Bard1基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种BARD1基因突变检测液相芯片和特异性引物，该液相芯片主要包括有：每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：T6883G位点的SEQ?ID?NO.11及SEQ?ID?NO.12，针对A43635G位点的SEQ?ID?NO.13及SEQ?ID?NO.14，针对G1670C位点的SEQ?ID?NO.15及SEQ?ID?NO.16，针对G25542A位点的SEQ?ID?NO.17及SEQ?ID?NO.18，和/或针对G1134C位点的SEQ?ID?NO.19及SEQ?ID?NO.20；有不同anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。
【专利说明】BARD1基因突变检测特异性引物和液相芯片
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种BARDl基因突变检测特异性引物和液相芯片。
【背景技术】
[0002]BRCAl 关联环域 I (BRCA1 associated RING domain，BARDl)是一种可以与 BRCAl蛋白结合的蛋白，因为具有和BRCAl相似的环指功能域，所以命名为BARD1。BARDl基因位于2号染色体2q34_35的长臂上，编码含777个氨基酸残基的蛋白。该蛋白的主要功能域有环指功能域、三个锚蛋白重复序列和两个羧基端功能域。BARDl基因突变可以阻止BARDl蛋白对受损DNA的修复，DNA缺陷的累积会使细胞的生长分裂失去控制，从而形成肿瘤。另外，有研究发现BARDl基因在乳腺癌的发生发展中发挥了一定的作用。
[0003]目前，BARDl基因突变检测方法主要有:基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术(MALD1-T0F-MS)、荧光定量PCR技术和PCR-RFLP，基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术是一种软电离技术，在蛋白质等生物大分子的检测中有着强大而成熟的功能，但是在核酸检测领域，由于核酸分子本身的特殊性，检测受到一定的限制，荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高的特点，但也存在样品易污染、假阳性率高的缺点，且每次只能检测一种突变类型，PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大 小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是提供BARDl基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并行检测BARDl基因五种常见基因型T6883G、A43635G、G1670C、G25542A和G1134C的野
生型和突变型。
[0005]实现上述目的的技术方案如下。
[0006]一种BARDl基因突变检测液相芯片，包括有:
[0007](A).针对BARDl基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对T6883G位点的SEQ ID N0.11及SEQ ID N0.12，针对A43635G位点的 SEQ IDN0.13 及 SEQ ID N0.14，针对 G1670C 位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对 G25542A 位点的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，和 / 或针对 Gl 134C 位点的 SEQ IDN0.19 及 SEQ ID N0.20 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.10 ；
[0008](B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.21~SEQ IDN0.30,且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；[0009]( C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
[0010]在其中一个实施例中，所述扩增引物为:针对T6883G位点的SEQ ID N0.31及SEQID N0.32，针对 A43635G 位点的 SEQ ID N0.33 及 SEQ ID N0.34，针对 G1670C 位点的 SEQID N0.35 及 SEQ IDN0.36，针对 G25542A 位点的 SEQ ID N0.37 及 SEQ ID N0.38，和 / 或针对 G1134C 位点的 SEQ IDN0.39 及 SEQ ID N0.40。
[0011]在其中一个实施例中，所述ASPE引物对为针对T6883G位点的由SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.11组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.12组成的序列，针对A43635G位点的由SEQ IDN0.3和SEQ ID N0.13组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.14组成的序列，针对G1670C位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.15组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.16组成的序列，针对G25542A位点的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.17组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ IDN0.18组成的序列，和/或针对Gl 134C位点的由SEQ IDN0.9和SEQ ID N0.19组成的序列及由SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.20组成的序列。
[0012]本发明的另一目的是提供用于BARDl基因突变检测的特异性引物。
[0013]实现该目的的技术方案如下。
[0014]用于BARDl基因突变检测的特异性引物，所述特异性引物为针对T6883G位点的SEQ IDN0.11 及 SEQ ID N0.12，针对 A43635G 位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，针对G1670C 位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对 G25542A 位点的 SEQ ID N0.17 及 SEQID N0.18，和 / 或针对 G1134C 位点的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20。
[0015]本发明的主要优点在于:
[0016]1.本发明所提供的BARDl基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%。且检测所需要的 时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的BARDl基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。
[0017]2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。
[0018]3.本发明的检测方法步骤简单，5种突变位点检测可通过一步PCR即可完成5条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
[0019]4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
【具体实施方式】[0020]实施例1BARDl基因突变检测液相芯片，主要包括有:
[0021]一、ASPE 引物
[0022]针对BARDl 基因五种常见基因型 T6883G、A43635G、G1670C、G25542A 和 G1134C 的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示:
[0023]表1BARDl基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特异性引物序列)
[0024]
【权利要求】
1.一种BARDl基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有: (A).针对BARDl基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对T6883G位点的SEQ ID N0.11及SEQ ID N0.12，针对A43635G位点的 SEQ IDN0.13 及 SEQ ID N0.14，针对 G1670C 位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对G25542A 位点的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，和 / 或针对 G1134C 位点的 SEQ ID N0.19及 SEQ ID N0.20 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.10 ； (B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.21~SEQ ID N0.30，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的BARDl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为:针对 T6883G 位点的 SEQ ID N0.31 及 SEQ ID N0.32，针对 A43635G 位点的 SEQ ID N0.33 及SEQID N0.34，针对G1670C位点的 SEQ ID N0.35 及 SEQ ID N0.36，针对G25542A位点的 SEQID N0.37 及 SEQ ID N0.38，和 / 或针对 G1134C 位点的 SEQ ID N0.39 及 SEQ ID N0.40。
3.根据权利要求1或2所述的BARDl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物对为针对T6883G位点的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.11组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.12组成的序列，针对A43635G位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.13组成的序列及由SEQ IDN0.4和SEQ ID N0.14组成的序列，针对G1670C位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.15组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.16组成的序列，针对G25542A位点的由SEQ ID N0.7和SEQID N0.17组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.18组成的序列，和/或针对G1134C位点的由SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.19组成的序列及由SEQID N0.10和SEQ ID N0.2 0组成的序列。
4.根据权利要求1或2所述的BARDl基因突变检测液相芯片，其特征在于，所述间隔臂为5 — 10个T。
5.用于BARDl基因突变检测的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物为针对T6883G 位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，针对 A43635G 位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQIDN0.14，针对 G1670C 位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对 G25542A 位点的 SEQ IDN0.17 及 SEQ ID N0.18，和 / 或针对 G1134C 位点的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20。
【文档编号】C40B40/06GK103849940SQ201210512217
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月4日 优先权日:2012年12月4日
【发明者】刘丽, 胡文晖 申请人:益善生物技术股份有限公司