专利名称：一种抗体嵌合基因的构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，公开了一种抗体嵌合基因的构建方法，其中有一部分的氨基酸序列连接的方向和传统的方向相反，有更多的自由氨基端，类似于生物体内天然存在的情况，所构建的抗体嵌合基因经在噬菌体、细菌、病毒和细胞表面表达后，可以用来筛选和分离的多价抗体，促进诊断和治疗药物的研究。
背景技术：
抗原抗体反应是一种发生在高等生物体内的独特的生命现象。这种反应不仅与疾病的预防，而且也与许多疾病的发生有关。随着分子生物学研究的深入，人们对抗体的形成过程，及其调节有了较为全面的认识。
制备抗体的方法目前分为二大类1.从生物个体的血清中分离，如用特定的抗原免疫动物，获得针对特定抗原的高免疫血清。目前在医学中使用的破伤风抗血清就是用这种方法制备的；2.利用基因工程和细胞工程的方法，从细胞或细菌中制备特异性的针对特定抗原的抗体。如利用细胞培养的方法制备单克隆抗体，或在大肠杆菌中表达单链免疫球蛋白等。
在自然选择的过程中，许多与人体自身的组织和细胞反应的淋巴细胞均被清除，只是在一些特定的疾病才出现与我们自身的细胞或组织反应的抗体或淋巴细胞，而有时候我们需要一些与自身的细胞起反应的抗体用来治疗人体的疾病，如与肿瘤坏死因子结合的抗体，与免疫记忆细胞反应的抗体等等，通过与这些因子或细胞的结合可以加速体内的清除过程或死亡过程，从而降低这些疾病的危害。
所有抗体分子都具有类似的基本结构单位，即由二条相同的轻链(25kDa左右)和二条相同的重链(55-70kDa)共同组成一个“Y”型的抗体分子结构，其中轻链与重链之间、二条重链之间均有二硫键联结，抗体分子立体结构属于球蛋白。轻链由一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)二个结构域组成。重链由一个可变区(VH)和三个恒定区(CH1、CH2和CH3)结构域组成。VH和VL空间结构上互补形成抗原结合区域，又称FV片段。Fv和CH1和CL区域组成抗体的Fab段。二条重链的CH2和CH3通过二硫键联结组成Fc段。Fab段与Fc段之间有一个铰链区，将二者连接起来。整个结构分为氨基酸序列较为保守的位于羧基端的恒定区(CL)，和氨基酸序列多变的位于氨基端的变异区(VL)。氨基端的变异区又可以分为较为保守的骨架区(FR)和相间于其间的高度变异区(CDR)。免疫球蛋白分为5种，血清中含量最多的为IgG。IgG的轻链约有220个氨基酸，其中变异区和恒定区各有约110个氨基酸。人体的轻链有二种亚类，分别称之为λ和k。重链有440个氨基酸左右，其中变异区约有110个氨基酸，恒定区约有330个氨基酸。抗体的变异区为与抗原的结合区，决定抗体与抗原结合的特异性；恒定区为体内的功能效应区，在身体内与吞噬细胞等结合，促进相关抗原的清除。变异区与恒定区由1-40个氨基酸组成的铰链区连接，这样确保了变异区和恒定区各自的功能不受干扰，使得Fab段得以灵活旋转而结合抗原。重链和氢链的变异区从氨基端开始分别为FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4区域。
抗体是一种十分复杂的分子。根据保守的骨架区(FR1)的基因序列和高变区与恒定区之间的连接区基因序列设计的聚合酶链反应引物，可以对所有的人类的抗体基因的变异区进行扩增，即获得人类的相关的免疫球蛋白基因。利用这种方法，可以从一个个体的外周血B淋巴细胞中分离为mRNA，再通过反转录等方法，制备成为cDNA，再通过适当的表达载体表达该基因，而获得该个体特异性的免疫球蛋白，这种免疫球蛋白可以用于许多疾病如类风湿性关节炎、肿瘤等的治疗。与从动物如老鼠或其他人所得的抗体相比，这种抗体更具有免疫同源性，这样会取得更好的疗效。
目前在利用大肠杆菌生产重组抗体的过程中，最常见的方法为将重链和氢链各自的变异区克隆，然后再在二者之间加上一条链接区，形成如下的结构VH→链接区→VL或VL→链接区→VH1即通过链接区将重链变异区的羧基端和轻链变异区的氨基端结合在一起，形成一条单链免疫球蛋白，称之为scFv。由于在正常情况下，免疫球蛋白轻重链的氨基端是自由的，不受任何限制，因此，可以形成较好的抗原结合位点。而在scFV，其中一条免疫球蛋白变异区的氨基端与另一条免疫球蛋白的羧基端通过链接区连接在一起，因此，其中有一条变异区的氨基端的活动受到限制，进而会使抗原和抗体的结合受到限制。
基因片段具有方向性，即在细胞内复制、转录和翻译时，合成的方向只能从5’端到3’端。因此，在体外基因的构建过程中，必须遵循这一原则，方能得到活性的产物。
随着人类基因组工作测序工作的完成，在与基因相关的领域取得了长足的进展。目前可以对基因进行全部的人工合成，且费用不是特别昂贵，需要的时间也不长。整个过程在一般的具有分子生物学实验条件的实验室中，通过人工合成的核酸片段，再通过聚合酶链反应拼接，测序等方法来完成。通过对基因的人工合成，不仅可以根据所用细胞的兼并密码子的使用频率来调整基因的序列，以提高蛋白的翻译水平，同时也可以根据氨基酸序列，利用分子生物学的手段，来构建全新的分子，不再受到传统的基因方向性原则的限制，即可以通过人工合成的方法，使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸利用细胞的蛋白合成机制来合成。
发明内容
发明目的克服上述在重组抗体或抗体文库过程中的缺点，以使形成的人工分子的氨基端区域不受限制的相互作用，更真实地模拟所表达分子的天然情形，是本发明的目的。
为了实现本发明的目的所采取的方案1、一种抗体嵌合基因的构建方法，在氨基酸序列合成时，方向为第一(或第二)链由重链(轻链)的氨基端到羧基端，通过链接区链接第二(或第一)链由轻链(重链)其特征是所述的第一链和第二链都以羧基端和链接区相连，所述的第二链(或第一)由轻链(重链)的方向为从羧基端到氨基端；形成一条完整的DNA链的嵌合基因序列的方向为第一(或第二)链由重链(轻链)的氨基端→羧基端→链接区→第二(或第一)链由轻链(重链)的羧基端→氨基端。
