用于wt1特异性免疫疗法的组合物和方法

专利名称：用于wt1特异性免疫疗法的组合物和方法
技术领域：
本发明一般地讲涉及恶性疾病例如白血病和癌症的免疫疗法。本发明更具体地涉及产生和增强对WT1免疫应答的组合物，并涉及此组合物用于预防和/或治疗恶性疾病的用途。
相关技术的说明癌症和白血病是美国和全世界的重要的健康问题。虽然在此类疾病的检测和治疗方面取得了进展，目前还没有预防或治疗癌症及白血病的疫苗或其它普遍成功的方法。目前这些疾病的处理有赖于早期诊断和攻击性治疗的组合，它可能包括许多疗法例如外科手术、放射疗法、化学疗法和激素疗法中的一种或多种。特定癌症的治疗路线通常根据各种病情预后参数，包括特异性肿瘤标志的分析进行选择。然而，利用已建立的标志常导致难以解释的结果，并且继续在许多癌症患者中观察到高的死亡率。
免疫疗法具有充分改善癌症和白血病治疗和存活的潜力。最近的数据证明白血病在骨髓移植(例如供体淋巴细胞输注)的情况下可通过免疫疗法治愈。此疗法可能涉及产生或增加针对肿瘤相关抗原(TAA)的免疫应答。然而，迄今为止相对少的TAA已知，而且针对此抗原的免疫应答的产生，除了罕见的例外，未显示出治疗益处。
因此，本领域需要用于白血病和癌症预防及治疗的改善的方法。本发明满足了这些需要，并进一步提供了其它的有关优点。
发明概述简要地陈述，本发明提供了诊断和治疗诸如白血病和癌症的疾病的组合物和方法。在一个方面，本发明提供了一种多肽，其包含天然WT1的免疫原性部分或其具有一个或多个取代、缺失、添加和/或插入区别的变体，从而该变体与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力未实质上减弱。在本发明的某些实施方案中，所述多肽包含WT1的至少免疫原性部分，其中免疫原性部分包含在WT1的氨基酸2-281位内。在某些实施方案中，所述多肽包含不多于16个连续的天然WT1多肽的氨基酸残基。在其它实施方案中，所述多肽包含天然WT1多肽的氨基酸残基1-174位的免疫原性部分或其变体，其中所述多肽包含不多于16个连续的位于天然WT1多肽的氨基酸175-449内的氨基酸残基。所述免疫原性部分优选与MHC I类分子和/或II类分子结合。在某些实施方案中，所述多肽包含选自下组中的序列(a)表II-XLVI中任一或多个所列举的序列，(b)前述序列的变体，其具有一个或多个取代、缺失、添加和/或插入的区别，从而该变体与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力未实质上降低，以及(c)上述多肽的模拟物，从而该模拟物与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力未实质上减弱。
在其它实施方案中，所述多肽包含选自下组的序列(a)ALLPAVPSL(SEQ ID NO34)、GATLKGVAA(SEQ ID NO88)、CMTWNQMNL(SEQ ID NO49和258)、SCLESQPTI(SEQ ID NO199和296)、SCLESQPAI(SEQ ID NO198)、NLYQMTSQL(SEQ IDNO147和284)、ALLPAVSSL(SEQ ID NO35和255)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO185和293)、VLDFAPPGA(SEQ ID NO241)、VLDFAPPGAS(SEQ ID NO411)、SEQ ID NO414-450、ALLPAVPSL(SEQ ID NO451)，(b)前述序列的变体，其具有一个或多个取代、缺失、添加和/或插入的区别，从而该变体与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力未实质上降低，以及(c)上述多肽的模拟物，从而该模拟物与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力未实质上减弱。模拟物可以包含与一个或多个氨基酸模拟物组合的氨基酸，也可以完全是非肽模拟物。
在另一方面，本发明提供了包含WT1蛋白免疫原性部分的变体的多肽，其中所述变体由于免疫原性部分内1到3个氨基酸位置的取代而与有别于免疫原性部分，从而该变体与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力相对于天然WT1蛋白未实质上减弱或增强。
本发明进一步提供了编码如上所述的WT1多肽的WT1多核苷酸。
在其它方面，本发明提供了药物组合物和疫苗。药物组合物可以包括如上所述的多肽或模拟物和/或以下一个或多个(i)WT1多核苷酸；(ii)与WT1多肽特异性地结合的抗体或其抗原结合片断；(iii)与WT1多肽特异性地反应的T细胞或(iv)表达WT1多肽的抗原呈递细胞，并组合药学上可接受的载体或赋形剂。疫苗包括如上所述的多肽和/或以下一个或多个(i)WT1多核苷酸；(ii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞或(iii)抗独特型抗体，以及非特异性免疫应答增强剂。在某些实施方案中，此类药物组合物和疫苗中使用的WT1多肽中存在着少于23个连续的天然WT1多肽氨基酸残基，优选少于17个氨基酸残基。免疫应答增强剂可以是佐剂。优选地，免疫应答增强剂增强T细胞应答。
本发明进一步提供了在患者中增强或诱导免疫应答的方法，包括向患者给药如上所述的药物组合物或疫苗。在某些实施方案中，患者为人类。
本发明进一步提供了在患者中抑制恶性疾病发展的方法，包括向患者给药如上所述的药物组合物或疫苗。恶性疾病包括，但不限于白血病(例如，急性髓性、急性淋巴细胞和慢性髓性白血病)和癌症(例如，乳腺癌、肺癌、甲状腺癌或胃肠癌或黑素瘤)。患者可能，但不必受恶性疾病的困扰，并且给药所述药物组合物或疫苗可抑制此类疾病的发作，或者可抑制已有疾病的进展和/或转移。
在其它方面，本发明进一步提供了从骨髓和/或外周血或其级分中除去WT1表达细胞的方法，包括使骨髓、外周血或骨髓或外周血级分同与WT1多肽特异性反应的T细胞接触，其中接触步骤在足以允许将WT1阳性细胞消除至少于骨髓、外周血或级分中髓样细胞或淋巴细胞数目的10％，优选少于5％，更优选少于1％的条件和时间下进行。骨髓、外周血和级分可以从患有与WT1表达相关的疾病的患者中获得，或者可以从未患此病的人或非人哺乳动物中获得。
在相关方面，本发明提供了抑制患者恶性疾病发展的方法，包括向患者给药如上所述制备的骨髓、外周血或骨髓或外周血级分。这种骨髓、外周血或级分可以是自体的，或者可以来自相关或不相关的人类或非人动物(同系或同种异体的)。
在其它方面，本发明提供了刺激(或致敏)和/或扩增T细胞的方法，包括在足以允许刺激和/或扩增T细胞的条件和时间下使T细胞同WT1多肽接触。此T细胞可以是自体的、同种异体的、同系的或者无关的WT1特异性T细胞，并且可以在体外或在体内刺激。在某些实施方案中，扩增的T细胞可以存在于骨髓、外周血或骨髓、外周血的级分中，并且可以(但不必)是克隆的。在某些实施方案中，T细胞在刺激和/或扩增期间可以存在于哺乳动物中。例如，WT1特异性T细胞可以用于供体淋巴细胞输注。
在相关方面，提供了抑制患者恶性疾病发展的方法，包括向患者给药如上所述制备的T细胞。在某些实施方案中，此T细胞可以是自体同源的、同系的或者同种异体的。
在其它方面，本发明进一步提供了在患者中监测与WT1表达相关的恶性疾病的免疫或治疗有效性的方法。此类方法以检测患者的抗体、CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞应答为基础。在某些此类方面，该方法可包括步骤(a)温育第一生物学样品与(i)WT1多肽、(ii)编码WT1多肽的多核苷酸或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞中的一种或多种，其中第一生物学样品获自治疗或免疫前的患者，并且其中温育在足以允许形成免疫复合体的条件和时间下进行；(b)检测WT1多肽与生物学样品中特异性结合WT1多肽的抗体之间形成的免疫复合体；(c)利用获自治疗或免疫后的同一患者的第二生物学样品重复步骤(a)和(b)；以及(d)比较在第一和第二生物学样品中检测到的免疫复合体的数目，并由此监测患者治疗或免疫的有效性。
在上述方法的某些实施方案中，检测步骤包括(a)温育免疫复合体和能够与该免疫复合体结合的检测试剂，其中所述检测试剂包括报告基团，(b)除去未结合的检测试剂，和(c)检测报告基团的存在或不存在。例如，检测试剂可以包括第二抗体或其抗原结合片断，它能够与特异性结合WT1多肽的抗体结合，或者诸如蛋白A的分子。在其它实施方案中，报告基团结合于WT1多肽，并且检测步骤包括除去未结合的WT1多肽，并随后检测报告基团的存在或不存在。
在另一方面，在患者中监测与WT1表达相关的恶性疾病的免疫或治疗有效性的方法包括步骤(a)温育第一生物学样品与(i)WT1多肽、(ii)编码WT1多肽的多核苷酸或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞中的一种或多种，其中第一生物学样品包含CD4+和/或CD8+ T细胞并且获自治疗或免疫前的患者，并且其中温育在足以允许T细胞特异性地激活、增殖和/或裂解的条件和时间下进行；(b)检测T细胞激活、增殖和/或裂解的量；(c)利用包含CD4+和/或CD8+ T细胞第二生物学样品重复步骤(a)和(b)，其中第二生物学样品获自治疗或免疫后的同一患者；以及(d)比较在第一和第二生物学样品中T细胞激活、增殖和/或裂解的量，并由此监测患者治疗或免疫的有效性。
本发明进一步提供了在患者中抑制与WT1表达相关的恶性疾病发展的方法，包括步骤(a)温育分离自患者的CD4+和/或CD8+ T细胞与(i)WT1多肽、(ii)编码WT1多肽的多核苷酸或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞中的一种或多种，从而T细胞得以增殖；和(b)向患者给药有效量的增殖的T细胞，由此抑制患者恶性疾病的发展。在某些实施方案中，温育T细胞的步骤可能重复一次或多次。
在其它方面，本发明提供了在患者中抑制与WT1表达相关的恶性疾病发展的方法，包括步骤(a)温育分离自患者的CD4+和/或CD8+T细胞与(i)WT1多肽、(ii)编码WT1多肽的多核苷酸或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞中的一种或多种，使得T细胞得以增殖；(b)克隆增殖的一种或多种细胞；以及(c)向患者给药有效量的克隆的T细胞。
在其它方面，提供了确定患者中存在或不存在与WT1表达相关的恶性疾病的方法，包括步骤(a)温育分离自患者的CD4+和/或CD8+T细胞与(i)WT1多肽、(ii)编码WT1多肽的多核苷酸或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞中的一种或多种；和(b)检测存在或不存在特异性的T细胞激活，由此确定存在或不存在与WT1表达相关的恶性疾病。在某些实施方案中，检测步骤包括检测存在或不存在T细胞增殖。
在另一方面，本发明提供了确定患者中存在或不存在与WT1表达相关的恶性疾病的方法，包括步骤(a)温育分离自患者的生物学样品与(i)WT1多肽、(ii)编码WT1多肽的多核苷酸或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞中的一种或多种，其中温育在足以允许免疫复合体形成的条件和时间下进行；和(b)检测WT1多肽与生物学样品中特异性结合WT1多肽的抗体之间形成的免疫复合体；并由此确定存在或不存在与WT1表达相关的恶性疾病。
在参考下列详细说明和附图之后，本发明的这些和其它方面将会变得明显。本文公开的所有参考文献特此整体并入作为参考，就如同分别单独并入一样。


