r>[0059] pH值对实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响实验：
[0060] 分别将100μL实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液加入到900μL不同 pH值的BR缓冲溶液中，固定激发波长为325nm，在室温下进行荧光光谱检测，根据420nm左 右的荧光峰强度，检测pH值对绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响。
[0061] pH值对绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图5 :在325nm激发 下，绿色荧光银纳米团簇探针溶液在pH为1-7的范围内，荧光峰强度变化较大，因而本发明 制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液选择pH=7。
[0062] 实施例4
[0063] 时间对实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液：
[0064] 将100μL实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液加入到50μLBR缓冲溶 液（pH= 7. 0)中，再加850μL去离子水，固定激发波长为325nm，在室温下0-10min内进行 荧光光谱检测，根据420nm左右的荧光峰强度，检测时间对绿色荧光银纳米团簇探针溶液 的荧光峰强度的影响。时间对绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图6: 在lOmin内，绿色荧光银纳米团簇探针的荧光强度基本保持不变。
[0065] 实施例5
[0066] 离子强度对实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响 实验：
[0067] 将100μL实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液加入到50μLBR缓冲溶 液（pH= 7. 0)中，再加850μL去离子水，固定激发波长为325nm，加入不同浓度的氯化钠溶 液（0~150mmol/L)，根据420nm左右的荧光峰强度，检测离子强度对绿色荧光银纳米团簇 探针溶液的荧光峰强度的影响。
[0068] 离子强度对绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图7 :在325nm 激发下，绿色荧光银纳米团簇探针溶液在不同浓度的氯化钠溶液（0~150mmol/L)范围内， 荧光峰强度基本不变，说明本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液抗离子干扰性强。
[0069] 实施例6
[0070] 实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液对生物硫醇检测的实验：
[0071] 将实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液稀释10倍，取稀释后的绿色荧光 银纳米团簇探针溶液100μL加入到900μL含生物硫醇的溶液中，固定激发波长为325nm， 在室温下进行荧光光谱检测，根据420nm左右的荧光峰强度，检测生物硫醇对银纳米团簇 探针溶液的荧光峰强度的影响。
[0072] 半胱氨酸对荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图8a:在325nm激发 下，绿色荧光银纳米团簇探针溶液在加入不同浓度的半胱氨酸后，荧光峰强度逐渐减小，最 后荧光峰基本趋于平滑；其中1~16分别是0, 1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40nm 〇l/L的半胱氨酸对绿色荧光银纳米团簇探针溶液荧光峰强度影响的荧光光谱图，说明本发 明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液能够实现对半胱氨酸的检测。
[0073] 谷胱甘肽对荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图8b:在325nm激发 下，绿色荧光银纳米团簇探针溶液在加入不同浓度的谷胱甘肽后，荧光峰强度逐渐减小，最 后荧光峰基本趋于平滑；其中1~14分别是0, 1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 50nmol/L的 谷胱甘肽对绿色荧光银纳米团簇探针溶液荧光峰强度影响的荧光光谱图，说明本发明制备 的绿色荧光银纳米团簇探针溶液能够实现对谷胱甘肽的检测。
[0074] 高半胱氨酸对荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的影响见图8c:在325nm激 发下，绿色荧光银纳米团簇探针溶液在加入不同浓度的高半胱氨酸后，荧光峰强度逐渐减 小，最后荧光峰基本趋于平滑；其中1~17分别是0, 1，2, 4, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ，60, 70, 80, 100nm〇l/L的高半胱氨酸对绿色荧光银纳米团簇探针溶液荧光峰强度影响的荧 光光谱图，说明本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液能够实现对高半胱氨酸的检测
[0075] 此外，本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液的荧光峰强度的变化与生物硫 醇的浓度呈线性关系，如图9a所示，半胱氨酸的线性方程为FQ-F= -86. 972+134. 016C(R2 =0. 995)，检出限能达到6.93X10 5nmol/L;图9b所示，谷胱甘肽的线性方程为FQ-F= 311. 41+172. 95C(R2= 0. 995)，检出限能达到5. 37X10 5nmol/L;图9c所示，高半胱氨酸的 线性方程为FQ-F= 2. 478+30. 810C(R2= 0. 993)，检出限能达到 3. 01X10 4nmol/L;
[0076] 实施例7
