聚乙二醇类衍生物具有-0 (CH2CH2O) η-结构，η = 1，2, 3,4, 5,聚乙二醇类衍 生物末端活性基团是马来酰亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺，通过与赖氨酸末端的羧基形成稳 定的共价键起偶联及水化作用；
[0041] 所述放射性核素为发射β -、γ或β +射线的放射性核素；
[0042] 所述化学药物为紫杉醇。
[0043] 所述的叶酸复合物，其中发射β +射线的显像用放射性核素为68Ga、64Cu、mIn和 " mTc，发射β -的治疗性核素为89Sr、9°Y、177Lu。
[0044] X通过γ -羧基与Y上的氨基以共价键相连，Y主要用于Z和X的偶联，Z用来结 合放射性核素、化学药物、磁共振显像剂、荷载化学药物的纳米粒子。
[0045] 所述的叶酸二聚体复合物在制备肿瘤靶向显像和治疗的药物中的应用。所述的肿 瘤为叶酸受体高表达的肿瘤，如卵巢癌、子宫颈癌、乳腺癌等。
[0046] 本研宄：1.通过化学合成FA二聚体，通过赖氨酸连接D0TA、Ν0ΤΑ、NODAGA等偶联 剂，并进一步与放射性核素、荧光物质、化学药物结合，2.体内外实验考察其一般理化性能； 3.考察其叶酸受体靶向结合特异性。4.体内实验考察其药代动力学、毒理学、对卵巢癌移 植瘤、淋巴转移灶的药效学。
[0047] 本课题组首次通过体外固相法合成叶酸二聚体复合物，其结构为（赖氨酸-叶 酸）2_聚乙二醇 2_赖氨酸[即（K-folate)2-PEG2-K(以下简称FA2),可与叶酸受体靶向结 合，并与偶联剂（如D0TA、DTPA、N0TA、N0DAGA等）连接，偶联剂介导叶酸二聚体的放射性核 素（如 686&、64&1、11111 1、991^、895!'、9°￥、1'1 1)的标记。其中放射性核素可以是显像性放射性 核素如68Ga、64Cu、 mIn和99niTc,也可以是治疗性放射性核素如89Sr、9°Y、 177Lu等。体外实验考 查其体外稳定性，体内实验考察其体内药代动力学和生物学分布，并通过MicroPET/CT (或 microSPECT/CT)显像评价其在卵巢癌肿瘤部位的放射性摄取。
[0048] 本发明的有益效果：
[0049] 本发明制备的叶酸二聚体（FA2)，并通过化学修饰与显像剂或治疗性药物偶联，能 与细胞膜表面叶酸受体靶向性结合，达到增加肿瘤局部显像剂或治疗性药物的浓度。利用 该叶酸二聚体制备的放射性核素标记物，可作为诊断或治疗卵巢癌的靶向性药物，具有较 好的效果。
[0050] 与抗体不同，该配体无免疫源性，分子量小，血液清除快，肝脾等富网状内皮系统 摄取少且清除快，在卵巢、子宫等组织中分布少，而在卵巢癌、子宫颈癌（及其转移）病灶部 位浓聚多，可有效作为诊断和治疗用放射性核素的载体。
[0051] 与叶酸单体相比，叶酸二聚体可有效增加其在叶酸受体高表达区域的摄取，呈近 似等级性放大，可有效提高放射性核素在肿瘤及其转移灶的聚集，提高诊断效能和治疗效 果。
[0052] 本发明的重点是合成叶酸二聚体及其标记物，旨在通过增加肿瘤部位稳定性摄 取，有效提高显像质量和治疗疗效。本发明为叶酸受体高表达的肿瘤（如卵巢癌、子宫颈 癌、乳腺癌等）及转移灶的靶向诊断和治疗提供新思路和科学依据，并为其进入临床奠定 基础，具有较好的临床应用前景。
【附图说明】
[0053] 图 1 是 D0TA-FAJ9 HPLC 图。
[0054] 图2是DOTA-FA2的质谱图。
[0055] 图 3 是 68Ga-DOTA-FA2HPLC 图。
[0056] 图 4 是 68Ga-DOTA-FA2卵巢癌（SK0V3)荷瘤鼠 microPET/CT 融合显像。
[0057] 其中：a，b，c分别为冠状位3D，横断层图像，矢状位3D图像。
[0058] 图5是荷人卵巢癌（SK0V3)和肺癌（A549)裸鼠尾静脉注射mLu-DOTA-FA 2不同时 间肿瘤体积变化曲线。
[0059] 图6是荷人卵巢癌（SK0V3)裸鼠尾静脉注射mLu-D0TA-FA# Id (左上），4d(右 上），8d (左下），16d (右下）肿瘤组织病理检查结果（HE : X 10)
【具体实施方式】
[0060] 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
[0061] 实施例1
[0062] 一、DOTA-FA2的合成及其质控：
[0063] 1.叶酸-NHS (琥珀酰亚胺）酯的合成
[0064] (1)称取440mg叶酸溶解于40ml DMSO中，加入EDC. HCld-乙基-(3-二甲基氨基 丙基）碳酰二亚胺盐酸盐）200mg冰浴反应Ih ;
