专利名称：抗人白细胞介素-4的单克隆抗体及产生白细胞介素-4的杂交瘤的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及单克隆抗体及其相关的杂交瘤，更具体地说是涉及特异于人白细胞介素-4的单克隆抗体。
人白细胞介素-4(IL-4)首先是由Yokota等人(Proc.Natl.Acad.Sci.，83∶5894-5898，1986)克隆并鉴定的。IL-4是一种作用于免疫系统许多成分的高度多向性的淋巴激活素。它具有T细胞生长因子(TCGF)活性和B细胞生长因子活性。它能够增强白细胞介素-2(IL-2)的TCGF活性和粒性白细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的集落生成活性。它诱导IgG1和IgE的优先产生，并诱导人白细胞Ⅱ类DR抗原的表达。这些活性提示IL-4具有几种可能的治疗应用，如作为IL-2抗肿瘤治疗的增强剂，作为GM-CSF刺激的骨髓再生增强剂，或作为裸核淋巴细胞综合症的治疗剂(Touraine，Lancet，319-321(1981，2，1);Touraine and Betuel，Human Immunology，2∶147-153(1981);Sullivan et al.，J.Clin.Invest.，76∶75-79(1985))。
IL-4的IgE诱导活性可能对变态反应性疾病患者具有重要意义。IL-4拮抗剂的可得性可为使用具有许多有害副作用的糖皮质类固醇(特别是在长期使用的情况下)提供一种替代物(参见GoodmanandGillman，ThePharmacologicalBasisofTher-apeutics，6thEd.，MacMillanPublishingCompany，NewYork，1980)。特别是，通过产生抗个体基因型抗体(例如，美国专利4，731，237)或通过模拟型筛选(如Geysenetal.，J.Immunol.Meth.，102∶259-274，1987;PCT专利申请WO86/00991和WO86/06487)来强烈阻断对人IL-4特异的单克隆抗体，为构建拮抗剂提供了一种方法。
任何涉及药物的治疗方法，其重要之处就在于是否能够预计和/或监测病人血液或其他体液中的药物浓度。单克隆抗体被广泛地用于这一目的(例如Springer，ed.，HybridomaTechnologyintheBiosciencesandMedicine，PlenumPress，N.Y.，1985;美国专利4，562，003、4，486，530和4，255，329)。
在遗传改造的蛋白质如IL-4的生产中，一个主要的问题是从转化的宿主细胞和/或其培养上清液中分离所表达的蛋白质。常用的分离方法包括使粗品一次或多次通过免疫吸附柱。特异于欲纯化蛋白质的单克隆抗体是这种吸附柱的关键性组成部分。也可用这类单克隆抗体来检验由特定方法(如“Western”印迹分析法)进行纯化的程度(Burnette，Anal.Biochem.，112∶195-203，1981)。
由上述情况可以看出，通过改进现有的纯化方法，并提供监测血液、尿等体液中IL-4浓度的方法，将有利于IL-4特异性单克隆和/或多克隆抗体在医学和兽医学上的应用。
本发明提供用于检测、纯化、测定和/或抑制人IL-4的化合物和组合物。这些化合物和组合物是由产生人IL-4特异性单克隆抗体的杂交瘤中得到的。本发明的化合物和组合物包括杂交瘤本身、由杂交瘤产生的单克隆抗体、重链和轻链可变区多肽及这些抗体的其他片段，如包含轻链与重链通过天然二硫键而连接的半分子、Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段等。本发明还包括使用上述化合物和组合物检测、纯化和测定人IL-4浓度的方法，以及实施这些方法的试剂盒。特别是，本发明包括杂交瘤IC1·llB4.6和MP4.25D2.11及其单克隆抗体和由其衍生的产物。
本发明的组合物也可用作人IL-4的激动剂或拮抗剂。具体地说，包含拮抗性抗IL-4抗体(如MP4.25D2.11的单克隆抗体)片段的组合物可用作治疗特异反应性疾病的治疗剂。
本发明的组合物还包括自杂交瘤ICl.llB4.6和MP4.25D2.11中提取的信使RNA(mRNA)。这些mRNA可用于在细菌、酵母或其他宿主中克隆和表达ICl.llB4.6和MP4.25D2.11抗体的片段。
抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链集合体。称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个的恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。
本文所用的术语“重链可变区”是指一种多肽，(1)其长度为110至125个氨基酸;(2)其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，(1)其长度为95至115个氨基酸;(2)其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。
