一种橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用图
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种橙皮苷的用途，特别是涉及一种橙皮苷在制备预防和/或治疗肺 纤维化疾病药物中的用途。 二、【背景技术】：
[0002] 肺纤维化（pulmonaryfibrosis，PF)是多种弥漫性间质性肺疾病的共同病理改 变和最终结局，临床主要表现为进行性呼吸困难，最终患者因呼吸困难而死亡。细胞外基质 (ECM)中胶原蛋白、弹性纤维以及蛋白糖类的过量堆积是其特征性的病理组织学变化。目 前，认为成纤维细胞的增殖和活化是ECM大量形成和堆积的主要原因，肺泡上皮细胞的间 质转化、成纤维细胞的增生是成纤维细胞的主要来源。在有害刺激、细胞因子等的作用下， 成纤维细胞活化，分泌大量的ECM。在这些因素中，TGF-0是目前公认的致纤维化因子，能 够诱导肺泡上皮细胞转化为成纤维细胞；促进成纤维细胞和肌成纤维细胞大量分泌ECM。 尽管对肺纤维化的发病机制有了更深入的认识，但临床治疗仍然不能令人满意。
[0003] 肺纤维化确诊后平均存活时间为3年，或出现临床症状后，存活5年。在肺纤维化 的终末阶段，肺移植是唯一有效的治疗方法。随着近年患者数量的增加，导致合适的供体的 缺乏，此外昂贵的医疗费用和移植后出现的免疫排斥等副作用，限制了肺移植的应用。糖皮 质激素类、免疫抑制剂和细胞毒类药物是目前治疗肺纤维化的药物，10-30%的接受糖皮质 激素治疗的患者显示出一定的疗效，但没有完全或持续缓解者。而且这些药物治疗均存在 副作用严重、长期疗效不能确定等问题。中药能够在一定程度上改善肺纤维化终末期患者 的生活质量，但也存在药理作用机制和作用靶点不明确问题，阻碍了其在临床的选择应用。 因此，具有靶点和作用机制明确、长期服用安全可靠等特点的药物开发，具有重要的意义。
[0004] 橙皮苷具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、调节免疫力、防辐射、保护心血管系统等药 理活性。橙皮苷对肺癌细胞的增殖有抑制作用，机制与干预细胞周期和诱导癌细胞的凋亡 有关。橙皮苷对肝纤维化有抑制作用，机制涉及TGF-e/Smad信号通路。另外，橙皮苷可用 于某些呼吸系统疾病的治疗，如急、慢性支气管炎等。截至目前，尚无橙皮苷防治肺纤维化 方面的相关研宄报道。 三、
【发明内容】
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[0005] 本发明要解决的技术问题是：提供一种橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾 病药物中的用途。橙皮苷通过抑制肺成纤维细胞增殖、抑制肺泡上皮细胞的上皮_间质转 化、抑制肺成纤维细胞活化，具有防治肺纤维化的新用途。
[0006] 为了解决上述问题，本发明采取的技术方案为：
[0007] 本发明提供一种橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途。
[0008] 根据上述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途，所述橙皮 苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中时，抑制肺成纤维细胞活化或增殖的有效浓 度为 12. 5 ~200yM。
[0009] 根据上述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途，所述橙皮 苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中时，抑制肺泡上皮细胞的上皮-间质转化的 有效浓度为25~IOOyM。
[0010] 根据上述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途，橙皮苷或 以橙皮苷为主要成分的药物组合物在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途。
[0011] 根据上述的橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途，所述药物 组合物为按照药学常规方法制备成的胶囊剂、滴丸剂、片剂或颗粒剂。
[0012] 本发明所述的橙皮苷是从芸香科柑橘属药材如枳实、枳壳、柑橘、柠檬、葡萄柚、橘 红、橙等中提取出来的；或者是通过化学方法合成的橙皮苷纯品。