2、所述的第一链和第二链含有骨架FR1、FR2、FR3、FR4及FC区域，和高变区CDR1、CDR2、CDR3，其特征是所述的第一链和第二链为一种免疫球蛋白的全部或部分基因片段，是来自特定个体或种群的基因片段；是确切的核苷酸序列或是随机的核苷酸序列。
3、所述的链接区由0-2000个氨基酸构成，其最佳长度为1-40个氨基酸序列，一般为苷氨酸和丝氨酸组成的链接序列。
4、所述的第二链的氨基端加入一个琥珀终止密码子UAG，以使嵌合基因表达产物纯化。
5、所述的琥珀终止密码子UAG的后面通过链接区连接噬菌体的基因片段，使其与外源性基因片段融合，并表达于噬菌体的表面，利于蛋白之间互相作用的深入研究。
6、一种嵌合基因的构建方法的应用，通过逆转录、聚合酶链反应、拼接、测序和人工合成常见的分子生物学方法，证明用本发明的嵌合基因的构建方法所构建的嵌合基因，其特征是使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸，有更多的自由氨基端，和生物体内天然存在的状况类似，使抗体和抗原自由结合，形成空间构象，用于筛选和分离多价抗体，促进诊断和治疗药物的研究。
利用现有的分子生物学技术，通过分离特定个体的外周血淋巴细胞，经逆转录-聚合酶链反应和测序，确定个体特异性的免疫球蛋白基因序列，然后再根据所获得的序列，经人工合成基因片段和聚合酶链反应拼接手段，建立一种免疫球蛋白的随机基因库，使这种库具有如下的结构如下排列，见图1，第一链即重链(轻链)的氨基端→羧基端序列→链接区→第二链轻链(重链)的羧基端序列→氨基端序列，可以克服传统的基因工程方法的限制，使得构建的抗体的重链和轻链的变异区的羧基端通过链接区相互连接，而轻重链的氨基端区域类似于生物体内天然的抗体一样，有更多的自由氨基端，不受任何限制的相互结合，形成可与抗原结合的空间构象。
利用逆转录-聚合酶链反应和测序的方法确定个体的免疫球蛋白的基因序列后，就可以通过与已知的免疫球蛋白的基因序列的比较，确定该个体特异性的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4的序列。然后再利用人工合成和聚合酶链反应拼接的方法，将CDR1和/或CDR2和/或CDR3区域的核苷酸全部或部分置换为随机序列，在噬菌体、细菌、酵母、病毒和细胞表面表达后，达到构建个体化的重组抗体库的目的。利用这种抗体库我们可以筛选与各种细胞、病毒或细胞因子或毒素结合的抗体，然后再用这种抗体治疗患者，则会消除机体对自身抗原的免疫反应，而达到延长治疗效果的目的。特别是象类似于类风湿性关节炎的病人，其体内肿瘤坏死因子的含量显著升高，目前最好的办法是利用抗体或肿瘤坏死因子可溶性的受体与肿瘤坏死因子结合，而加速其在体内的降解过程，达到缓解症状的目的。这些患者需要长期使用药物，因此，特别容易产生免疫反应，而使有关的药物渐次失去活性和疗效。利用个性化的抗体库筛选的抗体，由于完全为患者自身的抗体骨架，因此，诱导机体产生的机会要较目前的制剂为低，进而可以提高相关的疗效。同时，也可以利用所获得的抗体来增加机体的免疫反应，来达到治疗疾病的目的。
丝状噬菌体是一种细菌的病毒，它可以借助细菌的DNA和蛋白质合成机制，来完成自身的复制，并且不引起细菌的死亡。最常见和常用的丝状噬菌体为M13，fd等，其外形呈棒状。M13的基因组为一条单链DNA，其为10个基因编码。这10个基因编码的蛋白质，组成了包被单链DNA的外衣。整个噬菌体的分子量为1.63×107Da，其中88％为蛋白质，12％为DNA。整个包衣有大约2700份的主要包衣蛋白pVIII。在噬菌体的一端，有各为5个拷贝的基因VII和VI编码的蛋白，参与和细菌的结合以及结束噬菌体的装配过程。噬菌体的另一端为各为5个拷贝的基因VII和IX编码的分别为33个和32个氨基酸的蛋白，参与噬菌体装配的起始和噬菌体稳定性的维持。目前已经报道了分别用基因III，VI，VII，VIII和IX来显示抗体于噬菌体表面的报道。利用噬菌体的基因III，VI，VII，VIII或IX基因与外源性基因片段融合，可以使外源性基因编码的蛋白产物显示在噬菌体的表面，这样达到了基因型与表现型的统一。特别是利用体内外的筛选技术所获得的与受体或配基结合的噬菌体，直接可以从中分离出编码的基因片段，用于更进一步的研究。
重组噬菌体抗体系统利用了M13噬菌体独特的生活周期，特别是在噬菌体表面表达的几个噬菌体蛋白的独特特性。丝状噬菌体M13长度约为895nm，直径为9nm。其为单链DNA，共有6407个碱基，为10个蛋白质编码。与其它的大多数细菌噬菌体不同的是，M13并不产生溶菌性的感染，而是在保持宿主存活的状态下，利用宿主的基因复制和蛋白合成机制来复制产生大量的噬菌体。在感染宿主的过程中蛋白III起着至关重要的作用，因为通过蛋白III与宿主细菌菌毛的结合，而使得噬菌体可以进入大肠杆菌体内。利用分子生物学方法，将抗体的相关基因片段通过与蛋白III或蛋白VIII等的融合，表达于噬菌体的表面，而达到基因与功能的偶联，为研究蛋白之间的相互作用，开辟了一条新的途径。
除了噬菌体以外，还有许多动物和人类的病毒、细菌、酵母和细胞被用来在其表面显示外源性的蛋白质。如葡萄球菌的蛋白A，脊髓灰质炎病毒，酵母的α因子等，用来与外源性的蛋白质组成融合蛋白，使外源性的蛋白质表达在其表面，同样可以通过筛选技术，达到基因型和表现型的统一。
本发明的优点和应用本发明的抗体嵌合基因的构建方式，使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸，不受传统的氨基酸序列的方向的限制，有更多的自由氨基端，和有机体内天然存在的状况类似，使抗体和抗原自由结合，形成空间构象，能用于筛选和分离多价抗体，促进诊断和治疗药物的研究。
图1为本发明的方法所构建的抗体嵌合基因的结构方向2为常规方法所构建的抗体嵌合基因的结构方向中箭头为体内蛋白质合成的方向；1、2、椭圆为嵌合基因的第一链与第二链；3、基因片段的羧基端；4、7、线条为链接区；5、基因片段的氨基端；6、矩形为琥珀终止密码子；8、三角形为噬菌体的pIII(VI，VII，VIII或IX)基因所编码的蛋白片段。
