2-CH2-OBz)，5.16(b，2H，NH2)，5.83(t，1H，C2-H，J＝3.8Hz)，6.39(dd，1H，C4-H)，7.45(t，2H，aromatic)，7.62(t，1H，芳香族的)，7.92(s，1H，C8′-8)，8.10(d，2H，芳香族的).
紫外分析(CH3OH)λmax为312nm顺式异构体(-)-(2R，4R)-2-苯甲酰氧基甲基-4-(2′-氨基-6′-氯-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环Rf＝0.26(己烷∶乙酸乙酯＝3∶7)〔αD〕-87.7°(CH2Cl2，浓度是0.2565)1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)4.25-4.33 dd，1H，C5-H)，4.60-4.64(m，3H；C5-H and C2-CH2-OBz)，5.17(b，2H，NH2)，5.42(t，1H，C2-H，J＝3.5Hz)，6.33(dd，1H，C4-H)，7.45(t，2H，芳香族的)，7.62(t，1H，芳香族的)，7.95(d，2H，芳香族的)，8.05(s，1H，C8′-8).
紫外分析(CH3OH)λmax为312nm。
实施例5(-)-(2R，4R)-2-苯甲酰氧基甲基-4-(2′-氨基-6′-环丙基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环 在溶有600mg(-)-(2R，4R)-2-苯甲酰氧基甲基-4-(2′-氨基-6′-氯-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环的30ml乙醇溶液中加入环丙胺(2ml，18eq.)，混合物慢慢加热，在80-85℃回流18h后冷却到室温，溶剂在真空中被蒸干。剩余物用100ml二氯甲烷溶解，然后用饱和碳酸氢钠溶液、水和盐水洗涤，用硫酸镁干燥。在真空中溶剂被去除。以EtOAc∶MeOH为洗脱剂，用硅胶柱层析纯化剩余物，得到我们想要的产品，是一种泡沫，有80％的得率(506mg)。
Rf为0.26(CH2Cl2∶MeOH＝95∶5)〔αD〕-67.7℃(MeOH，浓度为0.2565)1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)0.64-0.68(m，2H，环丙基的CH2)，0.91-0.96(m，2H，环丙基的CH2)，3.06(b，1H，环丙基的CH)，4.27-4.30(dd，1H，C5-H)，4.54-4.57(dd，1H；C5-H)4.60(t，2H，C2-CH2-OBz)，5.37(b，2H，NH2)，5.42(t，1H，C2-H，J＝3.5Hz)，6.28(b，1H，NH)，6.35(dd，1H，C4-H)，7.45(t，2H，芳香族的)，7.58(t，1H，芳香族的)，7.77(s，1H，C8′-8)，8.01(d，2H，芳香族的)，紫外分析CH3OH的λmax为283nm和260nm。
实施例6(-)-(2R，4R)-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6′-环丙基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环(化合物A) 在室温将(-)-(2R，4R)-2-苯甲酰氧基甲基-4-(2′-氨基-6’-环丙基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环(480mg)在氨的饱和甲醇溶液(30ml)中的混合物搅拌18h。混合物在真空中被蒸干。剩余物用20ml水溶解，用10ml二氯甲烷洗涤两次并冻干，得到283mg的白色固体，得率为80％。
Rf为0.26(CH2Cl2∶MeOH＝9∶1)
〔αD〕-35.9℃(MeOH，浓度为0.334，)1H-NMR(DMSOd-6)δ(ppm)0.55(m，2H，环丙基的CH2)，0.95(m，2H，环丙基的CH)，3.15(b，1H，环丙基的CH)，3.80(m，2H，CH2OH)，4.30(dd，1H，C5-H)，4.55(dd，1H；C5-H)，5.08(t，1H，C2-H)，5.17(b，H，OH)，6.15(b，2H，NH2)，6.52(dd，1H，C4-H)，7.72(b，1H，NH)，8.12(s，1H，C8′-8).
