人β防御素4用于制备治疗喉癌药物的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人β防御素4的新应用，具体涉及人β防御素4用于制备治疗喉癌 药物的应用。
【背景技术】
[0002] 人β防御素4 (HBD4)是2001年Jose-Ramon对人染色体8ρ23的基因序列图谱分 析时发现的一种新型β防御素。HBD4表达于睾丸、胃窦、子宫等各种粘膜细胞和上皮组织， 与HBD3、溶菌酶有协同作用，是单核细胞的趋化物。现有技术研宄表明，HBD4对多种细菌具 有杀伤作用，特别是绿脓杆菌杀伤作用更强。
【发明内容】
[0003] 本发明一方面的目的是提供人β防御素4用于制备治疗喉癌药物的应用。
[0004] 发明人研宄发现人β防御素4(HBD4)对人喉癌上皮细胞细胞具有杀伤作用，并且 其杀伤作用具有时间和剂量依赖性，并且HBD4选择性肿瘤细胞膜穿透作用是其主要抗肿 瘤作用机制。
【附图说明】
[0005] 图I (a)为对照组H印2细胞X 2000,图I (b)为HBD4作用的H印2细胞X 2000。
【具体实施方式】
[0006]目前国内外主要用人工合成方法获得HBD4,或用原核表达系统来表达HBD4,证实 其具有强烈的抗菌活性。但是，关于HBD4是否有抗肿瘤作用，其抗肿瘤机制如何。发明人 进行了 HBD4对人喉癌上皮细胞（Hep2)的杀伤作用及其作用机制的研宄。
[0007] 发明人将通过基因工程方法表达并纯化获得的HBD4作用于H印2细胞，根据HBD4 终浓度将H印2细胞分为A、B、C、D四组，浓度分别为0 μ g. L-1 (对照组）、20 μ g. L'40 μ g. L'100 μ g. ΙΛ根据HBD4作用时间又分为I、II、III三组，时间分别为6、12、24h。倒置相差 显微镜下观察H印2细胞形态，噻唑蓝（MTT)法测定HBD4对H印2细胞的杀伤作用，扫描电 镜观察其细胞表面变化。具体实验材料、方法及结果如下：
[0008] 1、材料：
[0009] HBD4由第四军医大学西京医院儿科实验室赠送。
[0010] HBD4的表达和纯化：采用基因工程的方法，在大肠杆菌中表达HBD4融合蛋白，亲 和层析纯化，获得HBD4蛋白。重组蛋白冻干保存，使用前用灭菌生理盐水溶解成lmg/L浓 缩液备用。
[0011] ifep-2细胞细胞系为上海研晶生物科技有限公司产品。
[0012] 2、方法：
[0013] (1)细胞培养和噻唑蓝（MTT)测定HBD4对H印2细胞生长的影响
[0014] 取对数生长期H印2细胞，调节细胞浓度为I X 107?Λ接种于96孔细胞培养板，每 孔接种200 μL，置SYOjOmL.r1二氧化碳（CO2)孵箱中培养过夜，次日加入HBD4,根据其 终浓度将H印2细胞分为A、B、C、D 4组，浓度分别为0 μ g. L-1 (对照组）、20 μ g. L'40 μ g. L \ 100 Ug-L10
[0015] 根据HBD4作用时间又将H印2细胞分为I、II、III 3组，作用时间分别为6h、12h、 24h，每一浓度对应的每个时间点均做4个复孔，倒置相差显微镜下观察细胞形态。37°C孵 箱中培养到相应时间后，每孔加入MTT溶液[2g. Γ1磷酸盐缓冲液（PBS) ] 50 μ L，37°C孵育 4h，弃上清，每孔加入二甲亚砜150 μ L，振荡后测每孔A49tlnm值，计算杀伤率：杀伤率=(处 理孔 A49tlm/对照孔 A49tlJ X 100 %。
[0016] H印2细胞形态学观察结果：
[0017] 正常生长的ifep2细胞呈梭形或多角形，有较长的突起，呈单层贴壁，生长迅速，代 谢旺盛，48h须换液一次，3-4d传代1次。对照组细胞大小、形态不规则，但差异不大，折光 性好，边缘清晰，内含丰富颗粒。HBD4处理6h后细胞大小、形态和贴壁能力较对照组有明显 差别：B组细胞形态变化不大，贴壁尚可；C组细胞明显皱缩，突起少见，细胞间隙增大，细胞 内颗粒颜色加深，折光性增强，大量细胞呈片状脱落，培养液中有多量细胞漂浮，细胞生长 明显减缓。D组作用12h后，大部分肿瘤细胞死亡。
[0018] MTT法结果显示：
[0019] D组随着HBD4作用时间的延长，细胞数减少，差异显著（P〈0. 05) ; I、II、111组：随 HBD4浓度增加，细胞数均减少，差异显著（Ρ〈0. 01)，提示HBD4对H印2细胞的杀伤作用具有 时间和剂量依赖性，见表1。
[0020] 表1不同浓度的HBD4作用H印2细胞不同时间后的A值
[0022] 注：D 组，III和 I 比较，*Ρ〈0. 05
[0023] I 组，A 和 D 比较，#Ρ〈0· 01 ;Β 和 D 比较，#Ρ〈0· 05
[0024] II组，C 和 A、D 和 B 比较，ΔΡ〈〇·〇5 ;D 和 A 比较，ΔΡ〈〇·〇1，
[0025] III组，B 和 D、B 和 A 比较，?Ρ〈0·05 ;C 和 A、D 和 A 比较，?Ρ〈0·01
[0026] (2)扫描电镜的制样及HBD4对H印2细胞杀伤作用的观察
[0027] 常规培养H印2细胞至对数生长期，用新鲜培养液配制成活细胞数为I X 108ΙΛ 接种到96孔培养板上，每孔200 μ L，培养到细胞数为I X IO9L'加入HBD4,调节其浓度为 40 μ g. ΙΛ置37°C、50mL. ΙΛΧ)2孵箱中继续培养12h，1000 r. mirT1离心10min，弃上清液，加 入戊二醛固定，〇. lmol. T1PBS换洗三次，IOg. Γ1锇酸固定，清洗，常规梯度脱水，置换，临界 点干燥，离子派射镀膜，扫描电镜观察。
[0028] HBD4作用于H印2细胞后的电镜观察结果：
[0029] 体外培养的H印2细胞经HBD4作用12h，细胞表面正常的微绒毛消失，出现散在的 不规则的孔洞，细胞膜骨架严重破坏，细胞内容物大量外泄，至细胞彻底死亡，见图I (a)。而 未经HBD4处理的对照组肿瘤细胞膜结构完整无破损，表面具有微绒毛，见图I (b)。
[0030] 经过上述实验研宄，发明人证实HBD4对H印2细胞具有杀伤作用，并且其杀伤作用 具有时间和剂量依赖性。同时揭示了 HBD4抗肿瘤作用机制：HBD4选择性肿瘤细胞膜穿透 作用是其主要抗肿瘤作用机制。
【主权项】
1.人0防御素4用于制备治疗喉癌药物的应用。
【专利摘要】本发明涉及人β防御素4用于制备治疗喉癌药物的应用。本发明发明人研究发现人β防御素4对人喉癌上皮细胞细胞具有杀伤作用，并且其杀伤作用具有时间和剂量依赖性，并且HBD4选择性肿瘤细胞膜穿透作用是其主要抗肿瘤作用机制。
【IPC分类】A61K38/17, A61P35/00
【公开号】CN104984320
【申请号】CN201510437446
【发明人】曹玉红, 张光运, 曹开方
【申请人】中国人民解放军第四军医大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月23日