一种筛选具有调节斑马鱼胃肠动力活性化合物的方法
【专利摘要】本发明涉及一种筛选具有调节斑马鱼胃肠动力活性化合物的方法。该方法包括胚胎准备、药物处理、活体标记、实验结果影像采集和结果分析及统计。本发明首次利用钙黄绿素作为荧光标记物对斑马鱼胃肠道进行标记，通过对斑马鱼胃肠道蠕动次数进行统计分析，进行胃肠道活性药物的筛选；通过对相关条件的优化，获得了稳定可靠、成功率高和重复性好的筛选方法；对高通量筛选调节胃肠动力化合物具有重要意义。
【专利说明】
-种筛选具有调节斑马鱼胃肠动力活性化合物的方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种筛选具有调节斑马鱼胃肠动力活性化合物的方法，特别设及一种 巧黄绿素为标记物的筛选调节胃肠道动力化合物的方法，属于药物筛选技术领域。
【背景技术】
[0002] 胃肠运动功能是消化道最主要的功能之一，其调节机制非常复杂。自改革开放W 来，随着经济的高速发展，社会竞争的日趋激烈，人们生活节奏的加快和工作压力的增大而 导致的胃肠动力障碍性疾病问题日渐普遍。截至目前为止，胃肠动力障碍性疾病已成为临 床的常见病和多发病。在日常医疗工作中，约50%的患者会因消化道问题就诊，而其中约 30%-40%的患者最终会被确诊为肠动力障碍。胃肠动力障碍性疾病主要的病理过程包括 胃肠协调运动素乱、胃排空延迟和小肠排空减慢等。其发病机制可能与饮食、神经屯、理、神 经激素、胃酸和幽口螺旋杆菌感染等因素相关。胃肠动力障碍性疾病多属于功能性疾病，且 目前尚无特效治疗方法，患者每年均需花费高额的治疗费用，且其生活质量亦受到不同程 度的影响。因此如何W快速且有效的活体方法来筛选新型促胃肠动力药物，将具有非常重 要的社会效益和广阔的市场前景。
[0003] 目前筛选促胃肠动力药物的研究中，主要利用（1)离体器官进行药物筛选，观察受 试物对离体胃、肠平滑肌等的影响，得到大量初步的结果。再利用（2)小型哺乳动物进行二 次验证，即利用影像技术观察活体动物的胃肠动力;或是将实验动物处死后，检测受试物对 实验动物胃排空、肠推动等的影响，从而验证大量初步结果。W上过程相当缓慢且成本较 高，加上离体器官缺少周围神经反馈，无法准确模拟胃肠运动，不能准确反应药物在体内微 环境下的活性，无法系统性解释药物毒性及活性;而小型哺乳动物模型又无法快速地验证 其结果，且不适合高通量筛选。因此造成胃肠动力药物大量筛选出现了一个很大的断层。
[0004] 斑马鱼(Daniorerio)是一种小型热带淡水鱼，属于經科，是一种理想的脊椎模式 生物，现已被美国国家卫生研究院列为继人类和小鼠之后的第Ξ大模式生物。斑马鱼与人 类在基因水平具有高达87%的同源性，约70%的人类基因至少有一个明显的斑马鱼同源基 因。在信号通路传导、蛋白质功能和生理结构等方面，斑马鱼与人类相比也表现出很高的保 守性。与其他哺乳动物模型比，斑马鱼产卵量高，发育周期短，药物用量少，可重复性强，可 直观地反应出药物的治疗效果及毒副作用，更适用于大规模的化合物筛选研究。
[0005] 斑马鱼胃肠道在细胞功能和解剖学方面与人类相似，均由内皮细胞、结缔组织、外 纵肌和环状肌组成。斑马鱼胚胎发育至26-126hpf，其肠道的管腔形成，并不断生长，内胚层 分化形成有功能的肠道上皮。在未喂食情况下，斑马鱼胚胎发育至72hpf，肠道首次出现不 稳定的自发收缩。伴随着发育的进行，第120-144hpf，大部分卵黄囊被吸收，斑马鱼肠道自 发的蠕动及摄食能力增强。由于早期发育阶段斑马鱼全身透明，因此方便由透明的斑马鱼 胚胎进行胃肠动力观察。