9、为骨架区1-FR1； 10、为高变区1-CDR1；11、为骨架区2-FR2；12、为高变区2-CDR2；13、为骨架区3-FR3；14、为高变区3-CDR3；15、为骨架区4-FR4；
图1表示体内抗体嵌合基因构建方向为第一链重链(轻链)氨基端→羧基端→链接区→第二链轻链(重链)羧基端→氨基端→琥珀终止密码子→链接区→噬菌体的pIII(VI，VII，VIII或IX)基因所编码的蛋白片段。
图2表示传统人工方法基因的构建方向为第一链重链(轻链)的氨基端→羧基端→链接区→第二链轻链(重链)氨基端→羧基端→琥珀终止密码子→链接区→噬菌体的pIII(VI，VII，VIII或IX)基因所编码的蛋白片段。
具体实施例方式
1.外周血淋巴细胞免疫球蛋白cDNA序列的确定1.1外周血淋巴细胞的分离1)抽取抗凝血，每毫升加入5单位肝素，一般需要20毫升的血液。
2)用等量的磷酸缓冲液稀释外周血。
3)为了分离血中的淋巴细胞，首先在各试管中加入3毫升淋巴细胞分离液(上海生化试剂厂)，然后在每个试管中从管壁轻轻加入5毫升稀释后的血液。
4)置低速离心机，2500转/分钟，离心20分钟。
5)此时可见试管中不同组分的条带，从上至下分别为血浆层(黄色)，淋巴细胞层(白色)，分离液(无色)和红细胞层(红色)，用毛细吸管轻轻吸取淋巴细胞层，置于另一10至15毫升的离心管中。
6)用磷酸缓冲液作等量稀释，1000转/分离心10分钟。
7)小心弃上清，照步骤6用磷酸缓冲液洗两遍。
8)用磷酸缓冲液按每10毫升血液悬1毫升的比例重选沉淀。
1.2总细胞RNA的提取1)将1毫升变性的溶液D(4摩尔的异硫氢酸胍，25毫摩尔的二水柠檬酸钠，0.5％月桂酰基肌氨酸钠(重量/体积)，0.1摩尔的二巯基乙醇)加入沉淀的细胞中(约107细胞)，悬起沉淀，使细胞碎片裂解。
2)加入0.1毫升2摩尔pH4.0的醋酸钠，混匀，分成两小管。
3)每管中加入0.5毫升水饱和酚，充分混匀。
4)每管加入1毫升氯仿-异戊醇溶液，混匀约10秒钟。置冰浴15分钟，如果未形成两层，另加入0.5毫升氯仿-异戊醇溶液。
5)置摄氏4度12000转/分钟离心20分钟。
6)上层水相转移至一新鲜离心管中，加等量异丙醇，置负摄氏20度沉淀1小时；弃上清，用75％的乙醇洗一遍。
7)室温自然干燥沉淀的RNA，重悬于50微升无RNA酶的纯水中。1.3 cDNA的合成1)将上述1.4.2所获得的总RNA取44微升加入一个无RNA酶的离心管中。加入4微升(0.5微克/微升)的oligo dT12-18，分成两管。
2)每管置入摄氏70度水浴中10分钟。然后置冰浴中3分钟。
3)制备以下混合液10 X PCR缓冲液 8微升25毫摩尔/升的氯化镁 8微升10毫摩尔/升的dNTP 4微升100毫摩尔/升的二巯基苏硫醇 8微升4)加14微升上述混合液到每个RNA引物混合管中，轻轻混合，暂离心。置室温5分钟。
5)每管加入2微升(200单位)反转录酶Superscript II RT，置摄氏42度60分钟。
6)置摄氏70度15分钟终止反应，置冰浴中。
瞬时离心，加2微升RNAase H于每个反应管，摄氏37度20分钟。
1.4人工合成人源变异区抗体基因扩增引物重链变异区5’端引物5’ CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG 3’重链变异区3’端引物5’TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC 3’轻链变异区5’端引物5’GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CC3’轻链变异区3’端引物5’TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC 3’1.5.重链变异区和轻链变异区基因的扩增1)制备下列混合液2微摩尔的5’端引物 10微升2微摩尔的3’端引物 10微升10 X PCR缓冲液 10微升15毫摩尔的氯化镁 10微升2毫摩尔的dNTP10微升
1.3制得的cDNA 2微升去离子水 48微升2)加入1-2滴石蜡油，摄氏94度5分钟后，加入2.5单位的Taq酶，以保证热启动。然后摄氏94度1分钟，摄氏55度1分钟，摄氏72度2分钟，35个循环。最后在摄氏72度延伸10分钟。
3)从低熔点琼脂糖胶中回收DNA片段。重链变异区基因为340个碱基对左右，轻链变异区基因为320个碱基对左右。
4)将回收的PCR扩增产物插入pGEM-T质粒中，转化大肠杆菌。挑取白色菌落，制备质粒。
1.6测序得到了如下序列的免疫球蛋白IgG的重链变异区基因序列如下5’CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAA GTA AAG AAG CCT GGG TCC TCGGTG ACG GTC TCC TGC AAG GCA TCT GGA GGC ACC TTC AGC AAC TAT TCT ATCAGC TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT GAG TGG ATG GGA GGT ATCATC CCC CTT TTT GGT ACA CCA ACC TAC TCA CAG AAC TTC CAG GGC GGT GTGCCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC ATCAGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC TAC TGC GAA CGC TAC AGTCAG GCA AAT TTT GAC CGG GCC CGG GTT GGC TGG TTC GAC CCC TGG GGC CAGGGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 