图1描绘了小鼠(MO)和人类(HU)WT1蛋白序列(分别为SEQ ID NO320和319)的比较。
图2是图解说明在血液恶性疾病(hematological malignancy，AML)患者中检测WT1特异性抗体的蛋白质印迹。泳道1显示的是分子量标准；泳道2显示的是阳性对照(由WT1特异性抗体免疫沉淀的WT1阳性人类白血病细胞系)；泳道3显示的是阴性对照(由小鼠血清免疫沉淀的WT1阳性细胞系)；而泳道4显示的是由AML患者的血清免疫沉淀的WT1阳性细胞系。对于泳道2-4，免疫沉淀物通过凝胶电泳分离，并用WT1特异性抗体探测。
图3是图解说明在由TRAMP-C(一种WT1阳性肿瘤细胞系)免疫的B6小鼠中检测WT1特异性抗体应答的蛋白质印迹(Westernblot)。泳道1、3和5显示的是分子量标准，而泳道2、4和6显示的是WT1特异性阳性对照(N180，Santa Cruz Biotechnology，跨越WT1蛋白N末端区域180个氨基酸的多肽，在蛋白质印迹中迁移至52kD)。所用的一抗在泳道2中为WT180、在泳道4中为未免疫B6小鼠的血清，在泳道6中为免疫B6小鼠的血清。
图4是图解说明在由代表性的WT1肽免疫的小鼠中检测WT1特异性抗体的蛋白质印迹。泳道1、3和5显示的是分子量标准而泳道2、4和6显示的是WT1特异性阳性对照(N180，Santa Cruz Biotechnology，跨越WT1蛋白N末端区域180个氨基酸的多肽，在蛋白质印迹中迁移至52kD)。所用的一抗在泳道2中为WT180、在泳道4中为未免疫B6小鼠的血清，在泳道6中为免疫B6小鼠的血清。
图5A到5C是图解说明在由代表性的WT1肽免疫的小鼠中刺激增殖的T细胞应答的图。如图所示，利用一个T细胞系和两个不同克隆进行了胸苷掺入测定，结果表达为cpm。x轴所示的对照为无抗原(无Ag)及B6/培养基；所用的抗原为人p6-22(p1)、p117-139(p2)或人p244-262(p3)。
图6A和6B是图解说明在由代表性的WT1肽免疫的小鼠中刺激增殖的T细胞应答的柱形图。第三次免疫后三周，已接种了疫苗A或疫苗B的小鼠的脾细胞用单独培养基(培养基)或者脾细胞和培养基(B6/无抗原)，以25ug/ml的p6-22(p6)、p117-139(p117)、p244-262(p244)肽脉冲的B6脾细胞(疫苗A；图6A)或者p287-301(p287)、p299-313(p299)、p421-435(p421)肽脉冲的B6脾细胞(疫苗B；图6B)以及以无关对照肽脉冲的脾细胞(无关肽)培养，96小时后，通过(3H)胸苷掺入测定增殖。条代表刺激指数(SI)，它计算为试验孔的均值除以对照(无抗原的B6脾细胞)的均值。
图7A-7D是图解说明产生增殖的p117-139和p6-22特异性T细胞系和克隆的柱形图。在体内免疫后，分别利用疫苗A或B的所有三个肽进行初始的三种体外刺激(IVS)。随后的IVS仅用两个相关肽p117-139和p6-22进行单肽刺激。如图所示，克隆来自p6-22和p117-139特异的T细胞系。T细胞用单独培养基(培养基)或者脾细胞和培养基(B6/无抗原)，用25ug/ml的p6-22(p6)、p117-139(p117)或无关对照肽(无关肽)脉冲的B6脾细胞培养，96小时后，通过(3H)胸苷掺入测定其增殖。条代表刺激指数(SI)，它计算为试验孔的均值除以对照(无抗原的B6脾细胞)的均值。
图8A和8B代表对人类WT1(SEQ ID NO319)进行具有引发Th应答潜力的肽的TSITES分析的结果。标示为“A”的区域为模块的AMPHI中点，“R”表示与Rothbard/’Taylor基序相匹配的残基，“D”表示与IAd基序相匹配的残基，而‘d’表示与IEd基序相匹配的残基。
图9A和9B是图解说明在由WT1肽免疫的小鼠中引发WT1肽特异性CTL的曲线图。图9A图解说明了同种异体细胞系对靶细胞的裂解而图9B显示了肽包被的细胞系的裂解。在每种情况下，显示了三个所示的效靶比下的裂解百分率(通过标准铬释放分析所测定的)。提供了淋巴瘤细胞(LSTRA和E10)以及E10+p235-243(E10+P235)的结果。E10细胞在文中也被称之为EL-4细胞。
图10A-10D是图解说明B6小鼠在由WT1肽P117免疫接种后引发WT1肽特异性CTL的曲线图，其中CTL杀死WT1阳性肿瘤细胞系但不杀死WT1阴性细胞系。图10A图解说明未免疫B6小鼠的T细胞不杀死WT1阳性肿瘤细胞系。图10B图解说明同种异体细胞系对靶细胞的裂解。图10C和10D证明了两个不同的实验中与WT1阴性细胞系相对比的WT1阳性肿瘤细胞系的裂解。此外，图10C和10D显示了肽包被细胞系(包被由相关WT1肽P117的WT1阴性细胞系E10)的裂解。在每种情况下，显示了三个所示的效靶比下的裂解百分率(通过标准铬释放分析所测定的)。提供了淋巴瘤细胞(E10)、前列腺癌细胞(TRAMP-C)、转化的成纤维细胞系(BLK-SV40)以及E10+p117的结果。
图11A和11B是图解说明代表性肽P117-139特异性的CTL裂解WT1阳性肿瘤细胞的能力的柱形图。第三次免疫后三周，已接种了p235-243或p117-139的小鼠脾细胞在体外用相关肽刺激，并检验其裂解与WT1肽温育的靶细胞以及WT1阳性和阴性肿瘤细胞的能力。条代表在25∶1的E∶T比时进行的一式三份铬释放分析中的特异性裂解百分率的均值。图11A显示了p235-243特异性T细胞系对WT1阴性细胞系EL-4(EL-4，WT1阴性)、脉冲了相关(用于免疫以及再刺激)肽p235-243(EL-4+p235)的EL-4、脉冲了无关肽p117-139(EL-4+p117)、p126-134(EL-4+p126)或p130-138(EL-4+p130)的EL-4以及WT1阳性肿瘤细胞BLK-SV40(BLK-SV40，WT1阳性)和TRAMP-C(TRAMP-C，WT1阳性)的细胞毒活性，如图所示。图11B显示了p117-139特异性T细胞系对EL-4、脉冲了相关肽p117-139(EL-4+p117)的EL-4及脉冲了无关肽p123-131(EL-4+p123)或p128-136(EL-4+p128)的EL-4、BLK-SV40和TRAMP-C的细胞毒活性，如图所示。
图12A和12B是图解说明WT1阳性肿瘤细胞裂解特异性的柱形图，通过冷靶抑制所证明。条代表在25∶1的E∶T比时进行的一式三份铬释放分析中的特异性裂解百分率的均值。图12A显示了p117-139特异性T细胞系对WT1阴性细胞系EL-4(EL-4，WT1阴性)、WT1阳性肿瘤细胞系TRAMP-C(TRAMP-C，WT1阳性)、与10倍过量(与热靶相比)的脉冲了无51Cr标记的相关肽p117-139的EL-4温育的TRAMP-C细胞(TRAMP-C+p117冷靶)以及与脉冲了无51Cr标记的无关肽的EL-4温育的TRAMP-C细胞(TRAMP-C+无关冷靶)的细胞毒活性，如图所示。图12B显示了p117-139特异性T细胞系对WT1阴性细胞系EL-4(EL-4，WT1阴性)、WT1阳性肿瘤细胞系BLK-SV40(BLK-SV40，WT1阳性)、与相关冷靶温育的BLK-SV40细胞(TRAMP-C+p117冷靶)以及与无关冷靶温育的BLK-SV40细胞(BLK-SV40+无关冷靶)的细胞毒活性，如图所示。
图13A-13C是描绘有关p117-139内9mer的CTL表位估测的柱形图。针对位于aa117-139内的含有或缺少适当的H-2bI型结合基序的肽并且在由p126-134或p130-138再刺激之后测试了p117-139肿瘤特异性CTL系。条代表在25∶1的E∶T比时进行的一式三份铬释放分析中的特异性裂解百分率的均值。图13A显示了p117-139特异性T细胞系对WT1阴性细胞系EL-4(EL-4，WT1阴性)以及脉冲了p117-139(EL-4+p117)、p119-127(EL-4+p119)、p120-128(EL-4+p120)、p123-131(EL-4+p123)、p126-134(EL-4+p126)、p128-136(EL-4+p128)和p130-138(EL-4+p130)肽的EL-4细胞的细胞毒活性。图13B显示了在由p126-134再刺激后该CTL系对WT1阴性细胞系EL-4、脉冲了p117-139(EL-4+p117)、p126-134(EL-4+p126)的EL-4细胞以及WT1阳性肿瘤细胞系TRAMP-C的细胞毒活性。图13C显示了在由p130-138再刺激后该CTL系对EL-4、脉冲了p117-139(EL-4+p117)、p130-138(EL-4+p130)的EL-4细胞以及WT1阳性肿瘤细胞系TRAMP-C的细胞毒活性。
图14描绘了在63个AML患者中的对WT1的血清抗体反应性。通过ELISA在AML患者中评估血清抗体对WT1/N-端蛋白的反应性。第一和第二泳道分别代表阳性和阴性对照。商业上可得的WT1特异性抗体WT180被用作为阳性对照。接下来的63个泳道代表来自每一个患者个体的血清的结果。所描述的OD值来自1∶500血清稀释液的ELISA。该图包括了来自3个单独实验的累积数据。
图15描绘了在2个AML患者中的对WT1蛋白和对照蛋白的血清抗体反应性。通过ELISA在2个AML患者中评估血清抗体对WT1/全长、WT1 N-端、TRX和Ra12蛋白的反应性。所描述的OD值来自1∶500血清稀释液的ELISA。AML-1和AML-2表示来自图1中对WT1/全长表现出抗体反应性的2个患者个体的血清。WT1全长蛋白作为与Ra12的融合蛋白表达。WT1/N-端蛋白作为与TRX的融合蛋白表达。对照Ra12和TRX蛋白以相似的方式纯化。结果证实针对WT1融合蛋白的血清抗体反应性指向该蛋白的WT1部分。
图16描绘了81个CML患者的对WT1的血清抗体反应性。通过ELISA在AML患者中评估血清抗体对WT1/全长蛋白的反应性。第一和第二泳道分别代表阳性和阴性对照。商业上获得的WT1特异性抗体WT180被用作为阳性对照。接下来的81个泳道代表来自每一个患者个体的血清的结果。所描述的OD值来自1∶500血清稀释液的ELISA。该图包括了来自3个单独实验的累积数据。
图17描绘了在2个CML患者中的对WT1蛋白和对照蛋白的血清抗体反应性。通过ELISA在2个CML患者中评估血清抗体对WT1/全长、WT1 N-端、TRX和Ra12蛋白的反应性。所描述的OD值来自1∶500血清稀释液的ELISA。CML-1和CML-2表示来自图3中对WT1/全长表现出抗体反应性的2个患者个体的血清。WT1全长蛋白作为与Ra12的融合蛋白表达。WT1/N-端蛋白作为与TRX的融合蛋白表达。对照Ra12和TRX蛋白以相似的方式纯化。结果证实针对WT1融合蛋白的血清抗体反应性指向该蛋白的WT1部分。
图18提供了用于血清学分析的重组WT1蛋白的特征。
图19A-19E是描绘小鼠中通过接种不同剂量的WT1蛋白所引发的抗体应答的条形图。
图20是由WT1蛋白免疫的小鼠中增殖的T细胞应答的条形图。
图21是由荧光显微镜检测的、在腺病毒WT1和痘苗病毒WT1感染后表达WT1的人类DC的照片。
图22是证明人类DC中的WT1表达在腺病毒WT1感染后可再现并且不被对照腺病毒感染诱导的照片。
图23是IFN-γELISPOT测定图，表明WT1全基因在体外致敏引发了WT1特异性的T细胞应答。
图24显示了WT1蛋白的氨基酸2-281(SEQ ID NO461)以及编码这些氨基酸残基的cDNA(SEQ ID NO460)。该截短的WT1蛋白被称之为WT1-F。
发明的详细说明特此将本说明书中提及的和/或申请数据页中列举的美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、国外专利、国外专利申请和非专利出版物全文并入作为参考。
如上文所指出的，本发明一般地涉及用于免疫治疗和诊断恶性疾病的组合物和方法。本文所述的组合物可以包括WT1多肽、WT1多核苷酸、表达WT1多肽的抗原呈递细胞(APC，如树突细胞)、与WT1多肽结合的因子例如抗体和/或WT1特异性免疫系统细胞(如T细胞)。本发明的WT1多肽通常包括维尔姆斯瘤(Wilms Tumor)基因产物(WT1)或其变体的至少一部分。本发明的核酸序列通常包括编码此类多肽的全部或部分的DNA或RNA序列，或者与此序列互补的序列。抗体一般是能够与WT1多肽的部分结合的免疫系统蛋白或其抗原结合片断。该组合物中可使用的T细胞通常为WT1多肽特异性的T细胞(如CD4+和/或CD8+)。本文描述的某些方法进一步使用了表达本文提供的WT1多肽的抗原呈递细胞。
本发明建立在发现针对维尔姆斯瘤(WT)基因产物(如WT1)引起的免疫应答能够为患有以增加的WT1基因表达为特征的恶性疾病的患者提供预防和/或治疗益处的基础上。此类疾病包括，但不限于白血病(如急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和儿童急性淋巴细胞白血病)，以及许多癌症例如肺癌、乳腺癌、甲状腺癌和胃肠癌以及黑素瘤。WT1基因最初是在维尔姆斯瘤患者的染色体11p13上的细胞遗传缺失的基础上鉴定并分离的(参见Call等，美国专利No.5,350,840)。该基因由10个外显子组成并编码锌指转录因子，图1及SEQ ID NO319和320提供了小鼠和人类WT1蛋白的序列。
WT1多肽在本发明的上下文中，WT1多肽是至少包括天然WT1(即由未经遗传修饰的生物体表达的WT1蛋白)或如本发明所述的其变体的免疫原性部分的多肽。WT1多肽可以是任意长度，只要它至少包括天然蛋白或其变体的免疫原性部分。换言之，WT1多肽可以是寡肽(即由相对小数目的氨基酸残基如8-10个残基通过肽键结合而构成)、全长WT1多肽(例如，存在于人类或非人动物如小鼠中)或中等大小的多肽。在某些实施方案中，优选利用含小数目连续的天然WT1多肽氨基酸残基的WT1多肽。这种多肽优选用于期望产生T细胞应答的某些用途中。例如，此WT1多肽可以含有少于23个，优选不多于18个，并且更优选不多于15个连续的天然WT1多肽氨基酸残基。包含天然WT1多肽9个连续氨基酸残基的多肽一般适用于此目的。WT1多肽中可存在来源于该天然蛋白和/或异源序列的额外序列，并且此序列可以(但不必然)具有另外的免疫原性或抗原性特征。本文提供的多肽可以进一步与其它多肽或非多肽化合物结合(共价或非共价结合)。
如本文所用的“免疫原性部分”是被B-细胞和/或T细胞表面抗原受体识别(即特异性结合)的多肽部分。某些优选的免疫原性部分与MHC I类或II类分子结合。如本文所用，免疫原性部分被表述为“结合”MHC I类或II类分子，如果这种结合利用本领域公知的测定法是可检测的话。例如，多肽结合MHC I类分子的能力可以通过监测促进125I标记的β2-微球蛋白(β2m)掺入到MHC I类分子/β2m/肽异源三聚体复合物的能力间接评价(参见Parker等，J.Immunol.152163，1994)。备选地，可以使用本领域公知的功能性肽竞争分析法。某些免疫原性部分具有表II-XIV中之一或多个所述的一种或多种序列。代表性的免疫原性部分包括，但不限于RDLNALLPAVPSLGGGG(人类WT1残基6-22；SEQ ID NO1)、PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE(人类和小鼠WT1残基117-139；分别为SEQ ID NO2和3)、GATLKGVAAGSSSSVKWTE(人类WT1残基244-262；SEQ ID NO4)、GATLKGVAA(人类WT1残基244-252；SEQ ID NO88)、CMTWNQMNL(人类和小鼠WT1残基235-243；分别为SEQ ID NO49和258)、SCLESQPTI(小鼠WT1残基136-144；SEQ ID NO296)、SCLESQPAI(人类WT1残基136-144；SEQ ID NO198)、NLYQMTSQL(人类和小鼠WT1残基225-233；分别为SEQ ID NOs147和284)；ALLPAVSSL(小鼠WT1残基10-18；SEQ ID NO255)；RMFPNAPYL(人类和小鼠WT1残基126-134；分别为SEQ ID NO185和293)、VLDFAPPGA(人类WT1残基37-45；SEQ ID NO241)或VLDFAPPGAS(人类WT1残基37-46；SEQ ID NO411)。更多的免疫原性部分在SEQ ID NO414-451中提供。本文提供了更多的免疫原性部分，而其它的一般可以利用公知技术如在Paul，Fundamental Immunology，3rd ed.，243-247(Raven Press，1993)及其中引用的参考文献中所综述的那些技术鉴定。鉴定免疫原性部分的代表性技术包括就与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力筛选多肽。天然WT1多肽的免疫原性部分是在实质上不小于全长WT1反应性的水平上与此类抗血清和/或T细胞反应(如在ELISA和/或T细胞反应性测定中)的部分。换言之，免疫原性部分在这种测定中可能以类似于或者大于全长多肽反应性的水平反应。这种筛选一般可以利用本领域普通技术人员公知的方法进行，例如在Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988中所描述的那些方法。
备选地，免疫原性部分可以利用计算机分析鉴定，例如Tsites程序(参见Rothbard和Taylor，EMBO J.793-100，1988；Deavin等，Mol.Immunol.33145-155，1996)，它可查找具有引发Th应答潜力的肽基序。具有适于结合鼠和人I类或II类MHC的基序的CTL肽可以根据BIMAS(Parker等，J.Immunol.152163，1994)和其它HLA肽结合预测分析进行鉴定。备选地，与特定MHC分子结合的免疫原性部分可利用确定的肽结合基序(例如在Rammensee等，Immunogenetics41178-228，1995中所述的那些肽结合基序)进行鉴定。为确认肽与鼠或人I类或II类MHC分子的结合，可以使用本领域公知的肽结合分析。为确认免疫原性，可以利用HLA A2或其它转基因小鼠模型和/或使用树突细胞、成纤维细胞或外周血细胞的体外刺激测定对肽进行测试。
正如上文所指出的那样，组合物可以包括天然WT1蛋白的变体。如本文所用，多肽“变体”是与天然多肽具有一个或多个取代、缺失、添加和/或插入之差异的多肽，从而该多肽的免疫原性得以保留(即该变体与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力相对于天然多肽未实质上降低)。换言之，变体与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力相对于天然多肽可以被增强或不改变，或者相对于天然多肽可以被降低小于50％，并且优选小于20％。在一个实施方案中，变体与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力相对于天然多肽可以被降低小于10％，5％，4％，3％，2％，1％或0.5％。此类变体可以一般地通过修饰上文的多肽序列之一并如本文所述评价修饰多肽与抗血清和/或T细胞反应的能力来进行鉴定。在本发明的一个实施方案中，变体可以通过评价它与人或鼠HLA分子结合的能力鉴定。在一个优选的实施方案中，变体多肽具有修饰，从而该变体多肽与I类或II类MHC分子(例如，HLA-A2、HLA-A24、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A68、HLA-A11、HLA-A31、HLA-A33、HLA-B14、HLA-B40、HLA-B60、HLA-B62、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B27、HLA-B3501、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B44、HLA-B51、HLA-B52、HLA-B58、HLA-CW03、HLA-CW04、HLA-CW06或HLA-CW07)结合的能力相对于野生型(未经修饰的)WT1多肽而言被提高。在另一实施方案中，WT1的N-端部分氨基酸1-281被修饰，从而其中任意数目的多肽与HLA-A2、HLA-A24、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A68、HLA-A11、HLA-A31、HLA-A33、HLA-B14、HLA-B40、HLA-B60、HLA-B62、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B27、HLA-B3501、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B44、HLA-B51、HLA-B52、HLA-B58、HLA-CW03、HLA-CW04、HLA-CW06或HLA-CW07结合的能力相对于野生型(未经修饰的)WT1多肽序列而被提高。在另一实施方案中，包含至少一个免疫原性部分(表位)的多肽被修饰从而它与MHC分子，例如HLA-A2、HLA-A24、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A68、HLA-A11、HLA-A31、HLA-A33、HLA-B14、HLA-B40、HLA-B60、HLA-B62、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B27、HLA-B3501、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B44、HLA-B51、HLA-B52、HLA-B58、HLA-CW03、HLA-CW04、HLA-CW06或HLA-CW07结合的能力被提高。实施例30描述了能够产生的举例说明性的变体。熟练技术人员将会容易地意识到这些是举例说明性的变体，并且能够以相似的方式产生与HLA-A2之外的HLA分子结合的多肽的其它变体。在另一实施方案中，变体多肽结合HLA分子的能力相对于天然WT1多肽被提高至少2倍，优选至少3倍、4倍或5倍。已经发现，在本发明的背景下，WT1多肽免疫原性部分中相对小数目的取代(例如1到3个)可以起到增强该多肽引发免疫应答的能力的作用。合适的取代一般可以如上文所述通过利用计算机程序鉴定，并且效果可以根据如本文所述的修饰多肽与抗血清和/或T细胞的反应性证实。因此，在某些优选的实施方案中，WT1多肽包括免疫原性部分内的1到3个氨基酸残基被取代的变体，从而与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力在统计学上高于未经修饰的多肽。此类取代优选位于多肽的MHC结合位点之内，这可以如上所述鉴定。优选的取代允许提高与MHC I类或II类分子的结合。
某些变体包含保守取代。“保守取代”是指其中氨基酸被取代为具有相似性质的另一氨基酸的取代，从而肽化学领域的技术人员将会预料到多肽的二级结构和亲水性质在实质上未改变。氨基酸取代一般地可以根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天门冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；而具有不带电荷的极性头部、具有相似亲水值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天门冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可代表保守改变的其它氨基酸组包括(1)ala，pro，gly，glu，asp，gln，asn，ser，thr；(2)cys，ser，tyr，thr；(3)val，ile，leu，met，ala，phe；(4)lys，arg，his；和(5)phe，tyr，trp，his。变体也可以，或者备选地，包含非保守改变。例如，变体也可以(或者备选地)通过缺失或添加对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性质具有最小影响的氨基酸进行修饰。
在优选的实施方案中，构建了WT1 N-端(氨基酸1-249)的变体多肽，其中该变体多肽能够与识别全长WT1和/或WT1 N-端多肽的抗体结合。非限制性的抗体实例为抗WT1抗体WT180(Santa CruzBiotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)。
如上文所提到的，WT1多肽在该蛋白的N-末端可以与共翻译地或翻译后指导该蛋白转运的信号(或前导)序列缀合。多肽也可以，或者备选地缀合于接头或者易化该多肽合成、纯化或鉴定(例如多聚-His)，或者增强该多肽结合到固相支持物上的其它序列。例如，多肽可以缀合于免疫球蛋白Fc区。
WT1多肽可以利用任一种公知技术制备。由本文所述的WT1多核苷酸编码的重组多肽可以容易地从该多核苷酸制备。一般而言，可以使用任一种本领域普通技术人员公知的许多表达载体表达重组WT1多肽。表达可以在任何已经转化或转染了含编码重组多肽的DNA分子的表达载体的合适的宿主细胞中实现。合适的宿主细胞包括原核生物、酵母和高等真核细胞。优选地，所使用的宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)、酵母或哺乳动物细胞系如COS或CHO。来自向培养基中分泌重组蛋白或多肽的合适的宿主/载体系统的上清可以首先利用商业上可获得的过滤器浓缩。然后可将浓缩物施加到合适的纯化基质上，例如亲合基质或离子交换树脂。最后，可以使用一个或多个HPLC步骤进一步纯化重组多肽。此类技术可用于制备天然多肽或其变体。例如，编码天然多肽的变体的多核苷酸一般可以利用标准突变技术，例如寡核苷酸指导的定点突变制备，并且可以除去DNA序列的片断，以允许制备截短的多肽。
某些部分和其它变体也可以利用本领域普通技术人员所公知的技术通过合成方法产生。例如，可以合成具有少于约500个氨基酸，优选少于约100个氨基酸，并且更优选少于约50个氨基酸的多肽。多肽可以利用商业上可获得的任何固相技术合成，例如Merrifield固相合成法，其中依次地将氨基酸添加到生长的氨基酸链上。参见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2146，1963。多肽自动合成的设备可从供应商例如Applied BioSystems，Inc.(Foster City，CA)处商业上获得，并且可以根据制造商的说明操作。
一般而言，如本文所述的多肽和多核苷酸是分离的。“分离的”多肽或多核苷酸是指从其原始环境中取出的多肽或多核苷酸。例如，如果天然存在的蛋白与在天然系统中共存的某些或所有物质分开了，则它是分离的。优选地，此类多肽至少约90％纯，更优选至少约95％纯，并且最优选至少约99％纯。如果多核苷酸，举例来说，被克隆到并非天然环境一部分的载体中，则它被认为是分离的。
在另一方面，本发明提供了WT1多肽的模拟物。此类模拟物可以包括与一个或多个氨基酸模拟物连接的氨基酸(即，WT1蛋白中的一个或多个氨基酸可以由氨基酸模拟物取代)，或者可以完全是非肽模拟物。氨基酸模拟物是构象(Conformation)类似于氨基酸的化合物，从而它能够替代WT1多肽中的氨基酸而不在实质上降低与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力。非肽模拟物是不含氨基酸的化合物，并具有类似于WT1多肽的整体构象，从而该模拟物与WT1-特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力相对于WT1多肽未在实质上降低。此类模拟物可以根据评价肽序列三维结构的标准技术(如，核磁共振和算法技术)设计。模拟物可以被设计成WT1多肽的一个和多个侧链官能团由不必具有相同大小和体积，但具有产生相似生物学反应的相似化学和/或物理性质的基团取代。应当理解，在本文所述的实施方案中，模拟物可以代替WT1多肽。
在其它举例说明性的实施方案中，多肽可以是包含本文所述的多个多肽，或者包含至少一个本文所述的多肽和无关序列如已知肿瘤蛋白的融合多肽。融合伴侣可以，例如，帮助提供T辅助细胞表位(免疫融合伴侣)，优选是被人类识别的T辅助细胞表位，或者可以帮助比天然重组蛋白以更高的产率表达蛋白(表达增强子)。某些优选的融合伴侣是免疫和表达增强性融合伴侣。可以选择其它融合伴侣以便提高多肽的溶解性，或者使得多肽靶向到期望的胞内区室中。还有另外的融合伴侣包括亲合标签，其有助于多肽的纯化。
融合多肽一般可以利用标准技术制备，包括化学缀合。优选地，融合多肽作为重组多肽在表达系统中表达，使得相对于非融合多肽具有提高水平的产量。简要地，编码多肽组分的DNA序列可以分别组装，并连接到合适的表达载体中。编码一个多肽组分的DNA序列的3′端，用或不用肽接头，与编码第二多肽组分的DNA序列的5′端连接，从而这些序列的读框协调一致。这允许翻译成保留了两个组成多肽的生物学活性的单个融合多肽。
可以使用肽接头将第一和第二多肽组分分开一定距离，该距离足以确保每个多肽折叠为其二级和三级结构。此类肽接头序列是利用本领域熟知的标准技术掺入到融合多肽中的。合适的肽接头序列可以根据下列因素选择(1)其采取柔性伸展构象的能力；(2)其不采取能够与位于第一和第二多肽上的功能表位反应的二级结构的能力；以及(3)可能与多肽功能表位反应的疏水或带电荷残基的缺乏。优选的肽接头序列含有Gly、Asn和Ser残基。其它近中性的氨基酸，例如Thr和Ala也可用在接头序列中。可作为接头有效使用的氨基酸序列包括在Maratea等，Gene 4039-46，1985；Murphy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838258-8262，1986；美国专利No.4,935,233和美国专利No.4,751,180中所公开的那些序列。接头序列的长度一般可以从1个到大约50个氨基酸。当第一和第二多肽具有可用于分开功能结构域并防止空间干扰的非必需N-末端氨基酸区时，则无需接头序列。
连接的DNA序列可操作地与转录或翻译调控元件连接。负责DNA表达的调控元件仅位于编码第一多肽的DNA序列的5′端。类似地，终止翻译需要的终止密码子和转录终止信号仅存在于编码第二多肽的DNA序列的3′端。
融合多肽可以包括如本文所述的多肽连同无关的免疫原性蛋白，例如能够引发记忆应答的免疫原性蛋白。此类蛋白的实例包括破伤风、肺结核和肝炎蛋白(参见如Stoute等New Engl.J.Med.，33686-91，1997)。
在一个优选的实施方案中，免疫融合伴侣来源于分枝杆菌属物种(Mycobacterium sp.)，例如结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)来源的Ra12片断。Ra12组合物及其用于促进异源多核苷酸/多肽序列的表达和/或免疫原性的方法公开于美国专利申请60/158,585中，特此将其全文公开的内容并入作为参考。简要地，Ra12是指结核分枝杆菌MTB32A核酸亚序列的多核苷酸区。MTB32A是由结核分枝杆菌毒性和非毒性株的基因编码的分子量32KD的丝氨酸蛋白酶。MTB32A的核苷酸序列和氨基酸序列已有描述(例如，美国专利申请60/158,585；也参见Skeiky等，Infection and Immun.(1999)673998-4007，特此并入作为参考)。MTB32A编码序列的C-末端片断以高水平表达，并在整个纯化过程中保持为可溶多肽。而且，Ra12可增强与之融合的异源免疫原性多肽的免疫原性。一个优选的Ra12融合多肽包括与MTB32A的氨基酸残基192-323对应的14KD的C-末端片断。其它优选的Ra12多核苷酸一般包括编码部分Ra12多肽的至少约15个连续的核苷酸，至少约30个连续的核苷酸，至少约60个连续的核苷酸，至少约100个连续的核苷酸，至少约200个连续的核苷酸或者至少约300个核苷酸。Ra12多核苷酸可以包括天然序列(即编码Ra12多肽或其部分的内源序列)或者可以包括此序列的变体。Ra12多核苷酸变体可以含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，从而其编码的融合多肽的生物学活性相对于包括天然Ra12多肽的融合多肽未在实质上降低。变体优选与编码天然Ra12多肽或其部分的多核苷酸序列表现出至少约70％的同一性，更优选至少约80％的同一性，并且更优选至少约90％的同一性。
在其它优选的实施方案中，免疫融合伴侣来源于蛋白D，革兰氏阴性细菌流感嗜血杆菌B(Haemophilus influenza B)(WO 91/18926)的表面蛋白。优选地，蛋白D衍生物包括大约该蛋白的头1/3(即N-末端的头100-110个氨基酸)，而且蛋白D衍生物可以被脂化。在某些实施方案中，脂蛋白D融合伴侣的头109个残基包括在N-末端中，以为该多肽提供附加的外源T细胞表位，并提高在大肠杆菌(E.coli)中的表达水平(因而起表达增强子的作用)。脂肪尾部确保了抗原到抗原呈递细胞的最佳提呈。其它融合伴侣包括来自流感病毒的非结构蛋白NS1(红血球凝集素)。典型地，利用N-末端的81个氨基酸，尽管可以利用包括T辅助细胞表位的不同片断。
在另一个实施方案中，免疫融合伴侣是称作LYTA的蛋白或其部分(优选C-末端部分)。LYTA来源于肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，它合成称之为酰胺酶LYTA的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码；Gene 43265-292，1986)。LYTA是特异性降解肽聚糖主链中某些键的自溶素。LYTA蛋白的C-末端结构域负责对胆碱或某些胆碱类似物如DEAE的亲和力。已利用这个性质开发出大肠杆菌C-LYTA表达质粒用于表达融合蛋白。在氨基末端含C-LYTA片断的杂种蛋白的纯化已有描述(参见Biotechnology 10795-798，1992)。在优选的实施方案中，可以在融合多肽中掺入LYTA的重复部分。重复部分见于始于残基178的C-末端区。尤其优选的重复部分包括残基188-305。
在另一个举例说明性的实施方案中，融和伴侣在N-末端包括来自大肠杆菌TorA信号肽的双生精氨酸移位(TAT)信号肽；参见J.Mol.Microbiol.(2000)2(2)179-189；Journal of Bacteriology，Jan 2001p604-610 Vol 183，No 2；Journal of Biochemistry Vol 276，March 162001 pp 8159-8164)，特此全文并入最为参考。
而另一个举例说明性实施方案涉及融合多肽以及编码它们的多核苷酸，其中融合伴侣包括能够指导多肽到内体/溶酶体区室的靶向信号，如美国专利No.5,633,234中所述。本发明的免疫原性多肽在与该靶向信号融合时，将更有效地与MHC II类分子结合，从而提供增强的该多肽特异的体内CD4+T细胞刺激。
本发明提供了无需添加融合伴侣能够在大肠杆菌中重组表达的截短形式的WT1多肽。这些截短形式的实例显示于SEQ ID NO342-346中，且由SEQ ID NO337-341中所示的多核苷酸编码。在这些截短物的变化中，WT1的头76个氨基酸可以与该蛋白的C-末端融合，产生更易于在大肠杆菌中表达的重组蛋白。也可以利用除大肠杆菌之外的其它宿主，例如象B.megaterium。该蛋白可以进一步制备呈不带组氨酸标签。
在其它实施方案中，可制备不同的亚基，并以不同于天然WT1的次序融合在一起。此外，可以与例如Ra12进行融合。示例性的融合蛋白显示于SEQ ID NO332-336中，并且可由SEQ ID NO327-331中所示的多核苷酸编码。
WT1多核苷酸编码如本文所述的WT1多肽的任何多核苷酸都是本发明涵盖的WT1多核苷酸。此类多核苷酸可以是单链的(编码链或反义链)或者双链的，并且可以是DNA(基因组DNA、cDNA或合成DNA)或RNA分子。附加的编码或非编码序列可以，但不必须存在于本发明的多核苷酸中，并且多核苷酸可以，但不必须连接于其它分子和/或支持材料。
WT1多核苷酸可以编码天然WT1蛋白，或者可以编码如本文所述的WT1变体。多核苷酸变体可以含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，从而编码的多肽的免疫原性相对于天然WT1蛋白不降低。对编码多肽的免疫原性的影响一般可以如本文所述评价。优选的变体在编码天然WT1序列的免疫原性部分的核苷酸位置上含有不多于20％，优选不多于10％的核苷酸取代、缺失、插入和/或添加。某些变体与天然基因或其部分实质上同源。此类多核苷酸变体能够在中度严谨条件下与天然存在的编码WT1多肽的DNA序列(或其互补序列)杂交。适宜的中度严谨条件包括在5×SSC，0.5％SDS，1.0mMEDTA(pH 8.0)溶液中预洗涤；于50℃-65℃在5×SSC中杂交过夜；接着在65℃各用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC洗涤2次)。
本领域普通技术人员将会理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码WT1多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中有些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。尽管如此，本发明特别考虑由于密码子利用差异而不同的多核苷酸。
所以，根据本发明的另一个方面，提供了包括某些或所有本文所示的多核苷酸序列、本文所示的多核苷酸序列的互补物以及本文所示的多核苷酸序列的简并变体的多核苷酸组合物。在某些优选的实施方案中，本文所示的多核苷酸序列编码如上文所述的免疫原性多肽。
一旦如上文所述鉴定了WT1的免疫原性部分，可以利用任一种技术制备WT1多核苷酸。例如，WT1多核苷酸可以从由表达WT1的细胞制备的cDNA扩增。此类多核苷酸可以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增。对于这种方法，可以根据免疫原性部分设计序列特异性引物，并且可以购买或合成。例如，人类WT1基因PCR扩增的合适引物包括第一步-P1181434-14145’GAG AGT CAG ACT TGAAAG CAGT 3’(SEQ ID NO5)和P1355’CTG AGC CTC AGCAAA TGG GC 3’(SEQ ID NO6)；第二步-P1365’GAG CAT GCATGG GCT CCG ACG TGC GGG 3’(SEQ ID NO7)和P1375’GGGGTA CCC ACT GAA CGG TCC CCG A 3’(SEQ ID NO8)。小鼠WT1基因PCR扩增的引物包括第一步-P1385’TCC GAG CCGCAC CTC ATG 3’(SEQ ID NO9)和P1395’GCC TGG GAT GCTGGA CTG 3’(SEQ ID NO10)，第二步-P1405’GAG CAT GCGATG GGT TCC GAC GTG CGG 3’(SEQ ID NO11)和P1415’GGGGTA CCT CAA AGC GCC ACG TGG AGT TT 3’(SEQ ID NO12)。
然后可以利用公知技术，利用扩增的部分从人类基因组DNA文库或者从合适的cDNA文库中分离全长基因。备选地，全长基因可以由多个PCR片断构建。WT1多核苷酸也可以通过合成寡核苷酸组分，并将组分连接在一起产生完整的多核苷酸制备。
WT1多核苷酸也可以通过本领域公知的任何方法合成，包括化学合成(如，固相亚磷酰胺化学合成)。多核苷酸序列也可以利用标准突变技术引入修饰，例如寡核苷酸指导的定点突变(参见Adelman等，DNA 2183，1983)。备选地，RNA分子可以通过编码WT1多肽的DNA序列的体外或体内转录产生，只要该DNA被掺入到具有合适的RNA聚合酶启动子(例如T7或SP6)的载体中。如本文所述，可以利用某些部分制备编码的多肽。另外，或者备选地，可以向患者给药某部分，从而编码的多肽在体内产生(例如通过用编码WT1多肽的cDNA构建物转染抗原呈递细胞如树突细胞，并向患者给药该转染的细胞)。
编码WT1多肽的多核苷酸一般可用于体外或体内产生该多肽。与编码序列互补的WT1多核苷酸(即反义多核苷酸)也可用作为探针或抑制WT1的表达。也可以将能够转录为反义RNA的cDNA构建物引入到组织的细胞中以便于产生反义RNA。
任何多核苷酸都可以进一步修饰以提高体内的稳定性。可能的修饰包括，但不限于，在5′和/或3′端添加侧翼序列；在主链中使用硫代磷酸酯或2′O-甲基而非磷酸二酯酶型链键和/或掺入非传统碱基例如肌苷、queosine和wybutosine，还有酰基、甲基或硫代及其它修饰形式的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。
如本文所述的核苷酸序列可以利用已建立的重组DNA技术连接于许多其它核苷酸序列。例如，可以将多核苷酸克隆到任一种克隆载体中，包括质粒、噬菌粒、λ噬菌体衍生物和粘粒。尤其有意义的载体包括表达载体、复制载体、探针生产载体和测序载体。一般而言，载体会包含在至少一种生物体中具有功能的复制原点、便利的限制性内切酶位点以及一个或多个选择标记。其它元件将取决于目的用途，并且对本领域普通技术人员是显而易见的。特别地，本发明的一个实施方案包括表达载体，该载体掺入了可操作地键接到(即“可操作地连接于”)表达调控序列(启动子)的本发明的核酸分子。构建此类载体，例如病毒(如腺病毒或痘苗病毒)或减毒病毒载体是本领域技术范围之内的事，就如同转化或转染细胞以产生编码目的分子的真核细胞系或原核细胞株那样。可以以这种形式使用的示例性的宿主细胞是COS细胞、CHO细胞、酵母细胞、昆虫细胞(如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)或Sf-9细胞)、NIH 3T3细胞等。也可以利用原核细胞例如大肠杆菌及其它细菌。
在某些实施方案中，可以配制多核苷酸从而允许其进入哺乳动物，并在其中表达。此类制剂对于治疗目的尤为有用，如下文所述。本领域普通技术人员将会理解有许多方法可实现多核苷酸在靶细胞中的表达，并且可以使用任何合适的方法。例如，可以将多核苷酸整合到病毒载体，例如但不限于腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或痘苗或其它痘病毒(如禽痘病毒)。将DNA整合到此类载体中的技术是本领域普通技术人员公知的。逆转录载体可以额外转移或掺入用作选择标记的基因(以帮助鉴定或选择转化的细胞)和/或靶向成分，例如编码位于特定靶细胞上的受体的配体的基因，以使载体成为靶特异性的。靶向也可以通过本领域普通技术人员公知的方法利用抗体实现。例如，可以利用此类载体中的cDNA构建物，转染人类和动物细胞系，用于建立WT1阳性肿瘤模型，可利用该模型进行肿瘤保护和过继性免疫疗法实验，以证明此类细胞的肿瘤或白血病生长抑制或裂解。
多核苷酸的其它治疗性制剂包括胶体分散系统，例如高分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠子，以及基于脂肪的系统，包括水包油型乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。优选的用作体外和体内递送载体的胶体系统是脂质体(即人造膜囊)。此类系统的制备和使用是本领域公知的。
抗体组合物、其片断及其它结合剂根据另一个方面，本发明进一步提供了结合剂，例如抗体及其抗原结合片断，它们对本文公开的WT1多肽、或其部分、变体或衍生物表现出免疫学结合。抗体或其抗原结合片断被表述为与本发明的WT1多肽“特异性结合”、“免疫学结合”和/或具有“免疫学反应性”，如果它以可检测的水平(例如在ELISA测定中)与该多肽反应，而且在相似条件下不能可检测地与无关多肽反应。
如该上下文中所用的免疫学结合一般是指发生在免疫球蛋白分子和该免疫球蛋白特异的抗原之间的非共价相互作用类型。免疫学结合相互作用的强度或亲和力可以表达为相互作用的解离常数(Kd)的形式，其中较小的Kd代表较大的亲和力。所选多肽的免疫学结合性质可以利用本领域公知的方法量化。一种此类方法必需测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物伴侣的浓度、相互作用的亲和力以及等同地影响双向速率的几何参数。因此，“开速率常数”(K开)和“关速率常数”(K关)都可以通过计算浓度和实际结合及解离速率确定。K关/K开比能够取消所有与亲和力无关的参数，因而等于解离常数Kd。一般参见Davies等(1990)Annual Rev.Biochem.59439-473。
抗体的“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子参与抗原结合的部分。抗原结合位点是由重链(″H″)和轻链(″L″)的N-末端可变区(″V″)的氨基酸残基构成的。重链和轻链V区中三个高度趋异的区段被称为“高变区”，其插在多个称之为“构架区”或″FR″的保守侧翼区段之间。因而术语″FR″是指天然见于免疫球蛋白高变区之间和邻近的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中彼此相对布置形成抗原结合表面。该抗原结合表面互补于结合的抗原的三维表面，因而每个重链和轻链的三个高变区被称为“互补决定区”或″CDR″。
利用本文提供的代表性测定法，结合剂可以进一步能够区分患有和未患WT1-相关癌症的患者。例如，与肿瘤蛋白结合的抗体或其它结合剂将优选在至少约20％的该疾病患者，更优选至少约30％的患者中产生指示存在癌症的信号。备选地，或者此外，抗体将在至少约90％没有癌症的个体中产生指示不存在该病的阴性信号。为确定结合剂是否满足这个要求，可以如本文所述对来自具有癌症或没有癌症的患者(如利用标准临床测试确定的)的生物学样品(如血液、血清、唾液、尿液和/或肿瘤生检)进行与该结合剂结合的多肽的存在的测定。优选地，将对具有统计学意义数目的有或无该病的样品进行测定。每个结合剂都应当满足上述标准；不过，本领域普通技术人员将会意识到结合剂可以联合使用以提高灵敏度。
满足上述要求的任何制剂都可以是结合剂。例如，结合剂可以是有或无肽组分的核糖体、RNA分子或多肽。在优选的实施方案中，结合剂是抗体或其抗原结合片断。抗体可以通过任一种本领域普通技术人员公知的许多技术制备。参见如Harlow和Lane，AntibodiesALaboratory Manual，冷泉港实验室，1988。一般而言，抗体可以通过细胞培养技术，包括如本文所述产生单克隆抗体、或者通过将抗体基因转染到合适的细菌或哺乳动物细胞宿主中，以允许产生重组抗体来制备。在一种技术中，首先将包括所述多肽的免疫原注射到任一种广泛种类的哺乳动物中(如小鼠、大鼠、兔子、绵羊或山羊)。在这个步骤中，本发明的多肽无需修饰可以起免疫原的作用。备选地，尤其是相对短的多肽，如果将该多肽连接于载体蛋白如牛血清白蛋白或_匙孔血蓝蛋白，则可能引发较出色的免疫应答。优选根据预定的计划，包括一次或多次加强免疫，向动物宿主注射免疫原，并定期对动物进行放血。然后可以通过，例如，使用偶联于合适的固相支持物的多肽的亲和层析从此抗血清中纯化该多肽特异的多克隆抗体。
目的抗原多肽特异性的单克隆抗体可以，例如，利用Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6511-519，1976的技术及其改进方法制备。简而言之，这些方法包括制备能够产生具有期望特异性(即与目的多肽的反应性)的抗体的永生细胞系。此类细胞系可以，例如，由得自如上文所述免疫的动物的脾细胞产生。然后通过，例如，与骨髓瘤细胞融合伴侣(优选是与该免疫动物同系的)融合而永生化该脾细胞。可以使用许多种融合技术。例如，脾细胞和骨髓瘤细胞可以与非离子去污剂混合数分钟，然后以低密度涂布到支持杂种细胞而非骨髓瘤细胞生长的选择性培养基中。优选的选择技术利用HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)选择。在足够的时间后，通常约1到2周，观察杂种集落。选取单个集落并测试其培养上清针对多肽的结合活性。优选具有高度反应性和特异性的杂交瘤。
单克隆抗体可以从生长着的杂交瘤集落上清中分离。此外，可以使用各种技术提高产率，例如将杂交瘤细胞系注射到合适的脊椎动物宿主如小鼠的腹膜腔中。然后可以从腹水和血液中收获单克隆抗体。可以通过常规技术象层析、凝胶过滤、沉淀和提取从抗体中除去污染物。例如，本发明的多肽可用于亲和层析步骤的纯化操作。
本领域公知许多治疗上有用的分子，其包括能够表现出抗体分子的免疫学结合性质的抗原结合位点。蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子产生数个片断，其中两个(″F(ab)″片断)各自包含一个包括完整的抗原结合位点的共价杂二聚体。胃蛋白酶能够切割IgG分子提供数个片断，包括″F(ab′)2″片断，其包含两个抗原结合位点。″Fv″片断可以通过优先蛋白酶解切割IgM，并且罕见的情况下切割IgG或IgA免疫球蛋白分子制备。不过，Fv片断更常见地是利用本领域公知的重组技术获得。Fv片断包括包含抗原结合位点的非共价VH::VL杂二聚体，其保留了天然抗体分子的大部分抗原识别和结合能力。见Inbar等(1972)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 692659-2662；Hochman等(1976)Biochem 152706-2710 以及 Ehrlich 等(1980) Biochem194091-4096。
单链Fv(″sFv″)多肽是共价连接的VH::VL杂二聚体，它由包括以肽编码接头连接的VH-和VL-编码基因的融合基因表达。见Huston等(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85(16)5879-5883。已经描述了许多方法辨别将来自抗体V区的天然聚集而在化学上分离的重链和轻链多肽链转化为sFv分子的化学结构，它将会折叠为基本上类似于抗原结合位点结构的三维结构。参见Huston等的美国专利No.5,091,513和5,132,405以及Ladner等的美国专利No.4,946,778。
每种上述分子包括一重链和一轻链CDR集合，分别插在重链和轻链FR集合之间，所述FR集合为CDR提供支持，并限定CDR相互之间的空间关系。如本文所用，术语″CDR集合″是指重链或轻链V区的三个高变区。自重链或轻链的N-末端起，这些区域分别被命名为″CDR1″、″CDR2″和″CDR3″。因此，抗原结合位点包括六个CDR，包含来自每个重链和轻链V区的CDR集合。包含单个CDR(如CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在文中被称为“分子识别单位”。对许多抗原-抗体复合物的晶体学分析证明CDR的氨基酸残基与结合抗原形成广泛的接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3的接触。因而，分子识别单位主要地负责抗原结合位点的特异性。
如本文所用，术语″FR集合″是指架构重链或轻链V区CDR集合的CDR的四个侧翼氨基酸序列。有些FR残基可以与结合的抗原接触；不过，FR主要负责使V区折叠成抗原结合位点，尤其是直接毗邻CDR的FR残基。在FR中，某些氨基酸残基和某些结构特点是非常高度保守的。就这点而言，所有V区序列含有90个氨基酸残基左右的内部二硫键环。当V区折叠为结合位点时，CDR陈列为突出的环基序，构成抗原结合表面。一般公认存在可将CDR环的折叠形状改变为“正则”结构(不管确切的CDR氨基酸序列如何)的保守FR结构区。此外，已知某些FR残基参与稳定抗体重链和轻链相互作用的非共价域间接触。
已经描述了包含来自非人免疫球蛋白的抗原结合位点的许多“人源化”抗体分子，包括啮齿类动物V区及其相关CDR与人恒定区结构域融合(Winter等(1991)Nature 349293-299；Lobuglio等(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 864220-4224；Shaw等(1987)J Immunol.1384534-4538以及Brown等(1987)Cancer Res.473577-3583)、在与合适的人类抗体恒定区融合前啮齿类动物CDR嫁接到人类支持FR中(Riechmann等(1988)Nature 332323-327；Verhoeyen等(1988)Science2391534-1536以及Jones等(1986)Nature 321522-525)，以及啮齿类动物CDR由重组镶饰的啮齿类动物FR支持(欧洲专利公开No.519,596，公开于1992年12月23日)的嵌合抗体。设计这些“人源化”分子以最小化不想要的对啮齿类动物抗人抗体分子的免疫应答，这种应答限制那些成分在人类受体中治疗应用的持续时间以及有效果。
如本文所用，″镶饰FR″和″重组镶饰的FR″是指来自例如啮齿类动物重链或轻链V区的FR残基用人类FR残基选择性地取代，以提供包含抗原结合位点的异种分子，其基本上保留了全部的天然FR多肽折叠结构。镶饰技术建立有关抗原结合位点的配体结合特征主要是由位于抗原结合表面中的重链和轻链CDR集合的结构和相对安置的了解的基础上。见Davies等(1990)Ann.Rev.Biochem.59439-473。因而，人源化抗体的抗原结合特异性只有在小心维持CDR结构、它们彼此之间的相互作用以及它们与V区其余结构域之间的相互作用的情况下才能得以保持。通过利用镶饰技术，容易为免疫系统遭遇的外部(如溶剂可接近的)FR残基被选择性地用人类残基取代，以提供包括或者弱免疫原性或者基本上非免疫原性的镶饰表面的杂种分子。
镶饰方法利用由Kabat等编撰的Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第4版，(U.S.Dept.of Health and HumanServices，U.S.Government Printing Office，1987)，Kabat数据库更新版，以及其它可用的美国和国外数据库(核酸和蛋白)中的人类抗体可变结构域的现有序列数据。V区氨基酸的溶剂可接近性可以由人和鼠抗体片断的已知三维结构中推断出。镶饰鼠抗原结合位点大致有两个步骤。首先，将目的抗体分子可变结构域的FR与由上文确定的来源获得的人类可变结构域的相应FR序列进行比较。然后将最同源的人类V区与相应的鼠氨基酸逐个残基地进行比较。鼠FR中与人对应物不同的残基利用本领域公知的重组技术由存在于人类成分的残基替代。残基转换仅对至少部分暴露(溶剂可接近)的成分进行，并对可能对V区结构域的三级结构具有重要影响的氨基酸残基如脯氨酸、甘氨酸和带电荷氨基酸的替代加以留心。
以这种方式，所得的“镶饰”鼠抗原结合位点被设计，以保留鼠CDR残基、与CDR基本上毗邻的残基、确定为隐藏或几乎隐藏(溶剂不可接近)的残基、据信参与重链和轻链结构域之间的非共价(如静电和疏水)接触的残基以及来自FR保守结构区据信影响CDR环“正则”三级结构的残基。然后利用这些设计标准制备将鼠抗原结合位点重链和轻链CDR组合到人类存在的FR中的重组核苷酸序列，它能够用来转染哺乳动物细胞，用以表达表现出鼠抗体分子的抗原特异性的重组人抗体。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的单克隆抗体可与一种或多种治疗制剂偶联。就这点而言的合适制剂包括放射性核素、分化诱导剂、药物、毒素以及它们的衍生物。优选的放射性核素包括90Y，123I，125I，131I，186Re，188Re，211At和212Bi。优选的药物包括氨甲喋呤、嘧啶和嘌呤类似物。优选的分化诱导剂包括佛波酯和丁酸。优选的毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍乱毒素、gelonin、假单胞菌外毒素、志贺菌属毒素以及美国商陆抗病毒蛋白。
治疗制剂可以直接和间接(如通过接头基团)地偶联于(如共价键合)合适的单克隆抗体。当制剂与抗体各自具有能够相互反应的取代基时，它们之间的直接反应是可能的。例如，一个上的亲核基团象氨基或巯基，可能能与另一个上的含羰基基团如酸酐或酰卤，或者含较好的离去基团(如卤化物)的烷基反应。
备选地，可能期望通过接头基团使治疗制剂和抗体偶联。接头基团可以行使间隔臂的功能，使抗体和制剂远离，以避免干扰结合能力。接头基团也可以起提高制剂或抗体上的取代基的化学反应性的作用，从而提高偶联效率。化学反应性的提高也可以促进否则不可能进行的制剂或制剂上的官能团的使用。
对本领域技术人员显而易见的是，许多双官能或多官能试剂，同型或异型官能的(例如在Pierce Chemical Co.，Rockford，IL目录中所描述的那些)，可用作为接头基团。例如，偶联可以通过氨基、羧基、巯基或氧化的糖残基实现。存在数目众多的描述此类方法学的参考文献，例如Rodwell等的美国专利No.4,671,958。
当治疗制剂在没有本发明的免疫缀合物的抗体部分更有效时，可能期望使用在内在化进入细胞期期间或之后可切割的接头基团。许多不同的可切割接头基团已有描述。从这些接头基团胞内释放制剂的机制包括通过还原二硫键(如Spitler的美国专利No.4,489,710)、通过辐照光敏键(如Senter等的美国专利No.4,625,014)、通过水解衍生的氨基酸侧链(如Kohn等的美国专利No.4,638,045)、通过血清补体介导的水解(如Rodwell等的美国专利No.4,671,958)以及酸催化的水解(Blatter等的美国专利No.4,569,789)切割。
可以期望将不止一种制剂偶联到抗体上。在一个实施方案中，将多分子的一种制剂偶联到一个抗体分子上。在另一个实施方案中，可以将不止一种类型的制剂偶联到一个抗体上。不论特定的实施方案如何，具有不止一种制剂的免疫缀合物可以由许多方法制备。例如，不止一种制剂可以直接偶联到抗体分子上，或者可以使用提供多连附位点的接头。备选地，可以使用载体。
载体可以以多种方式携带制剂，包括直接或者通过接头基团共价键合。合适的载体包括蛋白如白蛋白(如Kato等的美国专利No.4,507,234)、肽和多糖如氨基葡聚糖(如Shih等的美国专利No.4,699,784)。载体也可以通过非共价键合或通过囊化如在脂质体微囊中携带制剂(如美国专利No.4,429,008和4,873,088)。放射线核素特异性的载体包括放射性卤代小分子和螯合化合物。例如美国专利No.4,735,792公开了代表性的放射性卤代小分子及其合成。放射线核素螯合物可由螯合化合物形成，包括含有氮和硫原子作为供体原子与金属、或金属氧化物、放射线核素结合的那些化合物。例如Davison等的美国专利No.4,673,562公开了代表性的螯合化合物及其合成。
T细胞免疫治疗组合物也可以，或者备选地包括WT1特异性的T细胞。此类细胞一般可以利用标准程序体外或离体制备。例如，利用商业上可获得的细胞分离系统如可获自CellPro Inc.，Bothell WA的CEPRATETM系统，T细胞可存在于(或分离自)哺乳动物如患者的骨髓、外周血或骨髓或外周血级分(也参见美国专利No.5,240,856；美国专利No.5,215,926；WO 89/06280；WO 91/16116和WO 92/07243)。备选地，T细胞可来自相关或无关的人类、非人动物、细胞系或培养物。
T细胞可用WT1多肽、编码WT1多肽的多核苷酸和/或表达WT1多肽的抗原呈递细胞(APC)刺激。此类刺激在足以允许产生WT1多肽特异性的T细胞的条件和时间下进行。优选地，WT1多肽或多核苷酸存在于递送载体如微球体中，以促进抗原特异性T细胞的产生。简要地，将可通过常规技术(例如通过外周血淋巴细胞Ficoll/Hypaque密度梯度离心)分离自患者或相关或无关供体的T细胞与WT1多肽温育。例如，T细胞可以在体外与WT1多肽(例如，5到25μg/ml)或者合成可比量的WT1多肽的细胞在37℃温育2-9天(典型地4天)。可能期望在不存在WT1多肽时温育单独小份的T细胞样品作为对照。
T细胞被认为是WT1多肽特异性的，如果该T细胞杀死包被有WT1多肽或表达编码此种多肽的基因的细胞的话。T细胞特异性可以利用任一种标准技术评价。例如，在铬释放测定或增殖测定中，与阴性对照相比，裂解和/或增殖增加大于2倍的刺激指数指示T细胞特异性。此类测定可以例如象在Chen等，Cancer Res.541065-1070，1994中描述的那样进行。备选地，T细胞增殖的检测可通过多种已知技术实现。例如，T细胞增殖可以通过测量增加的DNA合成速率(例如，通过用氚化胸苷脉冲标记T细胞培养物，并测量掺入DNA中的氚化胸苷的量)检测。检测T细胞增殖的其它方法包括测量白介素-2(IL-2)产量、Ca2+通量或染料如3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-四唑的吸收的增加。或者，可以测量淋巴因子的合成(例如干扰素-γ)或者量化能够对WT1多肽应答的T细胞的相对数目。与WT1多肽(200ng/ml-100μg/ml，优选100ng/ml-25μg/ml)接触3-7天应当导致T细胞增殖至少两倍的增长，和/或如上所述接触2-3小时应当导致T细胞的激活，如利用标准细胞因子测定法测量的那样，其中细胞因子(例如TNF或IFN-γ)释放水平两倍的增长可指示T细胞的激活(参见Coligan等，Current Protocols in Immunology，vol. 1，WileyInterscience(Greene 1998))。WT1特异性T细胞可利用标准技术扩增。在优选的实施方案中，T细胞来自于患者或相关或无关供体，并在刺激和扩增后给药患者。
响应WT1多肽、多核苷酸或WT1-表达APC而被激活的T细胞可以是CD4+和/或CD8+。特异性CD4+或CD8+ T细胞的激活可由多种方法检测。检测特异性T细胞激活的方法包括检测T细胞的增殖、细胞因子(如淋巴因子)的产生或者细胞溶解活性的产生(即产生WT1特异性的细胞毒性T细胞)。对于CD4+ T细胞，检测特异性T细胞激活的优选方法是检测T细胞的增殖。对于CD8+ T细胞，检测特异性T细胞激活的优选方法是检测细胞溶解活性的产生。
对于治疗目的，响应WT1多肽、多核苷酸或APC而增殖的CD4+或CD8+ T细胞可以在体外或在体内进行数目上的扩增。此类T细胞的体外增殖可以由多种方法实现。例如，T细胞可以重新暴露于WT1多肽，添加或不添加T细胞生长因子如白介素-2和/或合成WT1多肽的刺激细胞。产生CD8+ T细胞应答时优选添加刺激细胞。T细胞可以在体外生长至庞大的数目并响应WT1多肽的间歇性再刺激保留特异性。简要地，对于初次体外刺激(IVS)，可将大数目的淋巴细胞(如大于4×107)置于具有含人类血清的培养基的烧瓶中。可以直接添加WT1多肽(例如10μg/ml的肽)，连同破伤风类毒素(如5μg/ml)。然后可以温育烧瓶(如37℃7天)。对于二次IVS，则收集T细胞并置于具有2-3×107辐照的外周血单核细胞的新烧瓶中。直接添加WT1多肽(如10μg/ml)。烧瓶于37℃温育7天。在二次IVS后2天和4天，可以添加2-5单位的白介素-2(IL-2)。对于三次IVS，可将T细胞置于孔中，并用该个体自身的包被有该肽的EBV转化B细胞刺激。可以在每个循环的第2天和第4天添加IL-2。一旦表明细胞为特异性的细胞毒性T细胞，它们就可以利用10天的刺激循环在第2、4和6天用更高的IL-2(20单位)进行扩增。
备选地，在存在WT1多肽时增殖的一种或多种T细胞可以通过克隆在数目上扩增。克隆细胞的方法是本领域熟知的，并且包括有限稀释法。应答T细胞可以通过密度梯度离心和绵羊红细胞玫瑰花结从致敏患者的外周血中纯化，并在辐照的自体填充细胞存在下通过用微少的抗原刺激建立培养。为产生CD4+ T细胞系，利用WT1多肽作为抗原刺激物，利用通过转染EB病毒永生化的类淋巴母细胞系(LCL)或者自体同源外周血淋巴细胞(PBL)作为抗原呈递细胞。为了产生CD8+ T细胞系，可以利用由表达载体转染的产生WT1多肽的自体抗原呈递细胞作为刺激细胞。建立的T细胞系可在抗原刺激后2-4天通过将刺激的T细胞以每孔0.5个细胞的频率接种到具有1×106个辐照的PBL或LCL细胞和重组白介素-2(rIL2)(50U/ml)的96孔平底板中进行克隆。具有建立的克隆生长的孔可在初始接种后大约2-3周辨认，并用合适的抗原在自体抗原呈递细胞存在下再刺激，随后在抗原刺激后2-3天通过添加低剂量的rIL2(10U/ml)进行扩增。T细胞克隆可以通过抗原和rIL2大约每两周一次的定期再刺激维持在24孔板中。
在某些实施方案中，可在体内和/或体外使同种异体T细胞致敏(即对WT1致敏)。此类致敏可以通过使T细胞与WT1多肽、编码此多肽的多核苷酸或者产生此多肽的细胞在足以允许T细胞致敏的条件和时间下进行接触实现。一般而言，T细胞被认为致敏的，如果，举例来说，与WT1多肽的接触导致T细胞的增殖和/或激活的话，如本文所述的通过标准增殖、铬释放和/或细胞因子释放测定所测量的那样。与阴性对照相比，增殖或裂解多于两倍的增长以及细胞因子水平多于三倍的增长的刺激指数，指示T细胞特异性。例如，体外致敏的细胞可用在骨髓移植中或者用作供体淋巴细胞输注。
WT1特异性的T细胞能够杀死表达WT1蛋白的细胞。引入编码WT1 T细胞受体(TCR)链的基因被用作为定量和定性提高针对携带WT1的白血病和肿瘤细胞的应答的手段。增加能与WT1阳性细胞反应的T细胞数目的疫苗是靶向WT1携带细胞的一个方法。利用WT1特异性T细胞的T细胞治疗是另一种方法。备选方法是将WT1特异性的TCR链引入到T细胞和具有裂解可能性的其它细胞中。在合适的实施方案中，从WT1特异性T细胞系中克隆出TCRα和β链，并用于过继性T细胞治疗，例如在WO96/30516中所描述的，特此并入作为参考。
T细胞受体组合物T细胞受体(TCR)由命名为T细胞受体α和β链的2个不同的高度可变多肽链构成，它们通过二硫键连接(Janeway，Travers，Walport.Immunobiology.第4版，148-159.Elsevier Science Ltd/GarlandPublishing.1999)。α/β杂二聚体与不变CD3链在细胞膜上复合。该复合物识别与MHC分子结合的特异性抗原肽。TCR特异性庞大的多样性是通过体基因重排产生的，非常类似于免疫球蛋白的多样性。β链基因含有50多个可变区(V)、2个多样区(D)、10多个铰链(J)片断以及2个恒定区片断(C)。α链基因含有70多个V片断和60多个J片断但无D片断，还有一个C片断。在T细胞在胸腺发育期间，发生β链D到J基因的重排，接着是V基因片断到DJ基因的重排。该VDJβ外显子被转录并剪接与Cβ连接。对于α链，Vα基因片断重排至Jα基因片断以产生功能性外显子，其随之被转录并间接至Cα。多样性在重组过程期间通过在β链的V、D和J片断之间以及α链的V和J片断之间随机添加P和N核苷酸而被进一步提高(Janeway，Travers，Walport.Immunobiology.第4版，98和150.Elsevier Science Ltd/GarlandPublishing.1999)。
本发明在另一个方面提供了本文公开的多肽或其变体或衍生物特异性的TCR。根据本发明，提供了识别本文描述的肿瘤多肽的T细胞受体的α和β链的V-J或V-D-J结合区或其部分的多核苷酸和氨基酸序列。一般而言，本发明的这个方面涉及识别或结合在MHC环境中提呈的肿瘤多肽的T细胞受体。在优选的实施方案中，被T细胞受体识别的肿瘤抗原包括本发明的多肽。例如，编码WT1肽特异性的TCR的cDNA可以利用标准分子生物学和重组DNA技术分离自肿瘤多肽特异性T细胞。
本发明进一步包括与本发明识别或结合肿瘤多肽的T细胞受体具有基本上相同的功能或活性的T细胞受体或其类似物。此类受体包括，但不限于受体片断或本文提供的T细胞受体的取代、添加或缺失突变体。本发明也涵盖与本文提供的T细胞受体基本上同源或者基本上保留相同的活性的多肽或肽。术语“类似物”包括与本文提供的T细胞受体具有基本上同一的氨基酸残基序列的任何蛋白或多肽，其中一个或多个残基，优选不多于5个残基，更优选不多于25个残基已被功能上相似的残基保守取代，并且它展示出如本文所述的T细胞受体的功能性方面。
本发明进一步提供了由编码本文描述的多肽特异性的TCR的多核苷酸转染的合适的哺乳动物宿主细胞，例如，非特异性T细胞，由此使得该宿主细胞是所述多肽特异性的。TCR的α和β链可以包含在独立的表达载体中，或者备选地位于单个表达载体中，该载体也含有内部核糖体进入部位(IRES)，其用于IRES下游基因的帽子-非依赖性翻译。所述表达该多肽特异性的TCR的宿主细胞可用于，例如，如下文进一步讨论的WT1相关癌症的过继性免疫疗法。
在本发明的另一方面，本文所述多肽特异性的克隆的TCR可用在用于诊断WT1相关癌症的试剂盒中。例如，肿瘤特异性TCR的核酸序列或其部分可用作为探针或引物，检测生物学样品中编码该特异性TCR的重排基因的表达。因此，本发明进一步提供了检测编码多肽特异性TCR的信使RNA或DNA的测定法。
肽-MHC四体复合物本发明在另一个方面提供了识别本文公开的多肽的T细胞或其变体或衍生物特异性的肽-MHC四体复合物(四聚物)。在一个实施方案中，四聚物可用于检测WT1特异性T细胞。四聚物可用于监测WT1特异性免疫应答、早期检测WT1相关恶性肿瘤以及用于监测最小程度的残余疾病。四聚物染色典型地通过流式细胞仪分析进行，并且可用于在患有WT1相关疾病的患者群中鉴定处于较高的复发或疾病发展风险的群体。
药物组合物在另外的实施方案中，本发明涉及在药学上可接受的载体中一种或多种本文公开的多核苷酸、多肽、T细胞、TCR和/或抗体组合物的制剂，用于单独或者联合一种或多种其它形式疗法向细胞或者动物给药。
人们将会理解，如果需要，本文所公开的组合物还可以联合其它制剂给药，例如象其它蛋白或多肽或各种药学活性制剂。事实上，对于还可以包括的其它组分实质上没有限制，只要该附加制剂在与靶细胞或宿主组织接触时不导致显著的不利反应。该组合物因而可以与如特定情况所需的各种其它制剂一起递送。此类组合物可以自宿主细胞或其它生物学来源中纯化，或者备选地可以如本文所述化学合成。同样地，此类组合物可以进一步包括取代的或衍生的RNA或DNA组合物。
因此，在本发明的另一个方面，提供了包括本文描述的一种或多种多核苷酸、多肽、抗体、TCR和/或T细胞组合物连同生理学上可接受的载体的药物组合物。在某些优选的实施方案中，本发明的药物组合物包括本发明的免疫原性多核苷酸和/或多肽组合物，用于预防性和治疗性疫苗用途。疫苗制备一般性地描述在例如M.F.Powell和M.J.Newman 编辑，″Vaccine Design(the subunit and adjuvantapproach)，″Plenum Press(NY，1995)中。通常，此类组合物将包括与一种或多种免疫刺激物组合的一种或多种本发明的多核苷酸和/或多肽组合物。
显然本文描述的任何药物组合物可以含有本发明的多核苷酸和多肽的药学上可接受的盐。此类盐可以，例如由药学上可接受的非毒性碱，包括有机碱(例如，伯胺、仲胺和叔胺以及碱性氨基酸的盐)和无机碱(例如，钠、钾、锂、铵、钙和镁盐)制备。