[0006] 中国专利文献CN103301480A(申请号201310181252.4)公开了一种斑马鱼肠蠕动 模型的建立方法及筛选促胃肠动力药物的方法，包括（1)斑马鱼选取；（2)模型诱导及化合 物处理；（3)巧光显微镜定量分析。该方法选择斑马鱼作为实验动物，利用尼罗红作为染料 标记其胃肠道，通过计算促肠蠕动排空率来研究胃肠蠕动情况。在该发明中，发明人优选的 尼罗红染料标记斑马鱼胃肠道的时间为16h。因此应用该方法研究胃肠蠕动时，整个实验周 期较长。除此之外，2016年发表于南方医科大学学报的《过度喂养建立斑马鱼幼鱼肥胖模 型》一文中，作者发现尼罗红可W活体标记斑马鱼肝脏、膜腺等脏器内的脂肪细胞。由此可 知，尼罗红染料可经斑马鱼胃肠道吸收，进入其体内。因此中国专利文献CN103301480A中定 义的一一尼罗红染色后计算促肠蠕动排空率，并不能准确反应胃肠道蠕动情况。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术的不足，提供一种基于巧黄绿素为标记物的筛选影响斑马鱼 胃肠动力的化合物的方法。本发明可W方便、高效且快速的对影响胃肠动力的化合物进行 定量评价。
[0008] 本发明技术方案如下：
[0009] -种筛选具有调节斑马鱼胃肠动力活性化合物的方法，步骤如下：
[0010] (1)将斑马鱼受精卵置于培养容器中的胚胎培养水中，解育108~132小时，挑选健 康的斑马鱼胚胎，随机分组为受试组、阳性对照组和溶剂对照组；
[0011] (2)向受试组斑马鱼胚胎的胚胎培养水中加入溶解于溶剂中的待筛选药物，向阳 性对照组斑马鱼胚胎的胚胎培养水中加入阳性对照药物，向溶剂对照组斑马鱼胚胎的胚胎 培养水中加入溶剂，继续解育20~28小时；
[0012] (3)吸除受试组、阳性对照组和溶剂对照组中的液体，加入质量浓度为0.15~ 0.25 %的巧黄绿素溶液，23~27 °C标记8~12min，吸除液体，胚胎培养水清洗；
[OOU] (4)将受试组、阳性对照组和溶剂对照组的斑马鱼胚胎进行麻醉，利用图像采集工 具，对斑马鱼胚胎中显示黄绿巧光的胃肠道部分进行影像采集，得到受试组斑马鱼胚胎、阳 性对照组斑马鱼胚胎和溶剂对照组斑马鱼胚胎的胃肠道蠕动影像；
[0014] (5)根据步骤(4)采集的影像，分别在相同时间内对受试组、阳性对照组和溶剂对 照组的斑马鱼胚胎的胃肠道蠕动次数进行计数，并利用T检验对斑马鱼胃肠道的蠕动能力 进行统计学分析；
[0015] 当受试组的胃肠道蠕动次数高于溶剂对照组，且T检验结果显示P《0.05,则差异 显著，待筛选药物具有显著促进胃肠道蠕动的作用；
[0016] 当受试组的胃肠道蠕动次数高于溶剂对照组，且T检验结果显示P《0.01，则差异 非常显著，待筛选药物具有非常显著促进胃肠道蠕动的作用；
[0017] 当受试组的胃肠道蠕动次数低于溶剂对照组，且T检验结果显示P《0.05,则差异 显著，待筛选药物具有显著抑制胃肠道蠕动的作用；
[0018] 当受试组的胃肠道蠕动次数低于溶剂对照组，且T检验结果显示P《0.01，则差异 非常显著，待筛选药物具有非常显著抑制胃肠道蠕动的作用；
[0019] 当受试组与溶剂对照组的胃肠道蠕动次数经T检验后，结果显示P〉0.05，则统计学 上差异不显著，待筛选药物对胃肠道蠕动没有作用。
[0020] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中培养容器为标准规格的6孔或12孔细胞培养 板。
[0021] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中斑马鱼受精卵为健康成年AB系斑马鱼交配后 产出的受精卵。
[0022] 根据本发明优选的，所述步骤(1)和步骤(2)中的解育条件为:27~29°C，光照13~ 15小时/黑暗9~11小时的控光环境;进一步优选的，解育条件为:28°C，光照14小时/黑暗10 小时的控光环境；
[0023] 优选的，所述胚胎培养水组分如下：
