专利名称：一种磷灰石中空微球及其制备方法
技术领域：
本发明属于仿生材料制备领域，具体设计一种磷灰石中空微球的制备方法。
背景技术：
随着生物材料的迅猛发展，仿生技术逐步广泛应用于合成特定组分和形貌的生物材料，以使其性能进一步接近天然组织。磷灰石材料是最重要的无机生物材料之一，由于具备与天然骨骼和牙齿的矿物的组成和结构的相似性，具有良好的生物活性、生物降解性和生物相容性，已被广泛应用于骨组织工程和药物输送系统。天然骨组织的无机矿物中存在多种的微量元素，这些微量元素在材料与宿主的相互作用中起了重要的作用，微量元素不仅能够有效改善磷灰石材料的物理化学性能，而且其自身也能够引发一定的生物学反应，例如，锶元素与钙元素具有一定的化学相似性，因此锶元素可取代磷灰石中钙的位置，广泛存在于骨组织中，锶的取代在一定程度上会造成磷灰石晶体结构的不稳定，从而提高了磷灰石的溶解度，同时，锶的取代能够通过抑制破骨细胞，降低骨吸收，促进成骨，刺激成骨细胞的活性和分 化，从而提高材料的生物相容性和生物活性，因此从仿生的角度实现磷灰石材料的离子掺杂对制备新型骨修复材料具有重要的意义。掺锶磷灰石的制备方法有很多，例如固态煅烧法、溶胶凝胶法、水热法等等，这些传统方法的掺锶工艺都相对直接简单，大多将大剂量的锶盐以液体或固体的形式直接加入合成工艺过程中，但参与生命活动的锶元素含量是相当微量的，所有很多传统工艺都往往忽略了对微量掺锶量的有效控制以及其在材料中的均匀分布，这在一定程度上影响锶元素在应用过程中的释放，进而影响材料的生物学性能。
发明内容
本发明的目的在于克服传统工艺的缺点，提供一种利用酵母细胞制成生物模板对微量元素自主吸附的方法，实现对含锶量和掺入位置的有效控制，合成掺锶磷灰石中空微球。本发明的目的通过以下技术方案实现:一种磷灰石中空微球的制备方法，包括如下步骤:(I)将酵母细胞接种在含(TlOmg/ml锶盐的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)中，摇晃培养广3天，转速为16(T200转/分钟，离心纯化后获得富集的酵母细胞；(2)将上述得到的酵母细胞按质量百分比为f 5%的比例，通过层层自组装技术处理，得到自组装的生物模板；(3)将上述的生物模板浸入钙盐和锶盐的摩尔比例为:Sr/(Ca+Sr) =(Tl5%的混合溶液，室温连续搅拌6 24小时，分离后得到吸附金属离子的生物模板；所述钙盐的浓度为0.5 3M ；(4)将上述生物模板浸入0.5^3M的磷盐溶液中，碱性溶液调节pH值约为7 11，室温条件下搅拌处理12 48小时，分离干燥，得到磷灰石/生物模板复合微球；
(5)将上述复合微球在10(T90(TC保温I飞小时，即获得(掺锶)磷灰石中空微球。优选地，步骤(I)所述层层自组装技术处理是将酵母细胞先浸入聚电解质溶液I，连续搅拌15飞0分钟，再浸入聚电解质溶液II中，连续搅拌15飞0分钟，重复上述处理广3次，所述聚电解质溶液1、II的电荷相反。优选地，步骤(I)所述的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)为葡萄糖2wt%、蛋白胨2wt%和酵母提取物0.1 2wt%，余量为水。优选地,步骤(I)所述的酵母细胞为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)或者毕赤酵母(Pichia pastoris)。优选地，所述的钙盐和锶盐分别为氯化钙和氯化锶。优选地，步骤(4)中碱性溶液调节pH值约为10，步骤(5)中微球的煅烧温度为800。。。优选地，所述聚电解质溶液1、II分别为聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和聚丙烯酸的水溶液。优选地，所述聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和聚丙烯酸的水溶液的质量浓度分别为0.5 4%。优选地，所述聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和聚丙烯酸的水溶液的质量浓度均为1%。优选地，所述的磷盐溶液为磷酸氢二铵水溶液，碱性溶液为氨水。与现有技术相比，本发明具有如下优点:1.