在另一实施方案中，本发明举例说明性的免疫组合物如疫苗组合物包括编码一种或多种如上文所述的多肽的DNA，从而该多肽原位产生。正如上文所指出的那样，所述多核苷酸可以存在于任一种本领域普通技术人员公知的许多递送系统中给药。的确，许多基因递送技术是本领域熟知的，例如由Rolland，Crit.Rev.Therap.Drug CarrierSystems 15143-198，1998及其中引用的参考文献中所描述的那些技术。当然，合适的多核苷酸表达系统将含有用于在患者中表达的必要的调控性DNA调控序列(例如合适的启动子和终止信号)。或者，细菌递送系统可以包括给药在其细胞表面表达多肽免疫原性部分或者分泌此种表位的细菌(例如卡介菌苗(Bacillus-Calmette-Guerrin))。
因此，在某些实施方案中，编码本文所述的免疫原性多肽的多核苷酸利用任一种公知的许多基于病毒的系统引入到合适的哺乳动物宿主细胞中用于表达。在一个举例说明性的实施方案中，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利和有效的平台。可以利用本领域公知的技术将选择的编码本发明的多肽的核苷酸序列插入到载体中，并包装进逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并递送给受试者。已经描述了许多举例说明性的逆转录病毒系统(例如美国专利No.5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7980-990；Miller，A.D.(1990)Human Gene Therapy 15-14；Scarpa等(1991)Virology 180849-852；Burns等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3102-109)。
另外，许多举例说明性的基于腺病毒的系统也已有描述。与整合进宿主基因组的逆转录病毒不同，腺病毒持续存在于染色体外，因而使得与插入突变相关的风险最小化(Haj-Ahmad和Graham(1986)J.Virol.57267-274；Bett等(1993)J.Virol.675911-5921；Mittereder等(1994)Human Gene Therapy 5717-729；Seth等(1994)J.Virol.68933-940；Barr等(1994)Gene Therapy 151-58；Berkner，K.L.(1988)BioTechniques 6616-629；以及Rich等(1993)Human GeneTherapy 4461-476)。
也已经开发了用于多核苷酸递送的多种腺相关病毒(AAV)载体系统。AAV载体可容易地利用本领域熟知的技术构建。参见美国专利No.5,173,414和5,139,941；国际公开No.WO 92/01070和WO 93/03769；Lebkowski等(1988)Molec.Cell.Biol.83988-3996；Vincent等(1990)Vaccines 90(冷泉港实验室出版社)；Carter，B.J.(1992)CurrentOpinion in Biotechnology 3533-539；Muzyczka，N.(1992)CurrentTopics in Microbiol.and Immunol.15897-129；Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy 5793-801；Shelling和Smith(1994)GeneTherapy 1165-169以及Zhou等(1994)J.Exp.Med.1791867-1875。
可通过基因转移递送编码本发明多肽的多核苷酸的另外的病毒载体包括来自于痘病毒家族的那些病毒，例如痘苗病毒和禽痘病毒。作为实例，表达新分子的痘苗病毒重组体可以如下构建。编码多肽的DNA首先被插入到合适的载体中，从而它毗邻痘苗启动子和侧翼痘苗DNA序列，例如编码胸苷激酶(TK)的序列。然后利用该载体转染同时用痘苗转染的细胞。同源重组起着将痘苗启动子连同编码目的多肽的基因插入到病毒基因组中的作用。所得的TK.sup.(-)重组子可通过在5-溴脱氧尿苷存在下培养细胞进行选择，并挑取对其有抗性的病毒空斑。
基于痘苗的感染/转染系统可方便地用于在生物体的宿主细胞中提供可诱导的一种或多种本文描述的多肽的瞬时表达或共表达。在该特定的系统中，首先在体外用编码噬菌体T7 RNA聚合酶的痘苗病毒重组子感染细胞。该聚合酶展示出极佳的特异性，因为它仅转录携带T7启动子的模板。感染后，细胞用由T7启动子驱动的目的多核苷酸转染。痘苗病毒重组子表达的胞浆中的聚合酶将转染的DNA转录成RNA，然后其被宿主翻译机器翻译成多肽。该方法提供了高水平瞬时胞浆产生大量RNA及其翻译产物的方法。参见Elroy-Stein和Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)876743-6747；Fuerst等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)838122-8126。
备选地，也可以利用禽痘病毒例如鸡痘病毒和金丝雀痘病毒递送目的编码序列。表达来自哺乳动物病原体的免疫原的重组禽痘病毒已知在给药非禽物种时赋予保护性免疫力。尤其期望在人类和其它哺乳动物物种中利用禽痘病毒，因为禽痘病毒属的成员只能在易感的禽类中有成效地复制，因而在哺乳动物细胞中是非传染性的。产生重组禽痘病毒的方法是本领域公知的，而且使用遗传重组，就如上文所述的有关痘苗病毒的产生那样。参见WO 91/12882、WO 89/03429和WO92/03545。已开发了许多作为活病毒载体表达异源蛋白的痘病毒(Cepko等，Cell 371053-1062(1984)；Morin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 844626-4630(1987)；Lowe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，843896-3900(1987)；Panicali & Paoletti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，794927-4931(1982)；Machett等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，797415-7419(1982))。代表性的鸡痘病毒和猪痘病毒分别可以登记号VR-229和VR-363由ATCC获得。重组牛痘CEA可以登记号VR2323由ATCC获得。其它举例说明性的病毒载体也包括，但不限于由Therion Biologics(Cambridge，MA，USA)，例如在美国专利No.6,051,410、5,858,726、5,656,465、5,804,196、5,747,324、6,319,496、6,165,460中所描述的那些病毒载体。
也可利用任一种甲病毒载体递送本发明的多核苷酸组合物，例如描述在美国专利No.5,843,723、6,015,686、6,008,035和6,015,694中的那些载体。也可以利用某些基于委内瑞拉马脑炎(VEE)的载体，其举例说明性的实例可见于美国专利No.5,505,947和5,643,576。
此外，分子缀合载体，例如在Michael等J.Biol.Chem.(1993)2686866-6869和Wagner等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)896099-6103中描述的腺病毒嵌合载体，也可用于本发明的基因递送。
有关这些及其它已知的基于病毒的递送系统的另外的举例说明性信息可见于例如Fisher-Hoch等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86317-321，1989；Flexner等，Ann.N.Y.Acad.Sci.56986-103，1989；Flexner等，Vaccine 817-21，1990；美国专利No.4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美国专利No.4,777,127；GB2,200,651；EP0,345,242；WO91/02805；Berkner，Biotechniques 6616-627，1988；Rosenfeld等，Science 252431-434，1991；Kolls等，proc.Narl.Acad.Sci.USA91215-219，1994；Kass-Eisler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9011498-11502，1993；Guzman等，Circulation 882838-2848，1993以及Guzman等，Cir.Res.731202-1207，1993。
正如熟练技术人员将会容易地理解的那样，任何数目的附加组分可存在于表达如本文所述的WT1多肽或其任何部分的DNA或逆转录病毒载体中。例如，用于递送本发明的多核苷酸或肽的表达载体可以包括任何数目的各种共刺激分子，包括但不限于CD28、B7-1、ICAM-1和LFA-3。递送载体也可以包括任何数目的细胞因子，例如IFN-γ、GM-CSF或IL-2。在一个举例说明性的实施方案中，重组病毒载体，例如痘苗载体(vaccinia vector)或鸡痘载体(fowlpox vector)包括B7-1、ICAM-1和LFA-3。
本发明也包括利用本文描述的DNA和/或病毒载体的任意组合用于治疗与WT1表达相关的恶性肿瘤。一个举例说明性的实施方案中，向患有WT1-相关恶性肿瘤的动物或人类患者给药重组痘苗病毒载体，接着给药重组鸡痘载体。在本发明的另一个实施方案中，在给药痘苗载体后给药两次重组鸡痘(例如致敏/加强/强化疫苗接种方案)。
在某些实施方案中，可将多核苷酸整合到靶细胞中。这种整合可以介由同源重组(基因取代)位于特定位置和方向上，或者它可以整合于随机非特异性位置(基因增加)。又在另一实施方案中，多核苷酸可以作为独立的DNA附加体片断稳定地维持在细胞中。此类多核苷酸片断或“附加体”编码足以允许独立于或同步于宿主细胞周期的维持和复制的序列。表达构建物递送到细胞的方式以及多核苷酸维持在细胞何处取决于所使用的表达构建物的类型。
在本发明的另一个实施方案中，多核苷酸作为“裸”DNA给药/递送，例如象在Ulmer等，Science 2591745-1749，1993中描述的以及由Cohen，Science 2591691-1692，1993所综述的。裸DNA的摄入可通过将DNA涂敷到生物可降解珠子上提高，所述珠子被有效地转运到细胞中。
又在另一个实施方案中，本发明的组合物可以通过粒子轰击途径递送，其中许多已有描述。在一个举例说明性的实例中，气体驱动的粒子加速可利用装置例如由Powderject Pharmaceuticals PLC(Oxford，UK)和Powderject Vaccines Inc.(Madison，WI)所制造的那些装置实现，其中有些实例描述在美国专利No.5,846,796、6,010,478、5,865,796、5,584,807和欧洲专利No.0500 799中。该方法提供了无针递送途径，其中显微颗粒的干粉制剂如多核苷酸或多肽颗粒在由手控装置产生的氦气喷射器内被加速至高速，驱使所述颗粒进入目的靶组织。
在相关的实施方案中，可用于本发明组合物的气驱无针注射的其它装置和方法包括由Bioject，Inc.(Portland，OR)提供的那些，其中有些实例描述在美国专利No.4,790,824、5,064,413、5,312,335、5,383,851、5,399,163、5,520,639和5,993,412中。
根据另一个实施方案，本文所述的药物组合物将包括除了本发明的免疫原性多核苷酸、多肽、抗体、T细胞、TCR和/或APC组合物之外的一种或多种免疫刺激物。免疫刺激物本质上是指增强或加强针对外源抗原的免疫应答(抗体和/或细胞介导的)的任何物质。一类优选的免疫刺激物包括佐剂。许多佐剂包含设计为防止抗原迅速分解代谢的物质(例如氢氧化铝或矿物油)以及免疫应答刺激物(例如脂质A、Bortadella pertussis或结核分枝杆菌来源的蛋白)。某些佐剂是商业上可获得的，例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)；Merck佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia，PA)；铝盐例如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌盐；酰化酪氨酸的不溶悬液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生多糖；聚磷腈；生物可降解微球体；单磷酰基脂质A和quil A。细胞因子如GM-CSF、白介素-2、-7、-12等生长因子也可用作为佐剂。
在本发明的某些实施方案中，佐剂组合物优选是诱导主要为Th1型免疫应答的佐剂组合物。高水平的Th1型细胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)往往有利于诱导细胞介导的针对给药抗原的免疫应答。相反，高水平的Th2型细胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)往往有利于诱导体液免疫应答。在施用本文提供的疫苗后，患者将支持包括Th1和Th2型应答在内的免疫应答。在优选的实施方案中，应答主要是Th1型，Th1型细胞因子与Th2型细胞因子的水平相比将会提高更大的程度。这些细胞因子的水平可利用标准测定法容易地评价。有关细胞因子家族的综述，参见Mosmann和Coffman，Ann.Rev.Immunol.7145-173，1989。
用于引发主要是Th1型应答的某些优选佐剂包括，例如，单磷酰基脂质A优选为3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A连同铝盐的组合。MPL_佐剂可获自Corixa Corporation(Seattle，WA；例如参见美国专利No.4,436,727、4,877,611、4,866,034和4,912,094)。含CpG寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)也诱导主要Th1型应答。此类寡核苷酸是公知的并且描述于例如WO 96/02555、WO 99/33488及美国专利No.6,008,200和5,856,462中。免疫刺激DNA序列也例如由Sato等Science273352，1996描述。另一个优选的佐剂包括皂角苷，例如Quil A或其衍生物，包括QS21和QS7(Aquila Biopharmaceuticals Inc.，Framingham，MA)；七叶皂苷；毛地黄苷；或者丝石竹属(Gypsophila)或昆诺阿藜(Chenopodium quinoa)皂角苷。其它优选的制剂在本发明的佐剂组合物中包括不止一种皂角苷，例如，包括QS21、QS7、Quil A、β-七叶皂苷或毛地黄苷中的至少两种的组合。
或者皂角苷制剂可以联合疫苗载体，所述载体由壳聚糖或其它多聚阳离子聚合物、聚交酯以及聚丙交酯-共-乙交酯颗粒、基于聚-N-乙酰基葡糖胺的聚合物基质、由多糖或化学修饰的多糖组成的颗粒、脂质体和基于脂类的颗粒、由甘油单酯组成的颗粒等组成。皂角苷也可以在胆固醇存在下配制，以形成颗粒结构例如脂质体或ISCOM。而且，皂角苷可与聚氧乙烯醚或酯一起配制成非颗粒溶液或悬液或者颗粒结构例如薄层脂质体或ISCOM。皂角苷也可以和赋形剂如CarbopolR一起配制以提高粘度，或者可以以干粉形式和粉状赋形剂如乳糖一起配制。
在一个优选的实施方案中，佐剂系统包括单磷酰基脂质A和皂角苷衍生物的组合，例如QS21和3D-MPL_佐剂的组合，如WO 94/00153中所述，或者反应性较小的组合物，其中QS21用胆固醇抑制，如WO96/33739中所述。其它优选的制剂包括水包油乳剂和生育酚。另一个尤其优选的采用QS21、3D-MPL_佐剂和生育酚的水包油乳剂的佐剂配方描述在WO 95/17210中。
另一个强化的佐剂系统包括含CpG寡核苷酸和皂角苷衍生物的组合，特别是CpG和QS21的组合公开在WO 00/09159中。优选地，所述制剂额外包括水包油乳剂和生育酚。
用于本发明的药物组合物的另外的举例说明性的佐剂包括Montanide ISA 720(Seppic，法国)、SAF(Chiron，加利福尼亚，美国)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列佐剂(如SBAS-2或SBAS-4，可获自SmithKline Beecham，Rixensart，比利时)、Detox(Enhanzyn_)(Corixa，Hamilton，MT)、RC-529(Corixa，Hamilton，MT)及其它氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸(AGP)，例如在未决的美国专利申请序号No.08/853,826和09/074,720以及美国专利No.6,303,347中描述的那些，特此将其公开的内容全文并入作为参考，还有例如描述在WO 99/52549 A1中的那些聚氧乙烯醚佐剂。用于本发明的药物组合物的另外的举例说明性的佐剂包括isotucerosol。
其它优选的佐剂包括以下通式的佐剂分子(I)HO(CH2CH2O)n-A-R，其中n为1-50，A为键或-C(O)-，R为C1-50烷基或苯基C1-50烷基。
本发明的一个实施方案由疫苗制剂组成，其包括通式(I)的聚氧乙烯醚，其中n在1到50之间，优选4-24，最优选为9；R组分为C1-50，优选C4-C20烷基并且最优选为C12烷基，而A为化学键。聚氧乙烯醚的浓度应当在0.1-20％的范围内，优选从0.1-10％，并且最优选在0.1-1％的范围内。优选的聚氧乙烯醚选自下组聚氧乙烯-9-十二烷基醚、聚氧乙烯-9-steoryl ether、聚氧乙烯-8-steoryl ether、聚氧乙烯-4-十二烷基醚、聚氧乙烯-35-十二烷基醚以及聚氧乙烯-23-十二烷基醚。聚氧乙烯醚如聚氧乙烯十二烷基醚描述在Merck index(第12版，条目7717)中。这些佐剂分子描述在WO 99/52549中。
如果需要，根据上文通式(I)的聚氧乙烯醚可以与另一个佐剂组合。例如，优选的佐剂组合优选与如未决的英国专利申请GB 9820956.2中所述的CpG组合。
根据本发明的另一个实施方案，本文所述的免疫原性组合物通过抗原呈递细胞(APC)递送给宿主，APC例如树突细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞及其它可被改造为有效的APC的细胞。此类细胞可以，但不必需被遗传修饰以提高提呈抗原的能力，以改善T细胞应答的激活和/或维持，以本质上具有抗肿瘤效果和/或与受体免疫相容(即适配的HLA单倍型)。APC一般可以分离自任一种生物液和器官，包括肿瘤和肿瘤周围组织，并且可以是自体同源、同种异体、同系或异种细胞。
本发明某些优选的实施方案使用树突细胞或其先祖细胞作为抗原呈递细胞。树突细胞是高度有效的APC(Banchereau和Steinman，Nature 392245-251，1998)并且已经被证明可有效地作为生理学佐剂用以引发预防性或治疗性抗肿瘤免疫(参见Timmerman和Levy，Ann.Rev.Med.50507-529，1999)。一般而言，树突细胞可以根据它们的典型形状(原位星状，体外具有显著的可见胞浆突触(树突))、它们高效摄取、加工和提呈抗原的能力以及它们激活初生T细胞应答的能力进行鉴别。当然，树突细胞可以被改造，以在体内或离体表达不常见于树突细胞的特异性细胞表面受体或配体，而且本发明考虑此类修饰的树突细胞。作为树突细胞的替代，荷载了分泌的囊泡抗原的树突细胞(称为核外体)可用作疫苗中(参见Zitvogel等，Natusre Med.4594-600，1998)。
树突细胞和先祖细胞可获自外周血、骨髓、肿瘤浸润细胞、肿瘤周围组织浸润细胞、淋巴结、脾脏、皮肤、脐带血或任何其它合适的组织或体液。例如，树突细胞可通过向获自外周血的单核细胞培养物中添加组合的细胞因子如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFα而离体分化。或者，获自外周血、脐带血或骨髓的CD34阳性细胞可通过在培养基中添加GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配体、LPS、flt3配体和/或诱导树突细胞分化、成熟和增殖的其它化合物的组合而分化为树突细胞。
树突细胞被方便地分类为“未成熟”和“成熟”细胞，这允许以简单的方式区分两种被充分描述特征的表型。不过，这种命名法不应当理解为排除了所有可能的分化中间阶段。未成熟树突细胞以具有高抗原摄取和加工能力的APC为特征，这与Fcγ受体和甘露糖受体的高表达有关。成熟表型典型地以这些标志较低的表达、但负责T细胞激活的细胞表面分子如I类和II类MHC、粘附分子(如CD54和CD11)和共刺激分子(如CD40、CD80、CD86和4-1BB)高表达为特征。
APC一般可以用本发明的多核苷酸(或其部分或其它变体)转染，从而编码的多肽或其免疫原性部分表达于细胞表面。此类转染可离体发生，然后包括此类转染细胞的药物组合物可用于如本文所述的治疗用途。备选地，可以向患者给药靶向树突或其它抗原呈递细胞的基因递送载体，导致在体内发生转染。举例来说，树突细胞的体内和离体转染一般可以利用本领域公知的任何方法进行，例如在WO 97/24447中所描述的那些，或者由Mahvi等，Immunology and cell Biology75456-460，1997描述的基因枪方法。树突细胞的抗原荷载可通过与肿瘤多肽、DNA(裸露或位于质粒载体中的)或RNA、或者与表达抗原的重组细菌或病毒(例如，痘苗、鸡痘、腺病毒或慢病毒载体)一起温育树突细胞或先祖细胞实现。荷载前，多肽可以共价偶联于提供T细胞帮助的免疫学伴侣(如载体分子)。或者，树突细胞可以用未缀合的免疫伴侣分开地或者在多肽存在下脉冲。
尽管本领域普通技术人员公知的任何合适的载体都可用于本发明的药物组合物中，载体类型典型地取决于给药方式。本发明的组合物可按任何合适的给药方式配制，包括例如，局部、口、鼻、粘膜、静脉内、颅骨内、腹膜内、皮下和肌内给药。
可用在此类药物组合物中的载体是生物适应性的，并且也可以是生物可降解的。在某些实施方案中，该制剂优选提供相对恒定水平的活性组分的释放。然而，在其它实施方案中，可能期望给药后更加迅速的释放速率。此类组合物的配制完全落在本领域使用公知技术的普通技术人员的水平之内。就这点而言可用的举例说明性的载体包括聚(交酯-共-乙交酯)、聚丙烯酸脂、乳胶、淀粉、纤维素、葡聚糖等的微颗粒。其它举例说明性的缓释载体包括超分子生物载体，它包括非脂质的亲水核(例如交联多糖或寡糖)以及任选的包含两性分子化合物如磷脂的外层(参见美国专利No.5,151,254和PCT申请WO94/20078、WO/94/23701和WO 96/06638)。包含在持续释放制剂中的活性化合物的量取决于植入部位、释放速率和期望的持续时间以及待治疗或预防的疾病的性质。
在另一个举例说明性的实施方案中，使用生物可降解微球体(如聚乳酸聚羟乙酸酯)作为载体用于本发明的组合物中。合适的生物可降解微球体公开在，例如美国专利No.4,897,268、5,075,109、5,928,647、5,811,128、5,820,883、5,853,763、5,814,344、5,407,609和5,942,252中。修饰的乙肝核心蛋白载体系统，例如在WO/99 40934及其中引用的参考文献中描述的，也可用于许多应用。另一个举例说明性的载体/递送系统使用包括颗粒-蛋白复合物的载体，例如在美国专利No.5,928,647中描述的那些，它能够在宿主中诱导I型限制性细胞毒T淋巴细胞应答。
在另一个举例说明性的实施方案中，使用磷酸钙核芯颗粒作为载体、疫苗佐剂或作为本发明的组合物的控释基质。例示性的磷酸钙颗粒公开在例如公开的专利申请WO/0046147中。
本发明的药物组合物通常还包括一种或多种缓冲液(例如中性缓冲盐溶液或磷酸缓冲盐溶液)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、抗菌剂、螯合剂如EDTA或谷光甘肽、佐剂(如氢氧化铝)、使得制剂与受体血液等渗、低渗或微弱高渗的溶质、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。备选地，本发明的组合物可以配制为冻干剂。
本文描述的药物组合物可置于单剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿或药瓶。此类容器典型地如此密封以保持用前制剂的无菌性和稳定性。一般地，制剂可作为处于油性或水性介质中的悬浮液、溶液或乳剂贮存。或者，药物组合物可以贮存在冻干条件下，仅需要在用前现加无菌液体载体。
开发合适的给药和治疗方案以将本文描述的特定组合物用于各种治疗方案(例如包括口服、肠胃外、静脉内、鼻内和肌内给药及制剂)是本领域熟知的，其中有些用于一般性说明的目的在下文简要地讨论。
在某些用途中，本文公开的药物组合物可以通过口服递送向动物给药。这样的话，这些组合物可以与惰性稀释剂或与可同化的可食载体一起配制，或者它们可以被包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者它们可以被压缩成片，或者它们可以直接掺入到日常饮食的食物中。
活性化合物甚至可以和赋形剂混合并以可摄食的片剂、口含片、药片、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用(参见如Mathiowitz等，Nature 1997 Mar 27；386(6623)410-4；Hwang等，CritRev Ther Drug Carrier Syst 1998；15(3)243-84；美国专利5,641,515；美国专利5,580,579及美国专利5,792,451)。片剂、药片、药丸、胶囊等也可以含有任何一种另外的组分，例如，粘合剂，象黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；并且可以添加增甜剂如蔗糖、乳糖或糖精，或者调味剂如胡椒薄荷、冬青油或樱桃调味料。当剂量单位形式为胶囊时，其可以含有除了上述材料类型之外的液体载体。各种其它材料可作为包衣存在，或者以其它方式修饰该剂量单位的物理形式。例如，片剂、药丸或胶囊可以用虫胶或糖或两者包衣。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何材料应当是药学上纯的，并且在所用量下基本上无毒性。另外，活性化合物可以掺入持续释放的药剂和制剂中。
典型地，这些制剂将含有至少约0.1％的活性化合物或更多，尽管该活性成分的百分比当然可能变化，并且可以方便地为总制剂重量或体积的1或2％至约60％或70％或更多之间。自然地，每种治疗用组合物中活性化合物的量可以如此制备，以便合适的剂量将会在该化合物任何给定的单位剂量中获得。本领域技术人员将会考虑诸如溶解性、生物利用度、生物学半衰期、给药路径、产品保存限期以及其它药学方面的考虑等因素，并且以这种方式，可以期望多种剂量和治疗方案。
对于口服给药，本发明的组合物可以备选地掺入一种或多种赋形剂呈漱口液、牙粉、口含片、口腔喷雾剂或者舌下口服给药的制剂形式。备选地，活性成分可以掺入到口服液(例如含硼酸钠、甘油和重碳酸钾的口服液)中，或分散于牙粉中，或者以治疗有效量添加到可能包括水、粘附剂、研磨剂、调味剂、起泡剂和保湿剂的组合物中。或者所述组合物可以形成可以置于舌下或以其它方式溶解于口的片剂或溶液的形式。
在某些情况下，将期望肠胃外、静脉内、肌内或者甚至腹膜内递送本文公开的药物组合物。此类方法为技术人员公知，其中有些进一步公开在例如美国专利5,543,158、美国专利5,641,515和美国专利5,399,363中。在某些实施方案中，作为游离碱或者药学上可接受的盐的活性化合物溶液可以在与表面活性剂如羟丙基纤维素适当混合的水中制备。分散体也可以在甘油、液相聚乙二醇及其混合物以及油中制备。在普通的贮存和使用条件下。这些制备物通常含有防腐剂以防止微生物生长。
适于注射用的举例说明性的药物形式包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末(例如参见美国专利5,466,468)。在所有情况下，药物形式必须是无菌的且必须达到容易注射程度的流动性。它在生产和贮存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用予以保存。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇以及液相聚乙二醇等)、它们合适的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。例如，适度的流动性可以通过使用包衣如卵磷脂，通过维持分散体中所需的粒径和/或通过使用表面活性剂维持。微生物作用的防止可通过各种抗菌剂和抗真菌剂实现，例如，对羟苯甲酸、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物延长的吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的制剂如单硬脂酸铝和明胶实现。
在一个实施方案中，为以水溶液肠胃外给药，如果必要，溶液应当适当缓冲，并且该液体稀释液应当首先用充分的盐水或葡萄糖使之等渗。这些特定的水溶液特别适于静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药。就此而论，在本发明公开的启示下，可使用的无菌水介质是本领域技术人员公知的。例如，一个剂量可溶解于1ml等渗NaCl溶液中，并且或者添加到1000ml皮下输液中，或者在建议的输注部位注射(参见如″Remington′s Pharmaceutical Sciences″15版，第1035-1038及1570-1580页)。视待治疗受试者的情况而定，可必要地发生某些变化。而且，对于人类给药，制剂当然优选满足FDA局生物学标准所要求的无菌性、热原性以及一般的安全和纯度标准。
在本发明的另一个实施方案中，本文公开的组合物可以配制成中性或盐的形式。举例说明性的药学上可接受的盐包括酸式加成盐(与蛋白的自由氨基形成)并且其是与无机酸象例如盐酸或磷酸、或者诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成的。和自由羧基形成的盐也可以衍生自无机碱象例如钠、钾、铝、铵、钙或铁氢氧化物，以及诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。配制后，溶液应当以与剂量制剂相适应的方式且以治疗有效的量给药。
载体可以进一步包括任一和所有的溶剂、分散介质、载体、包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲液、载体液、悬浮液、胶体等。此类介质和制剂在药学活性物质中的应用是本领域公知的。除了与活性成分不相容范围内的任何常规介质或制剂，都可考虑将其用于治疗组合物。也可以将补足的活性成分掺入到组合物中。短语“药学上可接受的”是指当给药人类时不产生过敏或相似的不利反应的分子实体和组合物。
在某些实施方案中，药物组合物可以通过鼻内喷雾、吸入和/或其它气雾剂递送载体递送。通过鼻气雾剂喷雾将基因、核酸和肽组合物直接递送到肺部的方法已有描述，例如在美国专利5,756,353和美国专利5,804,212中。同样地，利用鼻内微颗粒树脂(Takenaga等，JControlled Release 1998 Mar 2；52(1-2)81-7)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国专利5,725,871)的药物递送也是药学领域公知的。同样，举例说明性的聚四氟乙烯支持基质形式的跨粘膜药物递送在美国专利5,780,045中有描述。
在某些实施方案中，利用脂质体、纳米胶囊、微颗粒、脂颗粒、囊泡等将本发明的组合物引入到合适的宿主细胞/生物体中。尤其是，本发明的组合物可以配制为脂颗粒、脂质体、囊泡、纳米球胶囊的形式等递送。备选地，本发明的组合物可以共价或非共价结合于此类载体介质的表面。
形成和利用脂质体和脂质体样制剂作为潜在的药物载体是本领域技术人员公知的(参见如Lasic，Trends Biotechnol 1998Jul；16(7)307-21；Takakura，Nippon Rinsho 1998 Mar；56(3)691-5；Chandran等，Indian J Exp Biol.1997 Aug；35(8)801-9；Margalit，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1995；12(2-3)233-61；美国专利5,567,434；美国专利5,552,157；美国专利5,565,213；美国专利5,738,868及美国专利5,795,587，特此特别地分别全文并入作为参考)。
脂质体已经被成功地利用于许多由其它操作通常难以转染的细胞类型，包括T细胞悬液、原代肝细胞培养物和PC 12细胞(Renneisen等，J Biol Chem.1990 Sep 25；265(27)16337-42；Muller等，DNA CellBiol.1990 Apr；9(3)221-9)。此外，脂质体没有基于病毒的递送系统的典型的DNA长度限制。脂质体已经被有效地用于将基因、各种药物、放射治疗制剂、酶、病毒、转录因子、变构效应物等引入到各种培养的细胞系和动物中。此外，脂质体的应用似乎与系统递送后自身免疫应答或不可接受的毒性无关。
在某些实施方案中，脂质体由分散在水介质中并自然形成多层同心双层囊泡(也被称为多层囊泡(MLV))的磷脂形成。
备选地，在其它实施方案中，本发明提供了本发明组合物的药学上可接受的纳米胶囊制剂。纳米胶囊一般能够以稳定和再现的方式包载化合物(参见如Quintanar-Guerrero等，Drug Dev Ind Pharm.1998Dec；24(12)1113-28)。为避免因胞内聚合物过载引起的副作用，可利用能够在体内降解的聚合物设计超细颗粒(大小0.1μm左右)。例如，此类颗粒可以如Couvreur等，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1988；5(1)1-20；zur Muhlen等，Eur J Pharm Biopharm.1998Mar；45(2)149-55；Zambaux等J Controlled Release.1998 Jan2；50(1-3)31-40以及美国专利5,145,684中的描述制备。
恶性疾病的治疗癌症治疗的免疫方法基于对癌细胞通常能够规避机体对于异常或外源细胞和分子的防御、并且这些防御能够通过治疗性刺激以再获得这种失利的认识，例如Klein，Immunology(Wiley-Interscience，NewYork，1982)的第623-648页。最近各种免疫效应物能够直接和间接地抑制肿瘤生长的众多观察导致了重兴的对这种癌症治疗方法的兴趣，如Jager等，Oncology 2001；60(1)1-7；Renner等，Ann Hematol 2000Dec；79(12)651-9。
其功能与抗肿瘤细胞免疫和肿瘤细胞从体内的消除有关的四种基本细胞类型是i)B淋巴细胞，其分泌免疫球蛋白到血浆中，用于鉴定和标记非自身入侵细胞；ii)单核细胞，其分泌补体蛋白，负责裂解和加工免疫球蛋白包被的靶入侵细胞；iii)天然杀伤淋巴细胞，具有破坏肿瘤细胞的两种机制，即抗体依赖性细胞细胞毒性和天然杀伤；以及iv)T淋巴细胞，加工抗原特异性受体，并具有识别携带补体标志分子的肿瘤细胞的能力(Schreiber，H.，1989，in FundamentalImmunology(ed).W.E.Paul，pp.923-955)。
癌症免疫疗法一般聚焦于诱导体液免疫应答、细胞免疫应答或两者。而且，已经清楚地确定诱导CD4+T辅助细胞是为其次诱导抗体或细胞毒CD8+T细胞所必需的。对癌细胞，尤其是与WT1表达相关的癌细胞选择性或者理想地特异性的多肽抗原，提供了诱导针对WT1表达相关癌症的免疫应答的强有力方法，并且是本发明的一个重要方面。
在本发明的另一方面，本文描述的组合物和疫苗可用于抑制恶性疾病(如进行性或转移性疾病或者以小肿瘤荷载如最小残留疾病为特征的疾病)的发展。一般而言，此类方法可用于预防、延迟或治疗与WT1表达相关的疾病。换言之，本文提供的治疗方法可用于治疗既有的WT-1相关疾病，或者可用于预防或延迟此类疾病在没有该病或者患有还与WT1表达无关的疾病的患者中的发病。
如本文所用，如果得病细胞(如肿瘤细胞)在病程期间的某个时候与同一组织的正常细胞相比产生可检测的更高水平的WT1多肽的话，疾病“与WT1表达相关”。WT1表达与恶性疾病相关并不需要WT1存在于肿瘤上。例如，WT1过表达可能参与引发肿瘤，但是蛋白表达可能随后丢失。或者，不以WT1表达的增加为特征的恶性疾病可能后来发展为以增加的WT1表达为特征的疾病。因而，任何其中得病细胞以前表达、正在表达或者预期随后表达增加水平的WT1的恶性疾病都被认为是“与WT1表达相关”。
免疫治疗可以利用任何一种技术进行，其中本文提供的化合物或细胞行使从患者中除去WT1表达细胞的功能。此种消除可作为在患者中增强或诱导WT1或者WT1表达细胞特异性的免疫应答的结果而发生。或者，WT1表达细胞可以离体消除(例如通过处理自体骨髓、外周血或者骨髓或外周血级分)。骨髓或外周血级分可利用本领域公知的任何方法获得。
在此方法中，可向患者给药药物组合物和疫苗。如本文所用，“患者”是指任何温血动物，优选为人类。患者可能或者可能未患恶性疾病。因此，上述药物组合物和疫苗可用于防止疾病的发病(即预防性地)或治疗患有疾病的患者(如预防或延迟既有疾病的发展和/或转移)。患有疾病的患者可能具有最小残留疾病(例如，在完全或部分好转的白血病患者中或者在手术放疗和/或化疗降低肿瘤荷载后的癌症患者中的低肿瘤荷载)。此患者可以被免疫以抑制复发(即预防或延迟复发，或者降低复发的严重度)。在某些优选的实施方案中，患者染有白血病(如AML、CML、ALL或儿童ALL)、骨髓样增生异常综合症(MDS)或癌症(如胃肠癌、肺癌、甲状腺癌或乳腺癌或黑素瘤)，其中癌症或白血病是WT1阳性的(即可检测地与本文提供的抗-WT1抗体反应，或者如本文所述表达RT-PCR可检测水平的WT1 mRNA)，或者患有针对WT1表达细胞的自身免疫病。
与WT1过表达相关的其它疾病包括肾癌(例如肾细胞癌或维尔姆斯瘤)，如Satoh F.，等，Pathol.Int.50(6)458-71(2000)以及Campbell C.E等，Int.J.Cancer 78(2)182-8(1998)中所述，以及间皮瘤，如Amin，K.M.等，Am.J.Pathol.146(2)344-56(1995)中所述。Harada等(Mol.Urol.3(4)357-364(1999)描述了WT1基因在人类睾丸生殖细胞肿瘤中的表达。Nonomura等，Hinyokika Kiyo 45(8)593-7(1999)利用睾丸癌特异性基因聚合酶链式反应描述了睾丸癌分子分期(Staging)。Shimizu等，Int.J.Gynecol.Pathol.19(2)158-63(2000)描述了在上皮卵巢肿瘤中维尔姆斯瘤基因(WT1)的免疫组织化学检测。
WT1过表达在结缔组织生成小圆细胞肿瘤中也有描述，见Barnoud，R.等，Am.J.Surg.Pathol.24(6)830-6(2000)以及Pathol.Res.Pract.194(10)693-700(1998)。WT1在成胶质细胞瘤及其它肿瘤中的过表达被Menssen，H.D.等在J.Cancer Res.Clin.Oncol.126(4)226-32(2000)“Wilms′tumor gene(WT1)expression in lungcancer，colon cancer and glioblastoma cell lines compared to freshlyisolated tumor specimens”中描述。表现出WT1过表达的其它疾病包括EBV相关疾病，例如Burkitt淋巴瘤和鼻咽癌(Spinsanti P.等，Leuk.Lymphoma 38(5-6)611-9(2000)，“Wilms′tumor gene expression bynormal and malignant human B lymphocytes”。
在Leukemia 14(9)1634-4(2000)中，Pan等描述了来自白血病或骨髓增生样异常综合症患者的外周血单个核细胞的体外IL-12处理，并报道了细胞毒性的增加和WT1基因表达的下降。在Leukemia13(6)891-900(1999)中，Patmasiriwat等报道了WT1和GATA1在骨髓增生样异常综合症和急性白血病中的表达。在Leukemia13(3)393-9(1999)中，Tamaki等报道维尔姆斯瘤基因WT1是诊断骨髓增生样异常综合症疾病进展的较好的标志。在Oji等，Jpn.J.Cancer Res.90(2)194-204(1999)中就胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌细胞系、生殖细胞肿瘤细胞系、卵巢癌、子宫癌、甲状腺癌细胞系、肝细胞癌讨论了维尔姆斯瘤基因WT1在实体瘤中的表达以及它参与肿瘤细胞生长。
本文提供的组合物可单独使用或者结合常规的治疗方案例如外科手术、放射、化学治疗和/或骨髓移植(自体、同系、同种异体或无关的)。如下文更加详细讨论的那样，本文提供的结合剂和T细胞可用于净化自体干细胞。此种净化在骨髓移植或者输血或其组分之前可能是有益的。本文提供的结合剂、T细胞、抗原呈递细胞(APC)和组合物可进一步用于在体外和/或体内扩增和刺激(或致敏)自体、同种异体、同系或无关的WT1特异性T细胞。此类WT1特异性T细胞可用在例如供体淋巴细胞输注中。
给药路径和频率以及剂量将根据个体变化，并且可利用标准技术容易地确定。一般而言，药物组合物和疫苗可以通过注射(如皮内、肌内、静脉内或皮下)、鼻内(如通过吸入)或者口服给药。在有些肿瘤中，药物组合物或疫苗可以局部给药(例如通过直肠镜检法、胃镜检法、电子内镜检查法、血管造影术或本领域公知的其它方法)。优选地，可以在52周的期间内给药1到10个剂量。优选地，以1个月的间隔给药6个剂量，并且之后定期给予加强接种。替代方案可能适于个别患者。合适的剂量是当如上文所述给药时，能够促进至少超出基底(即无关)水平10-50％的抗肿瘤免疫应答的化合物的量。此类应答可通过测量患者的抗肿瘤抗体、或者通过能够在体外杀死患者肿瘤细胞的细胞毒效应细胞的疫苗依赖性的产生来监测。此类疫苗应当也能够在接种患者中产生可导致与未接种患者相比改善的临床结果(如更快速的完全或部分缓解、或者更长的无疾病和/或整体存活)的免疫应答。一般而言，对于包括一种或多种多肽的药物组合物和疫苗，一个剂量中存在的每种多肽的量在从约100μg到5mg的范围内变化。合适的剂量大小将依患者的大小变化，但典型地在约0.1mL到约5mL的范围内。
一般而言，合适的剂量和治疗方案提供了足以提供治疗和/或预防益处的量的活性化合物。此类应答可通过在治疗患者中确定与未治疗患者相比改善的临床结果(如更快速的完全或部分缓解、或者更长的无疾病和/或整体存活)监测。先前存在的针对WT1的免疫应答的增加通常与改善的临床结果有关。此类免疫应答一般可以利用标准增殖、细胞毒性或细胞因子测定评价，这些测定可以利用获自治疗前和治疗后患者的样品进行。
在某些实施方案中，免疫治疗可以是主动免疫治疗，其中治疗有赖于给药免疫应答修饰剂(例如本文提供的多肽和多核苷酸)在体内刺激内源宿主免疫系统抗肿瘤反应。
在其它实施方案中，免疫治疗可以是被动免疫治疗，其中治疗包括递送具有确定的肿瘤免疫反应性(例如效应细胞或抗体)、能够直接或间接介导抗肿瘤效果、并且不必要依赖于完整宿主免疫系统的制剂。效应细胞的实例包括如上文所讨论的T细胞、T淋巴细胞(例如CD8+细胞毒T淋巴细胞和CD4+T辅助肿瘤浸润淋巴细胞)、杀伤细胞(例如自然杀伤细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞)、B细胞和表达本文提供的多肽的抗原呈递细胞(例如树突细胞和巨噬细胞)。本文所述多肽特异性的T细胞受体和抗体受体可以被克隆、表达并转移到其它载体或效应细胞中用于过继性免疫治疗。本文提供的多肽也可用于产生抗体或抗独特型抗体(如上文和美国专利No.4,918,164中所描述的)用于被动免疫治疗。
单克隆抗体可用任何一种标记进行标记，用于检测、诊断测定或治疗应用所需的选择用途(如美国专利No.6,090,365、6,015,542、5,843,398、5,595,721和4,708,930中所述，特此整体并入作为参考，就如同分别独立并入一样)。在每种情况下，标记的单克隆抗体与抗原决定部位的结合将表示检测或递送特定的治疗制剂到非正常细胞的抗原决定簇上。本发明进一步的目的在于提供所述的被适当标记的用于实现其预期的选择用途的特定单克隆抗体。
如本文所述，效应细胞一般可以通过体外生长而大量获取用于过继性免疫治疗。用于将单个抗原特异性效应细胞扩增至数十亿数目并保留体内的抗原识别的培养条件是本领域公知的。此种体外培养条件典型地利用抗原的间歇性刺激，常常是在细胞因子(例如IL-2)和非分裂饲养细胞存在下。正如上文所指出的那样，本文提供的免疫反应性多肽可用于迅速扩增抗原特异性T细胞培养物，以产生足够数目的细胞用于免疫治疗。特别是，抗原呈递细胞如树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和/或B细胞，可由免疫反应性多肽脉冲，或者利用本领域公知的标准技术由一种或多种多核苷酸转染。例如，抗原呈递细胞可用具有适于提高在重组病毒或其它表达系统中的表达的启动子的多核苷酸转染。用于治疗的培养的效应细胞必须能够在体内生长且广泛分布，并长期存活。研究表明，通过用补充有IL-2的抗原重复刺激，培养的效应细胞能够被诱导在体内生长，并以大量数目长期存活(参见如Cheever等，Immunological Reviews 157177，1997)。
或者，表达本文所述多肽的载体可被引入到取自患者的抗原递呈细胞中，并离体克隆繁殖，用于移植回到同一个患者中。转染的细胞可利用本领域公知的任何方法重新引入到患者中，优选是无菌的形式，通过静脉内、腹腔内、腹膜内或肿瘤内给药。
在另一方面，抑制与WT1表达相关恶性疾病发展的方法包括给药如上文所述的已经响应WT1多肽或表达WT1的APC而被激活的自体T细胞。此类T细胞可以是CD4+和/或CD8+，并且可以如上文所述增殖。可以向个体给药抑制恶性疾病发展有效量的所述T细胞。典型地，静脉内、腹腔内或在切除的肿瘤床中给药约1×109到1×1011T细胞/M2。本领域技术人员清楚细胞的数目以及给药频率将取决于患者的应答。
在某些实施方案中，T细胞可在自体移植前被刺激。此种刺激可发生在体内或体外。对于体外刺激，获自患者的骨髓和/或外周血(或者骨髓或外周血级分)可与WT1多肽、编码WT1多肽的多核苷酸和/或表达WT1多肽的APC在足以允许刺激如上文所述的T细胞的条件和时间下接触。然后可以利用标准技术向患者给药骨髓、外周血干细胞和/或WT1特异性T细胞。
在相关的实施方案中，相关或无关供体的T细胞可在同系或同种异体(相关或无关)骨髓移植之前被刺激。此种刺激可发生在体内或体外。对于体外刺激，获自相关或无关供体的骨髓和/或外周血(或者骨髓或外周血级分)可与WT1多肽、WT1多核苷酸和/或表达WT1多肽的APC在足以允许刺激如上文所述的T细胞的条件和时间下接触。然后可以利用标准技术向患者给药骨髓、外周血干细胞和/或WT1特异性T细胞。
在其它实施方案中，如本文所述的WT1特异性T细胞可用于除去自体骨髓、外周血或者骨髓或外周血级分(例如给药患者前富集CD34+的外周血(PB))中表达WT1的细胞。此类方法可通过使骨髓或PB与此种T细胞在足以允许降低WT1表达细胞至少于10％、优选少于5％、更优选少于1％的骨髓或外周血中髓样或淋巴细胞总数目的条件和时间下接触而进行。此类细胞被消除的程度可容易地通过标准方法检测，例如定性和定量PCR分析、形态学、免疫组织化学和FACS分析。然后可利用标准技术向患者给药骨髓或PB(或其级分)。
癌症检测和诊断组合物、方法及试剂盒一般而言，患者体内与WT1表达相关的癌症可根据获自患者的生物学样品(例如血液、血清、唾液、尿液和/或肿瘤生检)中一种或多种WT1蛋白和/或编码此类蛋白的多核苷酸的存在予以检测。换言之，此类WT1蛋白可用作标志指示癌症的存在或不存在。本文提供的结合剂一般允许检测生物学样品中与该制剂结合的抗原的水平。
多核苷酸引物和探针可用于检测编码WT1蛋白的mRNA的水平，这也可指示癌症的存在或不存在。一般而言，存在于肿瘤组织中的WT1序列的水平与该肿瘤起源的同一类型的正常组织中相比，应当是至少两倍，优选三倍，并且更优选五倍或更高。不同于所述肿瘤起源的组织类型中WT1的表达水平在某些诊断实施方案中无关，因为肿瘤细胞的存在可通过观察肿瘤组织与同一类型的正常组织的预定差异表达水平如2倍、5倍等证实。
其它差异表达模式可方便地用于诊断目的。例如，在本发明的一个方面，WT1序列在肿瘤组织和相同类型的正常组织(而不在其它正常组织类型，例如PBMC)中的过表达，可在诊断学上利用。在这种情况下，转移性肿瘤细胞的存在(例如在取自循环或不同于肿瘤起源的一些其它组织部位的样品中)，可通过例如利用RT-PCR分析检测肿瘤序列在该样品中的表达进行鉴定和/或确认。在许多情况下，将期望利用细胞捕获或其它技术富集目的样品如PBMC中的肿瘤细胞。
存在许多本领域普通技术人员公知的利用结合剂检测样品中WT1多肽标志的测定形式，参见如Harlow和Lane，AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。一般而言，患者中WT1相关癌的存在或不存在可通过(a)使获自患者的生物学样品与结合剂接触；(b)检测样品中与结合剂结合的WT1多肽的水平；和(c)将WT1多肽水平与预定的截止值进行比较而确定。
在优选的实施方案中，所述测定法包括利用固定在固相支持物上结合剂结合并分离WT1多肽与样品的剩余部分。结合的WT1多肽然后可以利用含有报告基团并与结合剂/WT1多肽复合物特异性结合的检测试剂检测。此类检测试剂可以包括，例如与WT1多肽或抗体或特异性结合所述结合剂的其它制剂特异性结合的结合剂，例如抗-免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A或凝集素。备选地，可以使用竞争性测定法，其中WT1多肽用报告基团标记，并在温育结合剂和样品之后，使之与固定的结合剂进行结合。样品组分抑制标记的WT1多肽与结合剂结合的程度可指示样品与固定的结合剂的反应性。用于此类测定的合适的多肽包括全长WT1蛋白及其与结合剂结合的多肽部分，如上文所述。
固相支持物可以是使本领域普通技术人员公知的WT1蛋白可能连附的任何材料。例如，固相支持物可以是微量滴定板的测试孔或者硝化纤维素或其它合适的膜。或者，支持物可以珠子或板，例如玻璃、玻璃纤维、乳胶或塑料材料如聚苯乙烯或聚氯乙烯。支持物也可以是磁性颗粒或光纤传感器，例如象在美国专利No.5,359,681中所公开的那些。结合剂可以利用本领域技术人员公知的许多技术固定到固相支持物上，这些技术在专利和科学文献中有充分的描述。在本发明的上下文中，术语“固定”是指非共价结合如吸附以及共价连接(这可能是制剂和支持物上的官能团之间的直接键合，或者可能是通过交联剂的键合)。优选通过吸附到微量滴定板的孔或膜的固定。在这种情况下，吸附可通过使处于合适的缓冲液中的结合剂与固相支持物接触适当量的时间实现。接触时间随着温度变化，但典型地在约1小时和1天之间。一般而言，用从约10ng到约10μg，并且优选约100ng到约1μg范围的量的结合剂与塑料微量滴定板(例如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的孔接触足以固定足够量的结合剂。
结合剂与固相支持物的共价连接一般可以通过首先使支持物与双官能试剂反应实现，所述双官能试剂能和支持物以及位于结合剂上的官能团如羟基或氨基反应。例如，结合剂可以利用苯醌或者通过支持物上的醛基与结合伴侣上的胺或活性氢原子的缩合作用共价连接到具有合适的聚合物涂层的支持物上(参见如Pierce ImmunotechnologyCatalog and Handbook，1991，at A12-A13)。
在某些实施方案中，所述的测定法为双抗体夹心测定法。该测定法可通过首先使已固定于固相支持物(通常是微量滴定板孔)上的抗体与样品接触，从而允许样品中的WT1多肽与固定的抗体结合而进行。然后从固定的多肽-抗体复合物中除去未结合的样品，并添加含报告基团的检测试剂(优选为能够与多肽不同部位结合的二抗)。然后利用适合于特定报告基团的方法测定保持结合于固相支持物上的检测试剂的量。
更具体地，一旦抗体如上文所述被固定在支持物上，支持物上其余的蛋白结合位点典型地被封阻。可利用本领域普通技术人员公知的任何合适的封阻剂，例如牛血清白蛋白或者Tween 20TM(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)。然后使固定的抗体与样品温育，并使多肽与抗体结合。样品在温育前可以用合适的稀释剂如磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释。一般而言，合适的接触时间(即温育时间)是足以检测获自具有WT1相关癌症的个体的样品中WT1多肽存在的一段时期，至少约为结合及未结合多肽实现平衡时的时间的95％。本领域普通技术人员将会意识到实现平衡所需的时间可以通过测定一段时期内发生的结合水平容易地确定。室温下，大约30分钟的温育时间一般足够。
然后可以通过用合适的缓冲液如含0.1％Tween 20TM的PBS洗涤固相支持物除去未结合的样品。然后向固相支持物中添加含报告基团的二抗。优选的报告基团包括上文所述的那些。
然后使检测试剂与固定的抗体-多肽复合物温育足以检测结合多肽的时间量。合适的时间量一般可以通过测定在一定时期内发生的结合水平确定。然后除去未结合的检测试剂，并利用报告基团检测结合的检测试剂。用于检测报告基团的方法取决于报告基团的性质。对于放射性基团，闪烁计数法或放射自显影法一般比较适当。分光光度计法可用于检测染料、发光光基团和荧光基团。生物素可利用偶联于不同的报告基团(通常为放射线或荧光基团或酶)的抗生物素蛋白检测。酶报告基团一般可以通过添加底物(一般特定的时间段)继之以反应产物的分光光度计或其它分析检测。
为确定与WT1表达相关的癌症的存在或不存在，通常将从结合于固相支持物的报告基团检测到的信号与相应于预定截止值的信号进行比较。在一个优选的实施方案中，检测WT1相关癌症的截止值是当固定的抗体与来自没有癌症的患者的样品温育时取得的平均信号的平均数。一般，产生超出预定截止值三个标准偏差的信号的样品被认为是癌症阳性的。在替代的优选实施方案中，截止值根据Sackett等，Clinical EpidemiologyA Basic Science for Clinical Medicine，LittleBrown and Co.，1985，p.106-7的方法利用Receiver Operator Curve确定。简要地，在这个实施方案中，截止值可由对应于诊断测试结果的每一个可能的截止值的真阳性率(即灵敏度)和假阳性率(100％特异性)对的制图确定。图中最接近左上角的截止值(即包括最大区域的数值)是最准确的截止值，并且产生高于由该方法确定的截止值的信号的样品可以考虑是阳性。或者，截止值可以沿图左移以最小化假阳性率，或者右移以最小化假阴性率。一般而言，产生高于由该方法确定的截止值的信号的样品被考虑为癌阳性。
在相关实施方案中，测定以流动或条测试的形式进行，其中结合剂被固定于膜如硝酸纤维素上。在流动测试中，样品中的多肽随着样品穿过膜与固定的结合剂结合。接着标记的第二结合剂随着含该第二结合剂的溶液流过膜而与结合剂-多肽复合物结合。然后可以如上文所述进行结合的第二结合剂的检测，在条测试形式中，结合了结合剂的膜的一段被浸泡到含样品的溶液中。该样品沿着膜迁移穿过含第二结合剂的区域并到达固定的结合剂区。固定抗体区第二结合剂的集中指示癌症的存在。典型地，该部位第二结合剂的集中产生一种能够通过视觉读出的图案例如线。此图案的缺乏指示阴性结果。一般地，选择固定在膜上的结合剂的量，以便在生物学样品中含有在如上文所讨论形式的双抗体夹心测定法中足以产生阳性信号水平的多肽时，产生视觉可辨的图案。此测定中所用的优选的结合剂是抗体及其抗原结合片断。优选地，固定在膜上的抗体的量在从约25ng到约1μg的范围内，并且更优选约50ng到约500ng。此类测试可典型地由非常小量的生物学样品进行。
当然，存在适用于本发明的WT1蛋白或结合剂的众多其它测定方案。上述说明旨在仅作示例。例如，对本领域普通技术人员显而易见的是上述方案可被容易地改造，利用肿瘤多肽检测生物学样品中与此多肽结合的抗体。此WT1特异性抗体的检测可能与WT1表达相关癌症的存在有关。
WT1表达相关癌症也可以，或者备选地根据生物学样品中与肿瘤蛋白特异性反应的T细胞的存在检测。在某些实施方案中，分离自患者的含CD4+和/或CD8+T细胞的生物学样品与WT1多肽、编码此多肽的多核苷酸和/或表达至少此多肽免疫原性部分的APC温育，并检测T细胞特异性激活的存在或不存在。合适的生物学样品包括，但不限于分离的T细胞。例如，T细胞可以通过常规技术(例如通过外周血淋巴细胞的Ficoll/Hypaque密度梯度离心)分离自患者。T细胞可以在体外与多肽(5-25μg/ml)于37℃温育2-9天(典型地4天)。可能期望在WT1不存在时温育另一小份T细胞样品作为对照。对于CD4+T细胞，激活优选通过评价T细胞增殖检测。对于CD8+T细胞，激活优选通过评价细胞溶解活性检测。比无病患者中高至少两倍的增殖水平和/或至少高20％的细胞溶解活性指示患者中存在与WT1表达相关的癌症。
如上文所指出的，癌症也可以，或者备选地，根据生物学样品中编码WT1蛋白的mRNA的水平检测。例如，在聚合酶链式反应(PCR)为基础的测定中，可以使用至少两个寡核苷酸引物，以扩增来自生物学样品的部分WT1 cDNA，其中至少一个寡核苷酸引物是编码WT1蛋白的多核苷酸特异性的(即与之杂交)。然后分离扩增的cDNA并利用本领域公知的技术如凝胶电泳检测。
同样地，与编码WT1多肽的多核苷酸特异性杂交的寡核苷酸探针可用于杂交测定以检测生物学样品中编码WT1蛋白的多核苷酸的存在。
为允许测定条件下的杂交，寡核苷酸引物和探针应当包括与编码本发明的WT1蛋白的多核苷酸的部分具有至少约60％，优选至少约75％而更优选至少约90％同一性的寡核苷酸序列，所述部分长度至少10个核苷酸，并且优选至少20个核苷酸。优选地，寡核苷酸引物和/或探针在如上文所限定的中度严谨条件下与编码本文所述的多肽的多核苷酸杂交。通常可用于本文描述的诊断方法的寡核苷酸引物和/或探针优选长度至少10-40个核苷酸。在优选的实施方案中，寡核苷酸引物包括具有如本文公开的序列的DNA分子的至少10个连续的核苷酸，更优选至少15个连续的核苷酸。基于PCR的测定和杂交测定的技术都是本领域公知的(参见如Mullis等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，51263，1987；Erlich ed.，PCR Technology，Stockton Press，NY，1989)。
一个优选的测定法使用RT-PCR，其中PCR与逆转录联合应用。典型地，从生物学样品如生检组织中提取RNA，并逆转录产生cDNA分子。利用至少一个特异性引物的PCR扩增产生cDNA分子，它可以利用如凝胶电泳分离并观察。扩增可对取自测试患者的和取自未患癌症的个体的生物学样品进行。扩增反应可对跨越两个数量级的数个cDNA稀释液进行。与非癌样品的相同稀释液相比，测试患者样品数个稀释液中增加两倍或更多的表达典型地被认为是阳性的。
在本发明的另一个方面，细胞培养技术可以与，例如，实时PCR联合使用以提供检测表达WT1抗原的转移细胞的更加灵敏的工具。在生物学样品，例如骨髓样品、外周血以及小针吸取样品中检测WT1相关癌细胞是具有以WT1表达相关的癌症的患者诊断和预后所需要的。
由表面细胞标志特异的单克隆抗体或四聚体抗体复合物涂敷的免疫磁珠可用来首先富集或正选择样品中的癌细胞。可利用各种商业上可得的试剂盒，包括Dynabeads_Epithelial Enrich(Dynal Biotech，Oslo，Norway)、StemSepTM(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，BC)和RosetteSep(StemCell Technologies)。熟练技术人员将会意识到也可利用其它方法学和试剂盒富集或正选择目的细胞群。Dynabeads_Epithelial Enrich含由两种表达在正常和赘生上皮组织上的糖蛋白膜抗原特异性的mAb涂敷的磁珠。可向样品中添加涂敷的珠子，然后将样品施加到磁铁上，由此捕获与珠子结合了的细胞。洗涤掉多余的细胞，并洗脱磁力分离的细胞用于进一步的分析。
RosetteSep可用于直接从血样中富集细胞，并且包括靶向多种不利细胞并将它们与样品中存在的红细胞(RBC)上的血型糖蛋白交联形成玫瑰花结的四聚体抗体混合物。当在Ficoll离心时，靶向的细胞与游离RBC一起沉淀。消耗混合物中抗体的组合决定了要除去哪种细胞以及随后要回收哪种细胞。可利用的抗体包括，但不限于CD2，CD3，CD4，CD5，CD8，CD10，CD11b，CD14，CD15，CD16，CD19，CD20，CD24，CD25，CD29，CD33，CD34，CD36，CD38，CD41，CD45，CD45RA，CD45RO，CD56，CD66B，CD66e，HLA-DR，IgE和TCRαβ。
在另一个实施方案中，本文描述的组合物可用作癌症进展的标志物。在该实施方案中，可随着时间推移进行如上文所述的诊断WT1表达相关癌症的测定法，并评价反应性多肽或多核苷酸水平的改变。例如，可以在为期6个月到1年的时期内每隔24-72小时进行所述测定，之后根据需要进行。一般，癌症在检测到WT1多肽或多核苷酸水平随着时间增加的那些患者中进展。相反，当反应性多肽或多核苷酸的水平随着时间保持稳定或下降时，癌症不进展。
可直接在肿瘤上进行某些体内诊断测定。一种此测定包括用结合剂接触肿瘤细胞。然后可以直接或间接地通过报告基团检测结合了的结合剂。此类结合剂也可用于组织学应用。备选地，多核苷酸探针可用在此类应用中。
本发明进一步提供了可用于任何一种上述诊断方法的试剂盒。此类试剂盒典型地包括进行诊断测定所必需的两种或更多的组分。组分可以是化合物、试剂、容器和/或设备。例如，试剂盒中的一种容器可以含有与WT1蛋白特异性结合的单克隆抗体或其片断。提供的此类抗体或片断可连接于如上文所述的支持材料。一个或多个附加容器可装有测定用的成分如试剂或缓冲液。此类试剂盒也可以，或者备选地，含有如上文所述的含适于直接或间接检测抗体结合的检测试剂。
备选地，可设计试剂盒检测生物学样品中编码WT1蛋白的mRNA的水平。此类试剂盒一般包括至少一种如上文所述的与编码WT1蛋白的多核苷酸杂交的寡核苷酸探针或引物。此寡核苷酸可用在例如PCR或杂交测定中。此类试剂盒中可存在包括便于编码WT1蛋白的多核苷酸的检测的第二寡核苷酸和/或诊断试剂或容器的额外组分。
下列实施例是提供用于举例说明而不是用于限制的。
实施例实施例1血液恶性疾病患者中针对WT1的免疫应答的鉴定该实施例举例说明了血液恶性疾病患者中既有免疫应答的鉴定。
为评价患者中已经存在的WT1特异性抗体应答的存在，利用蛋白质印迹分析分析了来自急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓样白血病(CML)以及重型再生障碍性贫血患者的血清。测试血清与来自人类白血病细胞系K562(American Type CultureCollection，Manassas，VA)的WT1免疫沉淀的能力。在每种情况下，通过凝胶电泳分离免疫沉淀物，转移到膜上，并用抗WTA1抗体WT180(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)探测。这种蛋白质印迹分析可鉴定血液恶性疾病患者中潜在的WT1特异性抗体。表明AML患者结果的代表性蛋白质印迹显示于图2。免疫沉淀反应中利用患者血清产生的52kD蛋白被WT1特异性抗体识别。该52kD蛋白迁移与阳性对照相同的大小。
额外研究分析了AML和CML患者血清中全长和截短WT1蛋白的抗体的存在。将代表人类WT1/全长(aa 1-449)、N-末端(aa 1-249)(WT1/N-末端)和C-末端(aa 267-449)(WT1/C-末端)区的CDNA构建物亚克隆到修饰的pET28载体中。WT1/全长和WT1/N-末端蛋白作为Ra12融合蛋白表达。Ra12为分泌的命名为MTB32B的结核分枝杆菌蛋白的C-末端片断(Skeiky等，Infect Immun.67；3998，1999)。将Ra12-WT1/全长融合区克隆到组氨酸标签修饰的pET28载体的组氨酸标签的3’端。将WT1/N-末端区亚克隆到修饰的pET28载体中，其具有5’组氨酸标签，接着是硫氧还蛋白(TRX)-WT1/N-末端融合区，接着是3’组氨酸标签。将WT1/C-末端编码区亚克隆到修饰的无融合伴侣、仅含5’和3’组氨酸标签、接着是凝血酶和EK位点的pET28载体中。
用三个WT1表达构建物转化BL21 pLysS大肠杆菌(Stratagene，La Jolla，CA)，过夜生长，并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导。WT1如下纯化收集细胞并通过在10mM Tris，pH 8.0中与蛋白酶完全抑制剂片(Complete Protease Inhibitor Tablets)(BoehringerMannheim Biochemicals，Indianapolis，IN)在37℃温育继之以重复循环的超生降解进行裂解。用10mM Tris，pH 8.0洗涤内含体两次。然后在镍-次氮基三乙酸树脂(QIAGEN Inc.，Valencia，CA；Hochuli等，Biologically Active Molecules217，1989)上通过金属螯合物亲合层析、接着在Source Q阴离子交换树脂(Amersham Pharmacia Biotech，Upsala，Sweden)上通过层析纯化蛋白。WT1蛋白的身份通过N-末端测序证实。
研究来自原发AML或CML成人患者的血清中WT1特异性Ab的存在。将重组蛋白吸附到TC微孔板上(Nunc，Roskilde，Denmark)。板用PBS/0.5％Tween 20洗涤并用1％BSA/PBS/0.1％Tween 20封阻。洗涤后，添加血清稀释液并于4℃过夜温育。洗涤板子并添加驴抗人IgG-HRP二抗(Jackson-Immunochem，West Grove，PA)，并于室温温育2小时。洗涤板子，与TMB过氧化物酶底物溶液温育(Kirkegaardand Perry Laboratories，MA)，由1N H2SO4终止，并立即读数(Cyto-Fluor 2350；Millipore，Bedford，MA)。
对于血清学调查，通过ELISA对从1∶50到1∶20,000范围内的人类血清系列稀释液进行测试。阳性反应定义为超过来自正常供体(n＝96)血清平均OD值3个(WT1/全长，WT1C-末端)标准偏差的1∶500稀释血清的OD值。由于正常供体中较高的对WT1/N-末端蛋白的背景，WT1/N-末端的阳性反应定义为超过来自正常供体血清平均OD值4个标准偏差的1∶500稀释血清的OD值。为验证患者的Ab应答是针对WT1而非蛋白的Ra12或TRX融合部分或者可能的大肠杆菌污染蛋白，以相似的方式纯化只包括Ra12和TRX蛋白的对照。从分析中排除对Ra12和/或TRX蛋白表现出反应性的样品。
为评价对WT1免疫的存在，测定了正常个体和白血病患者的血清中针对重组全长和截短WT1蛋白的Ab。抗体反应性通过针对WT1/全长蛋白、WT1/N-末端蛋白和WT1/C-末端蛋白的ELISA反应性分析。
96个正常供体中仅有2个具有与WT1/全长蛋白反应的血清抗体(图18)。那些个体中一个具有WT1/N-末端蛋白抗体，而一个具有WT1/C-末端蛋白抗体。相反，63个AML患者中有16个(25％)具有与WT1/全长蛋白反应的血清抗体。作为显著的对照，63个患者中只有2个(3％)具有WT1/C-末端蛋白反应性。81个CML患者中有15个(19％)具有与WT1/全长蛋白反应的血清抗体且81个患者中有12个(15％)具有与WT1/N-末端蛋白反应的血清抗体。81个患者中只有3个(3％)具有WT1/C-末端蛋白的反应性(图16和17)。
这些数据证明对于WT1的Ab应答在某些AML和CML患者中是可检测的。白血病患者中较高的抗体发生率为提供了强有力的有关针对WT1蛋白的免疫是作为患者具有表达或者有时表达WT1的恶性肿瘤的结果证据。并非局限于特定的理论，我们相信观察到针对WT1的抗体应答最有可能因患者对其自身白血病细胞上WT1免疫的结果，并且提供了尽管是“自身”蛋白，WT1可以产生免疫原性的直接证据。
针对WT1抗体的存在意味着并发的辅助T细胞应答也存在于相同的患者中。WT1为内部蛋白。因而，就白血病治疗而言，CTL应答很有可能是最有效的并且是最有毒的免疫武器。因而，这些数据提供了针对WT1的治疗性疫苗将能够引发针对WT1的免疫应答的证据。
检测的多数抗体与N-末端内的表位具有反应性，而仅有小亚群的患者表现出对C-末端微弱的抗体应答。这与动物模型中的观察结果一致，其中用来自N-末端的肽免疫引发了抗体、辅助T细胞和CTL应答，而没有一个测试的来自C-末端的肽引发抗体或T细胞应答(Gaiger等，Blood 961334，2000)。
实施例2在表达WT1的细胞系免疫的小鼠中针对WT1的抗体的诱导该实施例举例说明了表达WT1的细胞体内诱导WT1特异性抗体应答的用途。
白血病患者中针对WT1的既有抗体的检测强烈暗示了有可能对WT1蛋白免疫以引发对WT1的免疫性。为测试对WT1的免疫性是否可通过免疫接种产生，小鼠用TRAMP-C，一种起源于B6的WT1阳性肿瘤细胞系注射。简要地，雄性B6小鼠用5×106TRAMP-C细胞皮下免疫，并用5×106细胞以3周的间隔加强两次。末次免疫后3周，获取血清并用25μMβ-2-巯基乙醇、200单位青霉素每ml、10mML-谷氨酰胺和10％胎牛血清在RPMI 1640培养基(GIBCO)中制备脾单细胞悬液。
在TRAMP-C免疫后，在免疫动物中可检测到WT1特异性抗体应答。代表性的蛋白质印迹显示于图3。这些结果表明WT1蛋白免疫可引发针对WT1蛋白的免疫应答。
实施例3WT1肽免疫的小鼠中TH和抗体应答的诱导本实施例举例说明了用WT1肽免疫引发WT1特异性免疫应答的能力。
根据Tsites程序(Rothbard和Taylor，EMBO J.793-100，1988；Deavin等，Mol.Immunol.33145-155，1996)鉴定了适于引发Ab和增殖性T细胞应答的肽，该程序查找具有引发Th应答潜力的肽基序。合成并测序了表I中所示的肽。
表IWT1肽

