专利名称：一种o的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种由保藏号为CGMCC 0827的杂交瘤细胞分泌，且特异性结合O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)上KRTTLDSPLGKLE(C)序列的单克隆抗体。本发明还涉及分泌特异性结合O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶上的表位KRTTLDSPLGKLE(C)的单克隆抗体之杂交瘤细胞系CGMCC 0827。本发明还涉及一种制备本发明所述单克隆抗体的方法，以及所述单克隆抗体用于制备鉴定样品中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的水平检测试剂盒的用途。本发明进一步涉及一种利用所述试剂盒检测待测样品中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶水平的方法。
背景技术：
恶性肿瘤长期以来一直是威胁人类健康和生命的主要疾病之一。手术、化疗、放疗是目前治疗恶性肿瘤的三种主要手段，其中以化疗最为常用，在治疗恶性肿瘤过程中发挥重要的作用。
众所周知，化疗面临的最大问题是克服耐药性问题。具体的说，由于患者的具体情况不同，往往存在个体差异，即在化疗过程中不同患者对同一种化疗剂会呈现不同的反应，因而治疗效果差异很大。现阶段临床医生主要是凭经验根据肿瘤的类型和恶性程度等指标为患者选择化疗药物，制定化疗方案，在化疗之前往往无法预见选择的药物是否有效，因而有很大的盲目性。
如何根据病人的具体情况选择化疗药物、提高药物对肿瘤的杀伤作用，使医生在治疗之前就能预见到化疗效果，做到胸有成竹、对症下药，是临床化疗中最迫切希望解决的问题。揭示肿瘤耐药的分子机理是解决肿瘤预见性化疗难点的关键环节。
作为化疗过程中常用化疗药之烷化剂中的一种，亚硝脲类药物(常用的有嘧啶亚硝脲，双氯乙基亚硝脲，环氯乙基亚硝脲，链脲菌素等)因其具有高度脂溶性，容易通过血脑屏障等的优点，是治疗脑瘤的首选药物，并常用于其他各种肿瘤的化疗，如恶性肿瘤的脑脊髓转移，白血病，何杰森氏病，淋巴瘤，肺癌，乳腺癌，恶性黑色素瘤，胃癌，直肠癌，食管癌，及网状细胞肉瘤等。
亚硝脲类药物对肿瘤细胞的杀伤是通过在肿瘤细胞内释放出活泼的烷化基团，攻击靶分子，造成DNA损伤。其中最严重的损伤是DNA鸟嘌呤碱基第6位氧原子烷基化，产生O6-烷基鸟嘌呤-DNA，可进一步引起碱基错配、DNA链断裂和链间交联，最终导致肿瘤死亡。研究发现细胞中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶能够修复亚硝脲药物造成的DNA烷基化损伤，从而对抗亚硝脲的杀伤作用，使肿瘤细胞对亚硝脲药物产生耐药性。
1987年，本发明人领导的课题组开始进行甲基转移酶与肿瘤预见性化疗关系的研究。通过一系列的细胞和动物实验，证实肿瘤细胞中MGMT水平决定其对亚硝脲药物的耐药性。研究发现，患者的MGMT蛋白水平与临床化疗效果密切相关，肿瘤细胞MGMT蛋白水平越低，使用亚硝脲治疗，病人肿瘤明显缩小、治愈率高，反之，MGMT蛋白水平越高，使用亚硝脲治疗效果不好。可见，检测MGMT蛋白水平对预见亚硝脲化疗效果，实现个体化治疗具有重要意义。
令人遗憾的是，国内外较多采用的检测肿瘤细胞MGMT活性之同位素示踪法具有明显的缺陷需新鲜组织，无法分辩癌旁组织和肿瘤组织的MGMT活性；而且价格高，操作复杂，费时，原材料需进口，会造成同位素污染，难以在临床上推广应用。
使用单克隆抗体检测MGMT的研究一直没有能够用于临床。美国Brent研究组用SDS聚丙烯酰胺凝胶纯化技术获得变性的MGMT蛋白，在此基础上制备单克隆抗体，所产生的抗体只能识别用SDS变性的MGMT，因而不适合用于分析肿瘤细胞中的MGMT蛋白(Proceedings ofThe American Association for Cancer Research，1989；30486；CancerRes.1990；5058-61；Cancer Communications.1989；1323-327)。大约在同时，美国Yarosh(Cancer Research.1988；291)等试图用部分纯化并在玻璃滤膜上变性的MGMT制备抗体。虽然制备的抗血清能在Western印迹实验中识别MGMT，但不能识别细胞中有活性的MGMT，也未实际应用。
1991年美国的Pegg等尝试用合成多肽生产MGMT多克隆抗体。所获6个抗血清能在Western印迹实验中与MGMT结合。但均不能与活性蛋白结合(Carcinogenesis.1991；12(9)1671-1677；Carcinogenesis，1991；12(9)1679-1683)。Bigner/Brent研究组用MGMT氨基酸序列中不同部位的合成肽片段生产MGMT多克隆抗体。他们用了三个亲水片段和一个活性中心Cys残基附近的片段。四种多抗都能够与失活的(甲基化的)MGMT结合，两个能够用于Western印迹试验，只有1个能够与活性蛋白结合。因不同动物对抗原的反应不一样，多克隆抗体很难用于商业化的肿瘤标本检测(Cancer Res.1991；513339-3344)。
1995年Yarosh等，采用温和的方法制备MGMT蛋白，用所得具有转移酶活性的MGMT制备单克隆抗体，结果表明所制备的MGMT单克隆抗体不仅能够与无活性的MGMT反应，而且能与细胞内有活性的MGMT反应。1992年新加坡的Li等用重组的人MGMT免疫动物生产单克隆抗体，可用于检测MGMT活性(Cancer Res.1992；33547)，所生产的单克隆抗体有很好的特异性，不与鼠的MGMT交叉反应。
