测EV71的拷贝数；
[0049] (C-F)100ng/ml rhIL-35和2ug/ml的IFN-γ 刺激Jurkat细胞，对照组用DMSO和 2ug/ml的IFN- γ，24小时后收集细胞上清作为抗病毒溶液；
[0050] B·Α549细胞用Jurkat上清孵育 12小时，加入IAV(M0I = I) ,Real-time PCR检测胞 内IAV三种RNA。
[00511 C.血凝实验检测上清中IAV的滴度。
[0052] D·RD细胞，用Jurkat上清孵育 12小时，加入EV71 (Μ0Ι = 1 )，Real-time PCR绝对定 量检测EV71的拷贝数。
【具体实施方式】
[0053]通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施 例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0054] 【实施例1】A型流感病毒诱导白细胞介素 35表达
[0055] ( -）、实验材料
[0056] 1、临床样本
[0057] 健康人全血和咽拭子来自献血志愿者，流感病人血清、咽拭子来自医院。
[0058] 2、细胞、病毒株及质粒
[0059] 人肺腺癌上皮细胞系A549由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供，由本实验室 保存。人肺泡二型原代细胞(Human alveolar type II cells,AT-II细胞)购买自武汉原生 原代生物医药科技有限公司。外周血单个核细胞(PBMC)分离自新鲜的献血志愿者的血液。
[0060] A型流感病毒毒株A/HongKong/498/97H3N2由中国典型培养物保藏中心（CCTCC) 提供，由本实验室保存。
[0061 ] PCMV-IL-35由本实验室构建且保存。
[0062] 3、试剂
[0063] IL_35Ready set go ELISA试剂盒购于eBioscience。
[0064] F12K培养基，RPMI 1640培养基和胎牛血清(Gibco-BRL,Gaithersburg ,MD)购自武 汉生命生物技术公司。
[0065] M-MLV逆转录酶和RNA抑制剂(RNas in)购自Promega公司。
[0066] Trizol、dNTP和Oligo dT(18T)购自 Invitrogen公司。
[0067] SYBR Green PCR Master Mix，购自ABI公司。
[0068] 4、耗材及仪器
[0069] 细胞培养板、细胞培养皿和细胞培养瓶购自Corning公司
[0070] 4°C高速离心机、小型高速离心机、二氧化碳细胞培养箱和细胞操作台购自Herus
[0071] 超纯水系统购自mi Ilipore
[0072] 荧光定量 PCR 系统 LightCycler480II 购自 Roche
[0073] RNA提取所使用的RNase free的各种型号枪头和EP管购自Eppendorf
[0074] ELx800?酶标仪购自 BioTek? Instruments，Inc
[0075] 常规PCR仪购自东胜创新
[0076] (二）、实验方法
[0077] 1、哺乳动物细胞(贴壁)的复苏
[0078] 1)预先准备好37°C_38°C温水，从液氮罐中取出需要复苏的细胞，用眼科手术镊子 固定，迅速置于水中，保证冻存管完全浸没与水中，使其均匀受热，直到冻存管内的细胞完 全融化。
[0079] 2)用酒精消毒冻存管。
[0080] 3)用吸管预先吸取5ml细胞培养基于T25细胞培养瓶中，再用新的吸管将融化的细 胞转移到细胞瓶中并轻轻吹打一遍。
[0081 ] 4)盖好细胞瓶盖，将细胞瓶放置于细胞培养箱中，37°C，5%C02静置培养。
[0082] 5)约6-8小时后(取决于不同的细胞），更换信息培养基以消除细胞冻存液中存留 的DMSO对细胞生长的影响。
[0083] 2、细胞的传代和冻存
[0084] 1)当细胞长满T25细胞瓶后，用吸管吸取培养基并弃去。
[0085] 2)加入IOml的PBS，轻柔洗涤细胞后用吸管吸取并弃去。
[0086] 3)用吸管吸取1-1.5ml胰酶，使其覆盖住细胞瓶底部，将细胞瓶放入37°C，5 %⑶2 细胞培养箱静止3_5min(消化时间的长短取决于细胞种类）。
[0087] 4)显微镜观察，贴壁细胞变圆并且全部从细胞瓶壁脱离。
[0088] 5)在细胞操作台内，用吸管吸取约4ml培养基，加入细胞瓶内，轻柔的吹打，以吹散 细胞和中和胰酶的消化效果。