所用的术语Fab、Fc、F(ab)2及Fv各有其标准的免疫学含义(见Klein，Immunology，John Wiley，New York，1982;Parham，Chapter14，inWeir，ed.Immunochemistry，4thEd.，BlackwellScientificPublishers，Oxford，1986)。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指能与人IL-4特异结合的免疫球蛋白的同源群体。应明确的是，人IL-4可具有一个或多个下述的抗原决定簇(1)由人IL-4内几条单一肽链组成的肽抗原决定簇;(2)由一个以上空间上接近的肽链组成的构象抗原决定簇，这些肽链各自的氨基酸顺序在人IL-4多肽顺序上的位置并不相互衔接;(3)由翻译后共价连接到人IL-4上的整个或部分分子结构(如糖基等)组成的翻译后抗原决定簇。本发明的抗体可以针对一个或多个上述决定簇。
本文所使用的术语“结合组合物”是指含有这样两条多肽链的组合物(1)这两条肽链有效结合时，呈对人IL-4有高度结合亲合性的构象;(2)它们得自于产生人IL-4特异性单克隆抗体的杂交瘤。术语“有效结合”旨在指明这两条多肽链在结合时能以各种方式彼此相对定位，这些方式包括在天然抗体片段如Fab或Fv中结合，或借助于羧基末端的遗传改造的含半胱氨酸连接肽而结合。这两个多肽链通常相当于人IL-4特异性单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区。
图1图解显示了适于在细菌宿主内表达非糖基化人IL-4的表达载体;
图2图示了人IL-4最后纯化步骤的215nm光吸收图谱;
图3(A部分和B部分)显示了对结合于Daudi细胞上的125I-CHO HuIL-4的中和作用。
用已知技术产生本发明的杂交瘤。该方法通常包括使一种可持久传代的细胞系与一种可产生所需抗体的B淋巴细胞融合。另外，亦可使用非融合技术来产生持久存活的抗体生成细胞系，如利用病毒诱导的转化作用(Casali，etal.，“HumanMonoclonalsfromAntigen-SpecificSelectionofBLymphocytesandTransformationbyEBV”，Science，234∶476-479，1986)，这也在本发明的范围之内。持久存活的细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人的骨髓瘤细胞。从方便和可得性考虑，最常用的是大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。
从注射了靶抗原的哺乳动物来获得适当淋巴细胞的技术是熟知的。一般说来，如果需要人的细胞，可使用外周血淋巴细胞(PBL);如果需要非人类哺乳动物细胞，则使用脾细胞或淋巴结细胞。给宿主哺乳动物反复注射纯化的抗原，并使该哺乳动物产生所需的抗体生成细胞，然后收集这些细胞与持久存活的细胞系进行融合。细胞融合技术也是本领域内熟知的，一般包括将细胞与融合剂如聚乙二醇混合。用标准方法如HAT选择法选择杂交瘤细胞。使用Western吸印法、ELISA法、RIA法等标准的免疫分析法分析这些杂交瘤的培养基以选择出分泌所需抗体的杂交瘤。使用标准的蛋白质纯化技术(Tijssen，PracticeandTheoryofEnzymeImmun-oassays，Elsevier，Amsterdam，1985)由培养基中回收抗体。在应用任一种上述技术时有许多文献可供参考(Kohleretal.，HybridomaTechniques，ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，1980;Tijssen，PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays，Elsevier，
Amsterdam，1985;Campbell，MonoclonalAntibodyTechnology，Elsevier，Amsterdam，1984;Hurrell，MonoclonalHybridomaAntibodiesTechniquesandApplications，CRCPress，BocaRaton，FL，1982;等等)。
抗体片段的应用和产生也是熟知的。如Fab片段(Tijssen，PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays，Elsevier，Amsterdam，1985)和Fv片段(Hochmanetal.，Biochemistry，12∶1130-1135，1973;Sharonetal.，Biochemistry，15∶1591-1594，1976;Ehrlichetal.，美国专利4，355，023)以及抗体半分子(Auditore-Hargreaves，美国专利4，470，925)。此外，可借助已知技术用本发明的这些化合物和组合物构建双特异性抗体，如通过杂交瘤的进一步融合(即形成所谓四重杂交瘤)(quadromas))(Reading，美国专利4，474，493)或半分子的化学再连接(Brennanetal.，Science，229∶81-83，1985)。
