专利名称：用于扩增T细胞受体β链CDR3编码序列的引物组合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体地，本发明涉及用于扩增T细胞受体β链⑶R3编码序列的引物组合物及其用途。更具体地，本发明涉及用于扩增T细胞受体β链⑶R3编码序列的引物组合物，富集T细胞受体β链CDR3编码序列的方法，构建T细胞受体β链CDR3编码序列的测序文库的方法，确定T细胞受体β链CDR3编码序列的序列信息的方法，确定个体免疫状态的方法以及确定个体免疫状态的系统。
背景技术：
免疫系统是机体抵御病原菌入侵与免疫调节的重要系统，对其进行研究有很重要的意义。免疫球蛋白、T细胞受体(TCR)和HLA(人类白细胞抗原)是人类基因组中最活跃的免疫大分子，决定和反映了人和环境的相互作用。免疫大分子的多样性使得机体能识别无数的外来物质和清除体内产生的部分代谢物。免疫大分子多样性产生的机制主要有基因重排、体细胞突变、非模板核苷酸的插入与缺失等。其中，T细胞受体的多样性主要是通过人外周血T细胞主要表达的T细胞受体的α链和β链的重排引起的，而T细胞受体β链重排引起的T细胞受体β链CDR3编码序列的多样性能较好地代表T细胞受体的多样性甚至个人的免疫状态，因此，对T细胞受体β链CDR3编码序列进行研究，意义重大。然而，目前对于T细胞受体β链⑶R3编码序列的研究仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效地对T细胞受体β链CDR3编码序列进行富集的手段。根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于扩增T细胞受体β链CDR3编码序列的引物组合物。根据本发明的实施例，该引物组合物包括第一引物组，所述第一引物组由至少一种V区引物组成，所述至少一种V区引物的每一种均包含与至少一个V基因片段互补的序列；以及第二引物组，所述第二引物组由至少一种J区引物组成，所述至少一种J区引物的每一种均包含与至少一个J基因片段互补的序列。利用该引物组合物，能够有效地对T细胞受体β链CDR3编码序列进行富集，从而为对T细胞受体β链的CDR3进行深入研究提供了便利的工具。根据本发明的又一方面，本发明提供了一种构建T细胞受体β链CDR3编码序列的测序文库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤:根据前面所述的方法，获得富集所述T细胞受体β链CDR3编码序列的扩增产物；以及针对所述扩增产物，构建DNA测序文库，所述DNA测序文库构成所述T细胞受体β链CDR3编码序列的测序文库。由此，可以在对T细胞受体β链CDR3编码序列进行富集的基础上，构建可以用于测序的测序文库。 根据本发明的再一方面，本发明提出了一种确定T细胞受体β链CDR3编码序列的序列信息的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤:根据前面所述的方法，构建T细胞受体β链CDR3编码序列的测序文库；以及对所述T细胞受体β链CDR3编码序列的测序文库进行测序，以便确定所述T细胞受体β链CDR3编码序列的序列信息。根据本发明的又一方面，本发明提供了一种确定个体免疫状态的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤:根据前面所述的方法，对所述个体的T细胞受体β链CDR3编码序列进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果；以及基于所述测序结果，确定所述个体的免疫状态。通过该方法，能够有效地获得个体的T细胞受体β链CDR3编码序列的序列信息，从而可以有效地确定个体免疫状态。根据本发明的另一方面，本发明提出了一种确定个体免疫状态的系统。根据本发明的实施例，该系统包括:τ细胞受体β链CDR3编码序列富集装置，所述T细胞受体β链CDR3编码序列富集装置中设置有前面所述的引物组合物，以便对所述个体的核酸样本富集T细胞受体β链CDR3编码序列；文库构建装置，所述文库构建装置与所述T细胞受体β链⑶R3编码序列富集装置相连，以便针对所述经过富集的T细胞受体β链⑶R3编码序列构建T细胞受体β链CDR3编码序列的测序文库；测序装置，所述测序装置与所述文库构建装置相连，用于对所述T细胞受 体β链CDR3编码序列的测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果；以及分析装置，所述分析装置与所述测序装置相连，用于基于测序结果，确定所述个体的免疫状态。由此，利用该系统，能够有效地实施前述确定个体免疫状态的方法，从而能够有效地确定个体的免疫状态。根据本发明的又一方面，本发明供出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒中设置有前面所述的引物组合物。由此，该试剂盒能够用于检测T细胞受体β链的V-J重排，或者用于检测T细胞受体β链CDR3的编码序列。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:图1是根据本发明一个实施例的对T细胞受体β链⑶R3编码序列进行富集和测序的流程不意图；图2是根据本发明一个实施例的用于确定个体的免疫状态的系统结构示意图；图3是根据本发明一个实施例的多重PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果；以及图4是根据本发明一个实施例的对T细胞受体β链⑶R3编码序列进行测序后，所得到的V-J基因片段配对分布及丰度的结果示意图。
