使用组织特异性模拟肽配体的靶向递送的制作方法
【专利说明】使用组织特异性模拟肽配体的靶向递送
[0001] 本申请是申请日为2010年9月3日、申请号为201080049232. 6、发明名称为"使 用组织特异性模拟肽配体的靶向递送"的中国专利申请的分案申请。
[0002] 发曰月抟术领域
[0003] 本发明总地涉及疾病治疗和诊断领域，并且更具体地涉及用于将药剂递送到特异 性靶组织的新组合物和方法的开发。
【背景技术】
[0004] 在不限制本发明的范围的前提下，将其背景结合向特异性靶组织递送进行描述。
[0005] 用于癌症治疗的经静脉注射疗法被认为是最终的疗法，由于所有的肿瘤及其转移 瘤是由血管维持的。这些肿瘤血管床是足够渗漏的，从而使脂质体能直接达到肿瘤细胞。可 以使用递送到肿瘤脉管系统的抗血管生成药物或者基因疗法来阻止向肿瘤的血液供应，从 而引起肿瘤消退。
[0006] 靶向递送对于最高的疗效和降低的毒性而言是必要的。在多数脂质体递送系统广 泛的治疗应用中，主要的限制在于其体内转染效率低，在经静脉递送之后在肺中的累积，聚 集，全身性递送之后的清除（例如被Kupffer细胞），不能将所注射的脂质体复合物的大部 分递送到靶细胞和器官以及其他组织。缺少用于有效靶向的已知细胞表面受体使得用于癌 症治疗的靶向递送更加复杂。
【发明内容】
[0007] 本发明包括用于治疗剂的组织特异性靶向递送的靶向配体。所述的配体包含组合 物，该组合物具有式A-骨架-A'和一种或多种共价连接到骨架上的疏水锚。连接到所述骨 架上的所述A和A'化合物包括单价模拟肽（peptidomimetic)化合物，其中各个单价模拟肽 化合物选自：片段IKs、GKs、IDs、GSs、GTs、VSs、TKs、KTs、ARs、KIs、KEs、AEs、GRs、YSs、IRs 和吗啉（morpholino)。化合物A和A'可以是相同的。所述的骨架可以包含反应性二氯三 嗪基团。在一个实施方案中，一个或多个所述的疏水锚包含烃部分。在一个实例中，所述的 烃部分可以是十八烷基基团。所述的靶向配体还可以包含一个或多个接头，所述的接头是 可切割的或者不可切割的，所述的接头官能上（functionally)插入到骨架和疏水销之间。
[0008] 本发明还提供了合成用于靶向递送治疗剂的小分子复合物的方法。所述的方法包 括将两个或多个单价模拟肽化合物共价地偶联到骨架，其中各个单价模拟肽化合物选自： 片段IKs、GKs、IDs、GSs、GTs、VSs、TKs、KTs、ARs、KIs、KEs、AEs、GRs、YSs、IRs和吗啉；并 且将一个或多个疏水锚偶联到该骨架。A和A'化合物可以是相同的。所述的骨架可以包含 反应性二氯三嗪基团。在一个实施方案中，一个或多个所述的疏水锚包含烃部分。在一个 实例中，所述的烃部分可以是十八烷基基团。所述的靶向配体还可以包含一个或多个接头， 所述的接头是可切割的或者不可切割的，所述的接头官能上插入到骨架和疏水锚之间。
[0009] 本发明还包括配体官能化的递送系统，所述的递送系统包含治疗剂载体，以及用 于将治疗剂的组织特异性靶向递送的靶向配体。在一个实施方案中，所述的治疗剂载体是 脂质体。在一个实例中，所述的靶向配体非共价地通过一个或多个疏水锚，锚定在阳离子型 脂质体的外部脂双层的外表面上，所述的阳离子型脂质体具有内部脂双层和外部脂双层。