本发明的杂交瘤和单克隆抗体是针对用重组方法产生的成熟人IL-4的糖基化或非糖基化形式而产生的。一般说来，人IL-4的非糖基化形式是在大肠杆菌(E.coli)中产生的，而糖基化形式是在CVl或COS猴细胞、小鼠L细胞等哺乳动物细胞宿主中产生的。用重组方法产生的成熟人IL-4是通过用标准方法将表达载体引入宿主细胞而产生的(Maniatisetal.，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，1982;OkayamaandBerg，Mol.Cell.Biol.，2∶161-171，1982和3∶280-289，1983;Hamer，GeneticEngineering，2∶83-100，1980;美国专利4，599，308;Kaufmanetal.，Mol.Cell.Biol.，2∶1304-1319，1982;等等)。
一旦知道或可以得到编码所需蛋白质的核苷酸顺序，即使用本领域熟知的方法构建细菌或哺乳动物表达载体。如DeBoer公开了用于细菌表达载体的一些启动子(见美国专利4，511，433);Goeddel等人(美国专利4，601，980)和Riggs(美国专利4，431，739)公开了用大肠杆菌表达系统生产哺乳动物蛋白质的方法;Riggs(上述文献)、Ferretti等人(Proc.Natl.Acad.Sci.，83∶599-603，1986)、Sproat等人(NucleicAcidsRes.，13∶2959-2977，1985)和Mullenbach等人(J.Biol.Chem.，261∶719-722，1986)公开了构建在细菌中表达的合成基因的方法。因此，上述文献均列为本文参考文献。Yokota等人(文献同上)公开了成熟人IL-4的氨基酸顺序;Yokota等人(文献同上)所描述的、由pcD载体携带的编码人IL-4的cDNA寄存在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD)，登记号为67029。许多细菌表达载体和宿主细胞可以由市场上购得或通过ATCC得到。用以免疫宿主动物的人IL-4最好是从已用上述pcD载体短暂转染的COS、CVl蛐∈驦细胞的培养上清液中分离。
还可用重组方法制得本发明杂交瘤特有的抗体和抗体片段，特别是ICl.llB4.6，即提取信使RNA，构建cDNA文库，筛选编码抗体分子片段的克隆(Walletal.，NucleicAcidsRes.，5∶3113-3128，1978;Zalsutetal.，NucleicAcidsResearch，8∶3591-3601，1980;Cabillyetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，81∶3273-3277，1984;Bossetal.，NucleicAcidsResearch，12∶3791-3806，1984;Amsteretal.，NucleicAcidsResearch，8∶2055-2065，1980;Mooreetal.，美国专利4，642，234)。特别是可用这些技术生产种间单克隆抗体，其中一个种的抗体结合，区与另一个种的抗体非结合区相结合(Liuetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，84∶3439-3443，1987)。
用单克隆抗体进行纯化和测定是熟知的，如用于亲合层析(AffinityChromatography∶PrinciplesandMethods，Pharmacia，Orebro，Sweden，1979;Secheretal.，Nature，285∶446-450，1980和美国专利4，423，147;欧洲专利申请0190711(1986年8月13日))和免疫分析技术(Tijssen，文献同上;美国专利4，486，530;Burnette，文献同上)。人IL-4可用亲合层析法由样品如已用人IL-4表达载体转化或转染的细胞培养上清液中提取来进行纯化。本文将这样一种纯化方法称为免疫纯化法。该方法一般包括使人IL-4特异性单克隆抗体共价连接到置于柱内或容器内的固相载体(本文称为免疫吸附剂)上，然后使样品通过。样品中的人IL-4优先与已连接的单克隆抗体的结合位点结合，而样品中的其余材料则从柱或容器中洗出。然后用标准技术如低PH、高盐浓度等方法从免疫吸附剂上洗脱出人IL-4。
