枯草蛋白酶变体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及新枯草蛋白酶变体，其相对于亲本枯草蛋白酶在一种或多种性质上显示出改进，所述性质包括：洗涤性能、热稳定性、贮藏稳定性或催化活性。本发明的变体适合用于例如清洁或洗涤剂组合物中，例如洗衣洗涤剂组合物和洗碗组合物，包括自动洗碗组合物。
【专利说明】枯草蛋白酶变体
[0001]本发明申请是基于申请日为2006年7月6日，申请号为200680024704.6 (国际申请号为PCT/DK2006/000399)，发明名称为“枯草蛋白酶变体”的专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及新的枯草蛋白酶(subtilase)变体,其相对于亲本枯草蛋白酶在一种或多种性质上显示出改变，所述性质包括:洗涤性能、热稳定性、贮藏稳定性和催化活性。本发明的变体适用于例如清洁或洗涤剂组合物中，例如衣物洗涤剂组合物和洗碗组合物,包括自动洗碗组合物。本发明还涉及编码所述变体的分离的DNA序列、表达载体、宿主细胞和用于产生和使用本发明的变体的方法。此外，本发明涉及包含本发明的变体的清洁和洗涤剂组合物。
[0003]发明背景
[0004]在洗涤剂工业中，将酶应用在洗涤配方中已超过30年。用在这些配方中的酶包含蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶，以及其它的酶，或它们的混合物。商业上最重要的酶是蛋白酶。
[0005]越来越多的商用蛋白酶是蛋白工程的变体或天然存在的野生型蛋白酶，例
如 Relase?、 Alcalase?、 Savinase?、 Primase?、 Everlasee、 Esperase?、
Ovozyme!'、 Coronase? 、 Polarzyme*'和 Kannases (No voz yme s A/S)、Maxatase?、Maxacal?、Maxapem?、Properase?> Purafect?> Purafect OxP?、FN2?、FN3?、FN4?和Purafect Prime?(G enencor International, Inc.) >BLAP X和BLAP S(Henkel)tjJft外，许多蛋白酶变体在本领域得到描述。现有技术中蛋白酶变体的完整列表在W099/27082中列出。
[0006]然而，尽管已经描述了大量有用的蛋白酶变体，对于许多工业用途例如洗衣或硬表面清洁仍然存在对新的改进的蛋白酶或蛋白酶变体的需求。因此，本发明的目的是提供改进的枯草蛋白酶变体用于这些用途。
[0007]发明概述
[0008]因此，在第一方面本发明涉及枯草蛋白酶变体，其包含一个或多个表1中所列的修饰。
[0009]表1.枯草蛋白酶变体中的修饰
[0010]
【权利要求】
1.枯草蛋白酶变体，其包含一个或多个选自下组的修饰:S9R, A15T, V68A, H120N, Q245R;S9R, A15T, V68A, Q245R, N252K;S9R, A15T, V68A, I79T, G102S, P131H, Q137H;S9R, V68A, S99G, Q245R, N261D;S9R, A15T, V68A, S99G, N261D; S9R, A15T, V68A, Q245R, N261D;S9R, A15T, V68A, H120N, P131S, Q137H, Q245M;S9R, A15T, V68A, I72F, S99G, Q245R, N261D;S9R, A15T, V68A, S99D, Q245R, N261D;S9R, A15T, V68A, N76I, S99G, Q245R, N261D;Y167A, R170S, A194P, K251R;Y167A, R170S, A194P, S265K;Y167A, R170S, A194P, V244R;S141E, Y167A, R170S,A194P;Y167A, R170S,M175I;Y167A, R170S, A172T;Y167A, R170S, A174V,M175F;Y167A, R170S, A172V, A174V;Y167A, R170S, A172E;Y167A, R170S,M175L;Y167A, R170S, A174T;Y167A, R170S, A174T,M175L;G53C, G61E;A98S, S99D, GlOOS;S9R, T22A, V68A, S99A, *99aD;S9R, P14H, R19L, N62D;G61P,*99aS;N43S, N62D;*96aG，P131S, V203A, A228T;N62D, A232C, Q236L, Q245N;*96aA, A98T, R247K;S99D, S101R, S103A, V104I, G160S, A194P, L217D;*6IaD;N62D, S106A;V68A, S106M, N184D;S9R, A15T, *97aV, H120N;A15M, A16P, *99aD;*99aE, G160S, S163T, G195S, G211S, K237R, G258A, T260L;G23S,*99aD, A194P, S242T, Q245R;G100S, N173D;Y167A, R170S, A172E;A98T, Q137L, Y167A, R170S, M175L;*98aA, S99D;S99A, *99aD, V