有关免疫，肽如下分组
组A 人类p6-2210.9mg于1ml中(10μl＝100μg)p117-139人/小鼠7.6mg于1ml中(14μl＝100μg)人类p244-2624.6.mg于1ml中(22μl＝100μg)组B p287-301人/小鼠7.2mg于1ml中(14μl＝100μg)小鼠p299-3136.6.mg于1ml中(15μl＝100μg)p421-435人/小鼠3.3mg于1ml中(30μl＝100μg)对照 (FBL肽100μg)+CFA/IFA对照 (CD45肽100μg)+CFA/IFA组A含存在于WT1氨基端(外显子1)的肽，而组B含存在于羧基端的肽，其包含与其它DNA-结合蛋白具有同源性的4个锌指区。在组B中，p287-301和p299-313来自于外显子7，锌指1，而p421-435来自于外显子10，锌指IV。
B6小鼠用一组WT1肽或用对照肽免疫。肽溶于1ml无菌水中用于注射，而B6小鼠以3周的间隔免疫3次。所用的佐剂为CFA/IFA、GM-CSF和Montinide。然后如实施例1和2所述确定WT1特异性抗体的存在，并利用标准胸苷掺入测定法评价增殖性T细胞应答，其中细胞在抗原存在下培养，并且通过测量掺入的放射活性评价增殖(Chen等，Cancer Res.541065-1070，1994)。特别地，淋巴细胞以每孔2×105细胞培养于具有4×105辐照(3000拉德)的同系脾细胞和指定肽的96孔板中。
用命名为组A的肽组免疫小鼠引发了针对WT1的抗体应答(图4)。在疫苗B免疫后未检测到抗体，这与用疫苗B免疫缺乏辅助T细胞应答一致。P117-139引发增殖性T细胞应答(图5A-5C)。刺激指数(SI)在8到72之间变化。其它肽(P6-22和P299-313)也显示引发增殖性T细胞应答。用P6-22免疫产生2.3的刺激指数(SI)，而用P299-313免疫产生3.3的SI。阳性对照包括ConA刺激的T细胞，还有用已知抗原如CD45和FBL刺激的T细胞，以及同种异体T细胞系(DeBruijn等，Eur.J.Immunol.212963-2970，1991)。
图6A和6B显示了对疫苗A(图6A)和疫苗B(图6B)3个肽中每一个观察到的增殖应答。疫苗A引发针对免疫肽p6-22和p117-139的增殖性T细胞应答，刺激指数(SI)在3和8之间变化(bulk lines)。未检测到针对p244-262的增殖性应答(图6A)。
随后仅利用p6-22和p117-139作为单肽刺激进行体外刺激。用p117-139刺激疫苗A特异性T细胞系导致针对p117-139的增殖，对p6-22无应答(图7A)。来自该株系的克隆具有对p117-139的特异性(图7B)。作为对照，用p6-22刺激疫苗A特异性T细胞系导致针对p6-22的增殖，对p117-139无应答(图7C)。来自该株系的克隆具有对p6-22的特异性(图7D)。
这些结果表明用WT1肽免疫接种能够引发针对WT1蛋白的抗体应答和针对免疫肽的增殖性T细胞应答。
实施例4WT1肽免疫的小鼠中CTL应答的诱导该实施例举例说明了WT1肽引发CTL免疫的能力。
利用BIMAS HLA肽结合预测分析(Parker等，J.Immunol.152163，1994)鉴定了具有适于结合I类MHC基序的肽(9-mers)。此分析鉴定的肽显示于表II-XLIV中。在每一个表中，分值反应了肽对所示的MHC分子理论上的结合亲和力(半数解离时间)。表中还显示了由Rammensee等，Immunogenetics 41178-228，1995描述的确定的肽结合基序，特此全文并入该文献作为参考。HLA-B14的肽结合基序描述在DiBrino等，J.Biol.Chem.26923426-23434，1994中，也特此全文并入作为参考。肽位置缩写为P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8和P9。
利用Tsites程序(Rothbard和Taylor，EMBO J.793-100，1988；Deavin等，Mol. Immunol.33145-155，1996)(一种查找具有引发Th应答潜力的肽基序的程序)鉴定的肽进一步显示在图8A和8B以及表XLV中。
表II有关人类WT1肽对人类HLA A1结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果(HLA-A1肽结合基序锚定残基为位置3(P3)中的D或E、P9中的Y，辅助锚点为P4中的P以及P7中的L)