[0024] NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl2 0.4mM，MgS〇4 0.16mM，去离子水配制。
[002引根据本发明优选的，所述步骤(1)中解育时间为120小时。
[0026] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中随机分组的条件为每组不低于15条斑马鱼胚 胎。
[0027] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中阳性药物为促进胃肠道蠕动的阳性对照药物 或者抑制胃肠道蠕动的阳性对照药物；
[00%]进一步优选的，促进胃肠道蠕动的阳性对照药物为多潘立酬(Domperidonum)或是 盐酸依托必利（11〇91'1(10曲化〇(3111〇1'1(1611:〇91'1(16);抑制胃肠道蠕动的阳性对照药物为盐 酸洛赃下胺（loperamide hy化ochloride)。
[0029] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中溶剂为二甲基亚讽、甲醇或水。
[0030] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中巧黄绿素的质量浓度为0.2%;
[00川优选的，所述步骤(3)中标记的溫度为25 °C，时间为1 Omin，环境为避光。
[0032] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中胚胎培养水清洗2~3次。胚胎培养水清洗斑马 鱼胚胎2~3次后看不到各培养孔中巧黄绿素的黄绿色巧光。
[0033] 根据本发明优选的，所述步骤（4)中麻醉为采用质量浓度为0.02%的Ξ卡因 (t;ricaine，eth5d 3-aminobenzoate methanesulfonate)进行麻醉。在该条件下麻醉，斑马 鱼胚胎完全进入麻醉状态，但其胃肠蠕动能力尚未受到影响。
[0034] 根据本发明优选的，所述步骤(4)中影像采集工具为巧光显微镜或激光共聚焦显 微镜；
[0035] 根据本发明优选的，所述步骤(5)中计数的时间为Imin。
[0036] 有益效果
[0037] 1、本发明首次利用巧黄绿素作为巧光标记物对斑马鱼胃肠道进行标记，通过对斑 马鱼胃肠道蠕动次数进行统计分析，进行胃肠道活性药物的筛选;通过对相关条件的优化， 获得了稳定可靠、成功率高和重复性好的筛选方法；
[0038] 2、本发明所述筛选具有调节斑马鱼胃肠动力活性化合物的方法，该方法不仅具有 成本低、操作简便的优点，而且具有灵敏度高、筛选速度快、高通量性等优点，可W准确反应 药物在体内微环境下的活性，应用前景广阔。
【附图说明】
[0039] 图1为不同浓度多潘立酬处理斑马鱼后，巧黄绿素胃肠道标记后的照片；
[0040] 图中：A-C为溶剂对照组:A为巧光条件下巧黄绿素胃肠道标记照片;B为可见光下 巧黄绿素胃肠道标记照片;C为巧光与可见光同时存在下巧黄绿素胃肠道标记照片；
[0041] D-F为多潘立酬溶液浓度lOyg/mL的处理组:D为巧光条件下巧黄绿素胃肠道标记 照片;E为可见光下巧黄绿素胃肠道标记照片;F为巧光与可见光同时存在下巧黄绿素胃肠 道标记照片；
[0042] G-I为多潘立酬溶液浓度30yg/mL的处理组:G为巧光条件下巧黄绿素胃肠道标记 照片;Η为可见光下巧黄绿素胃肠道标记照片；I为巧光与可见光同时存在下巧黄绿素胃肠 道标记照片；
[0043] J-L为多潘立酬溶液浓度50yg/mL的处理组:J为巧光条件下巧黄绿素胃肠道标记 照片;K为可见光下巧黄绿素胃肠道标记照片；L为巧光与可见光同时存在下巧黄绿素胃肠 道标记照片。
[0044] 图2为不同浓度多潘立酬溶液处理后，斑马鱼胃肠道蠕动能力的统计柱状图；
[0045] 图中：*表示pi<0.05;**表示pKO.Ol。