[0065] (2)称取120mgNHS加入反应体系中，冰浴Ih后室温反应过夜；
[0066] (3)过滤，蒸去有机溶剂，用蒸馏水洗，离心，冻干待用，标记为A。
[0067] 2.叶酸-Lys (DOTA)的固相合成
[0068] (1)称取 1.0 g wang 树脂（wang Resin 天津南开合成 1 % DVB, 100-200mesh， 0. 8-1. Ommol/g)于洁净干燥的反应管中，加入适量DMF，溶胀活化30min左右，然后称取第 一个氨基酸Fmoc-Lys (Dde) -OH (N-荷甲氧羰基-Ν' -[1-(4, 4-二甲基-2, 6-二氧代环己亚 基）乙基]-赖氨酸）0. 2mmol，DMAP(4-二甲氨基吡啶）40mg，DIC 0. 3ml加入到反应管中， DMF做溶剂室温反应3. 5h。反应完毕用DMF洗4~6次，加入适量吡啶和醋酸酐，体积比为 1: 1，反应30min。反应完毕用DMF洗4~6次。然后用20%哌啶溶液脱掉氨基酸的Fmoc， 脱两次共15min，10min+5min。再用DMF洗4次，甲醇洗2次，取出少量树脂用茚三酮检测试 剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应。
[0069] (2)称取tBu (叔丁基）保护的DOTA原料0· 3mmol，HBTU(苯并三氮 唑-N，N，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯）0. 3mmol，DMF做溶剂，加入0. 5ml的DIEA(N，N-二异 丙基乙胺）室温反应lh，反应完毕用DMF洗4-6次，检测无色即可经行下一步反应。
[0070] (3)力P 入 2 % 水合肼的 DMF 溶液脱 Dde (见 Fmoc-Lys (Dde)-OH) 30min， 10min+10min+10min，然后用DMF洗4次，甲醇洗两次，取出少量树脂用茚三酮检测试剂检 测，检测为蓝色，即可进行下一步反应。
[0071] (4)称取 FM0C-PEG2-C00H，0· 3mmol，HBTU 0· 3mmol, DMF 做溶剂，加入 0· 5ml 的 DIEA室温反应lh，反应完毕用DMF洗4~6次，然后用20%哌啶溶液脱掉氨基酸的Fmoc， 脱两次共15min，10min+5min。再用DMF洗4次，甲醇洗2次，取出少量树脂用茚三酮检测试 剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应。
[0072] (5)称取 FMOC-Lys (Dde)-C00H，0. 3mmol，HBTU 0· 3mmol，DMF 做溶剂，加入 0· 5ml 的 DIEA室温反应lh，反应完毕用DMF洗4~6次，然后用20%哌啶溶液脱掉氨基酸的Fmoc， 脱两次共15min，10min+5min。再用DMF洗4次，甲醇洗2次，取出少量树脂用茚三酮检测试 剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应。
[0073] (6)称取A (叶酸-NHS酯）0.3mmol，DMSO做溶剂，加入DIEA 5滴，室温反应Ih ;反 应完毕用DMF洗4~6次。
[0074] (7)加入2%水合肼的01^溶液脱0(^301^11，101^11+101^11+101^11，然后用01^洗4 次，甲醇洗两次，取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应。
[0075] (8)称取 BOC {叔丁氧羰基} -Lys (Fmoc) -C00H，0· 3mmol，HBTU 0· 3mmol，DMF 做溶 剂，加入0. 5ml的DIEA室温反应lh，反应完毕用DMF洗4~6次，然后用20 %哌啶溶液脱 掉氨基酸的Fmoc{荷甲氧羰基}，脱两次共15min，10min+5min。再用DMF洗4次，甲醇洗2 次，取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应。
[0076] (9)称取A (叶酸-NHS酯）0.3mmol，DMSO做溶剂，加入DIEA 5滴，室温反应Ih ;反 应完毕用DMF洗4~6次；甲醇洗两次，抽干。
[0077] (10)最后用95%三氟乙酸切割液切割2h，反应液抽滤，得叶酸的三氟乙酸溶液， 用乙醚沉淀，离心，然后再用乙醚洗3~5次，得白色固体，经HPLC纯化，冻干，使用高效液 相色谱仪（HPLC)和质谱仪（MS)对目标化合物进行分子量和化学纯度进行质量分析。