紫外分析(CH3OH)λmax283nm和260nm实施例7(-)-(2R，4R)-2-苯甲酰氧基甲基-4-(2′-氨基-6′-环丁基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环 往(-)-(2R，4R)-2-苯甲酰氧基甲基-4-(2′-氨基-6′-氯-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环(250mg)的乙醇25ml溶液中加入环丁胺(0.17ml，3eq.)。将混合物慢慢加热，在80-85℃回流18h后冷却到室温。溶剂在真空中被蒸干。剩余物溶解在100ml二氯甲烷中，然后用饱和碳酸氢钠溶液、水及盐水洗涤，并用硫酸镁干噪。溶剂在真空中被去除，以95∶5的EtOAc∶MeOH为洗脱剂，用硅胶柱层析纯化剩余物，得到我们想要的泡沫状产物，有84％的得率(230mg)。
Rf为0.31(CH2Cl2∶MeOH为95∶5)〔αD)-62.5℃(CH2Cl2，浓度为0.4925)1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)1.74-1.78(m，2H，环丁基的CH2)，1.95-2.00(m，2H，环丁基的CH2)，2.43-2.45(m，2H，环丁基的CH2)，4.27-4.30(dd，1H，C5-H)，4.54-4.57(dd，1H；C5-H)，4.59(t，2H，C2-CH2-OBz)，4.75(b，1H，环丁基的CH)，5.37(b，2H，NH2)，5.41(t，1H，C2-H，J＝3.6Hz)，6.00(b，1H，NH)，6.35(dd，1H，C4-H)，7.45(t，2H，芳香族的)，7.58(t，1H，芳香族的)，7.75 (s，1H，C8′-8)，8.01(d，2H，芳香族的)，紫外分析(CH3OH)λmax为283nm和263nm。
实施例8(-)-(2R，4R)-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6′-环丁基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环(化合物B) 在室温条件下将(-)-(2R，4R)-2-苯甲酰氧基甲基-4-(2′-氨基-6′-环丁基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环(214mg)与20ml氨的饱和甲醇溶液的混合物搅拌18h。混合物在真空中被蒸干，剩余物溶于20ml水中，用乙醚洗涤两次，每次10ml，然后与乙醇共蒸发至干，得到154mg的纯泡沫状产物，得率为96％。
Rf为0.52(CH2Cl2∶MeOH为9∶1)〔αD〕-29.04℃(MeOH，浓度为0.396，)1H-NMR(DMSOd-6)δ(ppm)1.61(m，2H，环丁基的CH2)，2.06(m，2H，环丁基的CH2)，2.18(m，2H，环丁基的CH2)，3.58(m，2H，CH2OH)，4.17(dd，1H，C5-H)，4.40(dd，1H；C5-H)，4.90(b，1H，环丁基的CH)，5.01(t，1H，C2-H)，5.42(b，H，OH)，5.87(b，2H，NH2)，6.19(dd，1H，C4-H)，7.62(b，1H，NH)，7.85(s，1H，C8′-8).
紫外分析(CH3OH)λmax为283nm和260nm。
实施例9(-)-(2R，4R)-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6′-{羧基-环丙基氨基}-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环(化合物C) 往(-)-(2R，4R)-2-苯甲酰氧基甲基-4-(2′-氨基-6′-氯-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环(210mg)的乙醇30ml溶液中加1-氨基-1-环丙烷羧酸(113mg，2eq.)和三乙胺(0.2ml，2.5eq.)。慢慢加热混合物，在80-85℃回流72h，然后冷却至室温。溶剂在真空中被蒸干。剩余物溶于20ml甲醇的氨溶液中并整夜搅拌。溶剂在真空中被去除，用硅胶柱层析对剩余物进行纯化，以95∶5至9∶1的CH2Cl2∶MeOH梯度除去副产物，用含0.5％乙酸的CH2Cl2∶MeOH(4∶1)洗脱，最后得到我们想要的产物，共80mg的纯产物，有42.5％的得率。
Rf＝0.34(CH2Cl2∶MeOH＝4∶1，含0.5％的乙酸)1H-NMR(DMSOd6)δ(ppm)1.05(b，2H，环丙基的CH2)，1.45(b，2H，环丙基的CH2)，3.58(b，2H，CH2-OH)，4.17(dd，1H，C5-H)，4.41(dd，1H；C5-H)，5.12(t，1H，C2-H)，5.15(b，1H，OH)，5.82(b，1H，NH)，6.19(dd，1H，C4-H)，7.71(b，H，NH)，7.86(s，1H，C8′-8).