目前，国内外尚无用MGMT主要抗原表位合成多肽，免疫小鼠生产MGMT单克隆抗体的报道，更无用此方法生产出可与有活性MGMT反应的单克隆抗体的报道。也未见利用所述单克隆抗体制备的临床使用的检测试剂盒。
本发明人通过分析确定及化学合成MGMT优势抗原表位，制备出抗人MGMT单克隆抗体。本发明人进一步利用所述单克隆抗体制备MGMT检测试剂盒。所得检测试剂盒具有操作简单、快速，特异性好，无污染等优点，可准确诊断肿瘤细胞MGMT蛋白表达水平，指导临床对MGMT活性不同的肿瘤，采取不同的化疗方案，提高疗效，减轻病人痛苦和经济负担。
发明内容
本发明的一个方面，公开了一种O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的单克隆抗体或其具有特异性结合O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的生物活性的片段，其特征在于所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC0827的杂交瘤细胞分泌，其特异性结合O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶上KRTTLDSPLGKLE(C)序列。
本发明的又一方面涉及一种杂交瘤细胞系，其分泌特异性结合O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶上KRTTLDSPLGKLE(C)序列的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞系具有保藏号CGMCC 0827。
本发明的再一方面，涉及一种制备本发明所述单克隆抗体的方法，其包括1)化学合成KRTTLDSPLGKLE(C)肽；2)将1)中所得肽与钥孔血蓝蛋白结合制备半抗原；3)由所得抗原免疫动物，通过杂交瘤技术，得到杂交瘤细胞4)培养所述杂交瘤细胞，制备本发明所述单克隆抗体。
本发明还涉及本发明所述单克隆抗体用于制备鉴定样品中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的水平检测试剂盒的用途。
本发明还涉及一种鉴定样品中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的水平之免疫组织化学检测试剂盒，其中含有诊断有效量的本发明所述单克隆抗体，还含有用于免疫组织化学反应的缓冲液、二抗、底物、染液。
本发明进一步涉及一种检测待测样品中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶水平的方法，包括1)在能够使所述待测样品中与本发明所述单克隆抗体发生相互作用的条件下，使待测样品与本发明所述单克隆抗体相接触足够发生相互作用的一段时间；2)加入能够与本发明所述单克隆抗体发生相互作用的第二抗体，使二者在足够发生相互作用的条件下相互作用足够的时间，3)加入针对第二抗体的检测试剂，以检测样品中MGMT的水平。
具体的，由公开的文献报道可知(Pegg AE，Wiest L，Mummert C，Stine L，Dolan ME.，Carcinogenesis.1991；12(9)1671-1677)，MGMT之mRNA全长约950bp，编码207个氨基酸，MGMT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。
事实上，本领域技术人员知晓，本发明所述O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶也常常称为O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶。
根据抗原和抗体结合的原理，一个好的抗体应能够与天然抗原表面的表位特异的结合。Pegg等人(Carcinogenesis，vol12(9)，1679-1683，1991)研究表明，上述MGMT氨基酸序列中仅有氨基酸残基1-11的表位具有理想的抗原抗体结合性质。
依据多肽的亲水性和表面可能性的数值越高，说明其越可能位于MGMT蛋白的表面，而抗原指数则反映多肽作为抗原决定簇的可能性的理论，本发明人采用DNA star软件分析MGMT蛋白的空间结构，特别是分析其氨基酸序列的抗原指数、亲水性和表面的可能性三个指标。通过对上述三个指标的综合考虑，发现除所述MGMT蛋白质上KRTTLDSPLGKLE(8-20)和HEGHRLGKPGLGGS(171-184)、KGAGATSGSPPAGRN(193-207)三个肽段外，其余部分作为抗原决定簇的可能性很小。通过进一步对这三个肽段进行量化分析发现，它们的抗原相对指数为80％，80％和100％，相对亲水性为67％，100％和68％，表面可能性相对值为100％，40％和75％，若将三个指标相乘，综合比较这三肽段的作为抗原决定簇的综合指数分别为0.536，0.32和0.51。由此，本发明人出人意料的发现，所述MGMT蛋白上的表位中KRTTLDSPLGKLE(8-20)的表位具有最好的抗原抗体特异性结合特性。
因此，本发明人通过化学合成方法制备所述表位，并依照参照Harlow和Lane(1988)AntibodiesA laboratory Manual，CSH Press；Goding(1996)Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic Press以及特别是Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497中所述的方法，采用所得半抗原偶联钥孔血蓝蛋白免疫Balb/c小鼠，利用所述小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤细胞，进而利用ELISA法筛选，得到本发明所述单克隆抗体。