[0010] 本发明的另一个实施方案包括将有效负载（payload)递送到靶组织的方法。该 方法包括步骤：合成用于将治疗剂的组织特异性靶向递送的靶向配体；将该靶向配体引入 到包裹了治疗剂的脂双层中，所述的脂双层如细胞膜或者亚细胞的膜，或者多层或两层囊 泡，或者更具体地为双室泡；将所述的脂质体使用靶向配体进行覆盖；将此靶向脂质体复 合物与可逆掩蔽试剂（reversemaskingreagent)组合；并且将治疗有效量的该经掩蔽 的靶向脂质体复合物给予患者。在一个实施方案中，所述的脂质体可以是两层内陷的囊泡 (bilamellarinvaginatedvesicle，"BIV"）。具有约500Da或者更低的分子量的小的中 性脂质可以用作可逆掩蔽试剂。所述的靶组织可以包括人胰腺癌、人乳腺癌、人非小细胞 肺癌、人非小细胞肺癌血管内皮、黑色素瘤或者人胰腺癌血管内皮。靶向配体的实例包括 以下化合物中的至少一种，所述化合物为KB995、KB1001、KB1003、KB1005、KB1012、KB1023、 KB1029、KB1035、KB1036、KB1039、KB1042、KB1051、KB1061、KB1062、KB1063、KB1064、KB1066、 KB1067、KB1096、KB1107、KB1108或者KB1109。在一个方面，所述的靶组织是黑色素瘤，并 且所述靶向配体是化合物KB1037、KB1109和KB1123的至少一种。
[0011] 在另一个实施方案中，本发明包括分离用于结合靶组织的模拟肽化合物的方法， 所述的方法包括步骤：制备具有式：A-骨架-A'的组合物，其中A和A'包括单价模拟肽化 合物，其中各个单价模拟肽化合物选自：片段IKs、GKs、IDs、GSs、GTs、VSs、TKs、KTs、ARs、 KIs、KEs、AEs、GRs、YSs、IRs和吗啉；并且一种或多种疏水锚共价地连接到骨架上；将靶组 织与模拟肽化合物接触；分离与靶组织特异性地结合的模拟肽化合物；并且表征特异性地 连接到靶组织的组合物的式。所述的靶组织可以包括人胰腺癌、人乳腺癌、人非小细胞肺 癌、人非小细胞肺癌血管内皮、人黑色素瘤或者人胰腺癌血管内皮。在一个方面，该方法包 括用于在解离后直接筛选患者细胞的高通量检测。在一个方面，所述的模拟肽化合物文库 使用例如铕或者铽穴合物代替疏水尾部来进行标记。使用时间分辨荧光分析直接进行筛选 经解离的患者细胞以及肿瘤对正常。
[0012] 在一个实施方案中，本发明包括筛选结合到靶组织或细胞的模拟肽化合物的方 法，所述的方法包括步骤：制备具有式:A-骨架-A'的组合物的模拟肽文库，其中A和A'包 括模拟肽化合物，其中各个单价模拟肽化合物选自：片段IKs、GKS、IDS、GSS、GTS、VSS、TKs、 KTs、ARs、KIs、KEs、AEs、GRs、YSs、IRs和吗啉；将一种或多种脂双层锚共价连接到所述的模 拟肽化合物上；将该模拟肽化合物与脂质混合以形成脂质体；将靶组织与模拟肽化合物接 触；分离特异性结合到靶组织的模拟肽化合物；并且表征特异性结合到靶组织的组合物的 式。
[0013] 再另一个实施方案是筛选结合到靶组织或细胞的模拟肽化合物的方法，所述的方 法包括步骤：制备组合物的模拟肽文库，所述的组合物具有式：A-骨架-A'，其中A和A'包 括模拟肽化合物，其中各个单价模拟肽化合物选自：片段IKs、GKS、IDS、GSS、GTS、VSS、TKs、 KTs、ARs、KIs、KEs、AEs、GRs、YSs、IRs和吗啉；将一种或多种脂双层锚共价连接到所述的模 拟肽化合物上；将该模拟肽化合物与脂质混合形成脂质体，其中所述的脂质体还包含用于 递送到细胞的核酸；将靶组织与模拟肽化合物接触；将特异性结合到靶组织的模拟肽化合 物分离；并且表征特异性结合到靶组织的组合物的式。在一个方面，所述的靶组织进一步定 义为组织培养物中的细胞。在另一个方面，所述的靶组织进一步定义为组织培养物中的细 胞，并且所述的细胞是根据核酸对细胞的影响进行选择的。在再另一个方面，所述的靶组织 进一步定义为组织培养物中的细胞，其中所述的核酸是用于阴性或阳性选择的选择性标记 物，其表达用于阳性或阴性选择的选择性标记物，或者表达可检测的标记物。