紫外分析(CH3OH)λmax为283nm和264nm。
实施例10抗HIV活性抗病毒的检测。化合物A(-)的抗HIV-1活性，在先前的研究中，已有人用在各种各样的细胞类型中HIV-1IIIB的活性来评估(Gu等人，1992，1994，1999；Rando等人，1995；Salomon等人，1994)。简单的讲，将细胞与病毒一起培养3小时(用于T细胞试验的感染复数(MOI)为0.005，用于单核细胞试验的感染复数为0.5)，然后洗涤细胞，未结合的病毒被去除。随后将细胞接种于96孔平板上，感染的细胞用一系列浓度的试验化合物培养5-7天。抗-HIV-1的效力通过测试细胞培养上清液中的HIV-1 RT活性或p24水平加以确定。所有的评估均做双份。在每个试验中均用到齐多夫定和/或拉米夫定作对照。
化合物A(-)与被认可的抗-HIV剂的比较。在MT-2细胞中，化合物A(-)对HIV-1IIIB有0.083μM的EC50，这和拉米夫定、斯达夫定.扎西他宾以及阿巴卡韦四种抗-HIV-1的活性水平一致，但稍微小于齐多夫定(表1)。
表1.室温时，化合物A(-)与被认可的抗逆转录病毒剂抗HIV活性(用RT活性测定)的比较
对不同的细胞化合物A(-)的抗HIV-1活性。化合物A(-)的抗HIV-1活性在不同类型细胞中进行了检测，所述细胞包括人外周单核细胞(PBMCs)、T细胞(MT-2和MT-4)和单核细胞(U937)株。化合物A(-)在不同类型受试细胞中对HIV-1IIIB的EC50在微摩尔浓度以下(表2)。
表2.在不同类型的细胞中化合物A(-)的抗HIV-1效能(由RT活性测定)细胞 EC50(μM)化合物A(-) 齐多夫定 拉米夫定PBMC(3)*0.22 0.0027 0.035MT-2(4)0.082 0.0051 0.061MT-4(2)0.14 0.015 0.17U937(1)0.82 0.027 0.014*括号里的数字是测定的次数。
此外，我们还用不同类型的HIV-1毒株来检测化合物A(-)的抗逆转录病毒活性。表3结果表明，化合物A(-)对非合胞体细胞诱导株(HIV-19881)、dual tropic株HIV-1macBAL和monocytropic株(HIV-1WRM8488)是有效的。
表3.化合物A(-)对不同类型HIV-1毒株的抗HIV活性(用p24测定)EC50(μM)
HIV-19881PBMC0.590.0017HIV-1macBALPBMC4.140.043m/m 0.022 ＜0.0011HIV-1WRM8488m/m0.028 ＜0.0011实施例11毒性评价可用不同细胞的3H-胸苷摄入情况来评估化合物对细胞的毒性。不同的细胞，包括Molt-4、HT1080、DU-145、HepG-2和HSF，放在每孔有1×103-2×103个细胞的96孔平板中培养。24小时培养期过后，在培养基中分别加入10倍系列稀释的化合物(10-4-10-10M)，继续培养72小时。在最后18小时的培养期中加入3H-胸苷。与3H-胸苷培养之后，用PBS洗涤细胞一次，如果细胞粘附在一起，用胰蛋白酶处理，然后再悬浮于水中(低渗的溶液使细胞破裂)。将细胞抽提液直接加入到Tomtec Harvester 96中，使用该仪器，将抽提出来的DNA吸附在滤器上并洗涤，然后计数掺入DNA的3H-胸苷。50％的细胞毒性浓度(CC50)通过对试样在上述化合物的存在下的每分钟放射性计数与对照试样进行比较而加以确定。