表III有关人类WT1肽与人类HLA A0201结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-A0201肽结合基序锚定残基为P2中的L或M、P9中的V或L，辅助锚点为P6中的V)

表IV有关人类WT1肽与人类HLA A0205结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-A0205肽结合基序锚定残基为P9中的L，辅助锚点为P2中的V、L、I、M以及P6中的I、V、L、A)

表V有关人类WT1肽与人类HLA A24结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-A24肽结合基序锚定残基为P2中的Y、P9中的I、L或F，辅助锚点为P5中的I或V以及P6中的F)

表VI有关人类WT1肽与人类HLA A3结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-A3肽结合基序锚定残基为P2中的L、V或M，P9中的K、Y或F，辅助锚点为P3中的F或Y，P6中的I、M、F、V或L，P7中的I、L、M、F)

表VII有关人类WT1肽与人类HLA A68.1结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-A68.1肽结合基序锚定残基为P2中的V或T，P9中的R或K)

表VIII有关人类WT1肽与人类HLA A1101结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-A1101肽结合基序锚定残基为P9中的K，辅助锚点为P2中的V、I、F、Y，P3中的M、L、F、Y、I、A，P7中的L、I、Y、V或F)

表IX有关人类WT1肽与人类HLA A3101结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-A3101肽结合基序锚定残基为P9中的R，辅助锚点为P2中的L、V、Y或F，P3中的F、L、Y、W，P6中的L、F、V、I)

表X有关人类WT1肽与人类HLA A3302结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-A3302肽结合基序锚定残基为P9中的R，辅助锚点为P2中的A、I、L、F、Y或V)

表XI有关人类WT1肽与人类HLA B14结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B14肽结合基序锚定残基为P2中的R，P3中的Y，P5中的R，P9中的L。这4个锚定残基中的3个已足够)

表XII有关人类WT1肽与人类HLA B40结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B40肽结合基序锚定残基为P2中的E，P9中的L、W、M或A；辅助锚点为P3中的F、I或V)

表XIII有关人类WT1肽与人类HLA B60结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B60肽结合基序锚定残基为P2中的E，P9中的L；辅助锚点为P7中的I或V)

表XIV有关人类WT1肽与人类HLA B61结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B61肽结合基序锚定残基为P2中的E，P9中的V；辅助锚点为P3中的F、I、L、V、Y、W，P6中的I)

表XV有关人类WT1肽与人类HLA B62结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B62肽结合基序锚定残基为P2中的Q或L，P9中的F或Y；辅助锚点为P5中的I或V)

表XVI有关人类WT1肽与人类HLA B7结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B7肽结合基序锚定残基为P2中的P，P9中的L或F；辅助锚点为P2中的R)

表XVII
有关人类WT1肽与人类HLA B8结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B8肽结合基序锚定残基为P3中的K，P5中的K或R，P9中的L)

表XVIII有关人类WT1肽与人类HLA B2702结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B2702肽结合基序锚定残基为P2中的R；P9中的F、Y、I、L或W)

表XIX有关人类WT1肽与人类HLA B2705结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B2705肽结合基序锚定残基为P2中的R；P9中的L或F；在P9中也发现用于天然加工表位的Y、R、H和K)

表XX有关人类WT1肽与人类HLA B3501结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B3501肽结合基序锚定残基为P2中的P；P9中的Y、F、M、L或I)

表XXI有关人类WT1肽与人类HLA B3701结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B3701肽结合基序锚定残基为P8中的F、M或L；P9中的I或L；辅助锚点为P2中的D、E以及P5中的V、I)

表XXII有关人类WT1肽与人类HLA B3801结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B3801肽结合基序锚定残基为P9中的F或L；辅助锚点为P2中的H以及P3中的D或E)

表XXIII有关人类WT1肽与人类HLA B3901结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B3901肽结合基序锚定残基为P2中的R或H；P9中的L；辅助锚点为P6中的I、V或L)

表XXIV有关人类WT1肽与人类HLA B3902结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B3902肽结合基序锚定残基为P2中的K或Q；P9中的L；辅助锚点为P5中的I、L、F或V)

表XXV有关人类WT1肽与人类HLA B4403结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B4403肽结合基序锚定残基为P2中的E；P9中的Y或F)

表XXVI有关人类WT1肽与人类HLA B5101结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B5101肽结合基序锚定残基为P2中的A、P或G；P9中的F或I)

表XXVII有关人类WT1肽与人类HLA B5102结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B5102肽结合基序锚定残基为P2中的P、A或G；P9中的I或V；辅助锚点为P3中的Y)

表XXVIII有关人类WT1肽与人类HLA B5201结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B5201肽结合基序锚定残基为P8中的I或V；P9中的I或V；辅助锚点为P2中的Q，P3中的F、Y或W，P5中的L、I或V)

表XXIX有关人类WT1肽与人类HLA B5801结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-B5801肽结合基序锚定残基为P2中的A、S或T；P9中的F或W；辅助锚点为P4中的P、E或K，P5中的V、I、L、M或F)