【附图说明】
[0014] 为了更完全地理解本发明的特征和优点，在此参考本发明的详述以及所附的图， 并且其中：
[0015] 图1是识别化合物的一般方案（generalscheme)的图；
[0016] 图2显示了通过哌啶与取代的荧光素的选择性反应制备二聚体；
[0017] 图3显示了靶向策略的优化，经优化的靶向策略用于将90%以上的经静脉注射的 BIV复合物专一地递送到靶细胞中；
[0018] 图4显示了本发明的多种化合物的结构，一般结构在顶部显示，具体结构从左到 右列出，分别为KB991-KB1005;
[0019] 图5总结了本发明的结合部分的组合（A和/或A'）；
[0020] 图6显示了本发明的结构的一个实例，一般结构在顶部显示，具体结构从左到右 列出，分别为KB991-KB1005;
[0021] 图7a到7d显示了在本发明的结合部分的部分优化（A=Frag.A和/或A' = Frag.B)；
[0022] 图8是显示了所列出的化合物针对MCF7细胞的转染效率的图；
[0023] 图9是显示了所列出的化合物针对A549细胞的转染效率的图；
[0024] 图10是显示了所列出的化合物针对MCF10A细胞的转染效率的图；
[0025] 图11是显示了使用经覆盖的脂质体递送系统中所列出的化合物，在Panel细胞中 相对荧光素酶表达的图；
[0026] 图12是显示了使用经覆盖的脂质体递送系统中所列出的化合物，在MiaPaCa2细 胞中相对焚光素酶表达的图；
[0027] 图13是显示了使用经覆盖的脂质体递送系统中所列出的化合物，在HPDE细胞中 相对荧光素酶表达的图；
[0028] 图14是显示了使用所列出的化合物，在HUVEC和HI299细胞的共培养物中转染增 强；
[0029] 图15是显示了单独使用所列出的化合物，在HI299细胞的培养物中转染结果的 图，未注意到增强；
[0030] 图16是显示了使用所列出的化合物，在HUVEC细胞的培养物中转染增强的图，未 注意到增强；
[0031] 图17显示了使用所列出的化合物，在HUVEC和PANC1细胞的共培养物中转染增 强；
[0032] 图18是显示了单独使用所列出的化合物，在PANC1细胞的培养物中转染结果的 图，未注意到增强；
[0033] 图19是显示了单独使用所列出的化合物，在HUVEC细胞的培养物中转染结果的 图，未注意到增强；
[0034] 图20a到20c，在共培养后，内皮CD31+表达的增加。在对细胞计数后，我们以 30:1HUVEC:H1299的点板比建立了共培养物。使用结合藻红蛋白的抗-⑶31Ab将内皮细胞 染色，并且在接种后使用流式细胞术每天测量内皮细胞的数量（由R3进行分选）。大多数 的内皮细胞表达低水平的CD31 (由R4进行分选）。少数的内皮细胞表达高水平的CD31 (由 R2进行分选）。在共培养后8天，所述共培养的内皮细胞群与HUVEC对照相比，CD31表达 显著提高（c)。在共培养物中9天后，与HUVEC对照（a，c)相比，共培养中（b，c)⑶31表达 的提高更多。*P= 0.026。