本发明从仿生学的角度出发，采用微生物细胞作为生物模板内核，通过层层自组装技术、矿化和热处理后，获得一种多孔微球，该微球的主要晶相为磷酸三钙，具有多孔中空结构和良好的细胞相容性，可制成药物载体或人体组织工程支架，应用于骨组织缺损医疗领域。2.利用酵母细胞或者以酵母细胞为基础的生物模板对锶离子的吸附特性，在温和的合成工艺条件下，通过有机基团介导使磷灰石矿物的沉积在生物模板中，热处理去除生物模板后，形成多孔掺锶磷灰石中空微球，简单有效地控制锶元素的微量掺入以及其掺入位置，进而改善磷灰石材料的生物学性能，这在新型骨组织再生修复材料的构建与制备领域有重要的意义。
图1为本发明实施例f 3不同热处理温度的磷灰石中空微球(Al和A2:600°C ；BI 和 B2:7000C ；C1 和 C2:800°C)的 SEM 照片和 XRD 曲线图。图2为本发明实施例3 7不同掺锶磷灰石微球的SEM(A)、毒性测试CCK8图表(B)和EDS元素分布及含量(C)图表，初始钙盐和锶盐混合水溶液摩尔比例为Sr/(Ca+Sr)=0、1、5、10、15%，相对应的产物分别为 Ca+Sr0-CP800、Ca+Srl_CP800、Ca+Sr5_CP800、Ca+Srl0-CP800, Ca+Srl5_CP800。图3为本发明实施例3、7 12不同掺锶磷灰石微球的SEM(A)、毒性测试CCK8图表(B)和EDS元素分布及含量(C)图表，初始锶盐溶液为0,0.4、1.0,2.0,6.0,10.0mg/ml，相对应的产物分别为 YC+Sr0.0-CP800、YC+Sr0.4-CP800、YC+Srl.0-CP800、YC+Sr2.0-CP800、YC+Sr6.0-CP800、YC+Srl0.0-CP800。图4为本发明实施例3和14采用不同细胞制作生物模板获得的磷灰石复合微球(热处理之前)SEM图片，Al和A2采用毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)制备的复合微球，BI和B2米用面包酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)制备的复合微球。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明进一步说明，本发明的保护范围不限于此。实施例1一种磷灰石中空微球的仿生制备方法，其步骤如下:(I)将面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)(蛋白胨2%，葡萄糖2%，酵母浸提物0.5%)中，摇晃培养3天，转速为180转/分钟，离心纯化后获得富集的酵母细胞；(2)将上述得到的酵母细胞按5wt%的比例，先后浸入lwt%聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和lwt%聚丙烯酸的水溶液，各连续搅拌处理20分钟，重复以上步骤一次，得到层层自组装处理的生物模板；(3)将上述的生物模板浸入氯化钙(3M)水溶液，室温连续搅拌24小时，分离后得到吸附金属离子的生物模板；(4)将上述生物模板浸入0.5M的磷酸氢二铵水溶液中，氨水调节pH值约为10，室温连续搅拌24小时，分离干燥，获得磷灰石/生物模板复合微球；(5)将上述复合微球置于马弗炉中，在600°C保温3小时，即获得多孔磷灰石中空微球。实施例2一种磷灰石中空微球的仿生制备方法，其步骤如下:(I)将面包菌种(Saccharomyces cerevisiae)接种在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)(蛋白胨2wt%，葡萄糖2wt%，酵母浸提物0.5wt%)中，摇晃培养3天，转速为180转/分钟，离心纯化后获得富集的酵母细胞；(2)将上述得到的酵母细胞按5wt%的比例，先后浸入lwt%聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和lwt%聚丙烯酸的水溶液，各连续搅拌处理20分钟，重复以上步骤一次，得到层层自组装处理的生物模板；(3)将上述的生物模板浸入氯化钙(3M)水溶液，室温连续搅拌24小时，分离后得到吸附金属离子的生物模板；(4)将上述生物模板浸入0.5M的磷酸氢二铵水溶液中，氨水调节pH值约为10，室温连续搅拌24小时，分离干燥，获得磷灰石/生物模板复合微球；(5)将上述复合微球置于马弗炉中，在700°C保温3小时，即获得多孔磷灰石中空微球。