[0078] (11)合成不同PEG含量（PEGn)的叶酸二聚体，除第（4)步中，用FMOC-PEGn-COOH 外，其它合成过程与上述反应完全相同。
[0079] 3.质量分析
[0080] 使用高效液相色谱仪（HPLC)和质谱仪（MS)对目标化合物进行肽序、分子量和化 学纯度进行质量分析。
[0081] HPLC分析：参数：C18柱，（4. 6X250mm)，流动相：溶剂A为含0. 1%三氟醋酸的乙 腈，溶剂B为含0. 1 %三氟醋酸的超纯水，流动相梯度如下： 时间 A B 0,0 Imin 20°/ 80%
[0082] 20.Omin 40% 60% 30.0min 100% 0% 30.0 Imin Slop
[0083] 流速：1.0ml/min，紫外波长：220nm，加样体积为10 μ I。
[0084] 质谱分析条件：
[0085] Flow rate:0. 2ml/min Run Time: Imin
[0086] Buffer A :0.1 % HC00H in water Buffer B:0. 1%HC00H in Acetonitrile
[0087] 二·结果
[0088] I. DOTA-FA2*子结构式见式 1。
[0089]
【主权项】
1. 一种用于肿瘤靶向显像和治疗的叶酸二聚体复合物，其特征在于具有以下通式： X2-Y-Z-A 其中： 乂2为赖氨酸连接叶酸的二聚体或赖氨酸连接叶酸衍生物的二聚体； Y为具有"（聚乙二醇或聚乙二醇类衍生物）m-赖氨酸"结构的偶联物，m= 1，2, 3,4， 5 ； Z为DOTA、NOTA、CB-TE2A、DTPA、NODAGA、ox〇-D03A、PCTA、Hynic及它们的衍生物； A为放射性核素、磁共振显像剂、化学药物、或者荷载化学药物的纳米粒子； X，Y，Z和A各单元之间以共价键相连。
2. 根据权利要求1所述的叶酸二聚体复合物，其特征在于： 所述的叶酸衍生物为亚叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、2-去氨基-羟基叶酸、1-去氮叶酸、 3_去氮叶酸、或者8-去氮叶酸； 所述的聚乙二醇的平均分子量为500~40000 ; 所述的聚乙二醇类衍生物具有-O(CH2CH2O)n-重复结构，n= 1，2, 3,4, 5,聚乙二醇类衍 生物末端活性基团是马来酰亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺，通过与赖氨酸末端的羧基形成稳 定的共价键起偶联及水化作用； 所述放射性核素为发射e_、y或0 +射线的放射性核素； 所述化学药物为紫杉醇。
3. 根据权利要求2所述的叶酸复合物，其特征在于发射0 +射线的显像用放射性核素 为 68Ga、64Cu、mIn和 99mTc,发射 0 -的治疗性核素为 89Sr、9°Y、177Lu。
4. 权利要求1所述的叶酸二聚体复合物在制备肿瘤靶向显像和治疗的药物中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述肿瘤为叶酸受体高表达的肿瘤。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述叶酸受体高表达的肿瘤为卵巢癌、子 宫颈癌、乳腺癌。
【专利摘要】本发明属于医学领域，公开了一种与叶酸受体靶向结合的叶酸二聚体复合物及其应用。该复合物为X2-Y-Z-A，其中：X2为赖氨酸连接叶酸的二聚体或赖氨酸连接叶酸衍生物的二聚体；Y为具有“(聚乙二醇或聚乙二醇类衍生物)m-赖氨酸”结构的偶联物，m＝1，2，3，4，5；Z为DOTA、NOTA、CB-TE2A、DTPA、NODAGA等物质及它们的衍生物；A为放射性核素、磁共振显像剂、化学药物、或者荷载化学药物的纳米粒子；X，Y，Z和A各单元之间以共价键相连。该复合物可用于制备肿瘤靶向显像和治疗的药物，能有效提高放射性核素在肿瘤及其转移灶的聚集，提高诊断效能和治疗效果。
【IPC分类】A61K31-337, A61P35-00, A61K49-12, A61K51-06, A61K47-48, A61K51-04
【公开号】CN104815336
【申请号】CN201510194100
【发明人】邵国强, 王自正, 王峰, 谢静燕, 汤翠菊, 樊宏伟, 徐友娣
【申请人】南京市第一医院
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年4月22日