203A;N62D,K237R;VI1M, N76D, L126F, K251R;S9F, A15L, A16P, T22I, *98aA, S99D, R170H; *96aA，*130aG，P131H;E54D, N62D;*98aA, *98bS, S99G, S101T;*100aA, *100bG, *100cS, *100dG;V68A, LI111;*98aA, R170H, Q245R;I35V, N62D, N183D, T224S;*97aG，P131S, V203A, A228T;S9R, RlOK, P14Q, T22A, Y167A, R170S;S9R, *22aL, S57A, G61E, *98aA, V139L, N173S; P14T, N18K, Y167A, R170S;S9R, Q12E, P14Q, K27R, Y167A, R170S;N62D, R170L;N62D, R170S, Q245R;Y167A, R170S, A194P, K251R, S265K;P14T, N18K, Y167A, R170S, A194P;N62D,A151G, K237R;N62D,A151G, Q245R;N62D, A151G, K237R, Q245R;S103A, V104I, G159D, A232V, Q236H, Q245R; S9R, A15T, T22A, V139L;S9R, A15T, G61E, A85T, E89Q, P239L, Q245C; N248R;S9R, A15T, *22aL, V139L, N204D, Q245L; N218S;V68A,S106A, H120N;V68A, S106A, N252K;A15T,V68A, S99G, Q245R, N261D;V68A, S99G, Q245R, N261D;S9R, A15T, *22aL, V139L, S163G, N204D, Q245LQ245R, N252H;
S9R, *22aL, G61E, *97aA, Ml 191，Q137H, N173S 和
V68A, S106A, T213A。
2.根据权利要求1的变体,其中所述亲本枯草蛋白酶属于亚组1-S1。
3.根据权利要求1或2的变体，其中所述亲本枯草蛋白酶属于亚组1-S2，并且其中所述亲本优选是BLSAVI。
4.分离的DNA序列，其编码权利要求1-3中任一项定义的枯草蛋白酶变体。
5.表达载体,其包含权利要求4的分离的DNA序列。
6.微生物宿主细胞，将其用权利要求5的表达载体转化。
7.根据权利要求6的微生物宿主细胞，所述微生物宿主细胞是细菌，优选是芽孢杆菌属，特别是迟缓芽孢杆菌。
8.根据权利要求6的微生物宿主细胞，所述微生物宿主细胞是真菌或酵母，优选是丝状真菌，特别是曲霉属。
9.用于产生权利要求1-3中任一项定义的枯草蛋白酶变体的方法,其中在有益于表达和分泌所述变体的条件下培养权利要求6-8中任一项定义的宿主，并且回收该变体。
10.包含权利要求1-3中任一项定义的变体的清洁或洗涤剂组合物，优选是洗衣或洗碗组合物。`
11.根据权利要求10的组合物，所述组合物额外地包含纤维素酶、脂肪酶、淀粉酶、角质酶、蛋白酶、半纤维素酶、酯酶、乳糖酶、淀粉糖化酶、多聚半乳糖醛酸酶、β -半乳糖苷酶、木质酶，或它们的混合物。
12.权利要求1-3中任一项定义的变体在洗衣和/或洗碗洗涤剂中的用途。
13.根据权利要求1的枯草蛋白酶变体，其中所述变体进一步包含以下修饰中的一种或多种:K27R、*36D、S56P、N62D、V68A、N76D、S87N、G97N、S99SE、S101G、S101R、S103A、V104A、V1041、V104N、V104Y、S106A、H120D、H120N、N123S、G159D、Y167A、R170S、R170L、A194P、N204D、V2051、Q206E、L217D、N218S、N218D、M222S、M222A、T224S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N248D、N252K、T274A、S101G+V104N、S87N+S101G+V104N、K27R+V104Y+N123S+T274A、N76D+S103A+V1041、S99D+S101R+S103A+V104I+G160S、
S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+V199M+V205I+L217D,
S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+A194P+V199M+V205I+L217D,
S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+V205I 和 N76D+V104A。
14.根据权利要求1的枯草蛋白酶变体，其包含以下取代:
S101G+S103A+V104I+G159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+N252K。
【文档编号】C11D3/386GK103555697SQ201310544773
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2006年7月6日 优先权日:2005年7月8日
【发明者】亨丽埃特.德拉伯格, 维贝克.S.尼尔森, 斯蒂芬.明宁 申请人:诺维信公司