[0089 ] 6)用吸管吸取吹匀的细胞悬液(体积约1 /3-2/3)到另一新的细胞瓶，再补加5ml的 培养基，放置于细胞培养箱中，37 °C，5 % CO2的环境下继续静置培养。
[0090] 3、ELISA检测IL-35蛋白表达水平
[0091] 1)E1ISA板每孔加入100μΙ Ix捕获抗体，密封，放置4°C冰箱，孵育过夜。
[0092] 2)吸净孔内液体，加入250μ1洗涤缓冲液，室温放置1分钟，拍干板子。重复此步骤5 次。
[0093] 3)每孔加入Ix反应缓冲液室温封闭1小时。
[0094] 3)洗板子，同步骤2。
[0095] 4)加 100μΙ 100单位标准品到孔内，进行2倍系列稀释，每个浓度梯度设3个复孔， 作为标准曲线孔。每孔加 IOOyl待测样品，每个样设3个复孔。密封板子，室温孵育2小时或4 °C过夜。
[0096] 5)洗板子，同步骤2。
[0097] 6)每孔加入100μΙ Ix检测抗体，密封板子，室温放置1小时。
[0098] 7)洗板子，同步骤2。
[0099] 8)每孔加 100μΙ Ix酶Avidin-HRP，密封板子，室温孵育30分钟。
[0100] 9)洗板子，同步骤2。
[0101] 10)每孔加入IOOyl底物，室温孵育15分钟(时间长短根据实验调整）。
[0102] 11)每孔加入5(^1终止液。
[0103] 12)酶标仪读取450nm和570nm波长读数，450nm为参考波长，570nm为校正波长，每 孔读数结果= 450nm波长下的读数-570nm波长下的读数。
[0104] 4、逆转录荧光定量PCR检测目的基因 mRNA的表达水平 [0105] 1)逆转录反应体系如下
[0107] 逆转录反应条件：37°Clh，75°C10min
[0108] 2)Real_time 反应体系
[0109] ①目的基因的检测引物和内参引物
[0110] IL-35/EBI3: 5'-GCCTGCTCCAAACTCCAC-3'（sense)(SEQ ID N0.1)
[0111] 5'-CGGGCTTGATGATGTGCT-S^antisense)(SEQ ID NO.2)
[0112] IL-35/p35： 5'-GTACCAGGTGGAGTTCAA-3'(sense)(SEQ ID NO.3)
[0113] 5'-AATAGTCACTGCCCGAAT-S^antisense)(SEQ ID NO.4)
[0114] NP: 5'-GGATTTGGCGTCAAGCGAACA-3'(sense)(SEQ ID NO.5)
[0115] 5，-GTCCCTACCCCCTTTACTGC-3，(antisense)(SEQ ID NO.6)
[0116] GAPDH: 5'-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3'(sense)(SEQ ID NO.7)
[0117] 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGATGGG-S^antisense)(SEQ ID NO.8)
[0118] ②反应体系
[0123] 5、H3N2拷贝数快速检测方法(Real time PCR)
[0124] 1)质粒浓度与拷贝数换算
[0125] ①在分光光度计上，取2yL质粒溶液测定其浓度，重复几次，要求测得浓度值稳定， 初步估计质粒纯度以及是否有蛋白质污染的状况。
[0126] ②配制琼脂糖凝胶，检测质粒纯度及条带亮度。
[0127] ③根据以下公式将浓度换算为质粒拷贝数： ΓΠ1 9〇? 魏印数…纖纖垃?ν ' ' 办50
[0129] amount:0D值(ng/yL); length:质粒DNA碱基对数目（bp)。
[0130] 2)标准品制备
[0131] 将上述已知拷贝数的质粒用灭菌去离子水进行稀释，如稀释到lX101()C〇pieSAiL， 然后再进行倍比稀释，浓度依次为1〇 9,1〇8,1〇7,1〇6,1〇5,1〇 4,1〇3,1〇2, IO1CopiesAiLt3以此作 为测定H3N2拷贝数的标准品。
[0132] 3)Real-time PCR
[0133] ①反应体系：
[0135] ②NP检测片段引物：
[0136] NP: 5，-GGATTTGGCGTCAAGCGAACA-3，(sense)(SEQ ID NO.5)
[0137] 5'-GTCCCTACCCCCTTTACTGC-3'（antisense)(SEQ ID N0.6)
[0138] ③反应程序：
[0140] (三)实验结果和讨论
[0141] 通过Real-time PCR技术，我们发现在血液样本提取的PBMC中，病人的IL-35/ EBI3mRNA大约是正常人的3倍（图IA左