[0046] 图3为不同浓度盐酸洛赃下胺处理斑马鱼后，巧黄绿素胃肠道标记照片；
[0047] 图中：A-C为溶剂对照组:A为巧光条件下巧黄绿素胃肠道标记照片;B为可见光下 巧黄绿素胃肠道标记照片;C为巧光与可见光同时存在下巧黄绿素胃肠道标记照片；
[004引D-F为盐酸洛赃下胺溶液浓度扣g/mL的处理组:D为巧光条件下巧黄绿素胃肠道标 记照片;E为可见光下巧黄绿素胃肠道标记照片;F为巧光与可见光同时存在下巧黄绿素胃 肠道标记照片；
[0049] G-I为盐酸洛赃下胺溶液浓度lOyg/mL的处理组:G为巧光条件下巧黄绿素胃肠道 标记照片;Η为可见光下巧黄绿素胃肠道标记照片；I为巧光与可见光同时存在下巧黄绿素 胃肠道标记照片。
[0050] 图4为不同浓度盐酸洛赃下胺溶液处理后，斑马鱼胃肠道蠕动能力统计柱状图； [0化1] 图中：*表示ρι<0.05。
[0052] 图5为不同浓度阿司匹林处理斑马鱼后，巧黄绿素胃肠道标记照片；
[0053] 图中：A-C为溶剂对照组:A为巧光条件下巧黄绿素胃肠道标记照片；Β为可见光下 巧黄绿素胃肠道标记照片;C为巧光与可见光同时存在下巧黄绿素胃肠道标记照片；
[0054] D-F为多潘立酬溶液处理浓度50yg/mL的阳性对照组:D为巧光条件下巧黄绿素胃 肠道标记照片;E为可见光下巧黄绿素胃肠道标记照片;F为巧光与可见光同时存在下巧黄 绿素胃肠道标记照片；
[0055] G-I为阿司匹林溶液浓度30yg/mL的处理组:G为巧光条件下巧黄绿素胃肠道标记 照片;Η为可见光下巧黄绿素胃肠道标记照片；I为巧光与可见光同时存在下巧黄绿素胃肠 道标记照片；
[0056] J-L为阿司匹林溶液浓度50yg/mL的处理组:J为巧光条件下巧黄绿素胃肠道标记 照片;K为可见光下巧黄绿素胃肠道标记照片；L为巧光与可见光同时存在下巧黄绿素胃肠 道标记照片；
[0057] M-0为阿司匹林溶液浓度l(K)yg/mL的处理组:Μ为巧光条件下巧黄绿素胃肠道标记 照片;Ν为可见光下巧黄绿素胃肠道标记照片;0为巧光与可见光同时存在下巧黄绿素胃肠 道标记照片。
[0058] 图6为不同浓度阿司匹林溶液处理后，斑马鱼胃肠道蠕动能力统计柱状图；
[0059] 图中：阳性对照为多潘立酬溶液浓度50yg/mL的处理组，*表示八0.05;**表示八 0.01。
【具体实施方式】：
[0060]下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步阐述，但本发明所保护范围不限于 此。
[0061 ] 实验动物:所用野生型AB系健康斑马鱼，购自国家斑马鱼资源中屯、，雌雄斑马鱼在 28°C，14h光照/1化黑暗条件下分开养殖，每日于9:30(am)和4:30(pm)分别喂食两次丰年 虫。用卵时，于前日将健康成熟斑马鱼按雌雄比1:1或1:2的比例放入交配缸内，中间放置隔 板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵。排卵后半小时将成鱼拱出， 使排卵时间控制在半小时内，W降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，并用新培养水冲 洗3遍，对受精卵进行消毒和清洗，随后将受精卵置于28°C培养箱内，保持14h光照/1化黑暗 周期培养，中间每2地换约1/^3水，并及时吸出死亡胚胎。
[0062] 试剂配制：阿司匹林标准品购自中国食品药品检定研究院；多潘立酬标准品购自 加拿大TRC公司；盐酸洛赃下胺标准品购自德国DR Ehrentorfer公司。W上Ξ种标准品均用 二甲基亚枫(DMS0)溶解后，配制为1 Omg/mL的储液。
[0063] 胚胎培养水组分如下：
[0064] NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl2 0.4mM，MgS〇4 0.16mM，去离子水配制。