化合物的细胞毒性也可以用MT-2、H9、Turkat、U937和CBMCs细胞增殖的WST-1染色法来检测。在96孔平板中，以RPMI为培养基，每孔5×104个细胞，培养已建立的细胞系，同时以每孔0.5×106个细胞培养CBMC。在第0天加入10倍系列稀释的(10-4-10-7)化合物。第四天，更换一半培养基(含有适当稀释的化合物)使细胞传代。第七天，使用Boehringer Mannheim公司提供的WST-1试剂及供应商提供的方案检测细胞的活性。结果如表4。
表4.毒性
·以50mg/kg/天的剂量给小鼠腹腔内给药5天产生的体重增加效果(CDI成年雄性小鼠)实施例12初步药物动力学研究通过给成年的雄性大鼠尾静脉注射(5mg/kg)和口服(20mg/kg)来评价化合物的生物利用度。静脉注射后分别在第2、5、15、30、60、90、120和240分钟抽取大鼠血样；口服则在第5、15、30、60、90、120、240和360分钟抽取血样。
试验步骤制备血浆从静脉注射和口服给药的大鼠尾抽出1ml血样到含有EDTA(3ml)的离心管(vacutainer)中。在4℃条件下，以2000×g将血样离心15分钟。
HPLC分析分析条件HPLC系统二个Waters 616泵系统和二个带有PDA 996的Alliance 2690系统。
分析柱Phenomenex Luna C18(2)，5μm，250×4.6mm
梯度溶剂A0％→35％，20分钟。溶剂A是含有0.01％TFA的乙腈。溶剂B是含有0.01％TFA的、用0.25μm Millipore过滤器滤过的水。
流速1.0ml/分钟，UV200-350nm。
固相抽提将用水稀释到1ml的血样加载到Abselut Nexus吸附剂(#1210-3100)上，抽低真空(大约5｀｀Hg)使其流过。然后加入1ml去离子水至吸附剂，再抽真空使其流过。在高真空(＞10｀｀Hg)中干燥抽提柱1分钟。在Abselut Nexus分析柱上加入1ml的甲醇，洗提液以1-2ml/分钟的速度收集。用Speed Vac蒸发洗提液至干，样品重新用120μl的水溶解；100微升用来注射。结果如表5。
表5.药物动力学和口服的生物利用度
实施例14化合物A(-)的耐药性特点HIV-1的重组变体是通过定点诱变(Gu等人，1992，1994)方法而得到的，该方法将所设计的突变引入HXB2-D中。通过使MT-4细胞转染上有感染性的病毒DNA构建物而制得病毒原种。化合物A(-)的抗病毒活性的评价与实施例10中的一样。化合物A(-)对在反转录酶中有K65R和/或M184V突变的HIV-1变种的活性轻微减少，但对其他的变种(这些变种对齐多夫定、非核苷类抑制剂和蛋白酶抑制剂有耐药性)仍是敏感的(表6)。
表6.化合物A(-)对重组的耐药性HIV-1变种的效力(用RT活性测定)
1.那韦拉品的EC50＞10·M。
2.沙喹那韦的EC50是0.028·M，沙喹那韦对wtHXB2-D的EC50是0.0015·M。
实施例15化合物A(-)抗临床HIV-1分离株的效果通过与得自正常供体的PBMC共培养而从HIV-1感染的个体的PBMC中分离出临床毒株。为确定HIV-1临床分离株的RT基因型，将前病毒的DNA从CD4+T细胞或PBMC中抽提出来，然后用先前报道的PCR方法(Gu等人，1992)将完整的RT编码区域扩增。将PCR产物纯化，然后用RTS(5′-CCAAAAGTTAAACAATGGC-3′)做引物直接测序，该引物位于RT编码区的5′端(HXB2-D坐标的2603-2621泣核苷酸)。抗病毒活性的评价方法与实施例10一样。