本领域技术人员知晓，还可利用所述半抗原通过免疫多种不同的哺乳动物制备抗血清，所述哺乳动物包括但不限于大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、驴、马等。
本发明的一个方面，公开了一种O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的单克隆抗体或其具有特异性结合O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的生物活性的片段，其特征在于所述单克隆抗体由2002年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC-0827的杂交瘤细胞分泌，其特异性结合O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶上的表位KRTTLDSPLGKLE(C)。
在本发明的一个实施方案中，本发明人选择KRTTLDSPLGKLE为半抗原，与钥孔血蓝蛋白交联后，免疫BABL/c小鼠，制备杂交瘤。
在本发明的一个实施方案中，本发明人通过杂交瘤技术制备得到了保藏号为CGMCC 0827的杂交瘤，其可分泌特异性结合MGMT之KRTTLDSPLGKLE序列的单克隆抗体。
本发明进一步涉及一种检测细胞中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶水平的免疫学方法。所述免疫学方法包括但不限于放射免疫分析、酶联免疫吸附分析(ELISA)、夹心式免疫分析、免疫沉淀、荧光免疫分析等。
本发明的一个方面，公开了一种检测待测样品中中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶水平的方法，包括1)在能够使所述待测样品与本发明所述单克隆抗体发生相互作用的条件下，使待测样品与所述单克隆抗体相接触足够发生相互作用的一段时间；2)加入能够与本发明所述单克隆抗体发生相互作用的第二抗体，使二者在足够发生相互作用的条件下相互作用足够的时间，3)加入针对第二抗体的检测试剂，以检测样品中MGMT的水平。
本发明所述的检测方法中，待测样品可以是例如对于实体瘤患者，可以是诸如来自患者肿瘤组织的活检物、组织切片等，对于非实体瘤患者，可以是诸如来自患者的血清、淋巴液、尿液等。在本发明的一个具体实施方案中，使用来自患者的组织切片。
所述单克隆抗体与样品发生相互作用的条件，依据检测方法的不同而不同。
在本发明的一个具体实施方案中，采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APAAP)方法，通过测定经碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG，检测待测样品中与本发明所述单克隆抗体结合的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶水平。本领域技术人员知晓，在一个具体实施方案中，所述碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶方法可具体如下实施采用碱性磷酸酶免疫小鼠，制备抗碱性磷酸酶单克隆抗体，将碱性磷酸酶与抗碱性磷酸酶单克隆抗体按适当比例混合，制备碱性磷酸酶与抗碱性磷酸酶抗体复合物(即APAAP复合物)。采用羊抗鼠IgG抗血清作为桥联抗体，其一个Fab臂与APAAP复合物结合，另一个Fab臂与第一抗体结合，最后加底物显色，显微镜观察结果。
在本发明的又一具体实施方案中，采用ELISA方法(Sambrook，J.，等人，分子克隆实验指南，第2版，Cold Spring Harbour LaboratoryPress)，通过测定辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，检测待测样品中与本发明所述单克隆抗体结合的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶水平。具体的，检测方法中包括如下步骤(1)包被酶联板用50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)将抗MGMT多抗血清或纯化抗体稀释成一定浓度，每孔100μl，4℃过夜。10mMPBS-0.05％Tween 20(pH7.4)洗三遍.
(2)封闭已包被的酶联板用10％的小牛血清封闭包被的酶联板，100μl/孔，37℃，30分钟.
(3)在酶联板上加待测血清或体液100μl/孔，37℃，1小时，10mMPBS-0.05％Tween 20(pH7.4)洗三遍.
(4)在酶联板上加合适浓度MGMT单克隆抗体，100μl/孔，37℃，1小时，10mM PBS-0.05％Tween 20(pH7.4)洗三遍.
(5)加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠第二抗体50μl/孔，37℃30分钟.10mM PBS-0.05％Tween 20(pH7.4)洗三遍。
(6)加辣根过氧化物酶底物溶液50μl/孔，37℃，显色15分钟(7)加2N H2SO450μl/孔终止反应.