3’其中FR1的序列为5’CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAA GTA AAG AAG CCT GGG TCC TCGGTG ACG GTC TCC TGC AAG GCA TCT GGA GGC ACC TTC AGC3’CDR1的序列为5’AAC TAT TCT ATC AGC3’FR2的序列为5’TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT GAG TGG ATG GGA3’CDR2的序列为5’GGT ATC ATC CCC CTT TTT GGT ACA CCA ACC TAC TCA CAG AAC TTC CAGGGC3’FR3的序列为5’GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACCTTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC TAC TGC3’CDR3的序列为5’GAA CGC TAC AGT CAG GCA AAT TTT GAC CGG GCC CGG GTT GGC TGG TTC GAC
CCC3’FR4的序列为5’TGG GGC CAG GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC3’在基因的人工合成过程中我们将利用FR1，FR2，FR3和FR4的框架，将CDR1，CDR2和CDR3的序列全部置换为随机序列，最后得到如下的序列5’CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTAAAGAAGCCTGGGTCCTCG1 23 4 5 67 8 91011121314151617GTGACGGTCTCCTGCAAGGCATCTGGAGGCACCTTCAGCNNNNNNNNNNNN1819202122232425262728293031323334NNNTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGANNNNNN3536373839404142434445464748495051NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGTGTG5253545556575859606162636465666768CCAAGCAGATTCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACCTTCACCATC6970717273747576777879808182838485AGCAGCCTCCAGCCAGAGGACATCGCCACCTACTACTGCNNNNNNNNNNNN8687888990919293949596979899100 101 102NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116TGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCC3’117 118 119 120 121 122 123 124 125 1261.7经测序得到如下IgG轻链区基因序列5’ GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGAGAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG GGC ATT AGA AAT GAT TTAGCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CGC CTG ATC TAT GCTGCA TCC AGT TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA TCTGGG ACA GAA TTC ACT CTC ACA ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCAACT TAT TAC TGT TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA3’.
其中FR1的序列为5’GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GACAGA GTC ACC ATC ACT TGC3’CDR1的序列为5’CGG GCA AGT CAG GGC ATT AGA AAT GAT3’
PR2的序列为5’TTA GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CGC CTG ATC TAT3’CDR2的序列为5’GCT GCA TCC AGT TTG CAA3’FR3的序列为5’AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA3’CDR3的序列为5’TCT GGG ACA GAA TTC ACT CTC ACA ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GATTTT GCA ACT TAT TAC TGT3’FR4的序列为5’TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA3’将CDR区的碱基全部置换为随机序列后，可得到如下序列5’GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGAC123 4 5 6 7 8 9 10 11121314151617CGTGTCACCATCACTTGCNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNTTA181920212223242526272829 30313233GCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATNNN3435363738394041424344454647484950NNNNNNNNNNNNNNNAGTGGGGTCCCACTGCGTTTCAGCGGCAGTGGA51525354555657585960616263646566NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN67686970717273747576777879808182NNNNNNNNNNNNNNNNNNTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA3’838485868788899091929394959697981.8若要得到重链(轻链)的氨基端→羧基端序列→链接区→轻链(重链)的羧基端序列→氨基端序列的产物，则分别需要合成下列序列重链可变区的序列为5’TCCGTCACCGTCCTGACCGGCCAGGGCTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNN126 125 124 123 122 121 120 119 118 117 116 115 114 113 112 111NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGCTACTACACC110 109 108 107 106 105 104 103 102 101 100 9998979695GCCATCGACGAGCCACAGCTCAGCAGCATCACCTTCACCTTCGACACCGGT9493929190898887868584838281807978
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1.10重链的氨基端→羧基端序列→链接区→轻链的羧基端序列→氨基端序列的基因产物的合成。
通过人工合成，就可以得到如下的序列5’CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTAAAGAAGCCTGGGTCCTCG
1234 56 7 8 9 1011121314151617GTGACGGTCTCCTGCAAGGCATCTGGAGGCACCTTCAGCNNNNNNNNNNNN1819202122232425262728293031323334NNNTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGANNNNNN3536373839404142434445464748495051NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGTGTG5253545556575859606162636465666768CCAAGCAGATTCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACCTTCACCATC6970717273747576777879808182838485AGCAGCCTCCAGCCAGAGGACATCGCCACCTACTACTGCNNNNNNNNNNNN8687888990919293949596979899100 101 102NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116TGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCGGT GGT GGT GGT GGT TCT GGT117 118 119 120 121 122 123 124 125 126GGT GGT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGC GGC GGC GGC TCCAGT GGT GGT GGA TCCAAAATCGAAGTGAAGACCGGGCAAGGCTTC98979695949392919089NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN8887868584838281807978777675NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGAAGTGGCAGCTTCCGTCTG747372717069686766656463626160CCAGTCGGGAGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNTATATCCTGCGCAAG595857565554535251504948474645CCTGCCAAAGGGCCAAAACAGCAGTATTGGGCCTTANNNNNN4443424140393837363534333231NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGCACTATCACCGTCCGTGAC3029282726252423222120191817GGAGTATCTGCATCTCTGTCCTCCCCATCTCAGACCATGCAGATC16151413121110 9 8 7 6 5 4 3 2GAC3’ (链接区为黑字体)11.11轻链的氨基端→羧基端序列→链接区→重链的羧基端序列→氨基端序列的产物的合成。
