由蘑菇制备碳点的方法及其碳点和应用与流程

本发明属于发光材料的制备技术领域，涉及一种由蘑菇制备碳点的方法，还涉及由该方法制得的碳点，以及该碳点的应用。

背景技术：

近年来，作为碳纳米材料家族中一名新兴的重要成员，碳点受到越来越多的关注。除了具有类似于传统的半导体量子点的优良的光学性能，碳点还具有光稳定性好、毒性低、良好的生物相容性和环境友好性、制备条件温和、步骤简单、原料丰富廉价等传统量子点无可比拟的优点。目前，碳点的研究重点集中在寻找简便的制备方法以及在荧光分析中的应用。

碳点的合成一般分为自上而下法（如电弧放电法、激光消融法、电化学合成法和酸氧化法等）和自下而上法（如微波法、水热法和超声法等）两大类。自上而下法通过物理或者化学的方法将大块的碳材料由大变小，尺寸直到纳米级。自下而上法是以小尺寸的含碳有机物为碳源，通过小分子有序或者无序的组装结合由小变大，从而达到一定的尺寸来制备碳点。这两类方法制备出来的碳点都表现出优良的发光特性。制备碳点所使用的碳源基本上可以分为无机碳源和有机碳源两大类。无机碳源主要有蜡烛灰、石墨粉、活性炭、碳纳米管和碳纤维等。在用无机碳源制备碳点时，主要采用自上而下法。有机碳源有葡萄糖、氨基酸等含碳的有机化学试剂以及草、果皮、红薯、咖啡渣、辣椒、苹果和甘蔗等绿色环保的自然产物。在用有机碳源制备碳点时主要采用自下而上法，最常用的方法有水热法和微波法。但迄今为止，尚未见以菇类为碳源制备碳点的方法报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于利用自然界广泛存在的原生植物资源蘑菇做碳源，通过简单的水热法制备碳点，绿色环保。

经研究，本发明提供如下技术方案：

1．由蘑菇制备碳点的方法，其特征在于，将蘑菇粉与水按0.08g~0.1g：1ml的比例混合后，180-200℃反应5-7小时制得碳点。

更优选的，将蘑菇粉与水按0.1g：1ml的比例混合后，200℃反应6小时制得碳点。

优选的，将反应液冷却，离心，收集上清液，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液用截留分子量为100的透析袋透析后，干燥，得到碳点粉末。

更优选的，将反应液冷却，10000rpm离心15分钟，收集上清液，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液用截留分子量为100的透析袋透析24小时后，冷冻干燥，得到碳点粉末。

优选的，所述蘑菇粉是将新鲜蘑菇于60℃~80℃干燥24~48小时后，用研钵研磨成粉末。

．采用上述方法制得的碳点。

．所述碳点在细胞成像方面的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种由蘑菇制备碳点的方法，利用自然界广泛存在的原生植物资源蘑菇做碳源，通过简单的水热法制备碳点，绿色环保，所得碳点具有良好的荧光性能，还具有光稳定性好、毒性低、生物相容性好等优点，在细胞成像等方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1由蘑菇制备碳点的方法示意图。

图2碳点的表征：（a）碳点的荧光激发和发射光谱，其中插图为碳点分散液在可见光（i）和紫外光（ii）下的照片；（b）碳点的高分辨率透射电镜图；（c）碳点的红外光谱；（d）碳点的x射线能谱。