(8)测定OD490值本领域技术人员知晓，对于固相反应检测而言，可以将本发明所述单克隆抗体固定于固相载体，也可以将待测样品固定于固相载体上。反应通常在室温下进行一段时间，检测过程中需要洗涤不与本发明所述单克隆抗体结合的样品的步骤。
对于液相反应而言，通常可以向处在特定缓冲体系中的待测样品直接加入本发明所述单克隆抗体，然后在适于抗原抗体发生相互作用的温度下，例如室温下，反应一段时间。
本发明所述第二抗体的选择取决于本发明单克隆抗体的来源。本领域技术人员知晓，如何根据单克隆抗体的来源选择相应的第二抗体。本发明所述第二抗体可以是放射性同位素标记的，包括但不限于使用选自32p、125I、S、2H等；也可以是非放射性同位素标记的，包括但不限于使用选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、链霉亲和素等标记。本发明所述检测方法中使用的检测剂，取决于检测过程使用的第二抗体的标记物。本领域技术人员知晓如何选择合适的检测试剂。
本发明所述单克隆抗体能够用于测定待测样品中MGMT水平。所述MGMT水平的高低和变化可为临床上化疗方案的确定提供参考。事实上，本领域技术人员知晓，也可以使用本发明所述单克隆抗体的Fab片段测定样品中MGMT的水平，只要其特异性结合MGMT上的14肽KRTTLDSPLGKLE。因此，可以构建具有不同来源的抗体恒定区之嵌合抗体，以构建用于检测MGMT的抗体。
本发明还涉及本发明所述单克隆抗体用于制备鉴定样品中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的水平检测试剂盒的用途。
本发明还涉及一种鉴定样品中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的水平之检测试剂盒，其中含有诊断有效量的本发明所述单克隆抗体。任选的，所述检测试剂盒中还含有用于检测所述抗原抗体反应的检测剂和缓冲液，以及使用说明。
本领域技术人员知晓，所述“诊断有效量”的单克隆抗体是指具有适当的稀释度且能够与待测样品发生足以检测的相互作用的量的单克隆抗体。依据抗体制备的情况不同，以及检测的方法不同，本领域技术人员知晓在制备试剂盒的过程中，通过与阳性标准品的反应，选取不同的稀释度。通常，不同批次制备的单克隆抗体要经过效价测定，然后确定工作浓度，优选的，单克隆抗体原液制品稀释比范围在1∶5到1∶80之间。
在本发明的又一实施方案中，公开了一种采用APAAP检测系统组装成的免疫组织化学MGMT检测试剂盒，其中包含诊断有效量的用于与待测抗原结合的本发明所述单克隆抗体(即第一抗体)，以及用于检测第一抗体与待测抗原结合的第二抗体，和用于免疫组织化学反应的缓冲液、与用于检测所选第二抗体的底物和显色液。其中所述第二抗体(羊抗鼠IgG)起桥联作用，其中一个Fab段连接第一抗体，另一个Fab段连接抗碱性磷酸酶抗体与碱性磷酸酶形成的复合物(APAAP)，通过APAAP复合物中的碱性磷酸酶催化底物显色，以鉴定相应抗原物质。下面结合具体实施例进一步阐明本发明。
实施例实施例1
O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶单克隆抗体的制备1.杂交瘤细胞株制备程序1.1合成半抗原多肽采用Novabiochem公司生产的Novasyn KR树脂，使用固相合成法(参见，潘和平等人，“鲑鱼降钙素及其类似物的合成”，中国生物化学与分子生物学报，第14卷第4期1998年8月463-466)合成人甲基转移酶关键抗原表位的14肽(C)KRTTLDSPLGKLE，其中在氨基末端加一半胱氨酸，以提供巯基，用于连接载体蛋白KLH。合成多肽纯度在90％以上。
1.2半抗原多肽与载体蛋白交联选择钥孔血蓝蛋白作为半抗原载体。按照(Sambrook，J.，等人，分子克隆实验指南，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版，856页)中所述方法，首先将载体蛋白与MBS连接，形成MBS/KLH连接物。纯化后，MBS/KLH与含Cys的合成肽交联。载体蛋白N端和Lys侧链提供氨基，合成肽提供游离的-SH。
1.3免疫动物选取6～8周龄雌性BALB/c小鼠，用100μg抗原/只免疫2个月以上。第一次免疫加福氏完全佐剂，第二次以后加福氏不完全佐剂，前三次免疫间隔时间为3周，第三次以后每2周腹腔注射一次。融合前3天，取鼠尾静脉血，间接ELISA法测定效价，选择效价最高的小鼠腹腔加强免疫一次。
1.4细胞融合1.4.1.免疫脾细胞的制备BALB/c小鼠加强免疫三天后，处死，无菌状态下取出脾脏，去表面包膜及脂肪，剪碎，加GKN溶液制成单细胞悬液。去除大的团块后，离心，用GKN洗涤并重悬脾细胞，计活细胞数。
1.4.2 SP2/0骨髓瘤细胞的处理取指数生长期的SP2/0细胞，离心，用GKN洗一次。悬浮于GKN溶液中，计活细胞数.
1.4.3免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞的融合将SP2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1∶5比例混合均匀，离心，尽量倒净上清。37℃水浴中，加入50％聚乙二醇(MW1450)进行细胞融合。加入GKN溶液洗涤，用HAT选择性培养液重悬，加入到96孔细胞培养板，在CO2的孵箱中培养。第四天换新培养液，并根据细胞生长情况更换培养液。第七天开始观察杂交瘤细胞生长情况，当细胞生长至显微镜视野一半时，用ELISA的方法检测上清抗体活性的高低.