表7.化合物A(-)抗临床HIV-1分离株的活性(用RT活性测定)
a.S表示敏感，R表示耐药性。
b.平均EC50值。
c.在同一组中分离株EC50的范围。
表8.化合物A(-)抗PBMC临床耐药分离株的活性(用p24测定)
*R表示耐药性实施例16药物并用的效果化合物A(-)与抗HIV-1剂并用效果的可以在MT-2或PBMC中用HIV-1IIIB来评价。采用药物浓度的棋盘方式并用药物。抗病毒的作用可通过对培养上清液RT活性的监控而测定。用Chou和Talalay(Chou和Talalay，1984)以及Prichard(Prichard等人，1993)描述的方法对数据进行分析。用CalcuSyn软件(Biosoft，Cambridge，UK)对化合物A(-)及其它的抗HIV-1剂的并用指数(CI)进行计算。理论上，CI为1说明有加和作用，CI＞1说明有拮抗作用，CI＜1说明有协同作用。用MacSynergyII软件来计算药物并用的协同作用或拮抗作用。
表9在MT-2细胞中化合物A(-)与齐多夫定并有的作用
表10.
在PBMC中化合物A(-)与AZT并用作用
表11.在MT-2细胞中化合物A(-)与拉米夫定并用的作用
表12.在MT-2细胞中化合物A(-)与斯达夫定并有的作用
表13.在MT-2细胞中化合物A(-)与那韦拉品并用的作用
实施例17细胞毒性分析用3H-胸苷摄入(de Muys等人，1999)和WST-1染色法检测细胞毒性。在3H-胸苷摄入试验中，将Molt-4、HT1080、DU-145、HepG2和HSF放在96孔平板中，每孔细胞浓度为1-2×103。PHA刺激的PBMC则以每孔4×104个细胞的浓度培养。24小时的预培养后，加入试验化合物(浓度从10-4M到10-10M)，继续培养72小时。在最后18小时培养中加入3H-胸苷。细胞先用PBS洗涤一次(如果细胞粘附在一起的话用胰蛋白酶处理)，然后再悬浮于水中(低渗的溶液使细胞破裂)。将细胞抽提液直接加入到Tomtec Harvester 96中。50％细胞毒浓度(CC50)通过对药物处理过的样品与未处理的对照细胞的每分钟放射性计数进行比较而确定。
在WST-1染色试验中，将细胞系置于有RPMI培养基的96孔平板中培养，每孔5×104个细胞。CBMC的浓度则是每孔0.5×104个细胞。第0天加入化合物(浓度为10-4M到10-7M)。第七天根据Boehringer Mannheim公司提供的方案，用WST-1试剂检测细胞的生存能力。
根据3H-胸苷掺入和WST-1染色法的检测结果，在不同类型的细胞中，化合物A(-)的细胞毒性要比齐多夫定与扎西他宾的细胞毒性小得多(表14)。
表14.化合物A(-)的细胞毒性
实施例18线粒体DNA毒性分析化合物A(-)的线粒体DNA(mtDNA)毒性可在HepG2细胞中检测。在有化合物A(-)存在的条件下，培养该细胞28天。细胞每周传代一次。但是，含该化合物适当浓度的细胞培养基每周更换两次。扎西他宾用作对照。毒性通过southern杂交法(de Muys等人，1999)测量mtDNA与核DNA(28sr DNA)的含量比加以确定。化合物A(-)、直到100μM也没有出现显著的mtDNA毒性，这浓度是试验中达到的最高浓度(