[0065] 实施例1:多潘立酬对斑马鱼胃肠蠕动的影响
[0066] 1.斑马鱼胚胎的获得与使用
[0067] 采用健康性成熟的AB系斑马鱼，按雌雄1:1或1:2的比例放入交配缸内，中间放置 隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，排卵半小时后将成鱼拱 出，将排卵时间控制在半小时内，W降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，并用新的斑 马鱼胚胎培养水冲洗3遍，对受精卵进行消毒和清洗;随后将受精卵移入干净的斑马鱼胚胎 培养用水中，并向所述培养水中加入0.化pm亚甲基蓝，28°C下、14h光照/1化黑暗周期下，控 光培养，中间每24h换约水，并及时吸出死亡胚胎。将出生后5天的斑马鱼置于解剖镜下， 选取发育正常的斑马鱼胚胎，放入6孔板中，每孔20尾，每组3个平行孔。
[006引 2.化合物处理
[0069] 设置四个实验组：1个溶剂对照组，3个多潘立酬处理组。移除6孔板中的胚胎培养 水，溶剂对照组加入6ml含体积浓度0.5%二甲基亚讽的培养水溶液;多潘立酬处理组6ml培 养水中分别加入浓度为10yg/mL、30yg/mL和50yg/mL的多潘立酬溶液，由培养水与相应浓度 的多潘立酬储液配制获得;将W上各实验组斑马鱼胚胎分别放入28°C恒溫培养箱中，14h光 照/1化黑暗周期下培养24小时。
[0070] 3.活体标记
[0071] 施药24小时后，将上述四组6孔板中的药液吸除，加入质量浓度为0.2%的巧黄绿 素溶液，25°C条件下，恒溫避光解育斑马鱼胚胎lOmirulOmin标记结束后，将巧黄绿素溶液 吸除，加胚胎培养水清洗各组斑马鱼胚胎3次，至看不到各培养孔中巧黄绿素的黄绿色巧光 为止。
[0072] 4.实验结果影像采集
[0073] 利用质量浓度为0.02%的Ξ卡因溶液将上述四组斑马鱼胚胎麻醉。在巧光显微镜 下采集斑马鱼胚胎中显示黄绿巧光的胃肠道蠕动影像，结果如图1所示。
[0074] 5.结果分析及统计
[00巧]根据采集影像，在Imin内分别对溶剂对照组、1化g/mL、30yg/mL和50yg/mL的多潘 立酬溶液处理组的斑马鱼胚胎的胃肠道蠕动次数进行统计。结果显示，溶剂对照组Imin内 胃肠道平均蠕动次数为11.5; Ξ种浓度多潘立酬药物处理组（1化g/mL、30yg/mL和50yg/mL) 的斑马鱼胃肠道Imin内平均蠕动次数分别为:12、15和21.3，如表1所示。
[0076] 表 1
[0077]
[007引 注：*表不 f)〈0.05;林表不 f)〈0.01;
[0079] 由表1可W看出，随着多潘立酬浓度的增加，斑马鱼的胃肠道蠕动能力增加。
[0080] 利用T检验对斑马鱼胃肠道的蠕动能力进行统计学分析，结果显示多潘立酬药物 浓度为3〇yg/血时，与溶剂对照组(0.5%二甲基亚讽)相比较，其胃肠道蠕动能力显著增加， 且差异具有统计学意义(P<〇. 05)，如图2所示;多潘立酬药物浓度为50yg/mL时，与溶剂对照 组(0.5%二甲基亚讽处理组)相比较，斑马鱼胃肠道蠕动能力增加更为明显，且具有非常显 著的差异(P<〇.01)，如图2所示。
[0081 ] 实施例2:盐酸洛赃下胺对斑马鱼胃肠蠕动的影响
[0082] 1.斑马鱼胚胎的获得与使用
[0083] 采用健康性成熟的AB系斑马鱼，按雌雄1:1或1:2的比例放入交配缸内，中间放置 隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，排卵半小时后将成鱼拱 出，将排卵时间控制在半小时内，W降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，并用新的斑 马鱼胚胎培养水冲洗3遍，对受精卵进行消毒和清洗;随后将受精卵移入干净的斑马鱼胚胎 培养用水中，并向所述培养水中加入0.化pm亚甲基蓝，28°C、14h光照/1化黑暗周期下控光 培养，中间每2地换约1/^3水，并及时吸出死亡胚胎。将出生后5天的斑马鱼置于解剖镜下，选 取发育正常的斑马鱼胚胎，放入6孔板中，每孔20尾，每组3个平行孔。