图3碳点在不同激发波长下的发射光谱。

图4碳点的稳定性考察：（a）抗盐能力考察；（b）不同ph值条件下的稳定性考察；（c）稳定时间考察；（d）不同有机试剂中的稳定性考察。

图5不同浓度的碳点对ckk-8细胞的毒性考察。

图6由蘑菇制备碳点的条件优化：（a）反应时间优化；（b）反应温度优化。

图7（a）紫外灯下的nacl（左）和碳点（右）；（b）日光灯下的nacl（左）和碳点（右）。

图8（a）紫外灯下未涂抹碳点分散液的脱脂棉（左）和涂抹碳点分散液的脱脂棉（右）；（b）紫外灯下未涂抹碳点分散液的滤纸（左）和涂抹碳点分散液的滤纸（右）。

图9碳点在人肺腺癌细胞a549中的荧光图像：（a）为细胞明场照片；（b）为碳点标记细胞荧光成像（激发波长为488nm）；（c）为明场和荧光像叠加照片。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。

优选实施例中使用的主要试剂如下：蘑菇购自重庆市北碚区永辉超市；甲醇（methanol）、乙醇（ethanol）、丙酮（acetone）、乙酸（aceticacid）、乙腈（acetonitrile）、二甲基亚砜（dimethylsulfoxide）、四氢呋喃（tetrahydrofuran）和三氯乙烷（trichloroethane）购自成都科龙化工试剂厂；磷酸氢二钠（na2hpo4）、磷酸二氢钠（nah2po4）、冰醋酸（hac）、磷酸（h3po4）、硼酸（h3bo3）、氢氧化钠（naoh）和氯化钠（nacl）购自北京鼎国生物科技有限公司；实验用水为超纯水（millipore，18.25mω）。

优选实施例中使用的主要仪器如下：fa2004a电子天平（上海精天电子仪器有限公司），25ml聚四氟乙烯水热反应釜（中国济南恒化科技有限公司），f-7000型荧光分光光度计（日本日立公司），tecnaig2f20s-twin型透射电子显微镜（美国fei公司），escalab250型x-射线光电子能谱仪（美国thermo公司），prestige-21傅立叶红外光谱仪（日本岛津公司），pilofd8-4.3v型冷冻干燥仪（美国西盟国际公司），dhg-9140a电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司），upt实验室超纯水器（中国西安优普仪器设备有限公司），tg16-w微量高速离心机。

实施例1、以蘑菇为碳源制备碳点

1、碳点的制备

如图1所示，将新鲜蘑菇于80℃干燥24小时后，用研钵研磨成粉末；取蘑菇粉0.6g，加入超纯水6ml，混匀，置25ml聚四氟乙烯不锈钢反应釜中，200℃反应6小时；所得反应液冷却至室温，10000rpm离心15分钟，收集上清液，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液用截留分子量（mwco）为100的透析袋透析24小时后，冷冻干燥得到碳点粉末；将碳点粉末用超纯水分散，得到1μg/ml的碳点分散液，4℃保存。

2、碳点的表征

碳点的最佳激发波长为370nm，最佳发射波长为455nm（图2a），其在可见光下呈微黄色（图2a中的插图i），在365nm紫外光下发出青色荧光（图2a中的插图ii）。

使用高分辨率透射电镜观察碳点的形貌特征（图2b），可见碳点具有良好的分散性，平均直径为2.3±1.3nm。

使用傅里叶红外光谱分析碳点的表面结构（图2c），3438cm^-1处的峰归因于o-h伸缩振动，1678cm^-1处的峰归因于c=o伸缩振动，2964cm^-1处的峰归因于n-h伸缩振动，显示碳点的表面存在羧基、羟基、氨基等特征官能团。

使用x-射线电子能谱进行碳点的表面成分和元素分析（图2d），可见谱图上主要存在c、n和o三种类型的峰（284.6，399.8和531.4ev分别来自于c1s，n1s和o1s），说明碳点掺杂n。

碳点的荧光波长随着激发波长的增加有明显的红移现象，当激发波长从370nm增加到450nm，碳点的发射波长从370nm增加到450nm（图3）。

3、碳点的稳定性考察

（1）抗盐能力考察：取碳点分散液，加入不同终浓度（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mol/l）的氯化钠，孵育，在波长455nm处测定荧光强度。结果如图4a所示，碳点的荧光强度在体系中氯化钠浓度逐渐增大的情况下未发生明显改变，表明其具有较高的抗盐能力。

