Tyr基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种TYR基因突变检测液相芯片和特异性引物，该液相芯片主要包括有：每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：针对G6895A位点的SEQ?ID?NO.9及SEQ?ID?NO.10，针对C1205T位点的SEQ?ID?NO.11及SEQ?ID?NO.12，针对C575A位点的SEQ?ID?NO.13及SEQ?ID?NO.14，和/或针对A99214C位点的SEQ?ID?NO.15及SEQ?ID?NO.16；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。
【专利说明】TYR基因突变检测特异性引物和液相芯片
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种TYR基因突变检测特异性引物和液相芯片。
【背景技术】
[0002]酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)位于11号染色体llql4.3长臂上,具体位于11号染色体88911039到89028926碱基对之间。酪氨酸酶(TYR)是一种75kD含铜酶，来源于胚胎神经峭细胞，是黑素代谢和儿茶酚胺的关键酶。有研究发现，眼皮肤白化病I型患者身上可以发现TYR基因100多种突变，这些突变破坏了黑色素的正常生成，从而降低了头发、皮肤和眼睛的着色。另外，酪氨酸酶可能是白癜风自身免疫的重要抗原。最近发现部分白癜风患者血清中有酪氨酸酶抗体，且与白癜风临床类型和分期密切相关。自身免疫性白癜风发病机制与酪氨酸酶抗体水平有关，为其免疫治疗提供依据。酪氨酸酶抗体可以作为白癜风活动性的一个指标。
[0003]目前，TYR基因突变检测方法主要有=Illumina光纤微珠芯片技术、基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术(MALD1-T0F-MS)和荧光定量PCR技术，虽然Illumina光纤微珠芯片技术是高灵敏度和精确性的高通量检测系统，但是自动化程度低，手工操作比较多，难以满足实际应用的需要，荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高的特点，但也存在样品易污染、假阳性率高的缺点，且每次只能检测一种突变类型，同样不能满足实际应用的需要，基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术是一种软电离技术，在蛋白质等生物大分子的检测中有着强大而成熟的功能，但是在核酸检测领域，由于核酸分子本身的特殊性，检测受到一定的限制，也难以满足实际应用的需要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是提供一种TYR基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并行检测TYR基因四种常见基因型G6895A、C1205T、C575A和A99214C的野生型和突变型。
[0005]实现上述目的的技术方案如下。
[0006]一种TYR基因突变检测液相芯片，包括有:
[0007](A).针对TYR基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对G6895A位点的SEQ ID N0.9及SEQ ID N0.10，针对C1205T位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，针对 C575A 位点的 SEQ ID` N0.13 及 SEQ ID N0.14，和 /或针对A99214C位点的SEQ ID N0.15及SEQ ID N0.16 ;所述tag序列选自SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.8 ；
[0008](B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.17~SEQ IDN0.24,且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
[0009]( C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
[0010]在其中一个实施例中，所述扩增引物为:针对G6895A位点的SEQ ID N0.25及SEQID N0.26，针对 C1205T 位点的 SEQ ID N0.27 及 SEQ ID N0.28，针对 C575A 位点的 SEQ IDN0.29 及 SEQ IDN0.30，和 / 或针对 A99214C 位点的 SEQ ID N0.31 及 SEQ ID N0.32。
[0011]在其中一个实施例中，所述ASPE引物对为:针对G6895A位点的由SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.9组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.10组成的序列，针对C1205T位点的由SEQ IDN0.3和SEQ ID N0.11组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.12组成的序列，针对C575A位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.13组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.14组成的序列，和/或针对A99214C位点的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.15组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ IDN0.16组成的序列。
[0012]本发明的另一目的是提供用于TYR基因突变检测的特异性引物。
[0013]实现该目的的技术方案如下。
[0014]用于TYR基因突变检测的特异性引物，所述特异性引物为:针对G6895A位点的SEQIDN0.9 及 SEQ ID N0.10，针对 C1205T 位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，针对 C575A位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，和 / 或针对 A99214C 位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQID N0.16。
[0015]实现上述目的的技术方案如下。
[0016]本发明的主要优点在于:
[0017]1.本发明所提供的TYR基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%，且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的TYR基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。
[0018]2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。
[0019]3.本发明的检测方法步骤简单，4种突变位点检测可通过一步PCR即可完成4条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。 [0020]4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
【具体实施方式】[0021]实施例1TYR基因突变检测液相芯片，主要包括有:
[0022]一、ASPE 引物
[0023]针对TYR基因四种常见基因型G6895A、C1205T、C575A和A99214C的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示:
[0024]表1TYR基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特异性引物序列)
【权利要求】
1.一种TYR基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有: (A).针对TYR基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对G6895A位点的SEQ ID N0.9及SEQ ID N0.10，针对C1205T位点的SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，针对 C575A 位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，和 / 或针对 A99214C 位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.8 ； (B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.17~SEQ ID N0.24，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的TYR基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为:针对G6895A位点的 SEQ ID N0.25 及 SEQ ID N0.26，针对 C1205T 位点的 SEQ ID N0.27 及 SEQIDN0.28，针对 C575A 位点的 SEQ ID N0.29 及 SEQ ID N0.30，和 / 或针对 A99214C 位点的SEQ IDN0.31 及 SEQ ID N0.32。
3.根据权利要求1或2所述的TYR基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物对为:针对G6895A位点的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.9组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.10组成的序列，针对C1205T位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.11组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.12组成的序列，针对C575A位点的由SEQ ID N0.5和SEQID N0.13组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.14组成的序列，和/或针对A99214C位点的由SEQ ID N0.7和SEQ IDN0.15组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.16组成的序列。
4.根据权利要求1 或2所述的TYR基因突变检测液相芯片，其特征在于，所述间隔臂为5— 10 个 T。
5.用于TYR基因突变检测的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物为:针对G6895A位点的 SEQ ID N0.9 及 SEQ ID N0.10，针对C1205T位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，针对C575A位点的SEQ ID N0.13及SEQ ID N0.14，和/或针对A99214C位点的SEQ IDN0.15 及 SEQ ID N0.16。
【文档编号】C40B40/06GK103849941SQ201210512220
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月4日 优先权日:2012年12月4日
【发明者】吴诗扬, 陈昌华 申请人:益善生物技术股份有限公司