实施例3—种磷灰石中空微球的仿生制备方法，其步骤如下:(I)将面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)(蛋白胨2wt%，葡萄糖2wt%，酵母浸提物0.5wt%)中，摇晃培养3天，转速为180转/分钟，离心纯化后获得富集的酵母细胞；(2)将上述得到的酵母细胞按5wt%的比例，先后浸入lwt%聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和lwt%聚丙烯酸的水溶液，各连续搅拌处理20分钟，重复以上步骤一次，得到层层自组装处理的生物模板；(3)将上述的生物模板浸入氯化钙(3M)水溶液，室温连续搅拌24小时，分离后得到吸附金属离子的生物模板；(4)将上述生物模板浸入0.5M的磷酸氢二铵水溶液中，氨水调节pH值约为10，室温连续搅拌24小时，分离干燥，获得磷灰石/生物模板复合微球；(5)将上述复合微球置于马弗炉中，在800°C保温3小时，即获得多孔磷灰石中空微球。实施例4一种掺锶磷灰石中空微球的仿生制备方法，其步骤如下:(I)将面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)(蛋白胨2wt%，葡萄糖2wt%，酵母浸提物0.5wt%)中，摇晃培养3天，转速为180转/分钟，离心纯化后获得富集的酵母细胞；(2)将上述得到的酵母细胞按5wt%的比例，先后浸入lwt%聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和lwt%聚丙烯酸的水溶液，各连续搅拌处理20分钟，重复以上步骤一次，得到层层自组装处理的生物模板；(3)将上述的生物模板浸入氯化钙(3M)和氯化锶(锶离子摩尔比例为:Sr/(Ca+Sr) =1%)的混合溶液，室温连续搅拌24小时，分离后得到吸附金属离子的生物模板；(4)将上述生物模板浸入0.5M的磷酸氢二铵水溶液中，氨水调节pH值约为10，室温连续搅拌24小时，分离干燥，获得掺锶磷灰石/生物模板复合微球；(5)将上述复合微球置于马弗炉中，在800°C保温3小时，即获得掺锶多孔磷灰石中空微球。通过电子探针技术(EDS)测得该微球中锶元素含量为0.38±0.04At%。实施例5一种掺锶磷灰石中空微球的仿生制备方法，其步骤如下:(I)将面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)(蛋白胨2wt%，葡萄糖2wt%，酵母浸提物0.5wt%)中，摇晃培养3天，转速为180转/分钟，离心纯化后获得富集的酵母细胞；(2)将上述得到的酵母细胞按5wt%的比例，先后浸入lwt%聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和lwt%聚丙烯酸的水溶液，各连续搅拌处理20分钟，重复以上步骤一次，得到层层自组装处理的生物模板；(3)将上述的生物模板浸入氯化钙(3M)和氯化锶(锶离子摩尔比例为:Sr/(Ca+Sr) =5%)的混合溶液，室温连续搅拌24小时，分离后得到吸附金属离子的生物模板；(4)将上述生物模板浸入0.5M的磷酸氢二铵水溶液中，氨水调节pH值约为10，室温连续搅拌24小时，分离干燥，获得掺锶磷灰石/生物模板复合微球；(5)将上述复合微球置于马弗炉中，在800°C保温3小时，即获得掺锶多孔磷灰石中空微球。通通过电子探针技术(EDS)测得该微球中锶元素含量为1.33±0.14At%。实施例6