图1)。
实施例19本发明化合物的药物动力学研究化合物A(-)、DAPD和DXG的单一剂量给药是通过颈静脉注射10mg/kg或者口服20、125、500、1000或2000mg/kg。在口服药物前，所有的大鼠都要禁食12小时。静脉注射与口服给药用的赋形剂是用1N的HCl酸化使其pH值为3.15的0.1％羧甲基纤维素和0.1％Tween 80的蒸馏水溶液。血样从所有口服给药的大鼠身上抽取，抽取时间依下面计划表中所示。在各自给药的全部10只大鼠中，在7个时间点从颈静脉注射的大鼠(第2、5、15、30、60、120和240分钟)以及口服20mg/kg的大鼠(第5、15、30、60、120、240和360分钟)身上抽取血样，对于口服125-2000mg/kg的大鼠，还要在第480分钟和第1440分钟抽取。在第1440分钟，当所有的大鼠都安乐死以后从颈静脉抽取血样。结果，除了第1440分钟外，每个时间点都取四份。
口服给药的大鼠的血样采集时间表时间(分钟) 51530601202403604801440大鼠No.1× ×× ×大鼠No.2 × × × ×大鼠No.3× × ×× ×大鼠No.4 × × ×× ×大鼠No.5× ×× ×大鼠No.6× × × ×大鼠No.7 ×× × ×大鼠No.8× ×× ×大鼠No.9 × × × ×大鼠No.10 × × × ×每一大鼠在每一时间点采血约1ml，制备血浆试验步骤血浆的制备从静脉注射和口服给药的大鼠尾巴中抽出1ml血样到含有EDTA(3ml)的离心管中。在4℃条件下，以2000×g将血样离心15分钟。
HPLC分析分析条件HPLC系统二个Waters 616泵系统和二个带有PDA 996的Alliance 2690系统。
分析柱Phenomenex Luna C18(2)，5μm，250×4.6mm梯度溶剂A0％→35％，20分钟。溶剂A是含有0.01％TFA的乙腈。溶剂B是含有0.01％TFA的用0.25μm Millipore过滤器滤过的水。
流速1.0ml/分钟，UV200-350nm。
固相抽提将用水稀释到1ml的血样加载到Abselut Nexus吸附剂(#1210-3100)上，在低真空(大约5″Hg)下使其流过。然后吸附剂上加入1ml去离子水，再在真空下流过。在高真空(＞10｀｀Hg)中干燥抽提柱1分钟。在Abselut Nexus分析柱上加入1ml的甲醇，洗提液以1-2ml/分钟的速度收集。用Speed Vac蒸干洗提液，样品重新用120μl的水溶解；100微升用来注射。结果如表15和16所示。
表15.给大鼠静脉注射(10mg/kg)或口服(20mg/kg)化合物A(-)的PK参数
表16.静脉注射或口服DAPD后雄性与雌性大鼠的DAPD与DXG的药物动力学参数
以下是本申请中所引用的全部参考文献1.De Muys，J.-M.，H.Gourdeau，N.Nguyen-Ba，D.T.Taylor，P..S.Ahmed，T.Mansour，C.Locas，N.Richard，M.A.Wainberg和R.F.Rando.1999. 2′-脱氧-3′-氧杂-4′-硫代胞苷的抗HIV-1活性、细胞内代谢以及药物动力学评价.Antimicrob.Agents Chemother.431835-1844.