“两位点”或“夹心”免疫分析法(美国专利4，486，530，该专利列为本文参考文献)是本发明优选的免疫分析法。这些方法包括使用两组不同的抗IL-4抗体，其中至少有一组含有本发明的单克隆抗体，如由ICl·llB4.6产生的单克隆抗体。将其中一组的抗体连接在固相载体表面。然后使连接的抗体与可能含有人IL-4的样品接触。IL-4分子即结合到连接的抗体上。接着向结合的IL-4加入第二组抗体，这些抗体与一个或多个与结合了第一组抗体的抗原决定簇不同的抗原决定簇相结合。然后用与第二组抗体有关的间接或直接信号产生方法来检测IL-4。例如，抗体可直接与信号产生部分如酶、稀土金属螯合剂或有机染料相结合，也可通过附加抗体或高亲合性复合物(如抗生物素蛋白-生物素复合物)间接与一个或多个信号产生部分连接。将样品产生的信号与含有已知浓度人IL-4的，IL-4标准品产生的信号相比较，定量测定IL-4的浓度。
本发明包括用于免疫分析特别是夹心法免疫分析的试剂盒。这种试剂盒包括(1)一固相载体;(2)单克隆的并且能够与人IL-4的第一抗原决定簇结合的第一抗体;(3)选自能与人IL-4的第二抗原决定簇结合的单克隆抗体和对人IL-4特异的多克隆抗体(本文称之为“多克隆抗体组合物”)的第二抗体;(4)一种与这三种抗体之一相联的信号产生体。依据特定的实施方案，试剂盒可包含由三种抗IL-4抗体中选出的两种，或者是对第一抗原决定簇特异的单克隆抗体和对第二抗原决定簇特异的单克隆抗体，或者是对第一或第二抗原决定簇特异的单克隆抗体和一种多克隆抗体组合物。抗体可以是溶液或冻干形式。使用试剂盒时可将其中一组抗体加于固相载体的表面，也可以预先连接到固相载体上。信号产生体可以与两种类型抗体中的一种预先联接，也可能需要在使用前与缓冲液、抗体-酶结合物、酶底物等一种或多种组分结合。许多类型的信号产生体都可加以利用并可构成试剂盒的一个或多个组分。Tijssen(文献同上)描述了各种信号产生体。本发明的试剂盒还可包括其他试剂，如用于降低对固相表面的非特异性结合的阻断剂、洗涤剂和酶底物等。固相表面可以是微量滴定板、微球体等形式，可由适于固定蛋白质的聚氯乙烯、聚苯乙烯等材料制成。本文将这些具有固相表面的材料称为“载体”。催饣虺噬镄纬傻拿缸詈檬切藕挪宓囊桓鲎榉帧６庵置缸詈醚∽杂诠趸锩浮⒓钚粤姿狨ッ负挺 半乳糖苷酶。这些酶的底物和反应条件是本领域中熟知的(Tijssen，文献同上)。
也可使用本发明的组合物作为针对IL-4相关疾病的医药组合物的成分。可使用包含具有激动作用的单克隆抗体(或其结合片段)的医药组合物来增强IL-4的活性。也可使用包含具有阻断作用或拮抗作用的单克隆抗体(或其结合片段)的组合物来抑制IL-4的活性。这种组合物含有至少一种治疗量的本发明单克隆抗体(或其结合片段)和一种医药上适用的载体。医药载体可以是任何适于向病人体内释放本发明组合物的可配伍的无毒物质。载体中可包含无菌水、醇、脂肪、蜡和惰性固体。还可向医药组合物中掺入医药上可接受的助剂(缓冲剂、分散剂)。一般说来，适于胃肠道外给药的药物组合物是熟知的(Remington′sPharmaceuticalScience，15thEd.，MackPublishingCompany，Easton，PA，1980)。另外，可借助可植入的药物释放系统将本发明的组合物引入病人体内(Urquhartetal.，Ann.Rev.Pharmacol.，Toxicol.，24∶199-236，1984)。
实施例下列实施例旨在举例阐明本发明。载体和宿主的选择以及试剂的浓度、温度和其他变量的值只是举例说明本发明的应用，而不构成对本发明的限制。
实施例I.用pcD-人IL-4转染COS7猴细胞以产生糖基化的人IL-4表达载体pcD-人IL-4和宿主细胞COS7得自美国典型培养物保藏中心，登记号分别为67029和CRL1651。扩增pcD-人IL-4克隆，纯化质粒DNA，然后用标准转染方法转染COS7。将大约1×106个COS7细胞接种于含有Dulbecco改良的Eagle氏培养基(DME)、10%胎牛血清和4mML-谷氨酰胺的100mm组织培养皿上。接种约24小时后，由平皿中吸出培养基并用缓冲的(50mM Tris)无血清DME将细胞洗两次。向各平皿内加入4ml缓冲的无血清DME(含4mML-谷氨酰胺)、80μl DEAE-葡聚糖和5μg pcD-人IL-4DNA。细胞在该混合物中于30℃保温4小时，然后吸出混合物并用缓冲的无血清DME将细胞洗涤一次。洗涤后向各平皿内加入5ml含4mML-谷氨酰胺、100μM氯喹和2%胎牛血清的DME，并将细胞保温3小时，然后用缓冲的无血清DME洗两次。接着，加入5ml含4mML-谷氨酰胺和4%胎牛血清的DME，并将细胞于37℃保温24小时。然后将细胞用DME或PBS洗1-3次，加入5ml无血清DME(含4mML-谷氨酰胺)，细胞于37℃保温，5天后收集培养上清液。