[0013] 本发明的橙皮苷还可以与现有技术中具有防治肺纤维化的中药、西药联合使用。 包括但不限于丹参酮、川芎嗪、汉防己甲素、大黄素、恩替卡韦、维生素E和拉米夫定等。
[0014] 为了更好的理解本发明的实质性内容，以下结合橙皮苷的药理试验实例及其结 果，说明橙皮苷在制备预防和/或治疗肺纤维化疾病药物中的用途。
[0015] 实验例1:橙皮苷对人胚肺成纤维细胞（MRC-5)细胞增殖的影响
[0016] 1)材料与方法:MRC-5细胞购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。MEM培养 基（由武汉博士德生物工程有限公司提供该产品）、胎牛血清（由浙江天杭生物科技股份有 限公司提供该产品）。
[0017] 3.OXIO3的MRC-5细胞加入到96孔板的板孔中，培养24小时。吸出原培养液， 加入含有不同浓度（12. 5yM、25yM、50yM、100yM、200yM)的橙皮苷的完全培养液，以加 入不含橙皮苷的完全培养液作为正常对照。继续培养48小时，向每孔中加入20yL的含有 5mg/mL3-(4,5_二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT)的磷酸盐缓冲盐水，培养6 小时后，吸出每孔的培养液，每孔加入200yL的二甲基亚砜（DMSO)。震荡15分钟，在490nm 波长，检测各孔吸光度值，计算抑制率，即（对照组吸光度值-药物组吸光度值）/对照组吸 光度值。
[0018] 2)实验结果：详见表1。与未加药物组比较，100yM、200yM的橙皮苷组抑制率显 著增加（P〈〇. 01)。
[0019] 表1橙皮苷对人胚肺成纤维细胞（MRC-5)增殖的抑制作用（[土S)
[0020]
[0021] a'b，与 0 组比较，aP〈0. 05,bP〈0. 01。
[0022] 3)实验结论：橙皮苷对肺成纤维细胞增殖有抑制作用。
[0023] 实验例2:橙皮苷对肺泡上皮细胞（A549)上皮-间质转化的影响
[0024] 1)材料与方法:A549细胞来自于中国科学院上海生科院细胞资源中心。 1^:>]\11-1640 培养基（136；[」;[1^301&1'13；[03。1611。6&了6。11110108700.，1^(1.)、胎牛血清（浙江 天杭生物科技股份有限公司）、人转化生长因子I(HumanTGF-0 1，PeproTechInc); 纤维连接蛋白-I抗体（Fibronectin(FNl)antibody;货号BA1771)、a-平滑肌肌动蛋 白抗体（asmoothmuscleactin(a_SMA)Antibody;货号BM0002)和I型胶原蛋白抗体 (C0L1A1(CollagenI)Antibody;货号BA0325)均为武汉博士德生物工程有限公司产品。 即用型SABC-POD(小鼠IgG)试剂盒（货号SA1021)、即用型SABC-POD(兔IgG)试剂盒（货 号SA1022)均为武汉博士德生物工程有限公司产品。
[0025] 在24孔培养板的每个孔中加入玻璃片，然后在每个玻璃片上加入IXIO4细胞。将 培养板放入5%C02、37°C培养箱中，使细胞贴壁于玻璃片。2小时取出培养板，更换不含血 清的RPM1-1640培养液，继续培养8小时。吸除培养液，加入新的培养液；分为5组，即正 常组（加入RPM1-1640完全培养液）、TGF-M刺激组简称TGF-M组（加入含有5ng/mL TGF- 0 1的RPM1-1640完全培养液）、药物干预组（加入含有5ng/mLTGF- 0 1的RPM1-1640 完全培养液，培养液分别含有25yM、50yM、100yM的橙皮苷提取物），继续培养48小时。
[0026]Fibronectin-I(FN)、a-SMA和Collagen-I检测：取出细胞培养液后，每孔加入 4%的多聚甲醛溶液，固定然后取出孔中的玻璃片，按照试剂盒说明书分别进行FN、a-SM 和Collagen-I免疫细胞化学染色。分析上述蛋白表达，结果以阳性表达的累积光密度数值 (IOD)/细胞的面积（Area)表示。
[0027] 2)实验结果：详见表2。肺泡上皮-间质转化的特征性表现，是细胞特异性蛋白表 达的变化，特别是间质细胞特异性蛋白如FNXollagen-I和a-SMA表达量的增加。与正常 组比较，了6?-0 1组？1^显著升高（?〈〇.〇1)，(]〇1138611-1显著升高（?〈〇.〇1)，(3-5敵显著升 高（P〈0?01)。与TGF-(6l组相比，25yM橙皮苷组FN显著降低（P〈0?05)，25yM、50yM和 100UM橙皮苷组Collagen-I均显著降低（P〈0. 05或P〈0. 01)，25yM橙皮苷组a-SMA显著 降低（P〈〇. 01)。
[0028] 表2橙皮苷对TGF-M诱导A549细胞上皮-间质转化的影响（I± .s'