1.5分泌抗人MGMT单克隆抗体杂交瘤细胞的筛选采用ELISA法筛选抗人MGMT抗体的杂交瘤细胞。用碳酸盐缓冲液稀释合成多肽，加入到96孔板中，4℃过夜。用PBS-T缓冲液(组成成分为1.PBS-T配方800ml蒸馏水中溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44gNa2HPO4，0.24g KH2PO4，用HCl调节pH至7.4，加1ml Tween-100，加水定容到1L，室温保存。)洗三遍。用10％的小牛血清于37℃封闭30分钟，加杂交瘤细胞上清37℃、反应1小时，PBS-T洗三遍，加碱性磷酸酶标记的羊抗鼠第二抗体37℃反应30分钟，PBS-T洗三遍。加底物溶液(0.2M Tris液，50ml；0.1N盐酸，40ml；MgCl2·6H2O，0.2g；左旋咪唑，2mg；1％叠氮钠，5ml；调PH至8.3，加水至100ml)37℃、显色15分钟，加2N H2SO4终止反应，测定OD490值。
1.6杂交瘤细胞的克隆化用有限稀释法(Kohler G和C.Milstein.，1975，Nature 256495)对阳性孔的杂交瘤细胞进行多次亚克隆，使分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞单克隆化，从而使其能分泌均一的单克隆抗体，同时也避免了不分泌抗体的杂交瘤细胞过度生长而使分泌抗体的杂交瘤细胞丢失。反复克隆化至所有单个克隆的阳性率为100％，选取阳性强的克隆扩大培养，大量冻存作为原始细胞库。部分细胞连续传代培养3个月以上，观察杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性。
2.细胞库由融合细胞、一次亚克隆、二次亚克隆及体外连续培养3个月以上稳定分泌抗体的三次亚克隆细胞组成原始细胞库。取原始细胞库中三次亚克隆的杂交瘤细胞株全面检定，大量培养冻存，建立主细胞库。取主细胞库的细胞大量培养，经抗体活性及支原体复查合格后，冻存，每批不少于20管，建成工作细胞库。每次生产时取1管复苏，用于制备腹水抗体。
3.杂交瘤细胞鉴定3.1抗体分泌稳定性强阳性单克隆细胞株(C9D10)扩大培养，取部分细胞以生理盐水调整浓度为2×106/ml。接种于小鼠腹腔，细胞数为1×106/只。约7～10天形成腹水，至腹水增多，腹部特别膨隆时，处死小鼠，取腹水，离心后取上清并测腹水效价。另取部分细胞连续传代培养3个月后，同样条件小鼠腹腔接种，取腹水，并测腹水效价。二次ELISA测定结果均达到1×106。采用APAAP法测定腹水与4株MGMT阳性质控肿瘤细胞的反应，效价均达到1∶100。结果表明细胞株抗体分泌稳定性好。
3.2杂交瘤细胞染色体分析杂交瘤细胞传代培养36～48小时后加入秋水仙素，继续培养4～6小时，然后收集细胞。加入已预温到37℃的0.075M KCl悬浮细胞。置37℃水浴15～20分钟作低渗处理；细胞用甲醇/冰醋固定液三次固定后，悬浮在固定液中，4℃过夜。离心、去上清，留少许固定液将细胞悬浮、混匀后滴在刚从冰水中取出的载玻片上，吹散，通过火焰数次，自然干燥。10％Giemsa染色液染色10～20分钟，用水洗去染液，自然干燥。镜下观察杂交瘤细胞的染色体核型，显微拍照。BALB/c小鼠脾细胞染色体数目为40条。SP2/0细胞的平均染色体数目为60条左右。杂交瘤细胞平均染色体数目为94条左右，接近SP2/0细胞和脾细胞染色体数目之和，证明杂交瘤细胞是由SP2/0细胞和小鼠脾细胞融合而来。
4抗人MGMT单克隆抗体的大量制备4.1获取抗人MGMT单克隆抗体腹水选取10周龄BALB/C小鼠(军事医学科学院实验动物中心提供)，接种细胞前10～20天，预先腹腔注射Pristane 0.5ml/只。收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，以生理盐水调整细胞浓度至2×106/ml，腹腔接种杂交瘤细胞，接种数为1×106个/只，约7～10天形成腹水，至腹水形成增多，使得腹部特别膨隆时，处死小鼠，取腹水，离心后取上清并测腹水效价，分装，-20℃冻存备用。
4.2抗人MGMT单克隆抗体亚型的鉴定采用双向免疫扩散法，对杂交瘤腹水进行免疫球蛋白亚型的鉴定。用1％琼铺制琼脂板，待琼脂凝固后，用打孔器在上面打出梅花形的小孔，过火焰封底；将抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA及IgM抗血清加入中心孔，将腹水倍比稀释后加入周边孔，37℃放置24h。结果单克隆抗体腹水仅与抗小鼠IgG1抗血清有明显的沉淀线，说明杂交瘤细胞分泌的抗体为IgG1亚类。
4.3抗人MGMT单克隆抗体的纯化4.3.1硫酸铵沉淀法初步提纯。
腹水于4℃、10000rpm离心10分钟，取上清，按1∶1比例加入0.01MPBS(pH7.2)混匀，搅拌下加入饱和硫酸铵使成50％饱和度，25℃作用30分钟。4℃10000rpm离心15分钟，弃上清。沉淀用适量0.01M PBS(pH7.2)溶解，加入饱和硫酸铵使成33％饱和度，25℃作用30分钟。4℃10000rpm离心15分钟，弃上清。沉淀用适量0.02M PBS(pH7.0)溶解，备用。
