一种脱细胞颌下腺基质材料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发属于及生物医用材料的加工领域，具体涉及一种脱细胞颁下腺基质材料及其制备方法。
【背景技术】
[0002]细胞外基质(extracellular matrix, ECM)是由细胞分泌到细胞外间充质中的蛋白质和多糖类大分子物质。ECM通过高度组织有序的细胞外微环境，构成复杂的网架连接组织结构，对细胞的生存、分化等细胞生理活动具有关键的调节作用。因此，可模拟ECM的支架基底和支架材料是组织工程研宄和组织修复的理想载体。细胞与ECM的接触是动态的，ECM的变化将会导致邻近细胞形态和功能的改变。用于组织工程的理想支架材料需要为种植的细胞提供与体内ECM相同或者相似的微环境(包括ECM的组成、结构和生物力学特征等)。但是，天然的ECM是由多种蛋白质组成(主要分为胶原、糖蛋白、氨基聚糖及蛋白聚糖、弹性蛋白4大类)，并且具有复杂的结构，不易在体外重构与体内ECM组成相同和结构一致的ECM材料。通过不同化学、物理或酶学去细胞方法从组织和器官获得天然的ECM，为解决这一难题提供了新的有效解决途径。去细胞化基质具有组织或者细胞特异性的ECM蛋白质和微结构，同时具有良好的力学特性、细胞相容性以及生物降解性，有利于细胞粘附、生长、增殖及分化。
[0003]制备脱细胞基质材料的方法有很多，主要是通过物理、化学和生物酶综合处理的方法。中国专利申请号为201110134511.9的发明专利涉及制备一种脱细胞真皮基质材料的方法，虽然可以比较彻底地去除细胞而且处理时间短，但是制备过程中采用了十二烷基硫酸钠(SDS)的处理。由于SDS的强洗脱效果，很大程度上破坏了细胞基质的结构完整性和生物活性，此外使用SDS制备的细胞外基质具有潜在的生物毒性，不利于该基质材料对组织的三维结构重建。中国专利申请号为201210237911.7的发明专利涉及制备一种细胞外基质支架材料的脱细胞方法。虽然采用了吡喃葡萄糖苷降低了去污剂在清洗过程中可能对再植细胞造成的潜在生物毒性，但主要应用于含较多胶原纤维和弹力纤维的组织和器官，应用到被膜较薄，主要由腺泡结构组成的颁下腺组织中并不完全适用，并且本发明无需核酸酶处理，成本更低，方法也更为简便。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了克服以上技术的不足，采用健康的动物颁下腺组织为原料，应用复合酶处理剂和无机盐等化学物质，提供一种具有良好生物相容性和适当的生物降解速率的脱细胞颁下腺基质材料。
[0005]本发明的内容包括一种脱细胞颁下腺基质材料的制备方法，包括以下步骤:
[0006](I)选取健康的动物颁下腺组织，切成I厘米见方的小块，用PBS缓冲液清洗备用；
[0007](2)将颁下腺组织块反复冻融3次，破碎细胞；
[0008](3)把颁下腺组织块置于75%酒精中消毒；
[0009](4)将颁下腺组织块悬于入无菌三级水中，4°C中速搅拌处理6-12小时；
[0010](5)将颁下腺组织块悬于5mM CaCljP 5mM MgCl 2无菌溶液中，4°C中速搅拌处理12小时；
[0011](6)将颁下腺组块织悬于IM NaCl无菌溶液中，4°C中速搅拌处理12小时；
[0012](7)将颁下腺组织块悬于无菌PBS缓冲溶液中，4°C中速搅拌处理12小时，获得所述脱细胞颁下腺基质材料。
[0013]进一步地，所述步骤(I)中选取组织为新鲜的无病毒感染的、无病史的动物颁下腺。
[0014]进一步地，所述步骤(I)中将颁下腺组织切成的小块为Icm见方的小块。
[0015]进一步地，所述步骤(2)中，破碎细胞的方法为将组织块放入_80°C冰冻30分钟后取出，在37°C水浴解冻，如此反复冻融3次。
[0016]进一步地，所述脱细胞颁下腺基质材料可放置于含有90 μ g/ml氨苄的PBS中，4°C保存2个月以上。
[0017]本发明的内容还包括根据上述任意一项的方法制备获得的脱细胞颁下腺基质材料。
[0018]本发明的脱细胞颁下腺基质材料的制备方法中所有操作均在无菌超净工作台中进行。
[0019]采用本发明的方法所制备的脱细胞颁下腺基质材料，能够满足以下医学应用和医学研宄的要求:
[0020]1、作为颁下腺的替代品，用于手术后颁下腺损伤和缺失的修复。
[0021]2、可作为细胞培养和组织工程体外模型材料，如用于颁下腺再生和颁下腺发育研宄等。
[0022]本发明的方法和产品具有以下优点:
[0023]1、在维持动物颁下腺三维组织构造不变的前提下，彻底清除了动物颁下腺中的细胞成分，得到具有完整的三维组织构造的颁下腺基质。
[0024]2、具有良好的力学性能、可赋形性、良好的细胞分化增殖环境以及良好的粘附性會K ;
[0025]3、方法简便、易行，经济、合理、安全、可靠。
[0026]4、整个工艺过程属于清洁化制备，对环境无污染。
【附图说明】
[0027]图1a为含有细胞的新鲜小鼠颁下腺组织的HE染色显微镜照片(X200)，图1b为经脱细胞处理后的小鼠颁下腺细胞外基质材料的HE染色显微镜照片(X200)。