实施例Ⅱ.由COS7转染上清液中纯化糖基化的人IL-4A.用于纯化的生物学检测法在由实施例1中制得的上清液进行纯化时，用T细胞生长因子(TCGF)活性来检测人IL-4。已有文献述及几种检测TCGF活性的标准检测法(Devos et al.，Nucleic Acids Research，11∶4307-4323，1983;Thurman et al.，J.Biol.Response Modifiers，5∶85-107，1986;Robert-Guroff et al.，Chapterg in Guroff，Ed.Growth and Maturation Factors，John Wiley，New York，1984)。TCGF检测法一般是基于一种因子促进外周T淋巴细胞或IL-2依赖性T细胞系增殖的能力而建立的(Gillis et al.，J.Immunol.，120∶2027，1978)。可使用氚标记的胸苷掺入或比色法等标准技术来测定细胞增殖(Mosmann，J.Immunol.Meth.，65∶55-63，1983)。按下述步骤检测人IL-4的TCGF活性取健康供血者的血液置于加有肝素的试管内，在Ficoll-Hypaque上铺层，如在15ml离心管内每3ml Ficoll-Hypaque加5ml血液。以3000×g离心20分钟后，吸出界面上的细胞，用含有RPMI 1640(其中含有10%胎牛血清、50μM2-巯基乙醇、20μg/ml植物凝集素(PHA)和重组人IL-2)的生长培养基稀释。37℃下保温5-10天后，洗涤PHA刺激的外周血淋巴细胞(PBL)并用于2天比色分析(Mossman，文献同上)。利用上述生长培养基在96孔微量滴定板中，对IL-4标准品(pcD-人IL-4转染的COS7细胞的上清液)或待测组分进行两倍逐级稀释，使终体积为50μl/孔。各孔内加入50μl PHA刺激的PBL(浓度约4-8×106个细胞/ml)，将滴定板于37℃保温2天。然后按Mosmann的方法(文献同上)测定细胞生长。
这里所用的一个单位是一个孔(0.1ml)中，在48小时内刺激2×104个PHA刺激的PBL达到50%最大增殖的因子的量。
B、纯化依次应用阳离子交换层析、凝胶过滤和反相高压液相层析进行纯化。
离心除去COS-7细胞，将上清液经超滤浓缩约10倍并保存于-80℃待进一步处理。通过检测IL-4刺激植物凝集素诱导的人外周血淋巴细胞增殖的能力，即通过用上述标准检测法检测TCGF活性，来测定该蛋白的效价。将TCGF活性约为104-106单位/ml、蛋白质含量约为15-20mg/ml的浓缩COS-7上清液对50mM HEPES钠(PH7.0)透析24小时(此间更换两次液体，每次均为浓缩物体积的约10-15倍)。将透析液加至用50mM HEPES钠(pH7.0)预平衡的S-Sepharose柱上(1×2.5cm)(流速0.2ml/分)。用15倍柱体积的平衡缓冲液洗柱，然后用20倍柱体积的线性氯化钠梯度(0至0.5M氯化钠、50mM HEPES钠，pH7.0)洗脱。用5倍柱体积的50mM HEPES钠、0.5MNaCl(pH7.0)常液终止洗脱。分别以1.5ml和1.8ml为1份分两批收集各组分。发现两次层析均在300mM和500mM氯化钠浓度之间洗脱出IL-4效价。
合并从S-Sepharose柱洗脱出的含IL-4效价组分，总体积分别为9.0和10.8ml。用AmiconYM5膜(截留分子量5000)经超滤将两者都浓缩到1.9ml。由该步骤回收的蛋白质约有80%。将浓缩的IL-4溶液加到用50mMHEPES、0.4MNaCl(pH7.0)预平衡的SephadexG-100柱(1.1×58cm)上，并用同一缓冲液以0.15ml/分的流速洗脱。总共收集50份(1.0ml/份)并分析IL-4效价。在表观分子量为22，000道尔顿处观察到一生物活性峰。用牛血清白蛋白(65，000道尔顿)、碳酸酐酶(30，000道尔顿)和细胞色素C(11，700道尔顿)标定SephadexG-100柱，以测定表观分子量。
将从Sephadex G-100柱洗脱出的含IL-4活性组分真空浓缩3-4倍，并注入Vydac C-4防护柱(4.6×20mm)。在35℃柱温下，以1.0ml/分的流速在15分钟内产生0至72%(V/V)乙腈(溶于0.1%(V/V)三氟乙酸(TFA))线性梯度。于214nm处检测所得的三个峰，其保留时间分别为7.82和8.7分钟(分别为图2中峰1、2和3)。从峰2(洗脱时间8.2分钟)中取40μl样品冻干并再溶解于含10%胎牛血清的基本必需培养基中。该溶液显示有阳性TCGF反应。从峰2中取300μl等分样品蒸发至干并重新溶解于200μl 0.1%(W/V)十二烷基硫酸钠(SDS)中。用200μl1%(V/V)TFA稀释2μl样品并再次层析。该样品的HPLC证明在215nm处有一单峰。测得峰2物质的活性约为7×108单位/mg。
实施例Ⅲ.在大肠杆菌中生产非糖基化的人IL-4用标准技术(Maniatisetal.，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryNewYork，1982)构建表示为TRPCll的大肠杆菌表达载体。
将合成的相符RBS片段连接到ClaⅠ连接子(ATGCAT)上并将所得片段克隆到ClaⅠ限制的pMTllhc(已被预先修饰而含有ClaⅠ位点)中，从而构建出TRPCll载体。pMTllhc为pBR322的小的(2.3千碱基)、高拷贝AMPR、TETS衍生物，它携有πVX质粒(Maniatis等，文献同上)的EcoRⅠ-HindⅢ多连接子区。用EcoRⅠ和BamHⅠ限制pMT11hc、填平所得粘性末端并与ClaⅠ连接子(CATCGATG)连接，从而恢复EcoRⅠ和BamHⅠ位点，并用ClaⅠ位点置换SmaⅠ位点，这样，pMTllhc就被修饰而含有ClaⅠ位点。