表XXX有关人类WT1肽与人类HLA CW0301结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-CW0301肽结合基序锚定残基为P9中的L、F、M或I；辅助锚点为P3中的V、I、Y、L或M，P4中的P，P6中的F或Y)

表XXXI有关人类WT1肽与人类HLA CW0401结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-CW0401肽结合基序锚定残基为P2中的Y、P或F；P9中的L、F或M；辅助锚点为P6中的V、I或L)

表XXXII有关人类WT1肽与人类HLA CW0602结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-CW0602肽结合基序锚定残基为P9中的L、I、V或Y；辅助锚点为P5中的I、L、F或M，P6中的V、I或L)

表XXXIII有关人类WT1肽与人类HLA CW0702结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果(HLA-CW0702肽结合基序锚定残基为P9中的Y、F或L；辅助锚点为P2中的Y或P，P5中的V、Y、I、L、F或M，P6中的V，I，L或M6)

表XXXIV有关人类WT1肽与小鼠MHC I类Db结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果

表XXXV有关人类WT1肽与小鼠MHC I类Dd结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果

表XXXVI有关人类WT1肽与小鼠MHC I类Kb结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果

表XXXVII有关人类WT1肽与小鼠MHC I类Kd结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果

表XXXVIII有关人类WT1肽与小鼠MHC I类Kk结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果

表XXXIX有关人类WT1肽与小鼠MHC I类Ld结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果

表XI有关人类WT1肽与牛HLA A20结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果

表XLI有关小鼠WT1肽与人类HLA A0201结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果

表XLII有关小鼠WT1肽与小鼠MHC I类Db结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果

表XLIII有关小鼠WT1肽与小鼠MHC I类Kb结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果

表XLIV有关小鼠WT1肽与小鼠MHC I类Kd结合的BIMAS HLA肽结合预测分析的结果

表XLV有关能够引发辅助T细胞应答的人类WT1肽的TSites肽结合预测分析结果

选择某些CTL肽(表XLVI中所示)用于进一步的研究。对于表XLVI中的每一个肽，提供了利用BIMAS HLA肽结合预测分析获得的分值。
表XLVIWT1肽序列和HLA肽结合预测

与C57Bl/6鼠MHC的肽结合利用白血病细胞系RMA-S证实，如Ljunggren等，Nature 346476-480，1990所述。简要地，RMA-S细胞在补充有1％FCS的完全培养基中于26℃培养7天。向24孔板的每个孔中添加总计106RMA-S细胞，并单独或者与指定的肽(25ug/ml)在完全培养基中于26℃培养16小时并于37℃另外培养3小时。然后细胞洗涤三次并用异硫氰酸荧光素偶联的抗-Db或抗-Kb抗体(PharMingen，San Diego，CA)染色。标记的细胞洗涤两次，重悬并固定于具有1％聚甲醛的500ul PBS中，并在流式细胞仪(Becton-Dickinson FACSCalibur_)中进行荧光强度分析。RMA-S细胞表面Db或Kb分子增加的百分比通过与肽温育的细胞较之于仅在培养基中温育的细胞的平均荧光强度的增加来测量。
小鼠用能够与鼠I类MHC结合的肽免疫。免疫后，在体外刺激脾细胞并测试其裂解与WT1肽温育的靶标的能力。CTL用标准铬释放测定法评价(Chen等，Cancer Res.541065-1070，1994)。106靶细胞与150μCi Na51Cr在存在或不存在特定肽时于37℃温育90分钟。细胞洗涤三次并重悬于具有5％胎牛血清的RPMI中。对于该测定，10451Cr-标记的靶细胞与不同浓度的效应细胞在终体积200μl的U型平底96孔板中温育。于37℃4到7小时后取出上清，并通过以下公式确定特异性裂解百分数％特异性裂解＝100×(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)。
提供于表XLVII中的结果表明有些WT1肽能够与I类MHC分子结合，这是产生CTL所必需的。而且，许多所述肽能够引发肽特异性CTL(图9A和9B)，如利用铬释放测定法所确定的。在人类p10-18、人类p136-144、小鼠p136-144和p235-243 CTL肽免疫后，产生肽特异性CTL细胞系并建立克隆。这些结果表明肽特异性CTL能够杀死表达WT1的恶性细胞。
表XLVIIWT1 CTL肽与小鼠B6 I类抗原的结合

实施例5利用WT1多肽在小鼠中引发WT1特异性CTL本实施例举例说明了代表性的WT1多肽引发能够杀死WT1阳性肿瘤细胞系的CTL的能力。
如上文所述利用TSITES和BIMAS HLA肽结合预测分析鉴定了P117-139，一种具有适于与I类和II类MHC结合的基序的肽。如实施例3中所述免疫小鼠。免疫后，在体外刺激脾细胞并测试其裂解与WT1肽温育的靶标以及裂解WT1阳性和阴性肿瘤细胞的能力。CTL利用标准铬释放测定法评价。示于图10A-10D中的结果表明P117能够引发WT1特异性CTL，这能够杀死WT1阳性肿瘤细胞，然而未观察到WT1阴性细胞的杀伤。这些结果证明肽特异性CTL事实上杀死表达WT1的恶性细胞，且疫苗和T细胞治疗能够有效地抵抗表达WT1的恶性肿瘤。
利用9-mer的I类MHC结合肽p136-144、p225-233、p235-243以及23-mer的肽p117-139进行类似的免疫。免疫后，用4个肽中的每一个在体外刺激脾细胞，并测试其裂解与WT1肽温育的靶标的能力。产生了p136-144、p235-243和p117-139特异性的CTL，但p225-233未产生。肽p235-243和p117-139的CTL数据显示在图11A和11B中。未绘出肽p136-144和p225-233的数据。
CTL裂解要求靶WT1肽被内源性加工并结合肿瘤细胞I类MHC分子被提呈。测试了上述WT1肽特异性CTL裂解WT1阳性和阴性肿瘤细胞系的能力。p235-243特异性的CTL裂解与p235-243肽温育的靶标，但不能裂解表达WT1蛋白的细胞系(图11A)。作为显著的对比，p117-139特异性的CTL裂解与p117-139肽温育的靶标，并且也裂解表达WT1的恶性细胞(图11B)。作为阴性对照，p117-139特异性的CTL不裂解WT1阴性EL-4(文中也称之为E10)。
WT1特异性裂解的特异性通过冷靶抑制证实(图12A-12B)。效应细胞按多种效靶比涂板于96孔U-型平底板中。添加10倍过量的(与热靶相比)包被所示肽的无51Cr标记的靶。最后，每孔添加10451Cr-标记的靶细胞，并将板于37℃温育4小时。每孔的总体积为200μl。
p117-139特异性CTL对TRAMP-C的裂解被与相关肽p117-139温育的EL-4由58％封阻到36％，但不被与无关肽温育的EL-4封阻(图12A)。同样地，BLK-SV40的裂解被与相关肽p117-139温育的EL-4由18％封阻到0％(图12B)。结果证实WT1肽特异性的CTL通过识别加工的WT1特异性地杀死恶性细胞。
具有推测的CTL基序的数个片断包含在p117-139之内。为确定CTL表位的确切序列，合成了位于p117-139内的所有潜在的9-mer肽(表XLVIII)。这些肽中的两个(p126-134和p130-138)被证明与H-2bI类分子结合(表XLVIII)。通过p117-139免疫产生的CTL裂解与p126-134和p130-138温育的靶标，而不裂解与位于p117-139内的其它9-mer肽温育的靶标(图13A)。
用p126-134或者p130-138再刺激p117-139特异性的CTL细胞系。用p126-134或p130-138再刺激后，两个T细胞系都显示了肽特异性裂解，但只有p130-138特异性的CTL表现出WT1阳性肿瘤细胞系的裂解(图13B和13C)。因而p130-138似乎是天然加工的表位。
表XLVIII位于p117-139之内的WT1 CTL 9mer肽与小鼠B6 I类抗原的结合

实施例6小鼠肿瘤细胞系中WT1特异性MRNA的鉴定本实施例举例说明了利用RT-PCR在细胞和细胞系中检测WT1特异性的mRNA。
单核细胞通过密度梯度离心分离，并立即冷冻且贮存于-80oC直至通过RT-PCR分析WT1特异性mRNA的存在。RT-PCR一般如Fraizer等，Blood 864704-4706，1995所述进行。根据标准操作从107细胞中提取总RNA。将RNA沉淀重悬于25μL焦碳酸二乙酯处理过的水中，并直接用于逆转录。锌指区(外显子7到10)作为330bp的小鼠cDNA通过PCR扩增。扩增在热循环仪中在一轮或必要时两轮相继的PCR期间进行。利用的是50μl总反应体积中的AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)、2.5mM MgCl2和20pmol各种引物。20μL小份的PCR产物在染有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶中进行电泳。凝胶用Polaroid胶卷(Polaroid 667，Polaroid Ltd.，Hertfordshire，England)拍照。根据Kwok和Higuchi，Nature339237-238，1989的建议预防交叉污染。阴性对照包括cDNA试剂和PCR试剂与取代每个实验中的cDNA的水的混合物。为避免假阴性，对每个样品利用β-肌动蛋白引物通过对照PCR评价完整RNA的存在和足够cDNA的产生。将用这些引物不能扩增的样品从分析中排除。
用于扩增小鼠细胞系中WT1的引物为P1151458-14785’CCCAGG CTG CAA TAA GAG ATA 3’(正向引物；SEQ ID NO21)以及P1161767-17875’ATG TTG TGA TGG CGG ACC AAT 3’(反向引物；SEQ ID NO22)(参见Inoue等，Blood 882267-2278，1996；Fraizer等，Blood 864704-4706，1995)。
对照反应中所用的β肌动蛋白引物为5’GTG GGG CGC CCCAGG CAC CA 3’(有义引物；SEQ ID NO23)以及5’GTC CTT AATGTC ACG CAC GAT TTC 3’(反义引物；SEQ ID NO24)用于扩增人类WT1的引物包括P117954-9745’GGC ATCTGA GAC CAG TGA GAA 3’(SEQ ID NO25)以及P1181434-14145’GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3’(SEQ ID NO5)。对于巢式RT-PCR，引物可以是P1191023-10435’GCT GTC CCA CTTACA GAT GCA 3’(SEQ ID NO26)以及P1201345-13655’TCAAAG CGC CAG CTG GAG TTT 3’(SEQ ID NO27)。
表XLVIII显示了小鼠肿瘤细胞系WT1 PCR的结果。在表IV中，(+++)指示第一步RT PCR中强烈的WT1 PCR扩增产物，(++)指示通过第一步WT1 RT PCR可检测的WT1扩增产物，(+)指示只有在第二步WT1 RT PCR中才可检测的产物，而(-)指示WT1 PCR阴性。
表XLIX小鼠肿瘤细胞系中WT1 mRNA的检测

实施例7大肠杆菌中WT1 TRX融合构建物的表达截短的WT1开放读框(WT1B)由以下引物进行PCR扩增起始于第2位氨基酸的正向引物P-37(SEQ ID NO.342)5′ggctccgacgtgcgggacctg 3′Tm 64℃在终止密码子后产生EcoRI位点的反向引物P-23(SEQ ID NO.343)5′gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3′Tm63℃PCR在下述条件下进行10μl 10X Pfu缓冲液1μl 10mM dNTPs2μl 10μM各种寡聚物83μL无菌水1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)50ng DNA(pPDM FL WT1)96℃2分钟96℃20秒63℃15秒 72℃3分钟×40个循环72℃4分钟PCR产物用EcoRI限制性酶消化、凝胶纯化、然后克隆进pTrx2H载体(修饰的pET28载体，在N-末端有Trx融合物以及在Trx融合物周围有两个His标签。Trx融合之后存在凝血酶和肠激酶的蛋白酶切位点)。pTrx2H构建物用StuI和EcoRI限制性酶消化。正确的构建物通过DNA测序分析确认，然后转化到BL21(DE3)pLys S和BL21(DE3)CodonPlus表达宿主细胞中。
实施例8大肠杆菌中WT1 A HIS标签融合构建物的表达WT1的N-末端开放读框(WT1A)由下列引物进行PCR扩增起始于第2位氨基酸的正向引物
P-37(SEQ ID NO.344)5′ggctccgacgtgcgggacctg 3′Tm 64℃在第249位氨基酸后加入的人工终止密码子后产生EcoRI位点的反向引物PDM-335(SEQ ID NO.345)5′gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3′Tm 64℃PCR在下述条件下进行10μl 10X Pfu缓冲液1μl 10mM dNTPs2μl 10μM各种寡聚物83μL无菌水1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)50ng DNA(pPDM FL WT1)96℃2分钟96℃20秒63℃15秒 72℃1分20秒×40个循环72℃4分钟PCR产物用EcoRI限制性酶消化、凝胶纯化、然后克隆进已用Eco72I和EcoRI限制性酶消化的pPDM(一种修饰的pET28载体，具有符合读框的His标签)。PCR产物也被转染到pTrx 2H载体中。pTrx2H构建物用StuI和EcoRI限制性酶消化。正确的构建物通过DNA测序分析确认，然后转化到BL21(DE3)pLys S和BL21(DE3)CodonPlus表达宿主细胞中。
实施例9大肠杆菌中WT1 B HIS标签融合构建物的表达截短的WT1开放读框(WT1A)由以下引物进行PCR扩增起始于第250位氨基酸的正向引物PDM-346(SEQ ID NO.346) 5′cacagcacagggtacgagagc 3′Tm58℃
在终止密码子后产生EcoRI位点的反向引物P-23(SEQ ID NO.347)5′gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3′Tm63℃PCR在下述条件下进行10μl 10X Pfu缓冲液1μl 10mM dNTPs2μl 10μM各种寡聚物83μL无菌水1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)50ng DNA(pPDM FL WT1)96℃2分钟96℃20秒63℃15秒 72℃1分30秒×40个循环72℃4分钟PCR产物用EcoRI限制性酶消化、凝胶纯化、然后克隆进已用Eco72I和EcoRI限制性酶消化的pPDM(一种修饰的pET28载体，具有符合读框的His标签)。PCR产物也被转染到pTrx 2H载体中。pTrx2H构建物用StuI和EcoRI限制性酶消化。正确的构建物通过DNA测序分析确认，然后转化到BL21(DE3)pLys S和BL21(DE3)CodonPlus表达宿主细胞中。
对于实施例7-9，公开了下列SEQ ID NOSEQ ID NO.327为测定的Trx_WT1_B的cDNA序列SEQ ID NO.328为测定的Trx_WT1_A的cDNA序列SEQ ID NO.329为测定的Trx_WT1的cDNA序列SEQ ID NO.330为测定的WT1_A的cDNA序列SEQ ID NO.331为测定的WT1_B的cDNA序列SEQ ID NO.332为推测的由SEQ ID No.327编码的氨基酸序列
SEQ ID NO.333为推测的由SEQ ID No.328编码的氨基酸序列SEQ ID NO.334为推测的由SEQ ID No.329编码的氨基酸序列SEQ ID NO.335为推测的由SEQ ID No.330编码的氨基酸序列SEQ ID NO.336为推冽的由SEQ ID No.331编码的氨基酸序列实施例10大肠杆菌中表达的截短形式的WT1三个WT1读框由以下引物进行PCR扩增对于WT1 Tr2PDM-441(SEQ ID NO.348)5′cacgaagaacagtgcctgagcgcattcac3′Tm 63℃PDM-442(SEQ ID NO.349)5′ccggcgaattcatcagtataaattgtcactgc3′TM 62℃对于WT1 Tr3PDM-443(SEQ ID NO.350)5′caggctttgctgctgaggacgccc 3′Tm64℃PDM-444(SEQ ID NO.351)5′cacggagaattcatcactggtatggtttctcacc Tm 64℃对于WT1 Tr4PDM-445(SEQ ID NO.352)5′cacagcaggaagcacactggtgagaaac 3′Tm 63℃PDM-446(SEQ ID NO.353)5′ggatatctgcagaattctcaaagcgccagc3′TM 63℃PCR在下述条件下进行10μl 10X Pfu缓冲液1μl 10mM dNTPs
2μl 10μM各种寡聚物83μL无菌水1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)50ng DNA(pPDM FL WT1)96℃2分钟96℃20秒63℃15秒 72℃30秒×40个循环72℃4分钟PCR产物用EcoRI限制性酶消化并克隆进已用Eco72I和EcoRI消化的pPDM His(一种修饰的pET28载体，5′端具有符合读框的His标签)。构建物经测序分析证实是正确的，并转化到BL21 pLys S和BL21 CodonPlus细胞或者BLR pLys S和BLR CodonPlus细胞中。
实施例11WT1 C(氨基酸76-437)和WT1 D(氨基酸91-437)在大肠杆菌中的表达WT1 C读框由以下引物进行PCR扩增PDM-504(SEQ ID NO.354)5′cactccttcatcaaacaggaac 3′Tm61℃PDM-446(SEQ ID NO.355)5′ggatatctgcagaattctcaaagcgccagc3′Tm 63℃PCR在下述条件下进行10μl 10X Pfu缓冲液1μl 10mM dNTPs2μl 10μM各种寡聚物83μL无菌水1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)
50ng DNA(pPDM FL WT1)96℃2分钟96℃20秒63℃15秒 72℃2分钟×40个循环72℃4分钟PCR产物用EcoRI限制性酶消化并克隆进已用Eco72I和EcoRI消化的pPDM His中。序列经测序分析确认，然后转化到BLR pLys S和与CodonPlus RP共转化的BLR中。
实施例12通过重叠寡聚物退火合成产生WT1 TR-1实施本实施例测定改变脯氨酸密码子选择对表达的影响。
下列寡聚物对被退火1.PDM-505(SEQ ID NO.356)5′ggttccgacgtgcgggacctgaacgcactgctg 3′PDM-506(SEQ ID NO.357)5′ctgccggcagcagtgcgttcaggtcccgcacgtcggaacc 3′2.PDM-507(SEQ ID NO.358)5′ccggcagttccatccctgggtggcggtggaggctg 3′PDM-508(SEQ ID NO.359)5′cggcagtgcgcagcctccaccgccacccagggatggaa 3′3.PDM-509(SEQ ID NO.360)5′cgcactgccggttagcggtgcagcacagtgggctc 3′PDM-510(SEQ ID NO.361)5′cagaactggagcccactgtgctgcaccgctaac 3′
4.PDM-511(SEQ ID NO.362)5′cagttctggacttcgcaccgcctggtgcatccgcatac 3′PDM-512(SEQ ID NO.363)5′cagggaaccgtatgcggatgcaccaggcggtgcgaagtc 3′5.PDM-513(SEQ ID NO.364)5′ggttccctgggtggtccagcacctccgcccgcaacgcc 3′PDM-514(SEQ ID NO.365)5′ggcggtgggggcgttgcgggcggaggtgctggaccacc 3′6.PDM-515(SEQ ID NO.366)5′cccaccgcctccaccgcccccgcactccttcatcaaacag 3′PDM-516(SEQ ID NO.367)5′ctaggttcctgtttgatgaaggagtgcgggggcggtgga 3′7.PDM-517(SEQ ID NO.368)5′gaacctagctggggtggtgcagaaccgcacgaagaaca 3′PDM-518(SEQ ID NO.369)5′ctcaggcactgttcttcgtgcggttctgcaccaccccag 3′8.PDM-519(SEQ ID NO.370)5′gtgcctgagcgcattctgagaattctgcagat 3′PDM-520(SEQ ID NO.371)5′gtgtgatggatatctgcagaattctcagaatgcg 3′单独组合每个寡聚物对然后退火。然后将各对连接在一起，并且1μl连接混合物用于下述PCR条件10μl 10X Pfu缓冲液
1μl 10mM dNTPs2μl 10μM各种寡聚物83μL无菌水1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)96℃2分钟96℃20秒63℃15秒 72℃30秒×40个循环72℃4分钟PCR产物用EcoRI限制性酶消化并克隆进已用Eco72I和EcoRI消化的pPDM His中。序列经确认并转化到BLR pLys S和与CodonPlus RP共转化的BLR中。
对于实施例10-12，公开了下列SEQ ID NOSEQ ID NO337为确定的WT1_Tr1的cDNA序列SEQ ID NO338为确定的WT1_Tr2的cDNA序列SEQ ID NO339为确定的WT1_Tr3的cDNA序列SEQ ID NO340为确定的WT1_Tr4的cDNA序列SEQ ID NO341为确定的WT1_C的cDNA序列SEQ ID NO342为推测的由SEQ ID No.337编码的氨基酸序列SEQ ID NO343为推测的由SEQ ID No.338编码的氨基酸序列SEQ ID NO344为推测的由SEQ ID No.339编码的氨基酸序列SEQ ID NO345为推测的由SEQ ID No.340编码的氨基酸序列SEQ ID NO346为推测的由SEQ ID No.341编码的氨基酸序列WT1 C序列代表多核苷酸，具有TR2、TR3和TR4编码区。
WT1 TR-1合成序列代表多核苷酸，其中备选密码子取代了天然密码子，产生能够在大肠杆菌中表达WT1 TR-1的多核苷酸。
实施例13
WT1免疫在小鼠中的系统组织病理学和毒理学效果的评价本实施例的目的在于分析多剂量滴定中WT1蛋白免疫在小鼠中的免疫原性和潜在的系统组织病理学和毒理学效果。
用WT1蛋白免疫小鼠的实验设计概述于表L中。
表L小鼠中WT1免疫的实验设计

多剂量滴定(multiple dose titration)研究中(剂量范围从25μg、100μg到1000μg WT1蛋白)利用MPL-SE作为佐剂免疫接种WT1蛋白，在雌性C57/B6小鼠中引发强烈的WT1特异性抗体应答(图19)和细胞性T细胞应答(图20)。
未观察到WT1蛋白免疫的系统组织病理学或毒理学效果。未在下列组织中见到毒性的组织学证据肾上腺、脑、盲肠、结肠、十二指肠、眼、股骨和股骨髓、胆囊、心脏、回肠、空肠、肾脏、喉头、泪腺、肝脏、肺脏、淋巴结、肌肉、食道、卵巢、胰脏、副甲状腺、唾腺、胸骨和胸骨髓、脾脏、胃、胸腺、气管、甲状腺、膀胱及子宫。
特别的重点放在了评价潜在的造血毒性方面。胸骨和股骨髓中的骨髓/红细胞比(myeloid/erythroid ratio)正常。所有可评价的血细胞计数和血液化学(BUN、肌酸酐、胆红素、白蛋白、球蛋白)均在正常范围内(表LI)。
考虑到在某些白血病患者中存在针对WT1的既有的免疫，并且免疫接种WT1蛋白能够在小鼠中引发WT1特异性抗体和细胞性T细胞应答而对正常组织无毒性，这些实验证实了WT1为有效的肿瘤/白血病疫苗。
表LI临床化学和血液学分析表LIWT1剂量滴定研究临床化学和血液学分析