[0028]图2a为含有细胞的新鲜小鼠颁下腺组织的扫描电子显微镜照片，图2b为经脱细胞处理后的小鼠颁下腺细胞外基质材料的扫描电子显微镜照片。
[0029]图3为新鲜小鼠颁下腺组织DNA含量和脱细胞处理后小鼠颁下腺细胞外基质材料中的DNA含量柱状图。
[0030]图4a为含有细胞的新鲜小鼠颁下腺组织的Collagen I免疫组化结果，图4b为经脱细胞处理后的小鼠颁下腺细胞外基质材料的Collagen I免疫组化结果。
[0031]图5a为含有细胞的新鲜小鼠颁下腺组织的Collagen IV免疫组化结果，图5b为经脱细胞处理后的小鼠颁下腺细胞外基质材料的Collagen IV免疫组化结果。
[0032]图6a为含有细胞的新鲜小鼠颁下腺组织的Fibronectin免疫组化结果，图6b为经脱细胞处理后的小鼠颁下腺细胞外基质材料的Fibronectin免疫组化结果。
[0033]图7a为含有细胞的新鲜小鼠颁下腺组织的Laminin免疫组化结果，图7b为经脱细胞处理后的小鼠颁下腺细胞外基质材料的Laminin免疫组化结果。
[0034]图8a为含有细胞的新鲜大鼠颁下腺组织的HE染色显微镜照片，图Sb为经脱细胞处理后的大鼠颁下腺细胞外基质材料的HE染色显微镜照片。
[0035]图9为经脱细胞处理后的大鼠颁下腺脱细胞外基质的扫描电子显微镜照片。
[0036]图10为新鲜大鼠颁下腺组织DNA含量和脱细胞处理后大鼠颁下腺脱细胞外基质材料中的DNA含量柱状图。
[0037]图1 Ia和图1 Ib为小鼠颁下腺ECM材料在注射小鼠颁下腺原代细胞培养30天后的HE染色显微镜照片。其中图1lb为(X200)。
[0038]图12a和图12b为利用Matrigel作为基质模型诱导颁下腺干细胞分化，14天后的HE染色显微镜照片。其中图12a为(X100)，图12b为(X200)。
【具体实施方式】
[0039]下面通过实施例对本发明进行具体的描述。
[0040]实施例1小鼠颁下腺ECM的制作
[0041](I)取材:选取健康的小鼠的颁下腺组织，切成I厘米见方的小块，用PBS清洗两遍。至于EP管中-80°C冰箱备用。
[0042](2)破碎细胞:将组织块从_80°C冰箱取出在37°C水浴锅解冻后再放回-80°C冰箱冰冻30分钟，如此反复冻融3次。
[0043](3)消毒和准备:把组织块至于75%的酒精中，用缝合线将颁下腺组织块吊起，悬挂于250ml的广口瓶中，并在瓶底放置一枚Icm的磁力搅拌棒。
[0044](4)预清洗和破碎:加入250ml的无菌三级水，至于磁力搅拌器上(档位2)4°C处理6小时。
[0045](5)清洗并增强核酸酶酶活:将颁下腺组织换到装有250ml5mM CaCljP 5mM MgCl 2无菌溶液的小型搅拌循环器中。4°C处理12小时。
[0046](6)清洗细胞残片:将颁下腺组织换到装有250ml IM NaCl无菌溶液的小型搅拌循环器中。4°C处理12小时。
[0047](7)清洗:将颁下腺组织换到装有250ml无菌PBS缓冲溶液的小型搅拌循环器中，4°C处理12小时。
[0048]结果评价
[0049]1、ECM结构观察:ECM用10%中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5 μ m厚的薄片，经脱蜡脱水，苏木素-伊红(HE)染色，观察ECM结构，其HE染色显微镜照片见图lb，同时制作新鲜小鼠颁下腺组织的HE染色，其显微镜照片见图la。可见用本发明方法制备的小鼠ECM结构，证实无细胞结构残留，并且细胞外基质结构保持完整。
[0050]2、ECM超微结构观察:将ECM组织用临界点干燥仪干燥，镀金，扫描电子显微镜观察，拍摄电子显微镜照片见图2b，同时拍摄新鲜小鼠颁下腺组织电子微镜照片见图2a。对比两图可见用本发明方法制备的小鼠颁下腺ECM结构，可以完整地脱去细胞结构，并且比较完好地保留了细胞外基质结构的纤维结构。
[0051]3、ECM 中 DNA含量检测:将ECM组织磨碎后，用 DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)裂解消化提取DNA，并用Nano-drop (Thermo)测定DNA含量，并与新鲜小鼠颁下腺组织DNA含量进行对比，结果见图3。可见用本发明方法制得的小鼠ECM中，DNA含量减少了 98.75%,表明成功去除了绝大部分核酸残留。
[0052]4,ECM中Collagen I蛋白的免疫组化检测:ECM用10%中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5 μπι厚的薄片，经脱蜡脱水，去过氧化物酶，抗原修复，山羊血清封闭，孵育Collagen I抗体(稀释比例1:500) (abeam) 4°C过夜，孵育二抗室温I小时，DAB显色，封片观察，拍摄显微镜照片如图4b所示；同时拍摄新鲜小鼠颁下腺组织的Collagen I免疫组化显微镜照片4a作为对照。可见本发明制备的ECM材料较正常颁下腺