[0077] 实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液在尿液中生物硫醇检测应用的实 验：
[0078] 采用标准加入法用于实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液在尿液中生 物硫醇检测应用的实验。如表1所示，用稀释过的尿样配制浓度分别为4, 6, 8nmol/L的半 胱氨酸溶液，将实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液稀释10倍，取稀释后的绿色 荧光银纳米团簇探针溶液100μL分别加入到900μL含半胱氨酸的溶液中，固定激发波长 为325nm，在室温下进行荧光光谱检测，并记录相应的荧光强度。
[0079] 如表2所示，用稀释过的尿样配制浓度分别为2, 4, 6nmol/L的谷胱甘肽溶液，将实 施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液稀释10倍，取稀释后的绿色荧光银纳米团簇探 针溶液100μL分别加入到900μL含谷胱甘肽的溶液中，固定激发波长为325nm，在室温下 进行荧光光谱检测，并记录相应的荧光强度。
[0080] 如表3所示，用稀释过的尿样配制浓度分别为15, 25, 35nmol/L的高半胱氨酸溶 液，将实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液稀释10倍，取稀释后的绿色荧光银 纳米团簇探针溶液100μL分别加入到900μL含高半胱氨酸的溶液中，固定激发波长为 325nm，在室温下进行荧光光谱检测，并记录相应的荧光强度。
[0081] 利用图9a中的线性方程计算出实际样品中半胱氨酸的回收率。本实验中多组平 行测定并计算半胱氨酸的回收率，如表1所示，说明实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探 针溶液能够用于尿样中半胱氨酸的检测。
[0082] 利用图9b中的线性方程计算出实际样品中谷胱甘肽的回收率。本实验中多组平 行测定并计算谷胱甘肽的回收率，如表2所示，说明实施例1制备的绿色荧光银纳米团簇探 针溶液能够用于尿样中谷胱甘肽的检测。
[0083] 利用图9c中的线性方程计算出实际样品中高半胱氨酸的回收率。本实验中多组 平行测定并计算高半胱氨酸的回收率，如表3所示，说明实施例1制备的绿色荧光银纳米团 簇探针溶液能够用于尿样中高半胱氨酸的检测。
[0084] 表1为本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液用于尿样中半胱氨酸的检测
[0085]
[0086] 表2为本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液用于尿样中谷胱甘肽的检测
[0087]
[0088] 表3为本发明制备的绿色荧光银纳米团簇探针溶液用于尿样中高半胱氨酸的检 测
[0089]
[0090] RSD:相对标准偏差。
【主权项】
1. 一种绿色荧光银纳米团簇探针，其特征在于，是以丝素蛋白作为模板和保护剂，在碱 性环境中，通过"一锅法"制备得到。2. 如权利要求1所述的一种绿色荧光银纳米团簇探针的制备方法，其步骤包括： (1) 蚕茧脱胶制备丝素蛋白：将蚕茧剪成l-2cm2的小片，将蚕茧小片置于 0. 01-0. 03mol/L碳酸钠溶液中，在90-1KTC下加热0. 5-2h; (2) 将步骤⑴得到的脱胶后的丝素蛋白用去离子水清洗2-4次，在CaCl2:水：乙醇 =1:8:2的混合溶液中，在70-90°C下加热l_3h，使其溶解； (3) 向步骤（2)得到的丝素蛋白溶液冷却至室温，过滤，透析48h，置于4°C冰箱中备 用； (4) 量取步骤（3)得到的丝素蛋白溶液，不断搅拌下，向丝素蛋白溶液中加入 8-15mmol/L硝酸银，继续搅拌使两者充分混匀，丝素蛋白溶液与硝酸银溶液的体积比为 1-4:1 ； (5) 向步骤（4)得到的混合溶液中加入50yL氢氧化钠溶液，在室温下继续搅拌 5-15min,静置 6-10h; (6) 将步骤（5)得到的溶液经过离心，最终得到绿色荧光银纳米团簇探针溶液。3. 如权利要求2所述的一种绿色荧光银纳米团簇探针的制备方法，其特征在于，所述 步骤（1)中碳酸钠溶液的浓度为〇. 〇2mol/L。4. 如权利要求2所述的一种绿色荧光银纳米团簇探针的制备方法，其特征在于，所述 步骤（1)中蚕茧小片与碳酸钠溶液在l〇〇°C下加热lh。5. 如权利要求2所述的一种绿色荧光银纳米团簇探针的制备方法，其特征在于，所述 步骤⑵中得到的脱胶后的丝素蛋白用去离子水清洗3次，在CaCl2:水：乙醇=1:8:2的 混合溶液中，在80°C下加热2h。6. 如权利要求2所述的一种绿色荧光银纳米团簇探针的制备方法，其特征在于，所述 步骤（3)中透析是用截留分子量为8000-14000Da的透析袋透析48h。7. 如权利要求2所述的一种绿色荧光银纳米团簇探针的制备方法，其特征在于，所述 步骤（4)中的硝酸银溶液的浓度为10mmol/L;丝素蛋白溶液与硝酸银溶液的体积比为3:1。8. 如权利要求2所述的一种绿色荧光银纳米团簇探针的制备方法，其特征在于，所述 步骤（5)中的氢氧化钠溶液的浓度为lmol/L;室温下搅拌lOmin，静置8h。9. 如权利要求2所述的一种绿色荧光银纳米团簇探针的制备方法，其特征在于，所述 步骤（6)中离心是以13000r/min转速离心lOmin。10. 如权利要求1-9任一权利要求所述方法制备的绿色荧光银纳米团簇探针在生物硫 醇检测中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种绿色荧光银纳米团簇探针及其制备方法和应用，属于荧光纳米材料制备技术领域。所述的探针是以丝素蛋白作为模板和保护剂，在碱性环境中，利用“一锅法”制得大小均匀、稳定性好、绿色荧光的银纳米团簇。该探针制备方法简单，成本较低，原料广泛易得，具有良好的重复性；而且制得的绿色荧光银纳米团簇探针水溶性好、稳定性强，可应用于尿液中生物硫醇的检测。
【IPC分类】B22F9/24, G01N21/64, B82Y40/00, C09K11/58
【公开号】CN105345025
【申请号】CN201510742674
【发明人】张国梅, 徐婷, 张彩红, 张彦, 双少敏
【申请人】山西大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月4日