4.3.2 Protein G-Sepharose亲和层析用Pharmacia Biotech.公司的AKTA FPLC蛋白层析仪对单克隆抗体进行亲和纯化。先以3倍柱体积的0.02M PBS(pH7.0)冲洗HiTrapProtein G层析柱(1ml)填料中的乙醇，随即以5倍柱体积的0.02MPBS(pH7.0)平衡层析柱。将2ml硫酸铵初步纯化的抗体溶液加入层析柱。用5倍柱体积的0.02M PBS(pH7.0)冲洗层析柱，当紫外线检测器出现IgG洗脱峰时，迅速用已加入60-100μl 0.05M Tris-HCl缓冲液(pH9.5)的离心管收集。最后用5倍体积的0.02M PBS(pH7.0)冲洗平衡层析柱。将纯化的抗体分装，-20℃保存。
4.4抗体纯度及浓度测定将单克隆抗体腹水、硫酸铵沉淀后抗体及经Protein G-Sepharose亲和层析后抗体按常规方法进行SDS-PAGE电泳。抗体腹水中含大量杂蛋白；硫酸铵沉淀后电泳图谱呈现清蛋白、抗体重链和轻链三条带；亲和层析后抗体的电泳图谱呈现二条区带，为抗体的轻链和重链， 分子量约为22.8KD和53.1KD。经扫描测定，亲和层析后抗体纯度达98％以上。将20毫升单克隆抗体腹水提纯后，用PBS调整至原体积，以PBS为空白对照，测定抗体溶液的OD280nm值，计算抗体浓度为1.0mg/ml。
4.5单克隆抗体特异性鉴定采用ELISA法测定所得单克隆抗体只与合成多肽抗原特异结合，而与KLH不发生结合。
采用免疫印迹反应(Western Blot)，测定单克隆抗体与MGMT抗原的反应性，将MGMT抗原按常规SDS-PAGE后，转移到硝酸纤维素膜，以进口抗体为对照，按文献方法(Sambrook，J.，等人，分子克隆实验指南，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版，888页)进行检测，结果均与MGMT抗原发生特异性结合。
实施例2带有本发明所述单克隆抗体的检测试剂盒I)采用APAAP法检测的试剂盒1.试剂盒组份
2.检测试剂盒特异性测定MGMT阳性质控细胞的选定国外Neo Markers公司生产的MGMT(DNA修复酶)Ab-1(MT3.1)鼠单克隆抗体选用Molt-4、Raji、HeLaCCL2、Rh18(或HT-29)、CCRF-CEM细胞株作为阳性质控细胞，根据国内可以获得细胞株的实际情况，以及我们自己以前的实验结果，选定了Molt-4(T淋巴母细胞)、Raji(B淋巴母细胞)、HeLa S3(宫颈癌)以及中国人肝癌细胞系SMMC-7721共4株细胞作为MGMT阳性质控细胞。
4株MGMT阳性质控细胞特征如下Molt-4Raji HeLa S3 SMMC-7721MGMT活性(pmol/mg) 1.53 1.191.10 0.72ACNU D10(μg/ml)* 135 108 11477BCNU D10(μg/ml)* 183 178 164137*D10杀伤90％细胞的药物剂量，表示细胞对药物的耐药性。
MGMT阳性质控肿瘤细胞标本的制备取指数生长期的肿瘤细胞，用生理盐水洗涤一遍后，用生理盐水悬浮细胞，调节细胞浓度为1×106/ml，离心涂片，用丙酮固定，备用。
抗人MGMT单克隆抗体特异性检定用进口抗体Ab-1 MT3.1作为对照，经检测进口抗体及自制抗体对4株MGMT阳性细胞的特异性反应一致，均呈强阳性(++)反应，符合率为100％。
效价测定取纯化的抗人MGMT单克隆抗体，按1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80和1∶100的比例稀释，用APAAP法测定4株MGMT阳性质控肿瘤细胞涂片与不同工作浓度抗人MGMT单克隆抗体的反应性，确定最佳抗体工作浓度为1∶40。
第二抗体(羊抗鼠IgG)稀释度的确定用抗人MGMT单克隆抗体工作液作第一抗体。按1∶10、1∶20、1∶40、1∶60的比例稀释羊抗鼠IgG抗血清(购自军事医学科学院微生物流行病研究所)，作为第二抗体，用APAAP方法检测与4株MGMT阳性质控肿瘤细胞的反应强度，发现从1∶60开始显色强度减弱。第二抗体在37℃放置9天后，用同样方法检测其与MGMT阳性质控肿瘤细胞的反应强度，发现用1∶20稀释度的染色结果呈++，高于1∶20稀释度的染色结果呈+，确定最佳抗体工作浓度为1∶20酶复合物的鉴定酶复合物工作液(购自军事医学科学院基础医学研究所)，在37℃放置9天后，替换APAAP试剂盒中的酶复合物，用经检定合格的抗人MGMT单克隆抗体和APAAP试剂盒检测MGMT阳性质控肿瘤细胞，染色结果++为合格，低于++为不合格。
底物缓冲液的鉴定取配制好的底物缓冲液(0.2M Tris液，50ml；0.1N盐酸，40ml；MgCl2·6H2O，0.2g；左旋咪唑，2mg；1％叠氮钠，5ml；调pH至8.3，加水至100ml)5ml，37℃放置9天，物理检查无沉淀、变色。代替APAAP试剂盒中的底物缓冲液，用经检定合格的抗MGMT单克隆抗体和APAAP试剂盒检测MGMT阳性质控细胞标本，染色结果++为合格。