表LIWT1剂量滴定研究临床化学和血液学分析

表LIWT1剂量滴定研究临床化学和血液学分析

表LIWT1剂量滴定研究临床化学和血液学分析

表LI(续)WT1剂量滴定研究临床化学和血液学分析


表LI(续)WT1剂量滴定研究临床化学和血液学分析


表Ll(续)WT1剂量滴定研究临床化学和血液学分析


表LI(续)WT1剂量滴定研究临床化学和血液学分析


缩写WBC白细胞；RBC红细胞；Hg.血红蛋白；HCT血细胞比容；MCV平均红细胞体积；MCH平均红细胞血红蛋白；MCHC平均红细胞血红蛋白浓度；Plt.血小板；Abs.绝对值；Baso嗜碱性粒细胞；Eos嗜曙红细胞；Abs.Bands未成熟嗜中性粒细胞；Polys多形核细胞；Lymph淋巴细胞；Mono单核细胞；BUN血尿素氮。
实施例14通过全基因体外致敏引发人类WT1特异性T细胞应答本实施例证明WT1特异性T细胞应答能够从正常个体的血液产生。
树突细胞(DC)由来自正常供体PBMC的单核细胞培养物通过在含10％人类血清、50ng/ml GMCSF和30ng/ml IL-4的RPMI培养基中生长4-10天分化而来。培养后，DC用M.O.I.为5的重组WT1表达痘苗病毒(Vaccinia virus)感染16小时，或者用M.O.I.为10的重组WT1表达腺病毒感染3天(图21和22)。痘苗病毒通过U.V.辐照失活。CD8+ T细胞利用磁珠通过正选择分离，并且在96孔板中启动致敏培养。培养物每7-10天用感染了腺病毒或痘苗病毒而表达WT1的自体树突细胞再刺激。在3-6个刺激循环后，当用自体的WT1表达树突细胞或成纤维细胞刺激时特异性产生干扰素-γ的CD8+细胞系能够被鉴定。这些细胞系的WT1特异性活性能够在附加的刺激循环后维持。通过Elispot测定证明这些细胞系特异性地识别腺病毒或痘苗WT1感染的自体树突细胞，但不识别腺病毒或痘苗EGFP感染的自体树突细胞(图23)。
实施例15注射用RA12-WT1制剂利用赋形剂稳定冻干品本实施例描述了允许冻干Ra12-WT1完全溶解的制剂。
下列制剂允许重组蛋白Ra12-WT1在冻干干燥后溶解于水性介质中重组Ra12-WT1浓度0.5-1.0mg/ml；缓冲液10-20mM乙醇胺，pH 10.0；1.0-5.0mM半胱氨酸；0.05％吐温-80(聚山梨醇酯-80(Polysorbate-80))；糖10％海藻糖(T5251，Sigma，MO)10％麦芽糖(M9171，Sigma，MO)10％蔗糖(S7903，Sigma，MO)10％果糖(F2543，Sigma，MO)10％葡萄糖(G7528，Sigma，MO)。
发现带糖赋形剂的冻干蛋白比不带糖赋形剂的冻干蛋白显著更能溶。考马斯染色SDS-PAGE分析未表现出溶解物中残留固体的迹象。
实施例16WT1蛋白疫苗制剂本实施例描述了用WT1蛋白和2个不同的佐剂的制剂免疫后诱导WT1特异性免疫应答。
根据本实施例，与MPL-SE组合的WT1蛋白诱导了针对WT1的强烈抗体和干扰素-γ(IFN-γ)应答。下文详细描述的是利用MPL-SE或Enhanzyn作为佐剂由WT1蛋白免疫后在C57/B6小鼠中诱导WT1特异性免疫应答的方法。
C57BL/6小鼠用与MPL-SE或Enhanzyn佐剂组合的20μgrRa12-WT1免疫。一组对照小鼠用无佐剂的rRa12-WT1免疫，而一组仅用生理盐水免疫。给予三次肌内(IM)免疫，间隔三周。末次免疫后2周收集脾脏和血清。血清通过ELISA在涂敷有Ra12-WT1融合物、Ra12或WT1TRX的板上分析抗体应答。在用Ra12-WT1+MPL-SE和Ra12-WT1+Enhanzyn免疫的小鼠中观察到相似水平的IgG2a和IgG1抗体效价。用无佐剂的rRa12-WT1免疫的小鼠表现出较低水平的IgG2a抗体。
CD4应答通过在体外用rRa12-WT1、rRa12或者用WT1肽p6、p117和p287刺激脾细胞后测量干扰素-γ的产量评价。两种佐剂与单独用rRA12-WT1免疫的小鼠相比都增强CD4应答。另外，结果显示rRA12-WT1+MPL-SE比rRA12-WT1+Enhanzyn诱导更强的CD4应答。与由rRA12-WT1+Enhanzyn免疫的小鼠中的1-1.2相比，由rRA12-WT1+MPL-SE免疫的小鼠中IFN-γOD读数范围为1.4-1.6。仅观察到针对p117的肽应答，而且是仅在由rRa12-WT1+MPL-SE免疫的小鼠中。在所有小鼠中都观察到针对阳性对照ConA的强烈的IFN-γ应答。在由生理盐水免疫的阴性对照小鼠中仅观察到针对ConA的应答，表明应答是rRA12-WT1特异性的。
实施例17随机突变WT1文库的构建利用聚合酶链式反应法在8-氧代dGTP和dPTP存在时对人类WT1核酸序列进行随机突变(journal of Molecular Biology 1996；255589-603)。完整未剪接的人类WT1基因于SEQ ID NO380中公开，并且对应的蛋白质序列示于SEQ ID NO404中。利用WT1剪接变体作为PCR反应的模板，并且其在SEQ ID NO381(DNA)和408(蛋白质)中公开。选择条件从而核酸改变的频率引起氨基酸序列中定向的变化，通常为PCR产物的5-30％。然后利用4种正常的dNTP在不存在核苷类似物时扩增突变的PCR产物。将所述PCR产物亚克隆到哺乳动物表达载体和病毒载体中用于免疫。因而该文库含有混合的随机突变WT1克隆群。挑选数个克隆并测序。突变WT1变体的DNA序列在SEQ ID NO377-379中公开，并且推测的这些变体的氨基酸序列示于SEQ ID NO405-407中。这些改变了的序列以及来自文库的其它序列，可用作免疫原诱导更强的针对癌细胞中WT1蛋白的T细胞应答。
实施例18WT1-LAMP融合物的构建利用聚合酶链式反应以及含期望的人类溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP-1)和人类WT1序列剪接变体的接点的合成寡核苷酸构建一式三份融合物。用于这些融合的WT1剪接变体和LAMP-1序列公开在SEQ ID NO381和383中。具体地，将LAMP-1的信号肽(LAMP的碱基对1-87)融合于人类WT1开放读框的5’原始端(prime end)(长度1,290个碱基对)，然后将LAMP-1的跨膜和胞浆结构域(LAMP的碱基对1161到1281)融合于WT1序列的3’原始端。所得WT1-LAMP构建物的序列示于SEQ ID NO382(DNA)和SEQ ID NO409(蛋白质)中。该构建物如此设计从而当其在真核细胞中表达时，信号肽指导该蛋白进入内质网(ER)，在这里LAMP-1的跨膜和胞浆结构域中的定位信号指导该融合蛋白运输到溶酶体场所，此处肽被荷载到II类MHC分子上。
实施例19用于增强I类MHC提呈的WT1-遍在蛋白融合物的构建对人类遍在蛋白的开放读框(SEQ ID NO384)进行突变，从而编码最后一个氨基酸的核苷酸编码丙氨酸而不是甘氨酸。这种突变的开放读框以正确的读码刚好克隆到人类WT1剪接变体(SEQ ID NO381和408，分别为DNA和蛋白)的第一个密码子的上游。G->A突变防止新生蛋白在翻译期间被正常加工多聚-遍在蛋白的蛋白酶共翻译切割。所得构建物的DNA和推测的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO385和410中。当在人类细胞中表达时，所得蛋白表现出降低的细胞细胞毒性。尽管不可能产生表达天然WT1的稳定的细胞系，表达该融合蛋白的细胞系很容易获得。推测所得的蛋白将借助于添加的遍在蛋白分子靶向蛋白体。这应当导致该蛋白更为有效地被WT1特异性CD8+ T细胞识别。
实施例20表达人类WT1的腺病毒载体的构建人类WT1的剪接变体(SEQ ID NO381)被克隆到缺失了E1和E3的腺病毒血清型5载体中。该WT1基因的表达受介导高水平WT1蛋白表达的CMV启动子的调控。用该试剂感染人类细胞导致WT1蛋白高水平的表达。感染期间引入到宿主细胞中而感染后低水平产生的腺病毒蛋白的抗原性质能够起提高免疫监视和免疫识别作为免疫靶标的WT1的作用。当接种到人类受试者中时，该载体也可用于产生针对WT1蛋白的免疫应答。如果这些受试者为WT1表达肿瘤细胞阳性的，免疫应答能够对该疾病的进程具有治疗或治愈效果。
实施例21表达人类WT1的痘苗病毒载体的构建利用pSC11穿梭载体将全长人类WT1基因的剪接变体(SEQ IDNO381)克隆到痘苗病毒Western Reserve株的胸腺嘧啶激酶基因座。该WT1基因处于在痘苗病毒感染全程中介导基因表达的杂合型痘苗病毒启动子的调控之下。该试剂可用于在体内或在体外在人细胞中表达WT1蛋白。WT1是在某些人类肿瘤细胞中过表达的自身蛋白。因而，针对作为蛋白递送的WT1的免疫应答不可能导致主要组织相容性I类(MHC I类)分子介导的WT1识别。不过，该蛋白通过痘苗病毒载体在胞内区室表达将允许WT1蛋白高水平地被MHC I类提呈和被CD8+ T细胞所识别。痘苗病毒载体对WT1蛋白的表达也将引起WT1肽在MHC II类环境中的提呈，从而被CD4+ T细胞识别。
该发明的用途包括它的癌疫苗用途。免疫携带WT1阳性肿瘤的人类受试者能够引起治疗或治愈应答。WT1在细胞内的表达将导致该蛋白被CD4和CD8阳性T细胞识别。
实施例22利用全基因致敏产生WT1-特异性CD8+ T细胞克隆树突细胞(DC)由来自正常供体PBMC的单核细胞培养物通过在含10％人类血清、50ng/ml GM-CSF和30ng/ml IL-4的RPMI培养基中生长4-6天分化而来。培养后，DC用感染复数(MOI)为5的重组WT1表达痘苗病毒(描述在实施例21中)感染16小时，或者用MOI为10的重组WT1表达腺病毒感染3天。痘苗病毒通过U.V.辐照失活。CD8+ T细胞利用磁珠通过负排除分离，并且在96孔板中启动致敏培养。培养物每7-10天用感染了被改造表达WT1的腺病毒或痘苗病毒的自体树突细胞再刺激。在4-5个刺激循环后，当用自体的WT1表达树突细胞或成纤维细胞刺激时特异性产生干扰素-γ的CD8+T细胞系能够被鉴定。克隆这些细胞系，而且通过Elispot测定证明其可特异性地识别WT1转导的自体成纤维细胞，但不识别EGFP转导的成纤维细胞。
维尔姆斯瘤(WT1)基因参与白血病生成并且在大多数人类白血病以及数种实体瘤中过表达。前面的人类研究显示WT1特异性抗体(Ab)应答存在于所研究的16/63(25％)AML患者中以及15/81(19％)CML患者中。前面的小鼠研究证明基于WT1肽的疫苗引发WT1特异性Ab、Th和CTL应答。该肽在人类中作为疫苗的应用受限于它们的HLA限制以及引发肽特异性应答的倾向，而且只在少数患者中引发肿瘤特异性CTL。全基因免疫的优势在于数种辅助和CTL表位可以包含在单个疫苗中，因而不限制疫苗于特定的HLA类型。本文公开的数据证明了利用全基因在体外致敏诱导WT1特异性免疫应答，而且能够产生WT1特异性CD8+ T细胞克隆。考虑到有些白血病患者中存在既有的针对WT1的免疫，而且鼠和人WT1在氨基酸水平上有96％的同一性，而且免疫接种WT1蛋白、DNA和肽能够在小鼠中引发WT1特异性Ab以及细胞性T细胞应答而对小鼠正常组织无毒性，这些人类体外致敏实验为WT1作为肿瘤/白血病疫苗提供了进一步的证实。此外，产生WT1特异性CD8+ T细胞克隆的能力可导致利用遗传改造的T细胞治疗与WT1过表达相关的恶性肿瘤。
实施例23用于临床生产WT1的重组子构建物五个构建物如下文所详细描述的那样制备，用于生产临床级的WT1。
设计无His标签的Ra12/WT-E(SEQ ID NO388(cDNA)和391(蛋白质))和WT-1 E(SEQ ID NO386(cDNA)和395(蛋白质))WT-1 E读框用如下用于非His非融合构建物的引物进行PCR扩增PDM-780(SEQ ID NO396)5’gacgaaagcatatgcactccttcatcaaac 3’Tm PDM-779(SEQ ID NO397)5’cgcgtgaattcatcactgaatgcctctgaag 3’Tm 63℃利用下列PCR循环条件1μl 10X Pfu缓冲液，1μl 10mM dNTPs，2μl 1μM各种寡聚物，83μL无菌水，1.5μL Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)，50ng DNA(pPDMRa12 WT-1无His)。反应最初于96℃变性2分钟，接着是40个循环的96℃20秒、62℃15秒以及72℃1分40秒。这之后为72℃最后延伸4分钟。PCR产物由NdeI和EcoRI消化并克隆到已由NdeI和EcoRI消化的pPDM His(一种修饰的pET28载体)中。构建物通过测序分析确认，然后转化到BLR(DE3)pLys S和HMS 174(DE3)pLys S细胞中。然后用NcoI和XbaI消化该构建物-pPDM WT-1 E并用作为来自pPDM Ra12 WT-1 F(见下文)的NcoI和XbaI插入物的载体骨架。构建物通过DNA测序分析确认，然后转化到BLR(DE3)pLys S和HMS 174(DE3)pLys S细胞中。蛋白表达通过考马斯兰染色的SDS-PAGE和N-末端蛋白测序分析确认。
设计无His标签的Ra12-WT-1-F(a.a.1-281)(SEQ ID NO389(cDNA)和393(蛋白质))Ra12 WT-1读框由下列引物进行PCR扩增PDM-777(SEQ ID NO398)5’cgataagcatatgacggccgcgtccgataac3’Tm 66℃PDM-779(SEQ ID NO399)5’cgcgtgaattcatcactgaatgcctctgaag 3’Tm 63℃利用下列PCR循环条件1μl 10X Pfu缓冲液，1μl 10mM dNTPs，2μl 1μM各种寡聚物，83μL无菌水，1.5μL Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)，50ng DNA(pPDMRa12 WT-1无His)。反应最初于96℃变性2分钟，接着是40个循环的96℃20秒、58℃15秒以及72℃3分钟。这之后为72℃最后延伸4分钟。PCR产物由NdeI消化并克隆到已由NdeI和Eco72I消化的pPDM His中。序列经测序分析确认，然后转化到BLR(DE3)pLys S和HMS 174(DE3)pLys S细胞中。蛋白表达通过考马斯兰染色的SDS-PAGE和N-末端蛋白测序分析确认。
设计无His标签的Ra12-WT-1(SEQ ID NO390(cDNA)和392(蛋白质))Ra12 WT-1读框由下列引物进行PCR扩增PDM-777(SEQ ID NO400)5’cgataagcatatgacggccgcgtccgataac3’Tm 66℃PDM-778(SEQ ID NO401)5’gtctgcagcggccgctcaaagcgccagc 3’Tm 利用下列PCR循环条件1μl 10X Pfu缓冲液，1μl 10mM dNTPs，2μl 1μM各种寡聚物，83μL无菌水，1.5μL Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)，50ng DNA(pPDMRa12 WT-1无His)。反应最初于96℃变性2分钟，接着是40个循环的96℃20秒、68℃15秒以及72℃2分30秒。这之后为72℃最后延伸4分钟。PCR产物由NotI和NdeI消化并克隆到已由NdeI和NotI消化的pPDM His中。序列经测序分析确认，然后转化到BLR(DE3)pLys S和HMS 174(DE3)pLys S细胞中。蛋白表达通过考马斯兰染色的SDS-PAGE和N-末端蛋白测序分析确认。
在大肠杆菌中设计无His标签的WT-1 C(a.a.69-430)(SEQ IDNO387(cDNA)和394(蛋白质))WT-1 C读框由下列引物进行PCR扩增PDM-780(SEQ ID NO402)5’gacgaaagcatatgcactccttcatcaaac 3’Tm PDM-778(SEQ ID NO403)5’gtctgcagcggccgctcaaagcgccagc 3’Tm 利用下列PCR循环条件1μl 10X Pfu缓冲液，1μl 10mM dNTPs，2μl 1μM各种寡聚物，83μL无菌水，1.5μL Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)，50ng DNA(pPDMRa12 WT-1无His)。反应最初于96℃变性2分钟，接着是40个循环的96℃20秒、62℃15秒以及72℃2分钟。这之后为72℃最后延伸4分钟。PCR产物由NdeI消化并克隆到已由NdeI和Eco72I消化的pPDM His中。序列经测序分析确认，然后转化到BLR(DE3)pLys S和HMS 174(DE3)pLys S细胞中。蛋白表达通过考马斯兰染色的SDS-PAGE和N-末端蛋白测序分析确认。
实施例24利用全基因致敏产生WT1-特异性CD8+ T细胞克隆以及HLA-A2-限制的WT1表位的鉴定在本实施例中，利用腺病毒和痘苗病毒递送载体产生WT1特异性T细胞系。已证明来自该细胞系的一个T细胞克隆是WT1特异性的，并进一步鉴定了该克隆识别的表位。
树突细胞(DC)由来自正常供体PBMC的单核细胞培养物通过在含10％人类血清、50ng/ml GM-CSF和30ng/ml IL-4的RPMI培养基中生长4-6天分化而来。培养后，DC用感染复数(MOI)为5的重组WT1表达痘苗病毒感染16小时，或者用MOI为3-10的重组WT1表达腺病毒感染2-3天。痘苗病毒通过U.V.辐照失活。CD8+ T细胞利用针对CD4、CD14、CD16、CD19和CD56+细胞的抗体，继之以对这些Ab的Fc部分特异性的磁珠通过负排除分离。
在96孔板中启动致敏培养(priming cultures)。培养物每7-14天用感染了被改造表达WT1的腺病毒或痘苗病毒的自体树突细胞再刺激。在4-5个刺激循环后，当用自体的WT1表达树突细胞或成纤维细胞刺激时特异性产生干扰素-γ的CD8+细胞系能够被鉴定。克隆这些细胞系，而且通过Elispot测定证明其可特异性地识别WT1转导的自体成纤维细胞，但不识别对照转导的成纤维细胞。
为进一步分析这些WT1特异性CD8+ T细胞克隆的HLA限制，用WT1转导来自另外供体(D475)的成纤维细胞，该供体与建立T细胞克隆所来源的供体(D349)仅仅共有HLA-A2等位基因。ELISPOT分析显示了这些D475靶细胞被该T细胞克隆识别。为进一步显示HLA A2限制并证明该表位被“天然地”过表达WT1的肿瘤细胞(作为其恶性转化的一部分)表达，对白血病细胞系K562进行了测试。K562由HLA A2分子转导，并利用HLA-A2阴性K562细胞作为非特异性IFN-γ释放的对照。ELISPOT分析证明T细胞识别A2阳性K562细胞系，但不识别A2阴性K562细胞。所述识别的特异性和HLA-A2限制的进一步证据由HLA-A2抗体封阻实验证明。
为进一步确定WT1表位，产生了4个截短的WT1反转录病毒构建物。然后用这些构建物转导供体475成纤维细胞。ELISPOT测定显示了由WT1 Tr1构建物(aa2-aa92)转导的D475成纤维细胞的识别，从而证明WT1表位定位于WT1蛋白头91个N-末端氨基酸中。为精细绘制表位图谱，合成了重叠11个氨基酸的WT1蛋白的15mer肽。WT1特异性T细胞识别两个重叠的15mer肽肽9(QWAPVLDFAPPGASA)(SEQ ID NO412)和肽10(VLDFAPPGASAYGSL)(SEQ ID NO413)。为进一步表征识别的最小表位，利用该15mer肽共有的9mer肽和10mer肽(总共5个)分析克隆的特异性。所述克隆特异性识别9mer肽VLDFAPPGA(SEQID NO241)和10mer肽VLDFAPPGAS(SEQ ID NO411)。
实施例25来自WT1特异性CD8 T细胞的TCRα和β链的克隆和测序克隆了来自WT1特异性CD8+ T细胞的T细胞受体(TCR)α和β链。进行序列分析以显示该TCRα和β链的家族起源。另外，还鉴定了独特的多样性和连接片断(有贡献于应答的特异性)。
利用Trizol试剂从WT1特异性CD8+ T细胞克隆的2×106细胞中分离总mRNA，并利用Ready-to-go试剂盒(Pharmacia)合成cDNA。为确定克隆的Vα和Vβ序列，合成了一组Vα和Vβ亚型特异性引物(根据Clontech，Palo Alto，CA建立的引物序列)并连同产生自每个克隆的cDNA一起用于RT-PCR反应中。RT-PCR反应显示哪一个Vβ和Vα序列是由各个克隆表达的。
为从克隆中克隆全长TCRα和β链，设计跨越起始子和终止子编码TCR核苷酸的引物。利用由CTL克隆合成的cDNA和上述引物、使用保真热稳定聚合酶PWO(Roche，Basel，Switzerland)建立了标准的35个循环的RT-PCR反应。将所得的特异性条带(对于α链～850bp，而对于β链～950)连接到PCR钝端载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中并转化大肠杆菌。鉴定转化有含全长α和β链的质粒的大肠杆菌，并产生相应质粒的大规模制备物。然后利用标准方法对含全长TCRα和β链的质粒进行测序。从而确定了有贡献于TCR特异性的多样性-连接(DJ)区。
实施例26WT1特异性CD8+ T细胞克隆裂解WT1表达白血病母细胞(leukemic blasts)进一步测试了最初公开于实施例24中的识别肽序列VLDFAPPGA(人类WT1残基37-45；SEQ ID NO241)的CD8+T细胞克隆以HLA A2限制方式杀死(裂解)WT1表达白血病靶细胞的能力。将转导有HLA A2分子、GFP、A2Kb或者未转导的K562靶细胞用于标准的4.5小时51铬释放测定中，效应细胞与白细胞(E∶T)比为25∶1和5∶1。在25∶1的E∶T比时，CD8+ T细胞克隆裂解K562/A2和K562/A2Kb细胞(分别为40％和49％特异性裂解)，而对照GFP转导的K562细胞以及K562细胞未裂解。在5∶1的E∶T比时，K562/A2和K562/A2Kb细胞的特异裂解分别为21％和24％。因而，这种CD8+T细胞克隆以HLA-A2限制的方式识别和裂解表达WT1的白血病细胞。产生WT1特异性CD8+T细胞克隆的能力在利用遗传改造的T细胞与WT1过表达相关的恶性肿瘤的治疗中有用。
实施例27HLA-A2-肽-MHC四聚体复合物的构建本实施例描述了可溶性HLA-A2在昆虫细胞中的克隆和表达，以及纯化并组装HLA-A2为荧光多价肽-MHC四聚体复合物用于检测和分离抗原特异性CD8 T细胞。
本系统类似于由Altman等(Altman，J.等，Science，1996274(5284)94-6)研发和描述的系统，类似在于可溶性HLA-A2被逐个地在birA识别序列处由生物素标记，并随后在藻红蛋白偶联的链抗生物素蛋白支架上组装为多聚体。本文描述的物质不同在于HLA-A2以糖基化可溶形式自昆虫细胞中表达，且杂合二聚体利用抗-人I类MHC抗体亲和柱纯化。
将附有birA生物素标记序列的HLA-A2重链基因以及人类β-2-微球蛋白基因克隆到杆状病毒表达载体pFASTBAC-dual中。一旦感染昆虫细胞，基因由不同的启动子相伴转录并向培养基中分泌完全组装的糖基化可溶的HLA-A2杂合二聚体。感染的昆虫细胞在细胞工厂中于21℃培养4天然后收集上清。使用W6/32和生物素标记的B9.12.1抗体通过捕获ELISA监测HLA-A2的产生。利用连接于琼脂糖凝胶珠子的2个抗-人类I类MHC单克隆抗体通过一步亲合层析从培养上清中将HLA-A2纯化至＞90％的纯度。所用抗体为PA2.1和W6/32。纯化的HLA-A2利用商业上可获得的birA酶在位于重链C-末端的birA识别序列中逐个生物素标记。生物素标记的效率基本上如(Crawford et al(1998)Immunity June；8(6)675-82)所述进行评价，并且所述物质通过大小排阻层析(SEC)进一步纯化。藻红蛋白-偶联的链抗生物素蛋白用bio-HLA-A2饱和，并且该多价染色剂通过SEC纯化除去游离HLA-A2。HLA-A2四聚体室温下与10倍摩尔过量的Her-2/neu E75肽或者流感病毒基质MI肽温育48小时，之后所述特异性T细胞克隆在存在肽荷载的四聚体和抗-CD8抗体时于4℃染色30分钟。结果显示，在存在摩尔过量的M1 58-66 M1流感病毒肽时温育的四聚体特异性地染色流感病毒特异性T细胞克隆，而与过量Her-2/neu E75肽温育的四聚体特异性地染色Her-2/new特异性T细胞克隆。
实施例28利用WT1 MHC-肽四聚体检测WT1特异性T细胞将实施例27中描述的HLA-A2四聚体与摩尔过量的早先在实施例24中显示受HLA-A2限制的WT1 p37-45肽(VLDFAPPGA)(人类WT1残基37-45；SEQ ID NO241)温育。利用该四聚体染色实施例24中描述的WT1特异性CD8+ T细胞克隆。该克隆被证明特异性地识别p37-45表位。当四聚体与过量的p37-45肽温育时，它们特异性地染色CD8+ T细胞克隆，而与过量无关HLA-A2肽(Her2/neu、WT1p38-46、WT1p39-47)温育的那些四聚体不染色CD8+T细胞克隆。因而，WT1p37-45特异性CD8+ T细胞克隆被HLA-A2-p37-45肽MHC四聚体特异性地识别。
然后用HLA-A2-p37-45、无关Her2/neu或WT1p37-46四聚体对如实施例24所述产生的WT1特异性T细胞系染色。HLA-A2-p37-45四聚体染色这种WT1特异性T细胞系总群体的1％，和门控CD8+群的7％，而对照HLA-A2-p37-46四聚体与对照HLA-A2-Her2/neu四聚体以相同的本底水平染色。
这些结果表明MHC-肽四聚体是检测WT1特异性免疫应答的高度灵敏和特异性的工具。肽-MHC四聚体可用于WT1相关恶性肿瘤的早期检测、监测WT1特异性应答以及用于监测最小残留疾病。通过四聚体染色检测WT1特异性T细胞也是在患WT1相关病的患者群中鉴别处于更高的复发或疾病发展风险的组群的有用工具。
实施例29利用全基因致敏自HLA-A24阳性供体产生WT1特异性CD8+T细胞系在本实施例中，利用腺病毒和痘苗病毒递送载体自HLA-A24阳性供体产生WT1特异性T细胞系。该细胞系被证明是MHC I类限制性的。这些实验进一步证实了WT1蛋白的免疫原性，并支持它作为疫苗和/或其它免疫治疗方法的靶标的用途。
树突细胞(DC)由来自正常HLA-A24阳性供体PBMC的单核细胞培养物通过在含10％人类血清、50ng/ml GM-CSF和30ng/ml IL-4的RPMI培养基中生长4-6天分化而来。培养后，DC用感染复数(MOI)为5的重组WT1表达痘苗病毒感染16小时，或者用MOI为3-10的重组WT1表达腺病毒感染2-3天。痘苗病毒通过U.V.辐照失活。CD8+T细胞利用针对CD4、CD14、CD16、CD19和CD56+细胞的抗体，继之以对这些Ab的Fc部分特异性的磁珠通过负排除分离。
在96孔板中启动致敏培养。培养物每7-14天用感染了被改造表达WT1的腺病毒或痘苗病毒的自体树突细胞再刺激。在4-5个刺激循环后，能够鉴定当用自体的WT1表达树突细胞或成纤维细胞刺激时特异性产生干扰素-γ的CD8+细胞系。克隆这些细胞系，而且通过Elispot测定证明其可以MHC I类限制性的方式特异性地识别WT1转导的自体成纤维细胞，但不识别对照转导的成纤维细胞。
这些结果表明WT1蛋白能够用于产生T细胞应答，从而进一步证实了WT1抗原的免疫原性，并支持其作为疫苗及其它免疫治疗方法的靶标的用途。
实施例30HLA-A2高亲和力WT1表位的鉴定本实验描述了对预测能够以比天然加工表位更高的亲和力结合HLA-A2的WT1表位的in silico鉴定。本文鉴定的表位在用于WT1表达相关肿瘤治疗的疫苗和/或免疫治疗策略方面有用。
具有以比天然加工的肽更高的亲和力结合HLA-A2.1的基序的、天然加工的HLA A2限制性的WT1表位p37-45(VLDFAPPGA；人类WT1残基37-45；SEQ ID NO241；早先在实施例24中显示为HLA-A2限制性的)的肽类似物如下文更详细描述的那样构建。
利用基于由Rammensee等(Hans-Georg Rammensee，JuttaBachmann，Niels Nikolaus Emmerich，Oskar Alexander Bachor，Stefan StevanovicSYFPEITHIdatabase for MHC ligands andpeptide motifs.Immunogenetics(1999)50213-219)以及由Parker等(Parker，K.C.，M.A.Bednarek和J.E.Coligan.1994.Scheme forranking potential HLA-A2 binding peptides based on independentbinding of individual peptide side-chains.J.Immunol.152163)开发的算法的肽基序查找程序鉴定预测以比天然p37-45肽更高的亲和力结合HLA-A2的WT1 p37-45肽表位类似物。表LII中所示的肽具有等于或大于天然加工的p37-45肽的预测的肽结合分值。结合分值来自于预测的与HLA-A2 I类分子的半数解离时间。该分析建立在由Dr.Kenneth Parker kparker@atlas.niaid.nih.gov，NIAID，NIH公开的文献中推断出的系数表的基础上。
表LIIp37-45肽类似物


在独立的分析中，利用计算机模拟鉴定p37-45 WT1表位的肽表位类似物。HLA-A2天然结构的座标下载自Brookhaven蛋白质数据库(pdb I.D.3HLA)(L.L.Walsh，″Annotated PDB File Listing″，Protein Science 15，Diskette Appendix(1992)。该文档被用作样板用SwissModel程序(Peitsch MC(1996)ProMod and Swiss-ModelInternet-based tools for automated comparative protein modeling.Biochem.Soc.Trans.24274-279)处理，该程序可由Expasy网址(AppelR.D.，Bairoch A.，Hochstrasser D.F.A new generation of informationretrieval tools for biologiststhe example of the ExPASy WWWserver.Trends Biochem.Sci.19258-260(1994))获得。对结合到蛋白上的肽进行人工突变，以产生结合的WT p37-45肽。递交新结构由Swiss-PdbViewer的GROMOS96工具进行三轮能量最小化，就整体结构进行两轮能量最小化，接着进行一轮不利残基的挑选。最终的评价证明了模型总体有利的能量状态。Ramachandran绘图表明只有一个非甘氨酸残基远在非接受区域。利用本文所述的模拟法鉴定的肽示于下表LIII中。
表LIII计算机模拟鉴定的p37-45肽类似物

然后测试了利用上文所述的两种方法鉴定的几个肽被p37-45特异性CTL克隆(见实施例24)识别的能力。ELISPOT分析表明肽p37-1(SEQ ID NO426)和模型-1(SEQ ID NO445)被p37-45 CTL克隆识别。这些结果提示这两个肽类似物预测以比天然加工的表位更高的亲和力结合HLA-A2，并且依然能被天然T细胞受体识别。
从而，本实验描述了预测能够以比天然加工表位更高的亲和力结合HLA-A2的WT1表位的in silico鉴定。测试了鉴定的两个表位而且证明可被由天然WT1 p37-45表位产生的CTL克隆识别。本文鉴定的表位在用于WT1表达相关肿瘤治疗的疫苗和/或免疫治疗策略方面有用。
实施例31WT1抗原在体内的免疫原性本实施例描述了三种体内免疫原性研究用以评价小鼠中的WT1免疫接种策略。这三种策略包括1)裸DNA疫苗致敏和加强；2)减毒腺病毒致敏，继之以减毒甲病毒加强；或3)裸DNA致敏继之以腺病毒加强。用于这些研究的WT1剪接变体的全长cDNA示于SEQ IDNO381中。本文描述的结果为利用WT1 DNA/DNA、DNA/腺病毒或者腺病毒/甲病毒致敏/加强方案作为疫苗策略治疗与WT1表达相关的癌症提供了支持。
在第一种研究中，C57/B16小鼠以2周间隔用100μg编码WT1的裸DNA免疫3次。末次免疫后2-3周处死小鼠，并通过标准铬释放测定法评价CTL。该第一种研究表明这些小鼠中的WT1 DNA免疫引发了WT1特异性细胞毒T细胞应答，25∶1的E∶T比表现出40％的裂解。
在第二种研究中，HLA-A2/Kb转基因小鼠用5×108PFU编码WT1的减毒腺病毒(如实施例20所述)免疫一次，4周后继之以用5×106PFU编码WT1的甲病毒(AlphaVax)一次加强免疫。末次免疫后2-3周处死小鼠，并通过标准铬释放测定法评价CTL。结果表明HLA-A2/Kb转基因小鼠中的WT1特异性CTL特异性地裂解用表达WT1的病毒构建物转导的树突细胞(DC)以及由WT1肽脉冲的DC。因而，该免疫策略也有效地在体内引发了WT1特异性CTL。
在第三种研究中，C57/B16和HLA-A2/Kb转基因小鼠用100μg裸WT1 DNA分隔2周免疫2次，3周后继之以用7×108PFU编码WT1的腺病毒一次加强免疫。末次免疫后2-3周处死小鼠，并通过IFN-γ ELISPOT测定评价CTL。结果表明WT1 DNA和腺病毒致敏-加强在HLA-A2/Kb转基因小鼠中产生了WT1特异性CD8 T细胞应答。在用转导了WT1的DC刺激7天后，大约42％的CD8阳性细胞IFN-γ染色阳性。来自C57/BL6小鼠的结果表明这种免疫策略在新鲜脾细胞中产生可检测的CD8应答。脾细胞用10个跨越整个WT1蛋白的具有11个氨基酸重叠的15mer肽库刺激6小时。只有用p121-171刺激的细胞表现出IFN-γ染色。大约1.1％用p121-171肽库刺激的那些CD8 T细胞IFN-γ染色阳性。该肽包含实施例3中所示的在小鼠中引发CTL、T辅助细胞和抗体应答的p117-139肽(SEQ ID NO2)。
总而言之，这些结果表明本文测试的这三种免疫策略在体内产生T细胞应答。因而，这些研究进一步证实了WT1蛋白的免疫原性，并为利用WT1 DNA/DNA、DNA/腺病毒或者腺病毒/甲病毒致敏/加强方案作为疫苗策略治疗与WT1表达相关的癌症提供了支持。
实施例32用WT1蛋白免疫的HLA-A2/KB转基因小鼠中WT1+肿瘤生长的减少本实施例描述了在由WT1疫苗免疫的转基因小鼠中WT1+肿瘤的减少。这些结果进一步证明WT1为疫苗靶标并为在治疗WT1表达相关癌症的疫苗策略中应用WT1提供了支持。
鼠树突细胞(DC)系DC2.4.用WT1-LAMP构建物稳定转导(参见实施例18，cDNA和蛋白序列分别示于SEQ ID NO382和409中)。然后用2×106细胞皮下(s.c.)或者腹膜内(i.p.)接种小鼠。这导致肿瘤在80-100％小鼠中生长。在体内在小鼠中建立的肿瘤保留其WT1表达。因而，该模型提供了验证WT1疫苗策略有效性的系统。
然后按如下分隔2周对3组A2/Kb小鼠免疫3次组1仅生理盐水，皮下(对照，n＝10只小鼠)组2仅10μg MPL-SE，皮下(对照，n＝10只小鼠)组3100μg Ra12/WT1蛋白+10μg MPL-SE，皮下(n＝9只小鼠)在最后一次WT1免疫后2到3周，小鼠用过表达WT1的2×106A2/Kb DC2.4肿瘤细胞接种。在肿瘤攻击后监测小鼠，并且每周两次测量肿瘤大小直至肿瘤攻击后第4周。
结果表明在接受WT1蛋白疫苗的组中具有肿瘤生长的小鼠的百分比从大约100％(生理盐水对照)或90％(MPL-SE佐剂对照)降至45％(WT1蛋白免疫组)。此外，该组中的平均肿瘤大小从在对照组中观察到的平均肿瘤大小1233cmm(生理盐水对照)或753cmm(MPL-SE佐剂对照)降至WT1蛋白免疫组中的226cmm。组织病理学分析表明在预防接种的动物中肿瘤边缘与包括组织细胞、嗜曙红细胞、淋巴细胞、肥大细胞和浆细胞在内的宿主免疫反应混杂在一起。综合考虑，该结果证明WT1蛋白免疫提供防止或延迟WT1阳性肿瘤在WT1免疫动物中生长的保护。因而，这些结果支持了WT1蛋白作为与WT1表达相关的恶性肿瘤的疫苗的用途。
实施例33天然加工的WT1细胞毒T细胞表位的鉴定本实施例描述了被细胞毒T细胞识别的WT1蛋白天然加工表位的鉴定。本实验进一步证实了WT1蛋白的免疫原性，并为它用作疫苗和/或其它免疫治疗方法的靶标的用途提供了支持。另外，本实验鉴定了WT1蛋白可用于这些应用的表位。
HLA-A2/Kb转基因小鼠用100ug裸WT1 DNA间隔2周免疫两次，3周后继之以107PFU编码WT1的腺病毒的一次加强免疫。末次免疫后2-3周处死小鼠，并通过标准铬释放测定法评价CTL。正如在早先的实验中所观察到的，由WT1 DNA免疫继之以腺病毒加强免疫在HLA-A2转基因小鼠中引发WT1特异性CTL应答。为鉴定哪些表位被T细胞识别，利用标准流程通过有限稀释法建立并克隆CTL细胞系。然后利用由相应于最佳20个预测的HLA-A2限制CTL表位的肽脉冲的DC2.4 A2/Kb细胞作为靶细胞对阳性克隆进行测试。结果表明WT1 p10-18 9mer肽(氨基酸ALLPAVPSL，示于SEQ IDNO451中)被该CTL克隆识别。该表位早先就被预测是表位，如表XLVI，SEQ ID NO34中所述。在另外的实验中，在测试的5个WT1免疫动物中有4个观察到针对p10肽的CTL应答。因而，本实验证明预测的p10-18 WT1表位是CTL天然加工并识别的。而且，本实验证实了WT1蛋白的免疫原性，并进一步确定了天然加工的HLA-A2限制的CTL表位，它能够用在治疗与WT1过表达相关的恶性肿瘤的疫苗和免疫策略中。
实施例34利用孪生精氨酸易位体(Twin Arginine Translocator，TAT)信号肽的WT1表达构建物本实施例描述了WT1-TAT载体的构建以及WT1-TAT自这些载体的表达。这些构建物在表达用于疫苗接种策略的WT1-TAT分子中有用。
WT-1-F(WT1蛋白的a.a.2-281；WT1第2-281位的cDNA及氨基酸序列分别示于SEQ ID NO460和461中)以及全长WT-1如下文所述作为无His标签的pTAT融合物构建。所得融合物的cDNA及氨基酸序列分别示于SEQ ID NO452和453以及SEQ ID NO454和455中。
WT-1-F开放读框由下列引物进行PCR扩增PDM-439(SEQ ID NO456)5’GGCTCCGACGTGCGGGACCTGAAC 3’Tm 66℃PDM-779(SEQ ID NO457)5’CGCGTGAATTCATCACTGAATGCCTCTGAAG 3’Tm63℃WT-1全长开放读框由下列引物进行PCR扩增p37(SEQ ID NO458)5’GGCTCCGACGTGCGGGACCTG 3’p23(SEQ ID NO459)5’GAATTCTCAAAGCGCCAGCTGGAGTTTGGT 3’PCR条件如下1μl 10X Pfu缓冲液，1μl 10mM dNTPs，2μl 1μM各种寡聚物，83μL无菌水，1.5μL Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)，50ng DNA(pPDM FL WT-1)。反应于96℃变性2分钟，接着是40个循环的96℃20秒、64℃15秒以及72℃2分30秒，以及单次的72℃最后延伸4分钟。
PCR产物由EcoRI消化并克隆到pTAT(一种修饰的pET28载体，在N-末端具有来自大肠杆菌TorA信号肽的孪生精氨酸易位体(TAT)信号肽；参见J.Mol.Microbiol.(2000)2(2)179-189；Journal of Bacteriology，Jan 2001 p604-610 Vol 183，No 2；Journalof Biochemistry Vol 276，March 16 2001 pp 8159-8164)的Eco72I和EcoRI位点。序列经测序分析确认，然后转化到BLR(DE3)pLys S和HMS 174(DE3)pLys S细胞中。WT1-TAT蛋白的表达通过Western分析确认。
实施例35WT1的N-末端是该蛋白的优势体内免疫原性部分在本实施例中，小鼠用与MPL-SE佐剂配制的WT-1不同蛋白构建物(如实施例34中所述的F截短(2-281)以及全长(2-430)构建物)免疫。相对于全长蛋白，截短构建物引发了增强的CD4应答。因而本实施例证明WT1蛋白跨越氨基酸2到281的N-末端部分是WT1蛋白体内优势的免疫原性部分。
各组4只C57BL/6小鼠用20μg WT-1蛋白WT-1-F或WT-1全长(FL)，与Ra12、HIS或TAT的融合物皮下免疫。免疫于0、3和9周进行，并在11周收集脾脏。然后脾细胞在体外单用培养基、用15mer肽″p32″(ARMFPNAPYLPSCLE，WT1氨基酸125-139；见于SEQ ID NO2所示的p117-139肽中)、用DC2.4-WT-1/LAMP细胞系或者用rRa12刺激6小时。然后对CD4细胞进行胞内干扰素-γ染色并通过FACS分析定量。然后部分这些脾细胞在体外刺激8天，之后计数CD4+ IFN+细胞。在由p32刺激6小时后，在由截短的N-末端构建物rWT1-F-TAT免疫的小鼠中，0.33％的CD4阳性细胞是胞内IFN-γ染色阳性的。相反，在由rWT1-FL-TAT免疫的小鼠中，只有0.10％的CD4阳性细胞为胞内IFN-γ染色阳性。刺激8天后，由rWT1-F-TAT构建物免疫的小鼠在10.72％的CD4+细胞中表现出IFN-γ染色。相反，0.24％的来自用全长WT1-TAT构建物免疫的小鼠的CD4阳性细胞为胞内IFN-γ染色阳性。这些数据表明相对于全长rWT1-TAT构建物，截短的rWT1-TAT构建物引发了增强的CD4应答。
在第二种测定法中，脾细胞在体外用23mer肽p117-139(SEQ IDNO2；PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE，含已知的CD4表位并涵盖″p32″’)刺激3天，之后通过ELISA分析上清中分泌的IFN-γ。在来自用全长WT1构建物免疫的小鼠的脾细胞中无可检测的IFN-γ分泌。相反，来自用无HIS标签的rWT1-F免疫的小鼠的脾细胞中检测到平均为2477pg/ml的IFN-γ。在来自rWT1-F-TAT免疫小鼠的脾细胞中检测到平均为4658pg/ml的IFN-γ。这些数据进一步支持了相对于全长蛋白，截短的N-末端WT1构建物引发增强的CD4应答的观察。
WT1蛋白是由两个功能结构域构成的转录因子位于N-末端的脯氨酸-谷氨酰胺富集结构域，以及位于C-末端的与EGR1/Sp1转录因子家族具有同源性的由四个锌指组成的锌指结构域。WT1为自身蛋白。C-末端与其它自身蛋白同源因而具有较少的免疫原性，即为具有较大程度的免疫耐受的物质。值得注意的是C-末端中的4个锌指与EGR家族成员具有同源性。本实施例中描述的结果表明耐受将会在蛋白的不同部分之间变化，很可能取决于序列同源性和功能结构域。
总而言之，本实施例所描述的数据支持最有效的WT1疫苗将包括WT1 N-末端(或者作为重组蛋白或者作为基于基因的构建物)的主张。
实施例36用于表达WT1的N-末端片断(WT-1-F氨基酸1-281)的杆状病毒表达构建物以及利用昆虫细胞大规模生产该蛋白WT-1 N-末端片断的cDNA，连同Kozak共有序列是利用WT1-F质粒作为模板(WT-1-F克隆于起始甲硫氨酸下游的WT1蛋白氨基酸2-281；cDNA及WT1氨基酸序列2-281分别示于SEQ ID NO460和461中。在此处所述实验中用作为模板的pTAT融合构建物描述在实施例34中。该构建物的cDNA示于SEQ ID NO452中)通过PCR获得的。利用下列引物进行扩增WT1F1(SEQ ID NO466)5’CGGCTCTAGAGCCGCCACCATGGGCTCCGACGTGCG
WT1RV4(SEQ ID NO467)5’CGGCTCTAGACTACTGAATGCCTCTGAAGACACCGTG同一ORF加C-末端10个残基的His标签的cDNA类似于上文通过PCR获得，除了使用WT1RV3(SEQ ID NO468)作为反向引物(5’CGGCTCTAGACTAATGGTGATGGTGATGATGATGGTGATGATGCTGAATGCCTCTGAAGACACCGTG)之外。
将纯化的PCR产物克隆到供体质粒pFastBac1的Xba I位点。将重组供体质粒pFBWT1-F(cDNA及氨基酸序列分别示于SEQ IDNO463和465中)和pFBWT1-FH(带10X His标签；cDNA及氨基酸序列分别示于SEQ ID NO462和464中)转化到大肠杆菌菌株DH10Bac(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，以在大肠杆菌中通过定点转座制备重组杆粒。重组杆粒通过PCR分析确认，然后转染到Sf-9昆虫细胞中以制备重组杆状病毒BVWT1-F和BVWT1-FH。重组病毒在Sf-9细胞中扩增为高滴度病毒原种。
利用High Five昆虫细胞系优化蛋白表达及大规模生长重组蛋白的条件。为优化蛋白表达条件，用重组杆状病毒BVWT1-F和BVWT1-FH以不同的感染复数(MOI)感染单层High 5昆虫细胞，并在不同时期收集转导的细胞。蛋白的身份利用兔抗-WT1多克隆抗体[#942-32(799L)]通过蛋白质印迹分析确认。当重组病毒以1.0或2.0的MOI感染High 5细胞时，在感染后48小时或者54小时，WT1-F和WT1-FH重组蛋白都能很好地表达。
重组杆状病毒的扩增以及重组WT1-F和WT1-FH蛋白的表达随之被进一步优化。BVWT1-F和BVWT1-FH在含2％胎牛血清和0.5XPSF的ESF921培养基中都在Sf9昆虫细胞系中扩增。以0.05的MOI于28℃进行4天的扩增。利用High Five昆虫细胞系优化蛋白表达的条件。在收获前，High 5昆虫细胞用所述重组杆状病毒以0.5、1或2的MOI感染30、48、54或72小时。重组蛋白的身份利用针对WT1的特异性兔多克隆抗体(抗体#942-32)通过蛋白质印迹分析和通过毛细管LC-ESI-串联质谱测量法确认。这些实验表明，当重组病毒以0.5-1.0的MOI感染High 5细胞时，用于大规模生产WT1-F和WT1-FH的最佳蛋白表达发生在感染后43小时。
总而言之，上述WT1杆状病毒可用于大规模生产WT1的N-末端部分，用在与WT1表达相关的恶性肿瘤治疗的各种疫苗策略中。
实施例37利用重组TRICOM痘苗和鸡痘病毒载体在小鼠中诱导体内CD4和CD8 T细胞应答本实施例描述了评价小鼠中WT1疫苗接种策略的体内免疫原性研究。这些实验的目的在于测试rV-WT1/TRICOM和rF-WT1/TRICOM诱导针对WT1的免疫，尤其是T细胞免疫的能力。这里描述的结果为在治疗WT1表达相关癌症的疫苗策略中利用表达WT1并含有共刺激分子(B7-1、ICAM-1和LFA-3)三联体的TRICOM痘苗病毒载体(vaccinia vectors)和鸡痘病毒载体(fowlpox vectors)提供了支持。
在第一个研究中，C57Bl/6小鼠(每组12只小鼠)如下表1所示被免疫两到三次，在初免、二次免疫和三次免疫之间相隔14天。小鼠在二次免疫及三次免疫后第21天收集。CD8和CD4 T细胞应答如下文更加详细描述的那样通过对WT1肽激活的脾细胞进行IFN-γ胞内细胞因子染色测定。CD4 T细胞应答还另行通过rWT1蛋白刺激的脾细胞的IFN-γ释放测定。血清IgG1和IgG2b抗体应答通过ELISA测定。T细胞应答利用合并的脾细胞培养物(4只小鼠/组/时间点)评价。测定了单个小鼠的抗体效价(4只小鼠/组/时间点)。
表1疫苗接种策略