[0084] 2.化合物处理
[00化]设置四个实验组：1个溶剂对照组，3个盐酸洛赃下胺处理组。移除6孔板中的培养 水，溶剂对照组加入6ml含体积浓度0.5 %二甲基亚讽的培养水溶液，盐酸洛赃下胺处理组 6ml培养水中分别加入浓度为扣g/mL、10yg/mL和30yg/mL的盐酸洛赃下胺溶液，由培养水与 相应浓度的多潘立酬储液配制获得;将W上各实验组斑马鱼胚胎分别放入28°C恒溫培养箱 中，1地光照/1化黑暗周期下培养24小时。
[00化]3.活体标记
[0087]施药24小时后，将上述四组6孔板中的药液吸除，加入质量浓度为0.2%的巧黄绿 素溶液;25°C条件下，恒溫避光解育斑马鱼胚胎lOmiriDlOmin标记结束后，将巧黄绿素溶液 吸除，加胚胎培养水清洗各组斑马鱼胚胎2次，至看不到各培养孔中巧黄绿素的黄绿色巧光 为止。
[0088] 4.实验结果影像采集
[0089] 利用质量浓度为0.02%的Ξ卡因溶液将上述四组斑马鱼胚胎麻醉。在巧光显微镜 下采集斑马鱼胚胎中显示黄绿巧光的胃肠道蠕动影像，结果如图3所示。
[0090] 5.结果分析及统计
[0091] 根据采集影像，在Imin内对溶剂对照组、5yg/mL、lOyg/mL和30yg/mL的盐酸洛赃下 胺溶液处理组的斑马鱼胚胎的胃肠道蠕动次数进行统计，结果如表2所示。
[0092] 表 2
[0093]
[0094] 注:*表示 1)<0.05;
[00M]由表2可W看出，当盐酸洛赃下胺溶液浓度为30yg/mL时，6孔板中20条斑马鱼胚胎 全部死亡。运表明在该浓度下，盐酸洛赃下胺对斑马鱼胚胎具有较大毒害作用。但是盐酸洛 赃下胺溶液浓度为扣g/mL和lOyg/mL时，20条斑马鱼胚胎正常存活。溶剂对照组Imin内胃肠 道平均蠕动次数为11.7;5yg/mL盐酸洛赃下胺药物处理组，斑马鱼胃肠道Imin内平均蠕动 次数为11.3; 1化g/mL盐酸洛赃下胺药物处理组，斑马鱼胃肠道Imin内平均蠕动次数为8.2。
[0096] W上结果表明，在浓度小于30yg/mL时，随着盐酸洛赃下胺浓度的增加，斑马鱼的 胃肠道蠕动能力降低。利用T检验对斑马鱼胃肠道的蠕动能力进行统计学分析，盐酸洛赃下 胺浓度为lOyg/mL时，与溶剂对照组(0.5 %二甲基亚讽处理组）相比较，斑马鱼胃肠道蠕动 能力显著降低，且差异具有统计学意义(P<〇.05)，结果如图4所示。
[0097] 实施例3:阿司匹林对斑马鱼胃肠道蠕动的影响
[0098] 1.斑马鱼胚胎的获得与使用
[0099] 采用健康性成熟的AB系斑马鱼，按雌雄1:1或1:2的比例放入交配缸内，中间放置 隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，排卵半小时后将成鱼拱 出，将排卵时间控制在半小时内，W降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，并用新的斑 马鱼胚胎培养水冲洗3遍，对受精卵进行消毒和清洗;随后将受精卵移入干净的斑马鱼胚胎 培养用水中，并向所述培养水中加入0.化pm亚甲基蓝，28 °C、14h光照/1化黑暗周期下，控光 培养。中间每2地换约1/^3水，并及时吸出死亡胚胎。将出生后5天的斑马鱼置于解剖镜下，选 取发育正常的斑马鱼胚胎，放入6孔板中，每孔20尾，每组3个平行孔。
[0100] 2.化合物处理
