专利名称：马铃薯病毒rna的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种马铃薯病毒RNA的提取方法。
植物RNA的提取技术主要有两条路线。(1)异硫氰酸胍法。此方法适用于富含RNA酶的组织或核质不易分开的组织，但较为昂贵，不适合生产应用。(2)苯酚法。此方法的提取工艺虽较异硫氰酸胍法简单、经济，但操作流程仍然十分的繁琐，即玻璃器皿需在180℃下至少烘烤8小时，不耐高温的离心管、微量移液器吸头、实验用水均用DEPC处理。因此，RNA提取成本仍然较高，很难在生产上广泛使用。以上原因使目前用RT-PCR方法检测马铃薯病毒受到了限制。
本发明包括以下步骤1)将马铃薯茎或叶片组织放入冰预冷的灭菌匀浆器或研钵中，研磨成匀浆；2)向匀浆中加入提取缓冲液(Tris-HCl pH8.0 100mmol/L，NaCl 100mmol/L，EDTA10mmol/L)和β-巯基乙醇，在离心管中振荡混匀；3)加入水饱和酚，氯仿/异戊醇(49∶1，体积比)，充分混匀，冰浴中放置10分钟，其间混匀2～3次；4)以10000转/分室温离心15分钟，吸取水相，加入0.1倍体积的NaAc(3mol/L，pH5.2)和等体积的异丙醇，混匀，在-20℃中沉淀3小时；5)以11000转/分室温离心20分钟后，弃去上清，加冰预冷70％的乙醇洗涤沉淀2次，室温风干，至乙醇挥发完全为止；
6)用无菌双蒸水充分溶解提取的RNA，测OD值，计算RNA浓度。
本发明中使用的玻璃器皿不需要180℃高温烘烤8小时，不耐高温的器皿不需要用DEPC处理和实验用水不需要DEPC处理，只需高压灭菌。与传统的RNA提取方法相比，本发明在准备工作中，省去了对器皿的高温烘烤或DEPC处理，省去了对实验用水的DEPC处理。并且以冰予冷的匀浆器或研钵代替在液氮中研磨，以普通高速离心机代替冰冻高速离心机。以上的改进，简化了提取步骤，降低了成本，为生产上使用RT-PCR方法检测马铃薯病毒奠定基础。本发明提取的马铃薯病毒RNA纯度较高，含糖和酚类等小分子杂质较少，可以为RT-PCR检测提供有效的模板。
图2马铃薯S病毒扩增产物电泳结果。
2、向匀浆中加入1ml RNA提取缓冲液(Tris-HCl pH8.0 100mmol/L，NaCl100mmol/L，EDTA 10mmol/L)和8μlβ-巯基乙醇，在离心管中振荡混匀。
3、加入1ml水饱和酚，1ml氯仿/异戊醇(49∶1，v/v)，充分混匀，冰浴中放置10分钟，其间混匀2～3次。
4、台式高速离心机10000转/分，室温离心15分钟。吸取水相，水相中加入0.1倍体积的NaAc(3mol/L，pH5.2)和等体积的异丙醇，混匀。在-20℃中沉淀3小时。
5、台式高速离心机11000转/分，室温离心20分钟后，弃去上清。加600μl冰预冷70％的乙醇洗涤沉淀2次，室温风干，至乙醇挥发完全为止。
6、用50μl无菌双蒸水充分溶解提取的RNA，测OD值，计算RNA浓度。
采用本发明(简称简约法)提取马铃薯病毒RNA，用经典苯酚提取法提取马铃薯病毒RNA作为对照，用以上两种方法提取的马铃薯病毒RNA为模板进行RT-PCR反应。同时用简约法提取未染病组织的病毒RNA作为阴性对照，RT-PCR结果如
图1图1马铃薯Y病毒扩增产物电泳结果。图中的四个泳道分别为1分子量标准；2经典苯酚提取法提取马铃薯Y病毒RNA，以它为模板进行RT-PCR反应，得到病毒特异扩增的目的片段；3简约法提取马铃薯Y病毒RNA，以它为模板进行RT-PCR反应，得到病毒特异扩增的目的片段；