用于这些研究的WT1剪接变体的全长cDNA示于SEQ IDNO381中。这里所用的WT1-腺病毒如实施例20中所述。均表达WT1且含共刺激分子(B7-1、ICAM-1及LFA-3)三联体的rF-WT1/TRICOM重组鸡痘病毒以及rV-WT1/TRICOM重组痘苗病毒载体由TherionBiologics(Cambridge，MA，USA)建立。
为评价T细胞应答，脾细胞在体外用已知含CTL和辅助T细胞表位的WT1肽″p32″(ARMFPNAPYLPSCLE，WT1的氨基酸125-139；见于SEQ ID NO2所示的p117-139肽中)刺激。二次免疫后21天对p125-139激活的脾细胞进行胞内IFN-γ细胞因子染色，在由rV-WT1/TRICOM(致敏)和rF-WT1/TRICOM(加强)免疫的小鼠中表现出显著百分比的WT1应答性CD4+和CD8+T细胞，然而其它组未表现出显著的WT1特异性T细胞免疫应答。注意DNA组只用DNA致敏和加强。就是这个组后来接受rWT1-Adv三次免疫。
三次免疫后，评价针对重叠15-mer肽库的应答而不是针对单个肽#32的应答。在接种rV-WT1/TRICOM(致敏)和rF-WT1/TRICOM(加强X2)的小鼠中，发现肽库#32-36特异性的WT1肽CD8+和CD4+T细胞以类似于二次免疫后的应答的水平应答。另外，发现来自这些小鼠的CD4+和CD8+T细胞对包含在两个重叠15-mer肽#57-58(肽57DNLYQMTSQLECMTWN(氨基酸224-239)；肽58MTSQLECMTWNQMNL(氨基酸229-243)；重叠对应于WT1的氨基酸残基224-243)中的第二WT1表位产生应答，尽管处于比肽#32低得多的水平上。
抗体应答利用标准ELISA评价。在由rWT1+MPL-SE免疫的小鼠中，在二次免疫(效价1∶1350)后21天以及三次免疫(效价1∶3325)后21天，在所有8只小鼠中都可检测到针对WT1的低水平血清IgG2b抗体。相反，在所有其它组中血清IgG2b抗体效价都＜1∶100(表2)。
表2WT1-免疫的小鼠中的抗体应答

*血清效价是每组4只小鼠的平均值。记作＜50、＜75或＜100的效价也是平均值，只不过在所有情况下，少于4只小鼠具有可检测的效价。ND意味着未在任何小鼠中检测到。
总而言之，用rV-WT1/TRICOM(致敏)免疫C57Bl/6小鼠，继之以rF-WT1/TRICOM(加强)免疫，或者用WT1-DNA(致敏)继之以WT1-腺病毒(加强)免疫引发针对WT1的CD8和CD4 T细胞应答。针对rV-WT1/TRICOM继之以rF-WT1/TRICOM的T细胞应答与针对WT1-DNA继之以WT1-腺病毒的T细胞应答在该实验设计的能力范围内是等同的。并非束缚于任何理论，rF-WT1/TRICOM的主要优势在于多次加强能够持续提高免疫水平。因而，这些研究进一步证实了WT1蛋白的免疫原性并为在治疗与WT1表达相关的癌症的疫苗策略中使用WT1 DNA/腺病毒或者rv-WT1/TRICOM/rF-WT1/TRICOM免疫疗法提供了支持。
实施例38用于在大肠杆菌中表达WT1-F的粗短-WT1-F载体的构建本实施例描述了含有融合于WT1-F读框(WT1蛋白的2-281 N-末端部分)的截短的孪生精氨酸易位体(twin arginine translocator，TAT)信号肽的表达载体的构建。该载体可用于生产单种截短的TAT-WT1-F蛋白用在治疗与WT1表达相关的恶性肿瘤的免疫策略中。
如早先的实施例34中所述，TAT信号序列被用来制备各种WT1载体。当这些TAT载体用于表达时，观察到多种形式的蛋白。这些形式的N-末端测序表明这三种不同的表达蛋白中的每一种都是TAT肽的截短物。这些切割发生在每一个孪生精氨酸位点。因而，构建截短的TAT载体，使TAT信号肽从39个氨基酸缩短至12个氨基酸以避免在表达期间产生这些切割产物。该TAT ″Stumpy″载体通过保持TAT信号肽的头12个残基直到第一个孪生精氨酸而产生。该载体如下构建组合下列寡核苷酸对然后退火。
第1对粗短1(SEQ ID NO486)5’tatgaacaataacgatctgtttcaggc 3’粗短3(SEQ ID NO487)5’CTGAAACAGATCGTTATTGTTCA 3’第2对粗短4(SEQ ID NO488)5’aattcttggtcattcacgtggcggctcgc 3’粗短2(SEQ ID NO489)5’gagccgccacgtgaatgaccaag 3’寡核苷酸对和已由NdeI和EcoRI消化的pPDM(一种修饰的pET28载体)连接到一起。所得质粒pStumpy示于SEQ ID NO471中。该截短的TAT蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO506中。全长TAT多核苷酸示于SEQ ID NO503中，并且编码SEQ ID NO504中所示的TAT多肽的氨基酸序列。
然后利用该pStumpy载体构建Stumpy-WT1-F载体以表达无切割产物的WT1的N-末端部分。Stumpy-WT1-F载体如下构建WT1-F的编码区由下列引物组进行PCR扩增PDM-1005(SEQ ID NO484)5’GGCTCCGACGTTCGGGACCTGAACGCACTG 3’PDM-1004(SEQ ID NO485)5’CTGCAGAATTCATCACTGAATGCCTCTGAAG 3’扩增反应含有10ul 10X Pfu缓冲液，1ul 10mM dNTPs，2ul各10uM引物，83ul无菌水以及1.5ul Pfu DNA聚合酶(Stratagene，LaJolla，CA)。反应首先在96℃变性2分钟，接着是40个循环的96℃20秒、63℃15秒以及72℃30秒。然后反应继续，进行72℃4分钟的最后延伸。
然后PCR产物由EcoRI消化并克隆到已由Eco72I和EcoRI消化的pStumpy载体中。构建物经序列分析证实，然后转化到BLR(DE3)pLys S细胞中。所得的截短的TAT WT1-F融合蛋白作为单一物质表达。pStumpy WT1-F编码区的多核苷酸序列示于SEQ ID NO469中，其编码SEQ ID NO470所示的氨基酸序列。
实施例39构建用于在大肠杆菌中表达的WT1-F GMP、WT1-G和WT1-ΔG载体本实施例描述了优化用于在大肠杆菌中生产蛋白的WT1-F、WT1-G和WT1ΔG载体的构建。
对TAT WT-1 F DNA序列进行密码子优化，并通过Blue HeronBiotechnology(Bothel，WA)进行合成改造，以优化在大肠杆菌中的表达。这种密码子优化的WT1-F cDNA序列示于SEQ ID NO477中，且编码SEQ ID NO479中所示的氨基酸序列。然后将含此序列的质粒用NdeI和EcoRI消化，并亚克隆到已由NdeI和EcoRI消化的修饰pET28载体中用于在大肠杆菌中表达。该构建物经DNA测序分析证明是正确的，然后转化到BLR(DE3)pLys S细胞中用于表达。这种构建物是TAT WT1-F模板DNA的纯粹合成的可追溯的来源。
然后利用密码子优化的序列作为PCR模板以缺失N-末端区14个氨基酸的脯氨酸富集区(缺失SEQ ID NO461中所示的WT-1 F序列的氨基酸54-67；对应于全长WT1的氨基酸55-68)，产生SEQ IDNO473中所示的WT-1 G cDNA序列，其编码SEQ ID NO478中所示的氨基酸序列。这通过首先如下产生pTAT-WT-1 G构建物完成WT-1 G的5’编码区利用下列引物组进行PCR扩增PDM-1007(SEQ ID NO490) 5’caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc 3’Tm 76℃PDM-1006(SEQ ID NO491) 5’
cataaatttgcccgggcccgcccagagagccg 3’Tm 76℃WT-1 G区域的3’编码区利用下列引物组进行PCR扩增PDM-1008(SEQ ID NO492)5’cattcattcatcaaacaggagcc 3’Tm61℃PDM-1009(SEQ ID NO493)5’ccattaagaattcatcactgaatacc 3’Tm60℃用于扩增WT1-G的PCR反应含有10ul 10X Pfu缓冲液，1ul10mM dNTPs，2ul各10uM引物，83ul无菌水，1.5ul Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)以及50ng DNA模板(如SEQ ID NO477中所示的密码子优化的pTAT WT1-F)。反应首先在96℃变性2分钟，接着是40个循环的96℃20秒、63℃15秒以及72℃30秒。然后反应继续，进行72℃4分钟的最后延伸。
然后第一PCR产物用XbaI消化，并克隆到已由XbaI和Eco72I消化的pPDM(一种修饰的pET28载体)中。然后用SrfI和EcoRI消化所得的构建物(pTAT WT1-GA)。第二PCR构建物用EcoRI消化，并克隆到pTAT WT1-GA质粒构建物中。同时通过用XbaI和Srfl消化第一PCR构建物，并用EcoRI消化第二PCR构建物，并克隆到已用XbaI和EcoRI消化的pPDM中进行三方连接。所得的pTAT-WT1-G构建物经测序分析证实是正确的，然后转化到表达宿主中。pTAT-WT1-G的cDNA示于SEQ ID NO475中，并编码SEQ IDNO482中所示的氨基酸序列。
由于上述第二种方法期间的不完全SrfI消化，产生了未预期形式的WT-1 G(产生的WT-1ΔG缺失了14个氨基酸(WT-1 F的氨基酸55-68)并添加了3个额外的氨基酸(WT-1ΔG多核苷酸序列示于SEQID NO505中，其编码SEQ ID NO502中所示的多肽序列)。该TATWT-1ΔG构建物产生了预料不到的与TAT WT-1 F构建物相比的5倍的过量表达。pTAT-WT1ΔG构建物的cDNA示于SEQ ID NO476之中，且编码SEQ ID NO481中所示的氨基酸序列。
pTAT-WT-1G产生后，构建的pStumpy-WT1 G和有或无His标签的WT1-G是利用pTAT-WT1 G作为如下所述的PCR反应的模板构建的。
WT1-G区域的编码区利用下列引物组进行PCR扩增PCR 1PDM-1010(SEQ ID NO494)5’ggttcggatgtacgcgatctgaacg 3’Tm68℃PDM-1011(SEQ ID NO495)5’caaagaattcatcactgaataccgcg 3’Tm 63℃PCR 2PDM-1023(SEQ ID NO496)5’gcttttggcatatgggttcggatgtacgcgatc 3’Tm 71℃PDM-1011(SEQ ID NO497)5’caaagaattcatcactgaataccgcg 3’Tm 63℃PCR反应和扩增条件如上文所述，利用SEQ ID NO475中所示的pTAT-WT1 G作为模板。第一PCR产物用EcoRI消化，并克隆到已用EcoRI和Eco72I消化的pPDM(具有正确读框的his标签的修饰pET28载体)和pSTUMPY(如SEQ ID NO471中所示的、具有正确读框的12个氨基酸的截短的TAT前导肽的修饰pET28载体)中。第二PCR产物用NdeI和EcoRI消化，并克隆到已用NdeI和EcoRI消化的修饰pET28载体(pPDM)中。所述构建物经测序分析证实是正确的，然后转化到表达宿主中。所得的构建物如下具有His标签的WT1-G多核苷酸示于SEQ ID NO472中，且编码SEQ ID NO480中所示的氨基酸序列。无His标签的WT1-G多核苷酸示于SEQ IDNO473中，其编码SEQ ID NO478中所示的氨基酸序列。pStumpy-WT1-G多核苷酸序列示于SEQ ID NO474中，且编码SEQID NO483中所示的氨基酸序列。
在相关实验中，pStumpy WT-1 F GMP(密码子优化的)载体如下构建WT-1 F区域的编码区利用下列引物进行扩增PDM-1010(SEQ ID NO500)5’ggttcggatgtacgcgatctgaacg 3’Tm68℃PDM-1011(SEQ ID NO501)5’caaagaattcatcactgaataccgcg 3’Tm 63℃PCR反应和扩增条件如上文所述，利用pTAT WT-1F GMP作为模板。PCR产物用EcoRI消化，并克隆到已用EcoRI和Eco72I消化的如实施例38中所述的pStumpy载体中。构建物经测序分析证实是正确的，然后转化到表达宿主中。pStumpy WT-1 F GMP的多核苷酸序列示于SEQ ID NO498中，其编码SEQ ID NO499中所示的氨基酸序列。
总而言之，此处描述的表达载体可用于WT1、截短的WT1以及WT1融合蛋白的最佳表达和生产，以用于治疗与表达WT1相关的恶性肿瘤的疫苗策略。
综上所述，人们将会理解，尽管鉴于举例说明的目的，本文描述了本发明的具体实施方案，人们可以进行各种修饰而不偏离本发明的精神和范围。因此，若非所附权利要求书的限制，本发明不受任何限制。
序列表<110>Corixa CorporationGaiger，AlexanderMcNeill，Patricia D.
Jaya，NomalieCarter，Darrick<120>用于WT1特异性免疫疗法的组合物和方法<130>210121.46502PC<140>PCT<141>2002-10-30<160>506<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>17<212>PRT<213>人<400>1Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly1 5 10 15Gly<210>2<211>23<212>PRT<213>人<400>2Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro1 5 10 15Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu20<210>3<211>23<212>PRT<213>台湾鼷鼠(Mus musculus)<400>3Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro1 5 10 15Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu20<210>4<211>19<212>PRT<213>人
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<213>台湾鼷鼠<400>11gagcatgcga tgggttccga cgtgcgg27<210>12<211>29<212>DNA<213>台湾鼷鼠<400>12ggggtacctc aaagcgccac gtggagttt 29<210>13<211>17<212>PRT<213>台湾鼷鼠<400>13Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Leu Gly Gly Gly1 5 10 15Gly<210>14<211>19<212>PRT<213>台湾鼷鼠<400>14Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys1 5 10 15Trp Thr Glu<210>15<211>15<212>PRT<213>人<400>15Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg1 5 10 15<210>16<211>15<212>PRT<213>台湾鼷鼠<400>16Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg1 5 10 15<210>17<211>14<212>PRT<213>台湾鼷鼠
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<210>503<211>5400<212>DNA<213>大肠杆菌<400>503tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tatgaacaac aacgacctgt tccaggcttc 5100tcgtcgtcgt ttcctggctc agctgggtgg tctgaccgtt gctggtatgc tgggtccgtc 5160tctgctgacc ccgcgtcgtg ctaccgctgc tcacgtgccc atctgaattc tgcagatatc 5220catcacactg gcggccgctc gagcaccacc accaccacca ctgagatccg gctgctaaca 5280aagcccgaaa ggaagctgag ttggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc 5340ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt ttttgctgaa aggaggaact atatccggat 5400<210>504<211>39<212>PRT<213>大肠杆菌<220>
<221>变体<222>31，32，33，34，35，36，37，38，39<223>Xaa＝任何氨基酸<400>504Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala1 5 10 15Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35<210>505<211>816<212>DNA<213>人<400>505atgggttcgg atgtacgcga tctgaacgcg cttcttccgg cggtcccaag cttgggcggg60ggaggtggat gcgccctgcc cgtgagcggc gccgcgcaat gggccccggt ccttgatttt 120gctccgccgg gtgcgagcgc atacggctct ctgggcgggc ccgggcaaat tcattcattc 180atcaaacagg agcccagctg gggtggcgcc gaacctcatg aagaacaatg tctgtctgct 240tttaccgtac atttttcagg ccagtttacc ggaactgccg gtgcatgtcg ctatggccca 300ttcggtccgc cgccaccgtc acaagcctct tcgggacaag cccgcatgtt tccgaatgca 360ccctacctgc cgtcttgtct ggaaagccaa cccgcgatcc gtaaccaagg ctacagcacc 420gtcacgtttg atggtacccc gagctatggt catacgccga gtcatcatgc agcacagttc 480ccgaaccact cgttcaaaca cgaagatcct atgggccagc agggtagtct gggcgaacaa 540cagtatagcg tcccaccacc agtttatggt tgccataccc caacggattc ctgtactggt 600agccaagcgc tcctgctccg caccccctat tcttctgata atctctatca gatgaccagc 660caactggaat gtatgacgtg gaaccaaatg aacctgggcg caaccctgaa aggccacagt 720accggctatg agtcagataa ccacacaaca cccattttgt gcggcgctca atatcgtatt 780catacccatg gcgtttttcg cggtattcag tgatga 816<210>506<211>12<212>PRT<213>人<400>506Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg His1 5 10
权利要求
1.分离的多肽，包含选自SEQ ID NO414-450、478和502的维尔姆斯瘤抗原的免疫原性部分，或其变体，其中所述变体具有一个或多个取代、缺失、添加和/或插入的差别，从而该变体与WT1-特异性抗血清和/或T-细胞系或克隆反应的能力不实质上降低。
2.根据权利要求1的分离的多肽，其中免疫原性部分被修饰，从而该免疫原性部分结合MHC分子的能力相对于所述免疫原性部分增强。
3.根据权利要求2的分离的多肽，其中免疫原性部分被修饰，从而该免疫原性部分结合HLA-A2的能力相对于未修饰的免疫原性部分增强。
4.分离的多肽，包含缺失了富脯氨酸区的维尔姆斯瘤抗原。
5.根据权利要求4的分离的多肽，其中所述富脯氨酸区来自于维尔姆斯瘤抗原的大约氨基酸位置54到68。
6.权利要求5的分离的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO478和502中任一个所示的氨基酸序列。
7.融合蛋白，包含至少一个根据权利要求1、2或4中任一项的多肽。
8.权利要求7的融合蛋白，其中所述融合伴侣从由Ra12、蛋白D、LYTA、HIS标签、能够指导多肽到内体/溶酶体区室的导向信号、孪生精氨酸易位体以及截短的孪生精氨酸易位体组成的组中选择。
9.权利要求8的融合蛋白，其中融合蛋白包含孪生精氨酸易位体信号肽。
10.权利要求8的融合蛋白，其中融合伴侣包含SEQ ID NO504和506中任一个的氨基酸序列。
11.权利要求10的融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO453、455、470、479-483和499中任一个的氨基酸序列。
12.分离的多核苷酸，编码权利要求7、9和11中任一项的融合蛋白。
13.权利要求12的分离的多核苷酸，其中多核苷酸被密码子优化用于在大肠杆菌(E.coli)中表达。
14.权利要求12的分离的多核苷酸，其中多核苷酸包含SEQ IDNO452、454、469、471和472-477以及503、505中任一个的序列。
15.组合物，包含权利要求1、4、6或11中的多肽与药学上可接受的载体或赋形剂的组合。
16.疫苗，包含权利要求1、4、6或11中的多肽与非特异性免疫应答增强剂的组合。
17.根据权利要求15的疫苗，其中非特异性免疫应答增强剂优先增强患者的T细胞应答。
18.根据权利要求15的疫苗，其中非特异性免疫应答增强剂从由3d-MPL、MPL、RC-529、AGP’s、Montanide ISA50、Seppic MontanideISA 720、细胞因子、微球体、基于溴化二甲基二(十八烷基)铵(DDA)的佐剂、AS-1、AS-2、基于Ribi佐剂系统的佐剂、QS21、基于皂角苷的佐剂、微观流体化形式的Syntex佐剂、MV、ddMV、基于免疫刺激复合体(iscom)的佐剂以及灭活毒素组成的组中选择。
19.表达载体，包含可操作地连接于表达调控序列的权利要求12的多核苷酸。
20.由根据权利要求19的表达载体转化或转染的宿主细胞。
21.分离的多肽，包含维尔姆斯瘤抗原的免疫原性部分，其中所述多肽被修饰，使得该多肽结合HLA-A2的能力被增强，并且其中该多肽的免疫原性相对于SEQ ID NO241增强。
22.权利要求21的分离的多肽，其中所述多肽包含从由SEQ IDNO414-450中任一个组成的组中选择的氨基酸序列。
23.权利要求21的分离的多肽，其中所述修饰包括在SEQ ID NO241的位置1到9中任一位置处的一个或多个取代。
24.权利要求23的分离的多肽，其中所述修饰包括SEQ ID NO241位置6(P6)处的取代。
25.权利要求24的分离的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO445中所示的氨基酸序列。
26.权利要求23的分离的多肽，其中所述修饰包括SEQ ID NO241位置9(P9)处的取代。
27.权利要求26的分离的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO426中所示的氨基酸序列。
28.诱导动物免疫应答的方法，包括(a)向所述动物给药包含第一病毒载体的第一组合物，其中所述第一病毒载体包含可操作地连接于表达调控序列的WT1多核苷酸的至少免疫原性部分；(b)向所述动物给药包含第二病毒载体的第二组合物，其中所述第二病毒载体包含可操作地连接于表达调控序列的WT1多核苷酸的至少免疫原性部分；和从而诱导动物免疫应答。
29.权利要求28的方法，其中所述第一和所述第二病毒载体从由痘苗载体、鸡痘载体和腺病毒载体组成的组中选择。
30.权利要求29的方法，其中所述第一病毒载体包含重组痘苗载体。
31.权利要求28的方法，其中所述第一病毒载体包含rV-WT1/TRICOM。
32.权利要求28的方法，其中所述第二病毒载体包含重组鸡痘载体。
33.权利要求28的方法，其中所述第二病毒载体包含rF-WT1/TRICOM。
34.权利要求28的方法，其中所述第一和所述第二病毒载体进一步包含至少一个编码共刺激分子的多核苷酸。
35.权利要求28的方法，其中所述共刺激分子从由B7-1、ICAM-1和LFA-3组成的组中选择。
36.权利要求28的方法，其中所述第一组合物在第一时间点给药，而所述第二组合物随后在第二及第三时间点给药。
37.诱导患者免疫应答的方法，包括向所述患者给药包含第一组分和第二组分的组合物，其中第一组分包含414-450、453、455、470、478、479-483、499和502中任一个所示的氨基酸序列，而第二组分选自生理学上可接受的载体或免疫刺激剂中任一或两者。
38.诱导患者免疫应答的方法，包括向所述患者给药包含第一组分和第二组分的组合物，其中第一组分包含编码含有414-450、453、455、470、478、479-483、499和502中任一个所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，而第二组分包含含有414-450、453、455、470、478、479-483、499和502中任一个所示的氨基酸序列的多肽。
全文摘要
本发明公开了治疗恶性疾病例如白血病和癌症的组合物和方法。所述组合物包括WT1多核苷酸、WT1多肽、提呈WT1多肽的抗原呈递细胞、与WT1多肽特异性结合的抗体或者与WT1多肽特异性反应的T细胞中的一种或多种。此组合物可用于例如预防和治疗转移性疾病。
文档编号C12N5/08GK1671733SQ02826492
公开日2005年9月21日 申请日期2002年10月30日 优先权日2001年10月30日
发明者A·盖格尔, P·D·麦克尼尔, N·加亚, D·卡特尔 申请人:科里克萨有限公司