具体实施例方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。需要说明的是在本文中所使用的术语“第一”、“第二”等仅用于方便描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。根据本发明的一个方面，本发明提出了一种用于扩增T细胞受体β链CDR3编码序列的引物组合物。根据本发明的实施例，该引物组合物包括第一引物组和第二引物组。其中，第一引物组由至少一种V区引物组成，所述第二引物组由至少一种J区引物组成。在本文中所使用的术语“V区引物”指的是这样的一种引物，其能够特异性地识别T细胞受体β链家族中的V基因片段，从而可以引导进行聚合酶链式反应，由此第一引物组中所包含的V区引物的每一种均包含与至少一个V基因片段互补的序列。类似的，在本文中所使用的术语“J区引物”指的是这样的一种引物，其能够特异性地识别T细胞受体β链家族中的J基因片段，从而可以引导进行聚合酶链式反应，由此第二引物组中所包含的J区引物的每一种均包含与至少一个J基因片段互补的序列。进而，在V区引物和J区引物的引导下，可以通过扩增反应例如PCR扩增，从含有T细胞受体β链CDR3编码序列的核酸样本中特异性地扩增包含V基因片段和J基因片段的编码序列。由于T细胞受体β链的⑶R3是由V、D、J基因片段重排产物所编码的，因而通过特异性识别V基因片段和J基因片段的引物，即第一引物组和第二引物组，能够有效地从包含⑶R3编码序列的核酸样本中扩增获得⑶R3编码序列的扩增产物，在T细胞受体β链中，⑶R3是V-D-J重排的产物，因而通过采用根据本发明实施例的引物组合物，能够高特异性地从样本中扩增富集获得CDR3的编码序列，而不会存在其他的干扰序列。从而能够实现对T细胞受体β链CDR3编码序列的有效富集，进而为针对T细胞受体β链CDR3进行深入研究提供了便利的工具。根据本发明的实施例，V区引物和J区引物在PCR扩增过程中的作用，并不受特别限制。根据本发明的一个具体示例，V区引物可以作为正义链引物，J区引物可以作为反义链引物。发明人发现，通过如此设置V区引物和J区引物，能够进一步提高将引物组合物用于富集T细胞受体β链CDR3编码序列时的富集效率。根据本发明的实施例，上述引物组合物能够适用的T细胞受体类型，不受特别限制，本领域技术人员可以根据研究需要，选择适当的T细胞受体作为研究对象。根据本发明的一个实施例，所述T细胞受体为人类T细胞受体。由此，可以有效地将引物组合物用于对人类T细胞受体β链CDR3编码序列进行富集，从而可以有效地 用于对人体免疫状况进行研究。另外，根据本发明的实施例，可以通过对V区引物和J区引物的序列进行选择，实现一条引物可以识别多种V基因片段，从而可以进一步提高扩增的效率，减少引物的数目，降低成本。根据本发明的一个实施例，第一引物组的至少一种引物包含与多个V基因片段的保守区互补的序列。由此，可以在减少引物的数量的同时，提高对T细胞受体β链CDR3编码序列进行富集的效率，发明人还发现，这样操作能够提高各CDR3编码序列扩增的均一性，从而能够真实地反映CDR3编码序列在宿主中的分布比例。类似的，根据本发明的一个实施例，第二引物组的至少一种包含与多个J基因片段的保守区互补的序列。由此，可以在减少引物的数量的同时，提高对T细胞受体β链CDR3编码序列进行富集的效率，发明人还发现，这样操作能够提高各CDR3编码序列扩增的均一性，从而能够真实地反映CDR3编码序列在宿主中的分布比例。具体地，根据本发明的实施例,针对人类T细胞受体β链CDR3的序列特征，本发明提供了一组V区引物，和一组J区引物，其序列和名称分别总结如下:
权利要求
1.一种用于扩增T细胞受体β链⑶R3编码序列的引物组合物，其特征在于，包括: 第一引物组，所述第一引物组由至少一种V区引物组成，所述至少一种V区引物的每一种均包含与至少一个V基因片段互补的序列；以及 第二引物组，所述第二引物组由至少一种J区引物组成，所述至少一种J区引物的每一种均包含与至少一个J基因片段互补的序列， 任选地，所述V区引物是正义链引物，所述J区引物是反义链引物， 任选地,所述T细胞受体为人类T细胞受体， 任选地，所述第一引物组的至少一种引物包含与多个V基因片段的保守区互补的序列， 任选地，所述V区引物具有选自SEQ ID NO:1-30所示的核苷酸序列， 任选地，所述第二引物组的至少一种引物包含与多个J基因片段的保守区互补的序列， 任选地，所述J区引物具有选自SEQ ID NO:31-43所示的核苷酸序列。
2.一种富集T细胞受体β 链CDR3编码序列的方法，其特征在于，包括以下步骤: 提供核酸样本，所述核酸样本中包含编码T细胞受体β链CDR3的核酸序列；以及 利用权利要求1所述的引物组合物，以所述核酸样本作为模板，进行PCR扩增，以便获得富集所述T细胞受体β链CDR3编码序列的扩增产物， 任选地，进一步包括: 从人外周血分离外周血单个核细胞；以及 从所述外周血单个核细胞提取所述核酸样本， 任选地，所述外周血来源于正常人， 任选地，通过密度梯度离心分离所述外周血单个核细胞， 任选地，所述PCR扩增为多重引物PCR扩增， 任选地，所述多重引物PCR扩增的退火温度为60摄氏度， 任选地，进一步包括通过选自琼脂糖凝胶电泳、磁珠纯化和纯化柱纯化的至少一种分离纯化所述扩增产物， 任选地，所述扩增产物的长度为100-200bp。