[0101] 设置六个实验组：1个溶剂对照组，1个阳性对照组，3个待测化合物处理组。移除6 孔板中的培养水，溶剂对照组加入6ml含体积浓度0.5 %二甲基亚讽的培养水溶液；阳性对 照组加入6ml含浓度为50yg/mL的多潘立酬培养水溶液;Ξ个待测化合物处理组分别在6ml 培养水中加入浓度为30yg/mL、50yg/mL和10化g/mL的阿司匹林溶液。将W上各实验组斑马 鱼胚胎分别放入28°C恒溫培养箱中，14h光照/1化黑暗周期下培养24小时。
[0102] 3.活体标记
[0103] 施药24小时后，将上述六组6孔板中的药液吸除，加入质量浓度为0.2%的巧黄绿 素溶液;25°C条件下，恒溫避光解育斑马鱼胚胎lOmirulOmin标记结束后，将巧黄绿素溶液 吸除，加胚胎培养水清洗各组斑马鱼胚胎3次，至看不到各培养孔中巧黄绿素的黄绿色巧光 为止。
[0104] 4.实验结果影像采集
[0105] 利用质量浓度为0.02%的Ξ卡因溶液将上述六组斑马鱼胚胎麻醉。在巧光显微镜 下采集斑马鱼胚胎中显示黄绿巧光的胃肠道蠕动影像，结果如图5所示。
[0106] 5.结果分析及统计
[0107] 根据采集影像，在Imin内对溶剂对照组、阳性对照组和Ξ个浓度的阿司匹林处理 组(30yg/mL、50yg/血和100yg/mU的斑马鱼胚胎的胃肠道蠕动次数进行计数。结果显示，溶 剂对照组和阳性对照组Imin内胃肠道平均蠕动次数分别为10.2和21，Ξ种浓度阿司匹林处 理组(3化g/mL、50yg/mL和l(K)yg/mL)的斑马鱼胃肠道，Imin内平均蠕动次数分别为11、13.3 和11.2,如表3所示。
[010引 表3 「01091
[0110]注:*表示pi<0.05;**表示pKO.Ol;
[011。 由表3可W看出，在阿司匹林浓度为30yg/mL和10化g/mL时，斑马鱼的胃肠道蠕动 能力未受明显影响。利用T检验对斑马鱼胃肠道的蠕动能力进行统计学分析，结果显示，阿 司匹林浓度为50yg/mL时，与溶剂对照组(0.5%二甲基亚讽处理组)相比较，斑马鱼的胃肠 道蠕动能力增加，且差异具有统计学意义(P<0.05)，结果如图6所示。
[0112]由上述实施例的结果可W看出，与现有的筛选影响胃肠动力药物的筛选技术相 比，本发明所述的基于活体斑马鱼的胃肠动力药物筛选技术具有W下优点：（1)首次利用巧 黄绿素将斑马鱼的胃肠道进行了特异性标记。标记后的胃肠道清晰可见，便于结果观察。 (2)巧黄绿素安全可靠。0.2%浓度下，该标记物对活体动物不具毒害作用，标记结束后活体 动物可W继续培育，并不影响后续实验。（3)巧黄绿素进入体内特异性标记胃肠道，是通过 直接加入养鱼水中进行的，因此操作简便。（4)巧黄绿素标记斑马鱼胃肠道时间相对较短， 有效的缩短了实验周期。
【主权项】
1. 一种筛选具有调节斑马鱼胃肠动力活性化合物的方法，其特征在于，步骤如下： (1) 将斑马鱼受精卵置于培养容器中的胚胎培养水中，孵育108~132小时，挑选健康的 斑马鱼胚胎，随机分组为受试组、阳性对照组和溶剂对照组； (2) 向受试组斑马鱼胚胎的胚胎培养水中加入溶解于溶剂中的待筛选药物，向阳性对 照组斑马鱼胚胎的胚胎培养水中加入阳性对照药物，向溶剂对照组斑马鱼胚胎的胚胎培养 水中加入溶剂，继续孵育20~28小时； (3) 吸除受试组、阳性对照组和溶剂对照组中的液体，加入质量浓度为0.15~0.25%的 钙黄绿素溶液，23~27°C标记8~12min，吸除液体，胚胎培养水清洗； (4) 将受试组、阳性对照组和溶剂对照组的斑马鱼胚胎进行麻醉，利用图像采集工具， 对斑马鱼胚胎中显示黄绿荧光的胃肠道部分进行影像采集，得到受试组斑马鱼胚胎、阳性 对照组斑马鱼胚胎和溶剂对照组斑马鱼胚胎的胃肠道蠕动影像； (5) 根据步骤⑷采集的影像，分别在相同时间内对受试组、阳性对照组和溶剂对照组 的斑马鱼胚胎的胃肠道蠕动次数进行计数，并利用T检验对斑马鱼胃肠道的蠕动能力进行 统计学分析； 