TRPCll构建中的一个转化体具有邻接ClaⅠ位点的串联RBS顺序。用PstⅠ消化该质粒，用Bal31核酸酶处理，用EcoRⅠ限制，在所有四种三磷酸脱氧核苷酸存在下用T4DNA聚合酶处理，从而除去其中一个ClaⅠ位点和第二个RBS顺序拷贝的一部分。用聚丙烯酰胺凝胶电泳法回收所得到的30-40bp片段，并克隆到SmaⅠ限制的PUC12中。然后将衍生自pKC101(Nichols et al.，in Methods in Enzymology，101155，Academic Press，N.Y.1983)的携带大肠杆菌trpP的248bp EcoRⅠ片段克隆到EcoRⅠ位点中，即完成TRPCll的构建(见图1)。
使用TRPCll作为人IL-4cDNA的载体。首先用ClaⅠ和BamHⅠ消化，纯化后在标准连接溶液中将其与pcD-125(寄存于ATCC，登记号为67029)的EcoRV/BamHⅠ片段混合。标准连接溶液中含有0.1μM下列合成连接子5′-CGATGCACAAGTGCGAT-3′TACGTGTTCACGCTA
使用标准的氯化钙法直接用连接溶液转化大肠杆菌AB1899，增殖后铺平板。用标记的寡核苷酸探针选择含IL-4cDNA插入片段的菌落。在L-培养液中培养转化体，使其表达IL-4。
实施例Ⅳ.由大肠杆菌产生的聚集体中纯化非糖基化的人IL-4培养1升大肠杆菌AB1899(lon-)的培养物(得自Yale University E.coli Genetics Center，New Haven，CT)至OD560＝2(约为1.6×109细胞/ml)。于4℃下以4500×g离心15分钟收集细胞。将沉淀重新悬浮于30ml含有50mM NaCl、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)和0.1mM苯基甲基硫基氟(PMSF)的50mM Tris缓冲液(pH8.0)中。纯化前加入EDTA和PMSF旨在抑制可能降解人IL-4的蛋白酶活性。接着用超声波处理细胞(70瓦50次脉冲(50%))，在4℃下以25，000×g离心15分钟。将沉淀物溶于十二烷基硫酸钠后进行电泳分离，用考马斯蓝染色后将凝胶条带图形与阴性对照作比较，表明上述沉淀物的主要蛋白质组分是IL-4。
除去上清液后，将沉淀物重新悬浮于含有5M盐酸胍、2mM谷胱甘肽(还原型)和0.2mM谷胱甘肽(氧化型)的Tris缓冲液(50mMTris、50mMNaCl、1mMEDTA、0.1mMPMSF，pH8.0;每克沉淀物加9ml)中。室温下放置约1小时后，用含有2mM谷胱甘肽(还原型)和0.2mM谷胱甘肽(氧化型)的Tris缓冲液(pH8.0)将溶液稀释9倍。在稀释、透析或浓缩步骤中如果形成沉淀，则在进一步处理之前离心除去这些沉淀物。然后将全部溶液对3升磷酸盐缓冲液过夜透析3次。用AmiconYM5超滤膜浓缩透析液(即保留在透析袋内的物质)(达到终浓度8mg/ml)，并进行凝胶过滤层析(柱P30(BioRad)、1.5×90cm;洗脱缓冲液为PBS;流速8ml/小时)。每隔15分钟收集一份。合并第23-27份并用反相HPLC法进一步分析。分析结果表明合并的各管含有95%纯人IL-4。1升培养物(OD560＝2)所得人IL-4产率为2mg，比活性为5×107单位/mg。
实施例Ⅴ.杂交瘤ICl·llb4.6的产生取雄性Lewis大鼠腹腔内(i.p.)注射用1ml完全弗氏佐剂(CFA)乳化的1ml人IL-4溶液。人IL-4溶液由浓度为14μg/ml溶于10mM Tris-HCl、0.5MNaCl(pH7.4)中的人IL-4组成。人IL-4是依照实施例Ⅰ和Ⅱ产生的，其比活性为2×107单位/mg。首次免疫两周后，大鼠腹腔内再次注射用1ml CFA乳化的1ml人IL-4溶液。第2次注射3个月后，给大鼠静脉注射1ml人IL-4溶液(15μg)作加强免疫。加强注射4天后处死大鼠，收集血液，分离脾脏作细胞融合。利用聚乙二醇(PEG)以1∶1的比例使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞P3X63-Ag8.653(ATCCCRL 1580)融合。将细胞悬浮液(悬浮于HAT培养基中，3.5×105细胞/ml)分置于40个96孔微量滴定板中。10天后测试杂交瘤上清液与直接固定于微量滴定板上的人IL-4结合的能力(间接ELISA)或与结合于固定化免抗人IL-4的多克隆IgG部分的人IL-4结合的能力。用标准方法以过氧化物酶结合的羊抗大鼠免疫球蛋白来检测已结合的抗体。利用极限稀释法克隆可分泌与IL-4反应的抗体的杂交瘤。ICl·llB4.6就是一种用这些方法筛选的杂交瘤。经测定，由ICl·llB4.6产生的抗体为IgG2a同型抗体。可用标准的哺乳动物细胞培养技术保存和培养杂交瘤(如在含10%DMSO的培养基中于-70℃下保存并在含有10%胎牛血清并添加了1mM谷氨酰胺和50mM2-巯基乙醇的RPMI1640中培养)。