（2）不同ph值条件下的稳定性考察：取碳点分散液，在不同ph值（2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12）条件下孵育后，在波长455nm处测定荧光强度，结果如图4b所示，碳点的荧光强度在不同ph值条件下略有改变，总体较为稳定，最佳孵育ph值为7。

（3）稳定时间考察：取碳点分散液，孵育不同时间（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小时）后，在波长455nm处测定荧光强度。结果如图4c所示，碳点的荧光强度在12小时内稳定，不随时间的变化而变化。

（4）不同有机试剂中的稳定性考察：取碳点分散液，在不同有机试剂（甲醇、乙醇、丙酮、乙酸、乙腈、二甲基亚砜、四氢呋喃、三氯乙烷）中孵育后，在波长455nm处测定荧光强度。结果如图4d所示，碳点在大多数有机试剂中保持稳定。

4、碳点的毒性考察

取已过滤除菌的10mg/ml碳点分散液，用新鲜1640培养液稀释至终浓度分别为2.5、2.0、1.5、1.0、0.5mg/ml。取对数生长的ckk-8细胞接种于60mm细胞培养皿，共6皿，放入细胞培养箱孵育24h使细胞进入对数生长期，吸除各培养皿内培养液，分别加入前述不同浓度的碳点稀释液3ml，同时设置溶剂对照组（加入以生理盐水替代碳点分散液的1640培养液3ml），放入细胞培养箱培养24小时。结果如图5所示，即使在高剂量（2.5mg/ml）和长时间孵育（24小时）条件下，碳点也几乎不对细胞产生毒性，表现出良好的生物相容性。

5、碳点的荧光性

取冷冻干燥得到的碳点粉末，分别在紫外灯与日光灯下与nacl进行比较。结果如图6所示，碳点粉末在紫外灯下表现出明显的荧光（图6a），在日光灯下与nacl也存在明显的颜色差别（图6b）。

将碳点分散液分别涂抹在脱脂棉和滤纸上，在紫外灯下与未涂抹碳点分散液的脱脂棉和滤纸进行比较。结果如图7所示，在紫外灯下，涂抹碳点分散液的脱脂棉和滤纸与未涂抹碳点分散液的脱脂棉和滤纸有明显的荧光差异。

实施例2、以蘑菇为碳源制备碳点的条件优化

1、反应时间优化

按实施例1所述方法，于200℃分别反应4、5、6、7、8、9小时制备碳点。结果如图8a所示，反应5-7小时制得的碳点的荧光效果较好，反应时间最佳为6小时。

2、反应温度优化

按实施例1所述方法，分别于120、140、160、180、200℃反应6小时制备碳点。结果如图8b所示，180-200℃反应制得的碳点的荧光效果较好，反应温度最佳为200℃。

实施例3、以蘑菇为碳源制得的碳点在细胞成像方面的应用

将人肺腺癌细胞（a549细胞）接种于96微孔板中的6个孔，每孔加入封闭液后，放入湿盒中，再放入37℃、5%co2培养箱中孵育30分钟，取出96微孔板，先用0.01mol/l的磷酸缓冲液洗去封闭液，再用滤纸将孔板周围液体吸干，将实施例1制得的碳点分散液与6个孔中a549细胞在37℃、5%co2培养箱孵育1小时，用0.01mol/l的磷酸缓冲液洗涤，然后置荧光显微镜下观察细胞的标记情况。

碳点标记a549细胞结果如图9所示，可以看到在荧光显微镜下a549细胞呈现出明显的绿色荧光，说明本发明制得的碳点可以作为荧光染料用于细胞成像。

上述试验结果说明，本发明以蘑菇为碳源制得的碳点具有良好的荧光性能，还具有光稳定性好、毒性低、生物相容性好等优点，在细胞成像等方面具有良好的应用前景。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。