尿病性心肌病小 鼠心室前壁（LVAWd)、后壁（LVPWd)和室间隔（IVSd)厚度的影响。
[0027] 图5 :P印2_A1、P印2-A2或P印2-A3多肽对STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病小 鼠心脏短轴缩短率（FS)和射血分数（EF)的影响。
[0028] 图6 :P印2-Al、P印2-A2或P印2-A3多肽对STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病小 鼠心脏血流动力学指标左心室收缩压上升最大速率（+dP/dtmax)(图6 (A))和舒张压下降 最大速率（-dP/dtmax)(图6 (B))的影响。
[0029] 图7 :P印2-Al、P印2-A2或P印2-A3多肽对STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病小 鼠心脏组织纤维化的影响。图7 (A)从左到右依次为对照组、模型组、P印2-A1、P印2-A2、 Pep2-A3多肽给药组小鼠心脏组织胶原经天狼星红染色后的代表性图片，图7 (B)为胶原面 积统计结果。
[0030] 图8 :P印2-A1、P印2-A2或P印2-A3多肽对STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病 小鼠心脏组织细胞因子TGF-P 1的影响。图8 (A)为对照组、模型组、P印2-A1、P印2-A2、 P印2-A3多肽给药组小鼠心脏组织TGF-P 1典型免疫组化图，图8 (B)为TGF-P 1表达统计 结果。
[0031] 图9 :P印2-Al、P印2-A2或P印2-A3多肽对STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病小 鼠心脏组织细胞因子IL-6的影响。图9 (A)为对照组、模型组、P印2-Al、P印2-A2、P印2-A3 多肽给药组小鼠心脏组织IL-6典型免疫组化图，图9 (B)为IL-6表达统计结果。
【具体实施方式】
[0032] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0033] 下述实施例中，部分物质的全称或相应的中文名称如下：
[0034] Langendorff:离体心脏灌流装置；
[0035] KHB:Krebs_Henseleit缓冲液；
[0036] Laminin:层粘连蛋白；
[0037] HEPES:羟乙基哌嗪乙硫磺酸；
[0038]BSA:牛血清白蛋白；
[0039]EDTA:乙二胺四乙酸；
[0040] NP-40:乙基苯基聚乙二醇；
[0041] TBST:含吐温-20的Tris缓冲液；
[0042] PMSF:苯甲基磺酰氟
[0043] PBS :pH7. 4的磷酸缓冲液
[0044] Leu(Leupeptin，亮肽素）、Pep(Pepstatin，胃酶抑素）、Apr(Aprotinin，胰蛋白 酶抑制剂)、DTT(Dithiothreitol，二硫苏糖醇）：均为蛋白酶抑制剂。
[0045] 下述实施例中，序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的多肽分 别称为Al、A2和A3,其连接P印2细胞穿膜肽（P印2的氨基酸序列为HLYVSPW，如序列表中 SEQ ID N0:4所示）后形成的嵌合多肽分别称为P印2-Al、P印2-A2和P印2-A3,上述多肽或 嵌合肽均由北京赛百盛基因技术有限公司人工合成。AUA2和A3通过两个谷氨酸链连接 到P印2的C端。以上嵌合肽的序列结构如下：
[0046] P印2-A1序列为：
[0047] -His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Ser-Leu-Ser-Gln-Met-Leu-Ser-M et-"C"（其序列如序列表中SEQID NO: 10所示)。
[0048] P印2-A2的序列为：
[0049] -His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Leu-Thr-Arg-Leu-L eu-Gln-Thr-Lys-"C"（其序列如序列表中SEQIDN0:11所不）。
[0050] P印2-A3的序列为：
[0051] "N" -His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Ile-Gly-Ala-Ala-Leu-Asp-Thr-I Ie-"C"（其序列如序列表中SEQIDNO: 12所示)。
[0052] 下述实施例中所述室温如本领域常规所述，一般指15~25°C。
[0053] 实施例1原代大鼠心肌细胞分离与培养
