一种绿色荧光银纳米团簇探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及荧光纳米材料制备技术领域，具体涉及一种绿色荧光银纳米团簇探针 及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 金属纳米团簇，是一种金属核心尺寸小于2nm的超小纳米粒子。最近几年，高焚光 强度，高稳定性的金属纳米簇被密集的报道作为新型荧光纳米簇探针，用于检测很多种类 的目标物。金属纳米簇的一个明显特征是它强的光致发光，并且具有良好的光稳定性，大的 斯托克斯位移和高的发射效率，因而引起了研究者广泛的兴趣。银纳米团簇逐渐成为金属 纳米材料中的重要组成部分，并广泛应用于化学分析、生物传感、生物成像、催化等研究领 域。
[0003]目前，大多数合成的银纳米团簇在紫外光激发下发射蓝光。在分析检测以及生物 方面，绿色荧光银纳米团簇更有吸引力，这样就可以避免一些生物体自身荧光的干扰。
[0004] 生物大分子如多肽和蛋白质，具有良好的生物相容性，自身具备多种生物功能， 易于实现银纳米团簇的功能化，也常用作合成荧光银纳米团簇探针的优良模板。文献 (Afifteenatomsilverclusterconfinedinbovineserumalbumin,A.Mathew,P. R.SajanlalandT.Pradeep,J.Mater.Chem.，2011，21，11205-11212)，用一种商业化 的常见蛋白质一一牛血清白蛋白，简单地一步合成了高发光的银纳米团簇（红色荧 光），其中牛血清白蛋白既作保护剂又具有还原作用，在碱性环境中能将银离子还原 成银原子。受此工作的启发，用蛋白质作为模板合成银纳米团簇也得到了研究生的关 注。 文南犬(Glutathione-ProtectedSilverNanoclustersasCysteine-Selective FluorometricandColorimetricProbe,X.Yuan,Y.Q.Tay,X.Y.Dou,Z.T.Luo,D. T.LeongandJ.P.Xie,Anal.Chem.2013, 85, 1913-1919)，用谷胱甘肽保护合成银纳米 团族，检测半脫氨酸；文献（Functionalized-tryptophanstabilizedfluorescentAg nanoclusters:SynthesisanditsapplicationasHg2+ionssensor,P.P.Bian,L. W.Xing,Z.M.LiuandZ.F.Ma,Sensor.Actuat.BChem.，2014, 203, 252-257)，合成硝化后的 色氨酸保护的银纳米团簇，发蓝色荧光并用于汞离子的检测。这些方法固然好，然而，合成 过程有些繁琐，成本较高，发蓝色荧光的银纳米团簇用于生物检测存在一定的干扰性。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种绿色荧光银纳米团簇探针及其制备方法，该方法简单， 一步合成，反应条件温和，所得绿色荧光银纳米团簇探针可以避免生物体自身荧光的干扰， 能用于尿液中生物硫醇的检测。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供的一种绿色荧光银纳米团簇探针，是以丝素蛋白作 为模板和保护剂，在碱性环境中，通过"一锅法"制备得到。
[0007] 本发明提供的一种绿色荧光银纳米团簇探针的制备方法，步骤包括：
[0008] (1)蚕茧脱胶制备丝素蛋白：将原始蚕茧剪成l-2cm2的小片，将蚕茧小片置于 0. 01-0. 03mol/L碳酸钠溶液中，在90-1KTC下加热0. 5-2h;
[0009] (2)将步骤⑴得到的脱胶后的丝素蛋白用去离子水清洗2-4次，在CaCl2:水：乙 醇=1:8:2的混合溶液中，在70-90°C下加热l_3h，使其溶解；
[0010] ⑶向步骤⑵得到的丝素蛋白溶液冷却至室温，过滤，透析48h，置于4°C冰箱中 备用；
[0011] (4)量取步骤（3)得到的丝素蛋白溶液，不断搅拌下，向丝素蛋白溶液中加入 8-15mmol/L硝酸银，继续搅拌使两者充分混匀，丝素蛋白溶液与硝酸银溶液的体积比为 1-4:1；
[0012] (5)向步骤（4)得到的混合溶液中加入50yL氢氧化钠，在室温下继续搅拌 5-15min,静置 6-10h;
[0013] (6)将步骤（5)得到的溶液经过离心，最终得到绿色荧光银纳米团簇探针溶液。
[0014] 步骤（1)中碳酸钠溶液的浓度为0· 02mol/L。
[0015] 步骤（1)中蚕茧小片与碳酸钠溶液在100°C下加热lh。
[0016] 步骤⑵中得到的脱胶后的丝素蛋白用去离子水清洗3次，在CaCl2:水：乙醇= 1:8:2的混合溶液中，在80°C下加热2h，使其溶解。
[0017] 步骤（3)中透析是用截留分子量为8000-14000Da的透析袋透析48h。
[0018] 步骤（4)中的硝酸银溶液的浓度为10mmol/L。
[0019] 步骤⑷中的丝素蛋白溶液与硝酸银溶液的体积比为3:1。
[0020] 步骤（5)中的氢氧化钠溶液的浓度为lmol/L。
[0021] 步骤（5)中，在室温下继续搅拌lOmin，静置8h。
[0022] 步骤（6)中离心是以13000r/min转速离心lOmin。
[0023] 本发明方法制备的绿色荧光银纳米团簇探针可在生物硫醇检测中应用。
[0024]与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0025](1)以丝素蛋白为模板，原料广泛易得，绿色环保，制备方法简单，成本低廉。
[0026](2)制得的绿色荧光银纳米团簇探针具有良好的绿色发光性能，将其用于构建尿 液中检测生物硫醇的传感体系，可以避免生物体自身荧光的干扰。本发明制备的绿色荧光 银纳米团簇探针可在生物硫醇检测中应用。