[0035] 图21a和21b。在共培养后内皮VEGF-A表达的提高。以10:1HUVEC:PANC1的点板 比建立共培养物，并在双室transwell盘中培养8天。收获内皮细胞并使用实时RT-PCR和 蛋白质印迹法测量VEGF-A的表达。与HUVEC相比，在共培养之后，内皮VEGF-A的表达在转 录（a)和翻译（b)的水平上上升了。*P〈0. 01，N= 6。
[0036] 图22a到22f。在共培养后管存活的延长。以10:1HUVEC:PANC1的点板比在 transwell盘中共培养后8天，收获内皮细胞并且接种到Matrigel上。16小时之后，HUVEC 对照（a)和共培养的内皮细胞（b)都形成类似毛细血管的管状结构。这些结构在48小时 之后开始降解。到72小时为止，HUVEC对照的管状结构几乎完全降解（c)。然而在共培养 物中，有显著量的管状结构存活（d)。这些结构保持了优秀的管状网络并且又存活了 11天 (e，f) 〇
[0037] 图23a和23b。二价小分子结构和文库筛选。二价小分子的一般结构（23a)包括 两个用于与细胞表面受体相互作用的0 _转角模拟物，用于插入到BIV脂质体复合物的烃 尾部，以及接头。还显示了我们"命中"的分子，KB1023的结构。使用高通量的荧光素酶检 测（23b)来筛选肿瘤内皮细胞特异性靶向配体。在共培养后7天，收获细胞并且按2X104 个细胞/孔接种到96孔板中。在同一天，制备了BIV-荧光素酶DNA:脂质体复合物，随后 将化合物在多个化合物：DNA的比率下进行覆盖。将经覆盖的复合物在室温下温育过夜。 次日将细胞使用含有〇. 52yL经覆盖的复合物的50yL无血清培养基进行转染。通过将 转染培养基更换为含血清的细胞培养基终止转染。在转染之后24小时，将细胞裂解，并且 将该细胞裂解液按20yL/孔加载到96孔板上用于荧光素酶分析，所述荧光素酶分析使用 Luminoskan板读数仪进行。
[0038] 图24是本发明方法的流程图。
[0039] 图25a到25h。靶向胰腺和肺肿瘤内皮细胞的配体。化合物KB1023提高了 PANC1+HUVEC共培养物（a)，而非PANC1细胞（b)或HUVEC(c)的转染效率。共培养物中对 内皮细胞间隙（endotheliumcompartment)的革巴向（d)使用双室的transwell培养系统证 实。KB1023也提高了与AsPCl细胞共培养后的内皮细胞的转染效率（e)。KB1061提高了 H1299和HUVEC(f)的共培养物中的转染效率，而非H1299细胞（g)或者HUVECs(h)的转染 效率。将荧光素酶基因的表达与未经覆盖的脂质体复合物进行了比较。*P〈〇. 05。
[0040] 图26a到26c。体内靶向和优化。在经静脉注射后24小时，大部分KB1023覆盖的 脂质体复合物非特异性地转染到肺和心脏中（a)。当使用可逆掩蔽（RM)进行注射，以及采 用提高RM试剂浓度时，经静脉注射后14小时的肺和心脏的非特异性摄取显著地下降。在 llmMRM下，经静脉注射后14小时肺和心脏显示出很少到没有非特异性摄取（b)，而经静脉 注射后14小时在肿瘤组织中的递送和随后的基因表达增加了约10倍（c)。在其他的非特 异性组织如肝脏（c)中未发现增加的递送，这表明该靶向对肿瘤中的内皮是特异性的。将 肿瘤血管内皮从肿瘤组织中解离从而进行CAT分析和蛋白质分析是不允许的；因此向肿瘤 血管内皮中的递送提高10倍是被低估的。由于肿瘤内皮约占整个肿瘤体积的5%，向肿瘤 血管中提高的靶向递送很可能比单独使用未经覆盖的BTV复合物高约200倍。RM超过llmM 进一步提高未增加向肿瘤组织中的递送，反而削弱了递送和随后的基因表达。因此，对于肿 瘤内皮的靶向递送，使用llmMRM是最佳的。在经静脉注射后14小时测量!^!'的表达，并 且与使用无RM的靶向递送的对照进行比较。*P〈〇. 01. ~P〈〇. 05. N = 4?5每组。