3.一种构建T细胞受体β链CDR3编码序列的测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤: 根据权利要求2所述的方法，获得富集所述T细胞受体β链CDR3编码序列的扩增产物；以及 针对所述扩增产物，构建DNA测序文库，所述DNA测序文库构成所述T细胞受体β链⑶R3编码序列的测序文库， 任选地，针对所述扩增产物，构建DNA测序文库进一步包括: 对所述扩增产物进行末端修复，以便获得经过末端修复的扩增产物； 对所述经过末端修复的扩增产物进行3’端添加碱基Α，以便获得3’末端添加碱基A的扩增产物； 将所述3’末端添加碱基A的扩增产物与接头相连，以便获得连接产物； 对所述连接产物进行PCR扩增，以便获得第二扩增产物；以及将所述第二扩增产物进行纯化回收，以便获得回收产物，所述回收产物构成所述DNA测序文库， 任选地，所述末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的，所述Klenow片段具有5’ 一 3’聚合酶活性和3’ 一 5’外切酶活性，但缺少5’ 一 3’外切酶活性， 任选地，利用Klenow(3’ -5’ exo-)对所述经过末端修复的扩增产物进行3’端添加碱基A， 任选地，将所述具有粘性末端A的扩增产物与接头相连是利用T4DNA连接酶进行的， 任选地，通过选自琼脂糖凝胶电泳、磁珠纯化和纯化柱纯化的至少一种分离纯化所述第二扩增产物。
4.一种确定T细胞受体β链CDR3编码序列的序列信息的方法，其特征在于，包括以下步骤: 根据权利要求3所述的方法，构建T细胞受体β链CDR3编码序列的测序文库；以及对所述T细胞受体β链CDR3编码序列的测序文库进行测序，以便确定所述T细胞受体β链CDR3编码序列的序列信息。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，利用选自Hiseq2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一种进行所述测序。
6.一种确定个体免疫状态的方法，其特征在于，包括以下步骤: 根据权利要求4或5所述的方法，对所述个体的T细胞受体β链CDR3编码序列进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果；以及基于所述测序结果，确定所述个体的免疫状态。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，基于所述测序结果，确定所述个体的免疫状态进一步包括: 将所述测序结果与对照序列进行比对，以便确定所述个体中所包含的T细胞受体β链⑶R3的亚家族类型，以及各亚家族类型的相对比例。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在多个不同的时间点，从相同的个体提取样品，并分别根据权利要求4或5所述的方法，获得多个测序结果；以及 将所述多个测序结果进行比对，以便确定所述个体中T细胞受体β链CDR3的亚家族类型以及相对比例的变化。
9.一种确定个体免疫状态的系统，其特征在于，包括: T细胞受体β链CDR3编码序列富集装置，所述T细胞受体β链CDR3编码序列富集装置中设置有权利要求1所述的引物组合物，以便对所述个体的核酸样本富集T细胞受体β链⑶R3编码序列； 文库构建装置，所述文库构建装置与所述T细胞受体β链CDR3编码序列富集装置相连，以便针对所述经过富集的T细胞受体β链⑶R3编码序列构建T细胞受体β链⑶R3编码序列的测序文库； 测序装置，所述测序装置与所述文库构建装置相连，用于对所述T细胞受体β链CDR3编码序列的测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果；以及 分析装置，所述分析装置与所述测序装置相连，用于基于所述测序结果，确定所述个体的免疫状态， 任选地，所述分析装置进一步包括比对单元，所述比对单元中存储有对照序列，用于将所述测序结果与所述对照序列进行比对，以便确定所述个体中所包含的T细胞受体β链⑶R3的亚家族类型，以及各亚家族类型的相对比例。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中设置有权利要求1所述的引物组合物， 任选地，所述试剂盒用于检测T细胞受体β链的V-J重排； 任选地，所述试剂盒用 于检测T细胞受体β链CDR3的编码序列。
全文摘要
本发明涉及用于扩增T细胞受体β链CDR3编码序列的引物组合物及其用途。其中，用于扩增T细胞受体β链CDR3编码序列的引物组合物包括第一引物组，其由至少一种V区引物组成，该至少一种V区引物的每一种均包含与至少一个V基因片段互补的序列；以及第二引物组，其由至少一种J区引物组成，该至少一种J区引物的每一种均包含与至少一个J基因片段互补的序列。利用该引物组合物，能够有效地对T细胞受体β链CDR3编码序列进行富集，从而为对T细胞受体β链的CDR3进行深入研究提供了便利的工具。
文档编号C40B50/06GK103205420SQ20121001144
公开日2013年7月17日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者郑春婷, 刘晓, 洪雪玉, 张瑞芳, 苏政, 王俊 申请人:深圳华大基因科技有限公司, 深圳华大基因研究院