碱性磷酸酶底物的检定坚固红TR盐，按10mg/瓶分装，将一瓶分装好的底物放37℃放置9天，代替APAAP试剂盒中的底物，用经检定合格的抗MGMT单克隆抗体和APAAP试剂盒检测MGMT阳性质控细胞标本，染色结果++为合格。
II)采用ELISA法之检测试剂盒采用ELISA法之检测试剂盒，适用于检测血液和组织液中MGMT的水平，其组成如下MGMT单克隆抗体；羊抗鼠IgG抗血清；包被缓冲液；洗涤缓冲液；反应终止液；底物缓冲液；和显色底物上述试剂具体配制如下包被缓冲液(0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液；Na2CO31.59克，NaHCO3，2.93克，加蒸馏水至1000ml)；洗涤缓冲液(KH2PO4，0.2克；KCl，0.2克；Na2HPO4.12H2O，2.9克；NaCl，8.0克；Tween-20，0.5ml；加蒸馏水至1000ml)；终止液(2N H2SO4，H2SO4，21.7ml；加蒸馏水至200ml)；底物缓冲液A液柠檬酸21.14克溶于1000ml蒸馏水中B液Na2HPO4.12H2O 28.4克溶于1000ml蒸馏水中取A液24.3ml、B液25.7ml混合加蒸馏水至100ml。
底物四甲基联本胺(TMB)1毫克溶于1毫升无水乙醇底物配制临用前取TMB0.5ml、底物缓冲液4.5ml、3％的双氧水50μl混合备用。
实施例3本发明所述检测试剂盒的稳定性1试剂盒37℃加速破坏试验将连续生产的三批试剂盒置于37℃孵箱中，分别于第1、3、5、7、9天取出，以37℃保存0天的试剂盒为对照，用5例阳性参考品和例阴性参考品检测。检测结果表明，三批产品在37℃放置1天至9天后，检测结果与对照组一致，阳性参考品符合率和阴性参考品符合率均为100％，敏感性和特异性符合产品质量标准要求。按阿雷尼厄斯方程推导，试剂盒在37℃中，每稳定一天相当于4℃保存1.6个月，37℃下9天相当于4℃下保存14个月。
2试剂盒4℃稳定试验将连续生产的三批试剂盒置于4℃冰箱中，分别于0天、2、4、6、8、10、12、14个月取出，用5例阳性参考品和5例阴性参考品检测，以4℃保存0天的试剂盒为对照，观察产品的稳定性。结果说明，检测试剂盒4℃保存2、4、6、8、10、12、14个月后，检测结果与对照组一致，阳性参考品符合率和阴性参考品符合率均为100％，敏感性和特异性符合产品质量标准要求。
10例参考品的选定序号 标本号 肿瘤类型MGMT分析P1 31914胶质瘤++P2 33554恶性黑色素瘤 ++P3 35277质瘤 ++P4 34239胶质瘤++P5 35293肝细胞癌 ++N1 31925非何杰金氏淋巴瘤 -N2 35443小细胞肺癌-N3 33126非何杰金氏淋巴瘤 -N4 206084 小细胞肺癌-N5 205040 胃腺癌-实施例4.临床使用本发明所述检测试剂盒的检测及结果将本发明所述MGMT检测试剂盒用于临床检测，证明试剂盒对诊断肿瘤细胞中MGMT蛋白水平的特异性强，灵敏性好，操作简便、快速。
具体地，临床上共分析了1175名经确诊为肿瘤病人的病理标本，其中包括头颈部肿瘤、肠癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、生殖系肿瘤、肝癌、泌尿系统肿瘤、软组织肿瘤、甲状腺癌、脑癌和其他肿瘤等。用统一判定标准分析上述肿瘤标本的MGMT蛋白表达水平显微镜下观察，在肿瘤细胞核或浆内有粉红色着色颗粒的为阳性。其中呈强着色、着色细胞＞30％的为强阳性(++)；着色细胞在10％～30％为阳性(+)；着色程度很弱，不易判断或阳性细胞＜10％的为可疑(±)；无着色细胞的为阴性(-)。
在1175例检测的病理标本中，强阳性(++)290例，占24.68％；阳性(+)517例，占44.00％；可疑(介于阴性与阳性之间，±)188例，占16.00％；阴性(-)180例，占15.32％。各临床考核结果显示，MGMT检测试剂盒特异性好，灵敏度高，检测结果可靠、操作简单方便、为临床合理使用亚硝脲药物提供了准确的、具有预见性的依据，对提高肿瘤化疗水平有重要意义。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所<120>一种06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的单克隆抗体，其制备方法及诊断试剂盒<130>idc020039<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>205<212>PRT<213>人<400>1Met Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro Leu1 5 10 15Gly Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu His Glu Ile Lys20 25 30Leu Leu Gly Lys Gly Thr Ser Ala Asp Ala Val Glu Val Pro Ala Pro35 40 45Ala Ala Val Leu Gly Gly Pro Glu Pro Leu Met Gln Cys Thr Ala Trp50 55 60Leu Asn Ala Tyr Phe His Gln Pro Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro Val65 70 75 80Pro Ala Leu His His Pro Val Phe Gln Glu Ser Phe Thr Arg Gln Val85 90 95Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys Phe Gly Glu Val Ile Ser Tyr100 105 110