实施例Ⅵ.杂交瘤MP4.25D2.11的产生基本上按照实施例Ⅴ的椒ú咏涣鍪占锊⑸秆∷堑挠腥薎L-4特异性的抗体。然后用标准的体外检测法，根据其抗体阻断人IL-4的TCGF活性的能力，进一步筛选所收集的杂交瘤(如实施例Ⅱ所述)。从所鉴定的几种有阻断作用的单克隆抗体中选择出由MP4.25D2.11产生的抗体，该抗体具有最高效价的阻断活性。由MP4.25D2.11产生的抗体被确定为大鼠IgG1。
实施例Ⅶ.人IL-4的夹心检测法于37℃下使100μl兔多克隆抗人IL-4抗体(在蛋白A亲合层析柱上纯化的在PBS中的溶液，浓度为10μg/ml)在96孔聚氯乙烯微量滴定板的各孔表面上吸附2小时(PBS的组成为8.0gNaCl、0.2gKH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O和0.2gKCl，加蒸馏水至1升，pH为7.4)。用PBS-吐温(完全按PBS制备，此外每升加0.5ml吐温20)洗滴定板以除去未结合的抗体，然后以逐步降低IL-4浓度的顺序，在两排孔内(每排12个孔)加入双份作逐级稀释(用PBS)的纯化的大肠杆菌产生的人IL-4，其浓度范围为1000pg/ml至15pg/ml。在其余孔内加入下列样品(1)得自人T细胞克隆如ClLy1+2-/9(ATCC CRL 8179)的培养上清液;(2)用pcD-人IL-4转染的COS-7细胞的培养上清液;(3)含有不同浓度的COS-7产生的纯IL-4的人血清;(4)含有人IL-1α、IL-2、IL-3、IFN-γ、IFN-α2b、GM-CSF和BSF-2的样品。所有样品均于室温下保温2小时。用PBS-吐温洗涤后，向各孔内加入ICl·llB4.6的1∶10稀释的培养上清液(100μl/孔)，于室温下保温1小时。保温后洗滴定板，加入过氧化物酶结合的羊抗大鼠抗体，于室温下保温1小时，然后再洗滴定板。接着加入过氧化物酶底物ABTS，并通过检测各孔内光密度来测定人IL-4浓度。结果表明，该检测法可以检测出人血清中浓度低至50pg/ml的哺乳动物产生的人IL-4，但该检测法检测不到任何一种上面所列出的淋巴激活素。
下列表A和图3A显示11B4F(ab)、IgG和粗上清液(未纯化的抗体)抑制125I-HuIL-4与Daudi细胞结合的能力。所有三种制剂抑制结合的最大程度都达70%。对照组单克隆抗体GL117 F(ab)、IgG和粗上清液不影响结合(对照抗体是针对同一个体基因型的无关抗原的抗体)。纯化的11B4IgG或F(ab)产生50%结合抑制作用所需的浓度范围为10-100ng/ml。
下列表B和图3B显示在该检测法中25D2.11F(ab)抑制结合的能力。该制剂产生90%抑制，并在浓度为10-15ng/ml时产生50%最大作用。
图3A和3B中X轴为浓度(ng/ml)(对数标度)，Y轴为抑制百分比。
在这些实验中，HuIL-4是用中国仓鼠卵细胞制得的，在下列两表中表示为CHO-HuIL-4。
表AllB4对与Daudi细胞结合的125I-CHO-HuIL-4的中和作用结合结合样品ng/ml百分比样品ng/ml百分比llB4F(ab)128.1llB4IgG101025.341011.710054.2810071.01100067.9450073.661000064.56100069.54llB4上清液100GL117F(ab)1010045.1102.4100067.91000250074.310003.7500073.6100005.8GL117IgG10GL117上清液107.51001004.71001.8100001000025005.510000050000表B25D2.11F(ab)片段对与Daudi细胞结合的125I-CHO-HuIL-4的中和作用ng/ml抑制百分比ng/ml抑制百分比3000901554.11500901030.751000847.510.560773.003067.4
本发明前述实施方案旨在描述本发明。它们并不包罗一切或把本发明限定于所公开的具体内容，而且显然可以依据上述技术方案作出许多修改和变化。选择和描述这些实施方案是为了更好地解释本发明的原理及其实际应用，从而使本领域其他技术人员能够更好地依据各种实施方案来利用本发明，并根据需要和具体要求作出各种修改。本发明的范围是由所附的权利要求书来限定的。
申请人已将杂交瘤ICl·llB4.6和MP4.25D2.11寄存在美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD，USA，ATCC)，登记号分别是HB9550和HB9809。按照《布达佩斯条约》和ATCC的“用于专利目的的培养物保藏”协议作了上述保藏。这可确保美国专利和商标局局长可依照35USC122和37CFR1.14而得到保藏物，公众则可在授予美国专利后得到保藏物，这要求保藏物是存活的。保藏系的可得性不应被看作是允许在违背任何政府当局根据其专利法而授予的权利的情况下实施本发明。
权利要求
1.一种对人白细胞介素-4特异的单克隆抗体。
2.权利要求1的单克隆抗体，其特征在于，它对非糖基化人白细胞介素-4是特异的。
3.权利要求1的单克隆抗体，其特征在于，它对糖基化人白细胞介素-4是特异的。