4健康马铃薯叶片组织RT-PCR扩增产物。未见扩增的目的片段。
将本发明得到的病毒特异扩增目的片段进行测序鉴定。测序结果证明，扩增出的目的片段确实来自马铃薯Y病毒RNA，从而证明了本发明提取马铃薯病毒RNA的可靠性。从电泳结果可以看出，用上述两种方法提取的马铃薯病毒RNA制备的模板，均可用于RT-PCR检测。由于简约法具有快速、简便、可靠、成本低等优势，因此，可广泛应用于实际生产中马铃薯病毒的检测。
实施例2以天津市蔬菜所提供的带有马铃薯S病毒的马铃薯叶片为材料，采用实施例1的操作步骤简约法提取马铃薯病毒RNA，用经典苯酚提取法提取马铃薯病毒RNA作为对照，用以上两种方法提取的马铃薯病毒RNA为模板进行RT-PCR反应。同时用简约法提取未染病组织的病毒RNA作为阴性对照，RT-PCR结果如下(图2)图2马铃薯S病毒扩增产物电泳结果。图中的四个泳道分别为1分子量标准；2经典苯酚提取法提取马铃薯S病毒RNA，以它为模板进行RT-PCR反应，得到病毒特异扩增的目的片段；3新方法提取马铃薯S病毒RNA，以它为模板进行RT-PCR反应，得到病毒特异扩增的目的片段；4健康马铃薯叶片组织RT-PCR扩增产物。未见特异扩增的目的片段；将本发明得到的病毒特异扩增目的片段进行测序鉴定。测序结果证明，扩增出的目的片段确实来自马铃薯S病毒RNA，从而证明了本发明提取马铃薯病毒RNA的可靠性。从电泳结果可以看出，用上述两种方法提取的马铃薯病毒RNA制备的模板，均可用于RT-PCR检测。
权利要求
1.一种马铃薯病毒RNA的提取方法，其特征在于它包括以下步骤1)将马铃薯茎或叶片组织放入冰预冷的灭菌匀浆器或研钵中，研磨成匀浆；2)向匀浆中加入提取缓冲液Tris-HCl pH8.0 100mmol/L、NaCl 100mmol/L、EDTA10mmol/L和β-巯基乙醇，在离心管中振荡混匀；3)加入水饱和酚，氯仿/异戊醇(体积比，49∶1)，充分混匀，冰浴中放置10分钟，其间混匀2～3次；4)以10000转/分，室温离心15分钟，吸取水相，水相中加入0.1倍体积的NaAc，3mol/L，pH5.2，和等体积的异丙醇，混匀，在-20℃中沉淀3小时；5)以11000转/分，室温离心20分钟后，弃去上清，加冰预冷70％的乙醇洗涤沉淀2次，室温风干，至乙醇挥发完全为止；6)用无菌双蒸水充分溶解提取的RNA，测OD值，计算RNA浓度。
全文摘要
本发明涉及一种马铃薯病毒RNA的提取方法。它包括将马铃薯茎或叶片组织放入冰预冷的灭菌匀浆器或研钵中研磨成匀浆，加入提取缓冲液(Tris－HCl pH8.0100mmol/L，NaCl 100mmol/L，EDTA 10mmol/L)和β－巯基乙醇，混匀，加入水饱和酚，氯仿/异戊醇，室温离心，水相中加入NaAc(3mol/L，pH5.2)和等体积的异丙醇，－20℃中沉淀3小时；70％的乙醇洗涤沉淀，用无菌双蒸水充分溶解等步骤。本发明省去了对器皿的高温烘烤或DEPC处理，实验用蒸馏水亦不需DEPC处理。材料的粉碎只需在冰预冷的器皿中进行。全部提取过程均可在常温下进行。所得到的RNA经RT－PCR检测及序列分析，序列完整，没有降解。该技术可用于生产上大规模的马铃薯病毒RT－PCR检测。
文档编号C07H21/00GK1473839SQ03130540
公开日2004年2月11日 申请日期2003年8月8日 优先权日2003年8月8日
发明者杜荣骞, 李德森, 罗智敏, 俞键, 祁骥 申请人:南开大学, 天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所, 天津市农业生物技术研究中心