一种掺锶磷灰石中空微球的仿生制备方法，其步骤如下:(I)将面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD )(蛋白胨2wt %，葡萄糖2wt %，酵母浸提物0.5wt % )中，摇晃培养3天，转速为180转/分钟，离心纯化后获得富集的酵母细胞；(2)将上述得到的酵母细胞按5wt%的比例，先后浸入lwt%聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和lwt%聚丙烯酸的水溶液，各连续搅拌处理20分钟，重复以上步骤一次，得到层层自组装处理的生物模板；(3)将上述的生物模板浸入氯化钙(3M)和氯化锶(锶离子摩尔比例为:Sr/(Ca+Sr) =10%)的混合溶液，室温连续搅拌24小时，分离后得到吸附金属离子的生物模板；(4)将上述生物模板浸入0.5M的磷酸氢二铵水溶液中，氨水调节pH值约为10，室温连续搅拌24小时，分离干燥，获得掺锶磷灰石/生物模板复合微球；(5)将上述复合微球置于马弗炉中，在800°C保温3小时，即获得掺锶多孔磷灰石中空微球。通过电子探针技术(EDS)测得该微球中锶元素含量为2.32±0.25At%。实施例7一种掺锶磷灰石中空微球的仿生制备方法，其步骤如下:(I)将面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)(蛋白胨2wt%，葡萄糖2wt%，酵母浸提物0.5wt%)中，摇晃培养3天，转速为180转/分钟，离心纯化后获得富集的酵母细胞；(2)将上述得到的酵母细胞按5wt%的比例，先后浸入lwt%聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和lwt%聚丙烯酸的水溶液，各连续搅拌处理20分钟，重复以上步骤一次，得到层层自组装处理的生物模板；(3)将上述的生物模板浸入氯化钙(3M)和氯化锶(锶离子摩尔比例为:Sr/(Ca+Sr) =15%)的混合溶液，室温连续搅拌24小时，分离后得到吸附金属离子的生物模板；(4)将上述生物模板浸入0.5M的磷酸氢二铵水溶液中，氨水调节pH值约为10，室温连续搅拌24小时，分离干燥，获得掺锶磷灰石/生物模板复合微球；(5)将上述复合微球置于马弗炉中，在800°C保温3小时，即获得掺锶多孔磷灰石中空微球。通过电子探针技术(EDS)测得该微球中锶元素含量为3.33±0.05At%。实施例8一种掺锶磷灰石中空微球的仿生制备方法，其步骤如下:(I)将面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种在含0.4mg/ml氯化银的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)(蛋白胨2wt%，葡萄糖2wt%，酵母浸提物0.5wt%)中，摇晃培养3天，转速为180转/分钟，离心纯化后获得富集的酵母细胞；(2)将上述得到的酵母细胞按5wt%的比例，先后浸入lwt%聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和lwt%聚丙烯酸的水溶液，各连续搅拌处理20分钟，重复以上步骤一次，得到层层自组装处理的生物模板；(3)将上述的生物模板浸入氯化钙(3M)水溶液，室温连续搅拌24小时，分离后得到吸附金属离子的生物模板；(4)将上述生物模板浸入0.5M的磷酸氢二铵水溶液中，氨水调节pH值约为10，室温连续搅拌24小时，分离干燥，获得掺锶磷灰石/生物模板复合微球；
(5)将上述复合微球置于马弗炉中，在800°C保温3小时，即获得掺锶多孔磷灰石中空微球。通过电子探针技术(EDS)测得该微球中锶元素含量为0.18±0.04At%。实施例9一种掺锶磷灰石中空微球的仿生制备方法，其步骤如下:(I)将面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种在含1.0mg/ml氯化银的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)(蛋白胨2%，葡萄糖2%，酵母浸提物0.5%)中，摇晃培养3天，转速为180转/分钟，离心纯化后获得富集的酵母细胞；(2)将上述得到的酵母细胞按5wt%的比例，先后浸入1%聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和lwt%聚丙烯酸的水溶液，各连续搅拌处理20分钟，重复以上步骤一次，得到层层自组装处理的生物模板；(3)将上述的生物模板浸入氯化钙(3M)水溶液，室温连续搅拌24小时，分离后得到吸附金属离子的生物模板；(4)将上述生物模板浸入0.5M的磷酸氢二铵水溶液中，氨水调节pH值约为10，室温连续搅拌24小时，分离干燥，获得掺锶磷灰石/生物模板复合微球；(5)将上述复合微球置于马弗炉中，在800°C保温3小时，即获得掺锶多孔磷灰石中空微球。