4.权利要求3的单克隆抗体，其特征在于，它是由杂交瘤ICl·llB4.6产生的。
5.一种权利要求1的单克隆抗体，其特征在于，它能够阻断人白细胞介素-4的生物活性。
6.权利要求5的单克隆抗体，其特征在于，它是由杂交瘤MP4.25D2.11产生的。
7.一种能分泌对人白细胞介素-4特异的单克隆抗体的杂交瘤。
8.权利要求7的杂交瘤，其特征在于，它能够分泌对非糖基化人白细胞介素-4特异的单克隆抗体。
9.权利要求7的杂交瘤，其特征在于，它能够分泌对糖基化人白细胞介素-4特异的单克隆抗体。
10.一种权利要求9的杂交瘤，即ICl·llB4.6或MP4.25D2.11。
11.一种多肽，其特征在于，它包括对人白细胞介素-4特异的单克隆抗体的轻链可变区。
12.权利要求11的多肽，其特征在于，所述单克隆抗体是由杂交瘤ICl·llB4.6或杂交瘤MP4.25D2.11产生的。
13.一种多肽，其特征在于，它包括对人白细胞介素-4特异的单克隆抗体的重链可变区。
14.权利要求13的多肽，其特征在于，所述单克隆抗体是由杂交瘤ICl·llB4.6或杂交瘤MP4.25D2.11产生的。
15.一种对人白细胞介素-4特异的结合组合物，其特征在于，它包括对人白细胞介素-4特异的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区。
16.权利要求15的结合组合物，其特征在于，所述单克隆抗体是由杂交瘤ICl·llB4.6或杂交瘤MP4.25D2.11产生的。
17.一种检测可能含有人白细胞介素-4的样品中是否存在人白细胞介素-4的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤提供对人白细胞介素-4上的第一抗原决定簇特异的第一单克隆抗体;提供一种第二抗体，该抗体选自对人白细胞介素-4特异的多克隆抗体组合物和对人白细胞介素-4上第二抗原决定簇特异的第二单克隆抗体，其中第二抗原决定簇不同于第一抗原决定簇;提供一种能与第一单克隆抗体或第二抗体有效结合的信号产生体，所产生的信号强度或者仅与第一单克隆抗体的量有关，或者仅与第二抗体的量有关;将第一单克隆抗体或第二抗体连接到载体上，形成抗体-载体结合物;使样品与抗体-载体结合物接触，从而使样品中的人白细胞介素-4结合到抗体-载体结合物上;如果抗体-载体结合物包括第二抗体，使与信号产生体有效结合的第一单克隆抗体与结合到抗体-载体结合物上的人白细胞介素-4相接触;或者如果抗体-载体结合物包括第一タ寺固澹褂胄藕挪逵行Ы岷系牡诙固逵虢岷系娇固 载体结合物上的人白细胞介素-4接触;测定由信号产生体产生的信号。
18.权利要求17的方法，其特征在于，所述抗体-载体结合物包括所述第一单克隆抗体，所述第二抗体是所述的对人白细胞介素-4特异的多克隆抗体组合物。
19.权利要求18的方法，其特征在于，所述第一单克隆抗体是由杂交瘤ICl·llB4.6或杂交瘤MP4.25D2.11产生的单克隆抗体。
20.权利要求17的方法，其特征在于，所述抗体-载体结合物包括所述第二抗体，所述第二抗体是对人白细胞介素-4特异的所述多克隆抗体组合物。
21.权利要求20的方法，其特征在于，所述第一单克隆抗体是由杂交瘤ICl·llB4.6或杂交瘤MP4.25D2.11产生的单克隆抗体。
22.一种检测可能含有人白细胞介素-4的样品是否存在人白细胞介素-4的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括一种对人白细胞介素-4上的第一抗原决定簇特异的第一单克隆抗体;一种第二抗体，该抗体选自对人白细胞介素-4特异的多克隆抗体组合物和对人白细胞介素-4上第二抗原决定簇特异的第二单克隆抗体，第二抗原决定簇不同于第一抗原决定簇;一种载体;一种信号产生体。
23.权利要求22的试剂盒，其特征在于，所述第一单克隆抗体是由杂交瘤ICl·llB4.6或杂交瘤MP4.25D2.11产生的单克隆抗体，所述第二抗体是对人白细胞介素-4特异的所述多克隆抗体组合物。
24.权利要求23的试剂盒，其特征在于，所述信号产生体包括一种与所述第一单克隆抗体有效结合的酶，该酶选自过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酯酶。
25.一种从含有人白细胞介素-4的样品中提取人白细胞介素-4的免疫纯化方法，其特征在于，该方法包括使样品通过含有对人白细胞介素-4特异的单克隆抗体的免疫吸附柱。
26.权利要求25的免疫纯化方法，其特征在于，所述单克隆抗体是由杂交瘤ICl·llB4.6或杂交瘤MP4.25D2.11产生的。
全文摘要
本发明提供对人白细胞介素-4特异的单克隆抗体。还提供了用于检测、测定和免疫纯化人白细胞介素-4，以及阻断人白细胞介素-4生物活性的试剂盒和方法。
文档编号C12N15/70GK1032816SQ8810735
公开日1989年5月10日 申请日期1988年10月26日 优先权日1987年10月26日
发明者约翰S·阿伯拉姆斯, 伊莎贝尔·克雷蒂安, 弗兰克·D·李, 迈克尔K·皮尔斯 申请人:先灵生物技术公司