通过人工合成，就可以得到如下的序列5’GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCT1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314GTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCNNNNNNNNNNNNNNNNNN151617181920212223242526272829NNNNNNNNNTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCC3031323334353637383940414243CCTAAGCGCCTGATCTATNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTGGGGTC444546474849505152535455565758CCACTGCGTTTCAGCGGCAGTGGANNNNNNNNNNNNNNNNNN5960616263646566676869707172NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN7374757677787980818283848586NNNNNNTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGT GGT GGT878889909192939495969798GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGC GGC GGC GGC TCC AGT GGT GGT GGATCCTCCGTCACCGTCCTGACCGGCCAGGGCTGGNNNNNNNNN126 125 124 123 122 121 120 119 118 117 116 115 114NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN113 112 111 110 109 108 107 106 105 104 103 102 101 100NNNTGCTACTACACCGCCATCGACGAGCCACAGCTCAGCAGCATCACCTTC9998979695949392919089888786858483ACCTTCGACACCGGTAGCGGTAGCGGTAGCTTCCGTAGCCCAGTGGGTNNN8281807978777675747372717069686766NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN65646362616059585756555453525150AGGATGTGGGAGCTTGGGCAAGGACCTGCCCAGCGTGTGTGGNNNNNNNNN4948474645444342414039383736353433NNNNNNAGCTTCACCGGCGGATCTGCAAAGTGCTCCGTCACGGTGCTGTCC3231302928272625242322212019181716GGGCCTAAGAAGGTAGAAGCTGGGTCTCAGGTGCTGCAGGTGCAG3’1514131 21110 9 8 7 6 54 3 2 12.下面以1.1.10的序列为例，说明人工抗体嵌合基因库的构建过程
2.1首先人工合成下列DNA片段，其中片段1，2，4，6，8，10，12，14为正链，3，5，7，9，11，13，15为反链，并按照2.2到2.8所列的步骤连接。
片段15’GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCCCAG ATG CAG GTG GTG CAGTCT GGG3’(带下划线的序列为限制性内切酶Sfi I的酶切位点)片段25’CAG ATG CAG GTG GTG CAG TCT GGG GCT GAA GTA AAG AAG CCT GGGTCC CTG GTG ACG GTC TCC TGC AAG GCA TCT GGA GGC ACC TTC AGC NNN NNNNNN NNN NNN TGG GTG CGT CAG GCC CCT GGA3’片段35’TCC CAT CCA CTC AAG CCC TTG TCC AGG GGC CTG TCG CAC CCA3’片段45’CAA GGG CTT GAG TGG ATG GGA NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNNNNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN GGT GTG CCA AGC CGT TTC AGC GGTAGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACC TTC 3’片段55’GTC CTC TGG CTG GAG GCT GCT GAT GGT GAA GGT GAA GTC GGTACC GCT ACC GCT3’片段65’ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC TAC TGCNNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNNNNN TGG GGC CAG GGC ACC CTG GTC 3’片段75’AGA ACC ACC ACC ACC ACC GGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC CTGGCC CCA3’片段85’ACC GTC TCC GGT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGCGGC GGC GGC TCC AGT GGT GGT GGA TCC3’片段95’CCC GGT CTT CAC TTC GAT TTT GGA TCC ACC ACC ACT GGA GCC3’片段105’AAA ATC GAA GTG AAG ACC GGG CAA GGC TTC NNN NNN NNN NNNNNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNNNNN GGA AGT GGC AGC TTC CGT3’