通过电子探针技术(EDS)测得该微球中锶元素含量为0.39±0.06At%。实施例10一种掺锶磷灰石中空微球的仿生制备方法，其步骤如下:(I)将面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种在含2.0mg/ml氯化银的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)(蛋白胨2wt%，葡萄糖2wt%，酵母浸提物0.5wt%)中，摇晃培养3天，转速为180转/分钟，离心纯化后获得富集的酵母细胞；(2)将上述得到的酵母细胞按5wt%的比例，先后浸入lwt%聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和lwt%聚丙烯酸的水溶液，各连续搅拌处理20分钟，重复以上步骤一次，得到层层自组装处理的生物模板；(3)将上述的生物模板浸入氯化钙(3M)水溶液，室温连续搅拌24小时，分离后得到吸附金属离子的生物模板；(4)将上述生物模板浸入0.5M的磷酸氢二铵水溶液中，氨水调节pH值约为10，室温连续搅拌24小时，分离干燥，获得掺锶磷灰石/生物模板复合微球；(5)将上述复合微球置于马弗炉中，在800°C保温3小时，即获得掺锶多孔磷灰石中空微球。通过电子探针技术(EDS)测得该微球中锶元素含量为0.47±0.03At%。实施例11一种掺锶磷灰石中空微球的仿生制备方法，其步骤如下:(I)将面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种在含6.0mg/ml氣化银的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)(蛋白胨2wt%，葡萄糖2wt%，酵母浸提物0.5wt%)中，摇晃培养3天，转速为180转/分钟，离心纯化后获得富集的酵母细胞；(2)将上述得到的酵母细胞按5wt%的比例，先后浸入lwt%聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和lwt%聚丙烯酸的水溶液，各连续搅拌处理20分钟，重复以上步骤一次，得到层层自组装处理的生物模板；(3)将上述的生物模板浸入氯化钙(3M)水溶液，室温连续搅拌24小时，分离后得到吸附金属离子的生物模板；(4)将上述生物模板浸入0.5M的磷酸氢二铵水溶液中，氨水调节pH值约为10，室温连续搅拌24小时，分离干燥，获得掺锶磷灰石/生物模板复合微球；(5)将上述复合微球置于马弗炉中，在800°C保温3小时，即获得掺锶多孔磷灰石中空微球。通过电子探针技术(EDS)测得该微球中锶元素含量为0.24±0.02At%。实施例12一种掺锶磷灰石中空微球的仿生制备方法，其步骤如下:(I)将面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种在含10.0mg/ml氯化银的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)(蛋白胨2wt%，葡萄糖2wt%，酵母浸提物0.5wt%)中，摇晃培养3天，转速为180转/分钟，离心纯化后获得富集的酵母细胞；(2)将上述得到的酵母细胞按5wt%的比例，先后浸入lwt%聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和lwt%聚丙烯酸的水溶液，各连续搅拌处理20分钟，重复以上步骤一次，得到层层自组装处理的生物模板；(3)将上述的生物模板浸入氯化钙(3M)水溶液，室温连续搅拌24小时，分离后得到吸附金属离子的生物模板；(4)将上述生物模板浸入0.5M的磷酸氢二铵水溶液中，氨水调节pH值约为10，室温连续搅拌24小时，分离干燥，获得掺锶磷灰石/生物模板复合微球；(5)将上述复合微球置于马弗炉中，在800°C保温3小时，即获得掺锶多孔磷灰石中空微球。通过电子探针技术(EDS)测得该微球中锶元素含量为0.17±0.03At%。