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权利要求
1.式(I)的顺式核苷及其药用盐 式中n表示1或2；R4选自H、COOH、CONH2、OH、SH、NH2、NO2、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、卤素、CORa和COORb，其中，Ra指C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基，Rb指C1-6烷基、C2-6链烯基或C2-6炔基；R3表示H或C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基；X选自H、一磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯；被C1-6烷基、C2-6链烯基、C2- 6炔基、C6-10芳基所取代的羰基，或者是 其中每个Rc独立地选自H、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基或羟基保护基团；所述核苷是指(-)对映异构体、(+)对映异构体及其混合物，包括外消旋混合物。
2.如权利要求1所述的核苷，其中，所述核苷呈(-)型，其至少95％无(+)型。
3.如权利要求1所述的核苷，其中，所述核苷呈(-)型，其至少97％无(+)型。
4.如权利要求1所述的核苷，其中，所述核苷呈(-)型，其至少99％无(+)型。
5.如权利要求1所述的化合物，其中，所述羟基保护基团选自乙酰基-2-硫乙基酯、新戊酰氧基甲基酯或异丙基氧基羰基氧基甲基酯。
6.如权利要求1所述的化合物，其中，X是H。
7.如权利要求1所述的化合物，其中，n是1。
8.如权利要求7所述的化合物，其中，R3是H或甲基，或者R4是H。
9.如权利要求7所述的化合物，其中，R4是H；COOH；CONH2；C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基或COORb，式中，Rb是C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基。
10.如权利要求7所述的化合物，其中，R4表示H、COOH或C1-6烷基。
11.如权利要求7所述的化合物，其中，R4表示甲基或乙基。
12.如权利要求7所述的化合物，其中，R4是COOH。
13.如权利要求7所述的化合物，其中，R3和R4都是H。
14.化合物顺-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6′-环丙基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环及其药用盐。
15.化合物顺-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6′-环丁基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环及其药用盐。
16.化合物顺-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6′-〔1-羧基-环丙基氨基〕-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环及其药用盐。
17.化合物(-)-(2R，4R)-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6′-环丙基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环，其至少97％无相应的(+)型对映异构体。
18.化合物(+)-(2S，4S)-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6′-环丙基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环，其至少97％无相应的(-)型对映异构体。
19.化合物(-)-(2R，4R)-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6′-环丁基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环，其至少97％无相应的(+)型对映异构体。
20.化合物(+)-(2S，4S)-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6′-环丁基氨基-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环，其至少97％无相应的(-)型对映异构体。
21.化合物(-)-(2R，4R)-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6′-〔1-羧基-环丙基氨基〕-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环，其至少97％无相应的(+)型对映异构体。
22.化合物(+)-(2S，4S)-2-羟甲基-4-(2′-氨基-6′-〔1-羧基-环丙基氨基〕-嘌呤-9′-基)-1，3-二氧戊环，其至少97％无相应的(-)对映异构体。
23.对治疗病毒感染有用的组合物，包括权利要求1-21中的任一项所述的至少一种化合物或其药用盐；它还包括另一种选自核苷类似物、NNRTI或蛋白酶抑制剂的治疗剂。
24.如权利要求23所述的组合物，其中，所述核苷类似物选自齐多夫定、地达诺新、斯达夫定或拉米夫定。
25.如权利要求23所述的组合物，其中，所述非核苷反转录酶抑制剂选自那韦拉品、地拉韦啶或额发韦任。
26.如权利要求23所述的组合物，其中，所述蛋白酶抑制剂选自印第那韦、纳尔芬那韦、或来顿那韦。
27.用于医学治疗的权利要求1到22中的任一项所述的化合物。
28.用于治疗病毒感染的权利要求1到22中的任一项所述的化合物。
29.用于治疗HIV感染的权利要求1到22中的任一项所述的化合物。
30.用于治疗HBV感染的权利要求1到22中的任一项所述的化合物。
31.权利要求1到22中的任一项所述的化合物在制造治疗病毒感染的药剂中的应用。
32.一种治疗病毒感染的方法，其中包括给需要这种治疗的患者以治疗有效量的权利要求1到权利要求22中的任一项所述的化合物。
33.权利要求32所述的方法，其中，所述病毒感染是HIV感染。
34.权利要求32所述的方法，其中，所述病毒感染是HBV感染。
35.一种药物制剂，它包含至少一种权利要求1到权利要求22中的任一项所述的化合物和至少一种药用载体或赋形剂。
全文摘要
本发明提供一种式(Ⅰ)或者(Ⅰa)的核苷类似物,该核苷类似物是一种有用的抗病毒剂。
文档编号A61P31/18GK1334814SQ99816209
公开日2002年2月6日 申请日期1999年12月22日 优先权日1998年12月23日
发明者N·恩古耶-巴 申请人:希拉生物化学股份有限公司