[0054] 雄性大鼠（6周龄)腹腔注射10000U/kg肝素，并按50mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥 钠进行麻醉后，迅速开胸取心脏，立即放入冰冷的PBS中。清理结缔组织并剥离主动脉，将 心脏悬挂于Langendorff灌注装置并固定，使心脏周围及灌流液的温度均保持在37°C，经 主动脉逆行灌流 Krebs-Henseleit 缓冲液 KHB (含有 118mM NaCl、4.8mM KCl、25mM HEPES、 1.25禮1(2?04、1.2511111%304、111111葡萄糖和51111牛磺酸，？117.4)5分钟，随后换消化液(含有 0? 7mg/mL II型胶原酶，0? 2mg/mL透明质酸酶，0? 1%BSA和25 ii MCa2+)持续灌注10分钟，将消 化液中的Ca2+浓度从25 ii M补充到IOOii M，再灌注5分钟。当心脏变软后，将心脏剪下置入 KHB中，剪去心房和基底部组织，将心室组织剪成约I X I X Imm碎块，用吸管轻轻吹打，见到 单个细胞和细胞团脱落，用240μm的尼龙网过滤,滤液经500转/分离心后置于KHB中，重 复离心一次并去上清，将沉淀细胞悬于DMEM培养基(含有2mg/mL BSA、2mM L-肉毒碱、5mM 肌酸、5mM牛磺酸、100IU/mL青霉素和lOOug/mL链霉素)。细胞计数后铺于Laminin包被的 培养皿，培养于培养箱（37°C，5%C0 2)中，待细胞贴壁2小时后更换DMEM培养基，并于DMEM 培养基中加入25mM高糖刺激。12小时后在培养基中直接加入0. 5mM的P印2-Al、P印2-A2、 P印2-A3,使其终浓度为5 ii M，相互作用24小时后收集细胞。
[0055] 实施例2免疫共沉淀的方法验证蛋白p62与蛋白TRB3在心肌细胞内存在相互作 用
[0056] 免疫共沉淀试剂如下：
[0057] (1)裂解液A液：0.6057gTris碱，1.7532gNaCl，0. 1017gMgCl2 ? 6H20,0.0742g EDTA，IOmL甘油，10mL10%NP-40,加去离子水至150mL，用HCl调pH值至7. 6,定容至191mL， 充分混匀，0. 45iim滤膜过滤，4°C储存。
[0058] (2)裂解液 B 液：200ii L2MP -磷酸甘油，4mL 2. 5M NaF，2mL IOOmM NaV03,2mL IOOmM PMSF，200iiL IM DTT，lmg/mL的Leu、P印、Apr各200iiL，总体积共9mL。母液于-20°C 储存。使用前，将B液中各成分的母液解冻，分别按上述组成比例加入A液中并混匀，得到 免疫共沉淀裂解液。
[0059] (3)ProteinA/GPlus-Agarose购自美国Santacruz公司。
[0060] 具体操作步骤如下：
[0061] 1)收集培养的原代大鼠心肌细胞。
[0062] 2)以免疫共沉淀裂解液裂解细胞，收获细胞总蛋白，将蛋白调整至15ii g/iU，取 200 y g蛋白留作"输入细胞裂解液"，以作为对照。
[0063] 3)剩余蛋白（除"输入细胞裂解液"之外的总蛋白，大约2mg)加入2 ii g P62抗体 (购自Sigma公司)或者与P62抗体种属相同的正常IgG抗体(购自Santa cruz公司），同时 加入IOii L Protein A/G Plus-Agarose充分重悬，4°C缓慢旋转摇动过夜。4°C、3000rpm离 心5min，小心吸除上清，宁可留下少量上清也不能吸到Agarose。加入0. 5mL免疫共沉淀裂 解液，混匀，冰浴静置lmin，4°C、3000rpm离心30sec，小心吸除上清。重复洗涤5次，最后一 次离心前静置5min。小心吸除上清，加入20-30 ii L2 X SDS凝胶加样缓冲液，混匀，95°C变性 3min，迅速转移至冰浴冷却。12000rpm室温离心2min，上清即为沉淀的蛋白样品，取部分或 全部进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
[0064] 结果如图1所示，在心肌细胞内TRB3蛋白与P62蛋白存在明显的结合，而P印-A1， P印-A2，P印-A3可以显著干扰这种结合。其中输入代表初始细胞裂解液，输出代表经过P62 抗体及对照抗体IgG沉淀过的裂解液。
[0065]实施例3链脲菌素（STZ)加高脂饮食诱导的2型糖尿病小鼠模型制备、实验分组 及给药方案
[0066] 1、模型制备
[0067]SPF级C57BL/6J小鼠(雄性，3-4周龄)购自北京维通利华实验动物技术有限公司， 饲养于中国医学科学院药物研究所实验动物中心，恒温恒湿，自由饮食。小鼠适应性饲养一 周后，按体重随机分为2组：高脂+STZ组40只，给予高脂高糖饲料（含有35%脂肪，18%蛋 白质，47%碳水化合物）；对照组10只，持续给予基础饲料(含有4%脂肪，18%蛋白质，78%碳 水化合物）直到实验结束。持续4周后，高脂+STZ组腹腔注射链脲菌素STZ溶液IOOmg / kg(溶于0.IM柠檬酸缓冲液，PH4. 5)，并继续给予高脂高糖饲料；对照组腹腔注射溶剂0.IM 柠檬酸缓冲液。再持续4周后尾静脉取血检测血糖（BG)，血糖>11.ImM表示高脂饮食诱导 的2型糖尿病小鼠模型构建成功。
[0068] 2、实验分组及给药方案
[0069] 将高脂+STZ组的小鼠按血糖>11. ImM (表示建模成功）随机分为四组并持续给 予高脂高糖饲料：模型组(糖尿病组）和给药组（P印2-A1，P印2-A2或P印