实施例13一种掺锶磷灰石中空微球的仿生制备方法，其步骤如下:(I)将面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种在含2.0mg/ml氣化银的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)(蛋白胨2wt%，葡萄糖2wt%，酵母浸提物0.5wt%)中，摇晃培养3天，转速为180转/分钟，离心纯化后获得富集的酵母细胞；(2)将上述得到的酵母细胞按5wt%的比例，先后浸入lwt%聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和lwt%聚丙烯酸的水溶液，各连续搅拌处理20分钟，重复以上步骤一次，得到层层自组装处理的生物模板；(3)将上述的生物模板浸入氯化钙(3M)和氯化锶(锶离子摩尔比例为:Sr/(Ca+Sr) =5%)的混合溶液，室温连续搅拌24小时，分离后得到吸附金属离子的生物模板；(4)将上述生物模板浸入0.5M的磷酸氢二铵水溶液中，氨水调节pH值约为10，室温连续搅拌24小时，分离干燥，获得掺锶磷灰石/生物模板复合微球；(5)将上述复合微球置于马弗炉中，在800°C保温3小时，即获得掺锶多孔磷灰石中空微球。通过电子探针技术(EDS)测得该微球中锶元素含量为1.93±0.08At%。实施例14一种磷灰石中空微球的仿生制备方法，其步骤如下:(I)将毕赤酵母(Pichia pastoris)接种在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)(蛋白胨2%，葡萄糖2%，酵母浸提物0.5%)中，摇晃培养3天，转速为180转/分钟，离心纯化后获得富集的酵母细胞；(2)将上述得到的酵母细胞按5wt%的比例，先后浸入lwt%聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和lwt%聚丙烯酸的水溶液，各连续搅拌处理20分钟，重复以上步骤一次，得到层层自组装处理的生物模板；(3)将上述的生物模板浸入氯化钙(3M)水溶液，室温连续搅拌24小时，分离后得到吸附金属离子的生物模板；(4)将上述生物模板浸入0.5M的磷酸氢二铵水溶液中，氨水调节pH值约为10，室温连续搅拌24小时，分离干燥，获得磷灰石/生物模板复合微球；(5)将上述复合微球置于马弗炉中，在800°C保温3小时，即获得多孔磷灰石中空微球。通过上述实验，实施例f 3可获得不同煅烧温度下的多孔磷灰石中空微球，该微球在800°C煅烧后其主晶相为磷酸三钙，如图1所示。实施例4 7可获得掺锶量为0.38^3.33At%的多孔磷灰石中空微球，锶元素的掺入通过生物模板在矿化过程中对阳离子的吸附作用，细胞毒性实验采用CCK8检测方法(将粉体与人骨髓间质干细胞共混培养，在37°C，5% CO2的恒温培养箱中静置培养，分别在1、3、7天采用CCK8试剂检测450nm的吸光度，采用6%苯酚溶液和空白孔板分别作为阳性对照组和阴性对照组，实验组各样品的粉体浓度为200 y g/ml)，该实验结果表明细胞的增殖情况良好，实验组各样品对细胞无明显毒性，说明粉体与细胞具有良好相容性，如图2所示。实施例8 12可获得掺锶量为0.18^0.47At%的多孔磷灰石中空微球，锶元素的掺入通过酵母细胞在增殖过程中对阳离子的吸附作用，细胞毒性实验采用CCK8检测方法(将粉体与人骨髓间质干细胞共混培养，在37°C,5% CO2的恒温培养箱中静置培养,分别在1、
3、7天采用CCK8试剂检测450nm的吸光度，采用6%苯酚溶液和空白孔板分别作为阳性对照组和阴性对照组， 实验组各样品的粉体浓度为200 y g/ml)，该实验结果表明细胞的增殖情况良好，实验组各样品对细胞无明显毒性，说明粉体与细胞具有良好相容性，如图3所不。实施例3和14可分别获得以面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)制作生物模板的磷灰石复合微球(热处理之前),该微球的尺寸约为
1.5 ii m,而以面包酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)制作生物模板磷灰石复合微球，其尺寸约为5iim,如图4所示。
权利要求