[0027] (3)制得的绿色焚光银纳米团簇探针尺寸小、光稳定性强、毒副作用小、水溶性好， 荧光强度高，在生物成像、生物标记等领域有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针的作用机理示意图
[0029] 图2为本发明制备绿色荧光银纳米团簇探针溶液分别在日光灯（1)和波长为 365nm紫外灯（2)照射下的照片
[0030]图3为本发明制备绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光-紫外图，图中a为紫 外-可见吸收光谱图，b为荧光光谱图
[0031] 图4为本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液加入不同氨基酸时荧光峰强 度的变化
[0032] 图5本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液在不同pH值下荧光峰强度的变 化
[0033]图6本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度随时间的变化
[0034] 图7本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液随离子强度（氯化钠的浓度）的 变化其荧光峰强度的变化
[0035] 图8a为绿色荧光银纳米团簇探针溶液随半胱氨酸浓度的变化其荧光峰强度的变 化
[0036] 图8b为绿色荧光银纳米团簇探针溶液随谷胱甘肽浓度的变化其荧光峰强度的变 化
[0037] 图8c为绿色荧光银纳米团簇探针溶液随高半胱氨酸浓度的变化其荧光峰强度的 变化
[0038]图9a为绿色荧光银纳米团簇探针溶液与半胱氨酸浓度之间的线性关系
[0039]图9b为绿色荧光银纳米团簇探针溶液与谷胱甘肽浓度之间的线性关系
[0040]图9c为绿色荧光银纳米团簇探针溶液与高半胱氨酸浓度之间的线性关系
【具体实施方式】
[0041] 本发明是以丝素蛋白为模板，在碱性环境中，通过"一锅法"制备绿色荧光银纳米 团簇探针溶液，并用于尿液中生物硫醇的检测。下面通过实例对本发明作进一步说明。
[0042] 实施例1
[0043] 以丝素蛋白为模板的绿色荧光银纳米团簇探针的制备：
[0044] (1)蚕茧脱胶制备丝素蛋白：将原始蚕茧剪成l_2cm2的小片，将蚕茧小片与 0. 02mol/L碳酸钠溶液（2. 4g:lOOOmL)在 100°C下加热lh;
[0045] (2)将步骤⑴得到的脱胶后的丝素蛋白用去离子水清洗3次，在CaCl2:水：乙醇 =1:8:2的混合溶液中，在80°C下加热2h，使其溶解；
[0046] (3)向步骤（2)得到的丝素蛋白溶液冷却至室温，过滤，透析48h，置于4°C冰箱中 备用；
[0047] (4)量取步骤⑶得到的丝素蛋白溶液3mL，不断搅拌下，向丝素蛋白溶液中加入 10mmol/L硝酸银lmL，继续搅拌使两者充分混匀；
[0048] (5)向步骤（4)得到的混合溶液中加入50yLlmol/L氢氧化钠，在室温下继续搅拌 10min，静置 8h;
[0049] (6)将步骤（5)得到的溶液经过离心，最终得到绿色荧光银纳米团簇探针溶液。
[0050] 步骤（1)~（6)过程中，均是在室温条件下操作完成的。
[0051] 制备的绿色荧光银纳米团簇探针的作用机理示意图见图1。
[0052] 制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液分别在日光灯和波长为365nm紫外灯照射 下的照片见图2,图中1为绿色荧光银纳米团簇探针溶液在日光灯照射下的图片，颜色为黄 色，2为波长为365nm紫外灯照射下的图片，颜色为绿色。
[0053] 此外，制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光-紫外图见图3,其中荧光图 (b)表明制备的绿色荧光银纳米团簇探针在固定激发波长为325nm条件下，发射峰位置在 420nm左右。
[0054] 实施例2
[0055] 生物硫醇对实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响 实验：
[0056]将组氨酸（His)、谷氨酸（Glu)、天冬氨酸（Asn)、缬氨酸（Val)、苯丙氨酸（Phe)、 酪氨酸（Tyr)、丙氨酸（Ala)、丝氨酸（Ser)、亮氨酸（Leu)、精氨酸（Arg)、脯氨酸（Pro)、苏 氨酸（Thr)、谷氨酰胺（Gin)、色氨酸（Trp)、异亮氨酸（lie)和赖氨酸（Lys)配制成浓度为 400nmol/L的溶液，半胱氨酸、谷胱甘肽和高半胱氨酸配制成40nmol/L的溶液，将实施例1 制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液稀释10倍，取稀释后的绿色荧光银纳米团簇探针溶 液100μL加入到900μL上述含不同氨基酸的溶液中，固定激发波长为325nm，在室温下进 行荧光光谱检测，根据420nm左右的荧光峰强度，检测不同氨基酸对绿色荧光银纳米团簇 探针溶液的荧光峰强度的影响。
[0057] 氨基酸对绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图4:在325nm激 发下，从含氨基酸的绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光强度F与绿色荧光银纳米团簇探 针溶液的荧光峰强度F。的比值得出：半胱氨酸变化最大，其次是谷胱甘肽和高半胱氨酸，其 他氨基酸变化相对较小，说明本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液能够定性检测生 物硫醇。
[0058] 实施例3