[0041] 图27,使用TSP1基因的靶向递送抑制肿瘤的生长。在经腹腔注射共培养物之后2 周，将包裹了 35yg TSP1 DNA的BIV脂质体复合物用配体KB1023覆盖，并且与llmM可逆 掩蔽（RM)经静脉共同注射到各个小鼠中。所述的注射每两周一次，总计经静脉进行三次注 射。最后一次注射后2周（经腹腔注射共培养物后8周），将小鼠处死从而比较腹内肿瘤的 尺寸。与仅注射了脂质体的对照小鼠相比，使用TSP1的人肿瘤内皮靶向递送处理小鼠证实 癌症的生长显著延缓。当将靶向递送与最佳的掩蔽（RM)组合时，肿瘤生长被极大程度上抑 制，几乎将肿瘤根除。当治疗增加到每周注射总共五次经静脉注射时，肿瘤生长进一步地被 抑制。*N = 20。其他组每组包括5?7只小鼠。#P〈0. 05。
[0042] 图28显示了SK-MEL-28细胞用KB1037、KB1109和KB1123转染后表达的增加。
[0043] 图29显示了腹壁黑色素瘤肿瘤细胞用KB1037、KB1109和KB1123转染之后表达的 增加；
[0044] 图30显示了左臀肌黑色素瘤肿瘤细胞用KB1037、KB1109和KB1123转染之后表达 的增加。
[0045] 发明描沐
[0046] 尽管在下文中详细讨论了本发明的多种实施方案的制备和使用，应当认识到本发 明提供了多种可实施的发明构思，所述的发明构思可以在大量的具体环境下进行实施。在 本文中讨论的具体实施方案仅仅是为了说明制备和使用本发明的具体方式，而不限制本发 明的范围。
[0047] 为了便于理解本发明，在下文中定义了多个术语。在本文中所定义的术语具有本 发明相关领域的普通技术人员通常所理解的意义。术语如"一个（a) "、"一个（an)"和"该 (the) "不意图仅指单个的实体，而是包括用具体例子说明的一般的类。本文的术语用于描 述本发明的具体实施方案，但是其使用不限制本发明，除非在权利要求中指出。
[0048] 在脂质体表面多聚化（multimerized)的小肽可以在重复的注射，尤其是全身性 注射后产生免疫应答，并且肽可以避免渗透及沿肿瘤的间质压力梯度的递送。其他更大的 配体，包括抗体、抗体片段、蛋白质、不完全蛋白等等比使用小肽远远更难用于脂质体表面 上的靶向递送。需要的是小的非免疫原性分子，该分子可以位于递送系统如脂质体的表面 上，从而将脂质体选择性地靶向到组织。
[0049] 模拟肽是模拟肽的生物活性的分子，但是在化学本质上不再是肽。术语模拟肽一 般描述了不再含有任何肽键（即氨基酸之间的酰胺键）的分子。
[0050] 如本文中所使用的，术语"模拟肽"指在本质上不完全是肽的分子，例如假肽 (pseudopeptides)、半肽（semi-peptides)和类肽（peptoids)。无论是完全地或者部分地 非肽，根据本发明的模拟肽提供了反应性化学部分的空间排布，该排布非常类似于在蛋白 质-配体相互作用的热点领域发现的二级结构基序的三维分布，例如设计用于对细胞表面 受体有亲和性的二价0转角模拟物。
[0051] 脂质体有效负载的靶向递送对于最大疗效和降低的毒性是必需的。一般地，本发 明提供了与现有的方法相比，以更高的效率介导将治疗递送到靶细胞中的配体。本发明还 提供了合成该靶向配体的方法，以及使用该配体将治疗有效递送到靶细胞中的方法。这些 靶向配体为小分子的事实使其能够无限制地重