片段115’ACT CCC GAC TGG CAG ACG GAA GCT GCC ACT TCC3’片段125’CGT CTG CCA GTC GGG AGT NNN NNN NNN NNN NNN NNN TAT ATCCTG CGC AAG CCT GCC AAA3’片段135’TAA GGC CCA ATA CTG CTG TTT TGG CCC TTT GGC AGG CTT GCGCAGGAT ATA3’片段145’GGG CCA AAA CAG CAG TAT TGG GCC TTA NNN NNN NNN NNN NNNNNN NNN NNN NNN TGC ACT ATC ACC GTC CGT GAC GGA GTA TCT GCA TCT CTGTCC TCC CCA TCT CAG ACC ATG CAG ATC GAC3’片段155’GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGCGCT ACC GGA AGT AGA GCCCTA GTC GAT CTG CAT GGT CTG AGA 3’带下划线的序列为NotI的酶切位点，黑体字为链接区序列，斜黑体字为琥珀终止密码子。)下面为上述1-15DNA片段在人工合成的DNA 链中的位置片 段 2片 段 1 3’ CAG GAG CGT TGA CGC CGG GTC GGC CGG GTC CAC GTC ATC CAC GTC片 段 2片段1 AGA CCC CGA CTT CAT TTC TTC GGA CCC AGG AGC CAC TGC CAG AGG ACG片 段 2AAG GCA TCT GGA GGC ACC TTC AGC NNN NNN NNN NNN NNN TGG GTG CGATTC CGT AGA CCT CCG TGG AAG TCG NNN NNN NNN NNN NNN 片段3
片 段 2 片 段 4CAG GCC CCT GGA 片 段 3片 段 4 NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN CCA CAC GGT TCG片 段 4片段6 ACC ATCTCT AAG TCG CCA 片 段5片 段 6AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC TAC TGC NNN NNN NNN TAG CGG TGG ATG ATG ACG NNN NNN NNN片段 5片 段 6NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNNNNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN片 段 6 片 段 8NNN NNN TGG GGC CAG GGC ACC CTG GTC NNN NNN 片段 7片 段 8 CCA CCA CCA CCA AGA CCG CCG CCG 片段7 片 段9
片 段 8 片段10 CAA GGC TTC NNN NNN 片 段 9片 段 10NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNNNNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN片段 10NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN GGA AGT GGC AGC TTCNNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN 片 段 11片 段 12CGT NNN NNN NNN NNN NNN NNN 片 段 12 片 段 14 GGG CCA AAA CAG CAG TAT 片 段13片 段14TGG GCC TTA NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN TGC NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN ACG片段13片 段 14ACT ATC ACC GTC CGT GAC GGA GTA TCT GCA TCT CTG TCC TCC CCATGA TAG TGG CAG GCA CTG CCT CAT AGA CGT AGA GAC AGG AGG GGT
片 段 14TCT CAG ACC ATG CAG ATC GAC3’ 片 段15 片 段 152.2人工合成的DNA片段的5’端磷酸化制备下列反应液合成的DNA片段2-14(0.5微克/微升)各 1微升10XT4DNA多核苷酸激酶缓冲液 13微升10毫摩尔的ATP 13微升噬菌体T4多核苷酸激酶(10单位/微升) 4微升加水99微升瞬时离心，置摄氏37度水浴1小时。然后，取30微升于摄氏95度变性10分钟，然后缓慢冷却到室温。
2.3人工合成的5’端磷酸化的DNA片段的连接和双链化2.3.1制备下列混合液经变性后缓慢冷却到室温的DNA片段(约1微克) 20微升10X PE1缓冲液3微升去离子水 7微升2.3.2制备下列混合液10 X PE2缓冲液 4微升2毫摩尔的dNTP溶液4微升10毫摩尔的ATP溶液4微升T4 DNA连接酶(3魏氏单位单位/微升) 4微升大肠杆菌DNA聚合酶大片段(Klenow片段) 2微升(5单位/微升)去离子水 22微升置于冰浴中。