1.一种磷灰石中空微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将酵母细胞接种在含(TlOmg/ml锶盐的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中，摇晃培养1^3天，转速为16(T200转/分钟，离心纯化后获得富集的酵母细胞； (2)将上述得到的酵母细胞按质量百分比为f5%的比例，通过层层自组装技术处理，得到自组装的生物模板； (3)将上述的生物模板浸入钙盐和锶盐的摩尔比例为:Sr/(Ca+Sr)=(Tl5%的混合溶液，连续搅拌6 24小时，分离后得到吸附金属离子的生物模板；所述钙盐的浓度为0.5 3M ； (4)将上述生物模板浸 入0.5^3M的磷盐溶液中，碱性溶液调节pH值为7 11，搅拌处理12^48小时，分离干燥，得到磷灰石/生物模板复合微球； (5)将上述复合微球在10(T90(TC保温I飞小时，即获得磷灰石中空微球。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述层层自组装技术处理是将酵母细胞先浸入聚电解质溶液I，连续搅拌15飞0分钟，再浸入聚电解质溶液II中，连续搅拌15飞0分钟，重复上述处理f 3次，所述聚电解质溶液1、II的电荷相反。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基为葡萄糖2wt%、蛋白胨2wt%和酵母提取物0.1 2wt%，余量为水。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述的酵母细胞为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)或者毕赤酵母(Pichiapastoris)。
5.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述的钙盐和锶盐分别为氯化钙和氯化银。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(4)中碱性溶液调节pH值为10，步骤(5)中微球的煅烧温度为800°C。
7.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述聚电解质溶液1、II分别为聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和聚丙烯酸的水溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和聚丙烯酸的水溶液的质量浓度分别为0.5 4%。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述聚二甲基二烯丙基氯化铵的水溶液和聚丙烯酸的水溶液的质量浓度均为1%。
10.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述的磷盐溶液为磷酸氢二铵水溶液，碱性溶液为氨水。
全文摘要
本发明公开了一种磷灰石中空微球及其制备方法，包括如下步骤将酵母细胞接种在含0~10mg/ml锶盐的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中，摇晃培养1~3天，离心纯化后获得富集的酵母细胞；将酵母细胞通过层层自组装技术处理，得到自组装的生物模板；将生物模板浸入钙盐和锶盐的摩尔比例为Sr/(Ca+Sr)=0~15%的混合溶液，连续搅拌，分离后得到吸附金属离子的生物模板；将上述生物模板浸入磷盐溶液中，调pH值，搅拌，分离干燥，得到复合微球；将上述复合微球在100~900℃保温1~6小时，即获得磷灰石中空微球。该微球具有多孔中空结构和良好的细胞相容性，可制成药物载体或人体组织工程支架，应用于骨组织缺损医疗领域。
文档编号C01B25/32GK103120921SQ201210560470
公开日2013年5月29日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者王迎军, 黄淼俊, 赵娜如, 杜昶 申请人:华南理工大学