当受试组的胃肠道蠕动次数高于溶剂对照组，且T检验结果显示PS0.05,则差异显著， 待筛选药物具有显著促进胃肠道蠕动的作用； 当受试组的胃肠道蠕动次数高于溶剂对照组，且T检验结果显示PS0.01，则差异非常 显著，待筛选药物具有非常显著促进胃肠道蠕动的作用； 当受试组的胃肠道蠕动次数低于溶剂对照组，且T检验结果显示PS0.05,则差异显著， 待筛选药物具有显著抑制胃肠道蠕动的作用； 当受试组的胃肠道蠕动次数低于溶剂对照组，且T检验结果显示PS0.01，则差异非常 显著，待筛选药物具有非常显著抑制胃肠道蠕动的作用； 当受试组与溶剂对照组的胃肠道蠕动次数经T检验后，结果显示P>0.05，则统计学上差 异不显著，待筛选药物对胃肠道蠕动没有作用。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中培养容器为标准规格的6孔或 12孔细胞培养板； 优选的，所述步骤(1)中斑马鱼受精卵为健康成年AB系斑马鱼交配后产出的受精卵。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)和步骤(2)中的孵育条件为：27 ~29°C，光照13~15小时/黑暗9~11小时的控光环境;进一步优选的，孵育条件为:28°C，光 照14小时/黑暗10小时的控光环境； 优选的，所述胚胎培养水组分如下： NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl2 0.4mM，MgS〇4 0.16mM，去离子水配制。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中孵育时间为120小时； 优选的，所述步骤(1)中随机分组的条件为每组不低于15条斑马鱼胚胎。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中阳性药物为促进胃肠道蠕动 的阳性对照药物或者抑制胃肠道蠕动的阳性对照药物； 进一步优选的，促进胃肠道蠕动的阳性对照药物为多潘立酮(Domperidonum)或是盐酸 依托必利（Itopride Hydrochlorideltopride);抑制胃肠道懦动的阳性对照药物为盐酸洛 哌丁胺（loperamide hydrochloride)。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)中溶剂为二甲基亚砜、甲醇或 水。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)中钙黄绿素的质量浓度为 0.2% ； 优选的，所述步骤(3)中标记的温度为25 °C，时间为lOmin，环境为避光； 优选的，所述步骤(3)中胚胎培养水清洗2~3次。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4)中麻醉为采用质量浓度为 0 · 02% 的三卡因（tricaine，ethyl 3-aminobenzoate 11161:11&1168111;1^〇仙七6)进行麻醉。9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中影像采集工具为荧光显微镜 或激光共聚焦显微镜。10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中计数的时间为lmin。
【文档编号】C12Q1/02GK105999303SQ201610285698
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月3日
【发明人】孙晨, 韩建, 张云, 何秋霞, 刘可春, 王希敏, 彭维兵, 楚杰
【申请人】山东省科学院生物研究所