其中10 X PE1缓冲液的成份为200毫摩尔的三羟基氨基甲烷(pH7.5)100毫摩尔的氯化镁500毫摩尔的氯化钠10毫摩尔的二巯基苏硫醇
10 X PE2缓冲液的成份为200毫摩尔的三羟基氨基甲烷(pH7.5)100毫摩尔的氯化镁100毫摩尔的二巯基苏硫醇2.3.3将冰冷的2.3.2所配制的混合液30微升加入2.3.1所配制的30微升的反应液中，于摄氏16度反应16小时。然后于摄氏65度反应15分钟。
2.4人工连接的纯化的DNA片段的PCR扩增制备下列反应液10 X Vent DNA聚合酶缓冲液 10微升2毫摩尔的dNTP 10微升2微摩尔DNA片段1 10微升2微摩尔的DNA片段1510微升2.3.3所制得的DNA片段 2微升Vent DNA聚合酶(2单位/微升)1微升去离子水 57微升然后先于摄氏72度反应10分钟，然后摄氏94度1分钟，摄氏62度1分钟，摄氏72度2分钟，35个循环。最后再在摄 72度反应10分钟，于摄氏4度保存。
2.5嵌合基因的纯化用pH8.0的三羟基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液配制1.5％的低熔点琼脂糖凝胶。加入2.4制备的PCR产物后，在紫外灯下回收786碱基对的DNA片段。溶于100微升pH8.0的10毫摩尔三羟基氨基甲烷-1毫摩尔乙二胺四乙酸缓冲液中。
2.6嵌合基因的限制性内切酶消化将回收的PCR产物先后用SfiI和NotI进行酶切。
SfiI酶切反应纯化的PCR产物(0.25-1微克) 70微升10 X酶切缓冲液8.5微升Sfi I(10单位/微升)5微升去离子水 1.5微升加入85微升的液体石蜡，于摄氏50度进行4小时酶切反应。反应完毕后，置室温平衡，瞬时离心，将管壁上的液体甩下。然后进行NotI酶切。
NotI酶切反应于上述酶切反应液中加入3摩尔的氯化钠 3.6微升10 X酶切缓冲液 1.5微升NotI(10单位/微升) 6微升去离子水 3.9微升摄氏37度酶切反应4小时后，加入100微升酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，振荡混合1分钟，离心5分钟。移上清至新的离心管中，加入加入10微升的3摩尔的pH5.2的醋酸钠，然后在加入200微升的无水乙醇，于负摄氏20度放置16个小时。然后离心收集沉淀，再用75％的酒精洗一遍。于室温下自然干燥。然后溶于50微升pH8.0的10毫摩尔三羟基氨基甲烷-1毫摩尔乙二胺四乙酸缓冲液中。
2.7嵌合基因与pCANTAB-5-E的连接酶切的嵌合基因片段(150毫微克) 5微升10 X T4DNA连接酶缓冲液 5微升酶切的pCANTAB-5-E(250毫微克)5微升T4 DNA连接酶(1魏氏单位/微升)1微升去离子水34微升同时设一对照管，即仅有载体，无嵌合基因DNA片段。在摄氏16度连接1小时，置摄氏70度10分钟灭活连接酶，乙醇沉淀，最后溶于20微升pH8.0的10毫摩尔三羟基氨基甲烷-1毫摩尔乙二胺四乙酸缓冲液中。于摄氏负20度保存。
2.8嵌合基因与pCANTAB-5-E连接产物的转化及表达产物的纯化见Amersham Biosciences(目录号27-9401-01和27-9402-01)的说明。
权利要求
1.一种抗体嵌合基因的构建方法，在氨基酸序列合成时，方向为第一(或第二)链由重链(轻链)的氨基端到羧基端，通过链接区链接第二(或第一)链由轻链(重链)。其特征是所述的第一链和第二链都以羧基端和链接区相连，所述的第二链(或第一)由轻链(重链)的方向为从羧基端到氨基端；形成一条完整的DNA链的嵌合基因序列的方向为第一(或第二)链由重链(轻链)的氨基端→羧基端→链接区→第二(或第一)链由轻链(重链)的羧基端→氨基端。
2.根据权利要求1所述的一种抗体嵌合基因的构建方法，所述的第一链和第二链含有骨架FR1、FR2、FR3、FR4及FC区域，和高变区CDR1、CDR2、CDR3，其特征是所述的第一链和第二链为一种免疫球蛋白的全部或部分基因片段，是来自特定个体或种群的基因片段；是确切的核苷酸序列或是随机的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种嵌合基因的构建方法，其特征是所述的链接区由0-2000个氨基酸构成，其最佳长度为1-40个氨基酸序列，一般为苷氨酸和丝氨酸组成的链接序列。
4.根据权利要求1所述的一种嵌合基因的构建方法，其特征是所述的第二链的氨基端加入一个琥珀终止密码子UAG，以使嵌合基因表达产物纯化。
5.根据权利要求4所述的一种嵌合基因的构建方法，其特征是在所述的琥珀终止密码子UAG，的后面通过链接区连接噬菌体的基因片段，使其与外源性基因片段融合，并表达于噬菌体的表面，利于蛋白之间互相作用的深入研究。
6.一种嵌合基因的构建方法的应用，通过逆转录、聚合酶链反应、拼接、测序和人工合成常见的分子生物学方法，证明用本发明的嵌合基因的构建方法所构建的嵌合基因，其特征是使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸，有更多的自由氨基端，和生物体内天然存在的状况类似，使抗体和抗原自由结合，形成空间构象，用于筛选和分离多价抗体，促进诊断和治疗药物的研究。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了一种抗体嵌合基因的构建方法，其氨基酸序列连接的方向为重链(轻链)的氨基端→羧基端→链接区→轻链(重链)的羧基端→氨基端，其中的一条链和传统人工合成蛋白质的方向相反，传统方法的方向为重链(轻链)的氨基端→羧基端→链接区→轻链(重链)的氨基端→羧基端。本发明的序列连接方式类似于生物体内天然存在的状况，有更多的自由氨基端，在与抗原结合时形成空间构象，能不受限制地互相结合，用于筛选和分离多价抗体，促进诊断和治疗药物的研究。
文档编号C07H21/00GK1517440SQ0310061
公开日2004年8月4日 申请日期2003年1月17日 优先权日2003年1月17日
发明者刘吉荣, 迟云发 申请人:北京神洲天才科技发展有限公司