Gln Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn Pro Lys Ala Ala Arg Ala Val115 120 125Gly Gly Ala Met Arg Gly Asn Pro Val Pro Ile Leu Ile Pro Cys His130 135 140Arg Val Val Cys Ser Ser Gly Ala Val Gly Asn Tyr Ser Gly Gly Leu145 150 155 160Ala Val Lys Glu Trp Leu Leu Ala His Glu Gly His Arg Leu Gly Lys165 170 175Pro Gly Leu Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ala Gly Ala Trp Leu Lys Gly180 185 190Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ser Pro Pro Ala Gly Arg Asn195 200 20权利要求
1.一种O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的单克隆抗体或其具有特异性结合O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的生物活性的片段，其特征在于所述单克隆抗体由保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏号为CGMCC 0827的杂交瘤细胞分泌，其特异性结合O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶上的KRTTLDSPLGKLE(C)序列。
2.一种杂交瘤细胞系，其分泌特异性结合O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶上的表位KRTTLDSPLGKLE(C)的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞系具有保藏号CGMCC 0827。
3.一种制备权利要求1所述单克隆抗体的方法，其包括1)化学合成KRTTLDSPLGKLE(C)肽；2)将1)中所得肽与钥孔血蓝蛋白(KLH)结合制备抗原；3)由所得抗原免疫动物，通过杂交瘤技术，得到杂交瘤细胞4)培养所述杂交瘤细胞，制备权利要求1所述单克隆抗体。
4.权利要求1所述抗体用于制备鉴定样品中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的水平检测试剂盒的用途。
5.一种鉴定样品中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的水平之检测试剂盒，其中含有诊断有效量的权利要求1所述单克隆抗体，还任选的含有用于免疫组织化学检测的缓冲液、第二抗体、底物和/或染液。
6.权利要求5所述的检测试剂盒，其中含有诊断有效量的权利要求1所述单克隆抗体，还含有用于APAAP法检测的缓冲液、第二抗体、底物和/或染液。
7.权利要求5所述的检测试剂盒，其中含有诊断有效量的权利要求1所述单克隆抗体，还含有用于ELISA法检测的缓冲液、第二抗体、底物和/或染液。
8.一种检测待测样品中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶水平的方法，包括1)在能够使所述待测样品与权利要求1所述单克隆抗体发生相互作用的条件下，使待测样品所述单克隆抗体接触足够发生相互作用的一段时间；2)加入能够与权利要求1所述单克隆抗体发生相互作用的第二抗体，使二者在足够发生相互作用的条件下相互作用足够的时间，4)加入针对第二抗体的检测试剂，以检测样品中MGMT的水平。
9.权利要求8所述的检测方法，其中采用APAAP法。
10.权利要求8所述的检测方法，其中采用ELISA法。
全文摘要
本发明涉及一种特异性结合O
文档编号C07K16/44GK1502630SQ02151380
公开日2004年6月9日 申请日期2002年11月21日 优先权日2002年11月21日
发明者章扬培, 任会明, 由英, 季守平 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所, 中国人民解放军军事医学科学院野战输