专利名称：一种与Tau蛋白相关的多肽抗原及抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及Tau蛋白相关的多肽抗原及抗体。
背景技术：
微管系统是神经细胞骨架成分，主要参与多种细胞功能。微管由微管蛋白及微管相关蛋白组成，Tau蛋白是的微管相关蛋白。正常Tau蛋白的功能是与微管蛋白结合促进其聚合形成微管；与形成的微管结合，维持微管稳定性，降低微管蛋白分子的解离。Tau蛋白基因位于17染色体长臂。正常人中由于Tau蛋白RNA剪辑方式不同，可表达出至少6种异型。Tau蛋白为含磷酸基蛋白，正常成熟脑中Tau蛋白分子含2～3个磷酸基。而AD患者的Tau蛋白则异常过度磷酸化，每分子Tau蛋白可含5～9个磷酸基，并丧失正常生物功能。脑脊液中tau蛋白可能来自死亡的或退化变性的神经细胞。AD患者脑脊液中tau蛋白水平显著升高，约为健康对照组及其它神经系统疾病对照组的2倍。
申请人在研究Tau基因第6外显子的剪接时，发现Tau基因第6外显子的剪接不同于其外显子2，3，4A，和10的剪接[1]。随后的研究证实，Tau基因第6外显子剪接位点的选择利用将导致其阅读框架的改变，并可能产生截短的，即缺乏与微管蛋白结合结构域(C-端被截短)的新的Tau蛋白异型[1，2]——Tau蛋白异型6d。这种新的Tau蛋白异型6d是否以蛋白质的形式存在，需要进一步研究。从其mRNA结构看，Tau蛋白异型6d是利用Tau基因6号外显子内选择性剪接位点6d而产生，这一剪接造成后面序列的移码突变而很快遇到终止密码，3‘端带有很长的非翻译区(见图1)。目前3‘端的非翻译区是公认的导致mRNA不稳定的重要因素[3，4]。因此，蛋白异型6d是否以蛋白质的形式存在不能直接从上述公开的文献中直接得出结论。
发明内容
本发明的目的是通过对Tau蛋白异型6d的确认，进一步获得其特异性的多肽抗原以及抗体，并用于对Tau蛋白的检测。
本发明提供的特异性多肽抗原具有SEQ ID No.1的氨基酸序列。
本申请人通过对Tau蛋白异型6d氨基酸序列的分析，确定了特异性的多肽片段。
用上述得到的特异性多肽抗原经传统的免疫方法，可获得多克隆抗体。
用传统的方法也可以获得上述多肽抗原的单克隆抗体。
用上述获得的多克隆抗体检测和鉴定Tau蛋白异型6d。结果显示A.新的Tau蛋白异型6d确实以蛋白质的形式存在着(图4，5)；B.所制备的6d抗体为高度特异的抗体(图4，5)[11]。
从图5中B、C、D的检测结果可以看出，本发明制备的抗体仅对Tau蛋白异型6d产生免疫反应；而其他现有的抗体不具备这样的特性。
海马与人和动物的记忆、智力、情感等密切相关。在老年性痴呆病人，海马是最先受累和病变最重的部位，而在正常成年人和动物脑，其海马区的齿状回是神经干细胞集中区，认为这些神经干细胞与脑的正常功能的维持密切相关。为了解新的Tau蛋白异型6d在正常人海马中的表达和分布，用抗-6d抗体经免疫组化法对正常人海马区进行免疫染色，发现新的Tau蛋白异型6d阳性细胞主要集中在齿状回和CA1-CA3区，并与神经元的标志蛋白MAP2共定位，见图7。
因此，本发明提供的抗体可以制备成试剂盒，用于检测和诊断老年性痴呆致病。
图1.Tau基因6号外显子的选择性剪接异型阅读框架结构图。上为Tau/6+剪接异型(Tau/6+)的cDNA和氨基酸序列。中Tau/6p剪接异型(Tau/6p)的cDNA和氨基酸序列。下Tau/6d剪接异型(Tau/6d)的cDNA和氨基酸序列。上图部分的箭头标志着6p和6d两个选择性的剪接位点，StuI、Tau/6p和Tau/6d的终止子(TAA，tga)用下画线标识，*表示3’-端的非翻译区，侧翼序列为小写体。
图2所合成的特异性多肽的色谱结果；图3所合成的特异性多肽的质谱结果；图4纯化以后的抗体；图5用所获得的抗-6d多克隆抗体经Western Blotting检测体外表达的FLAG-Tau/6d。
(A)所构建的FLAG-融合的Tau蛋白异型表达载体结构简图。
(B-D)Western Blotting检测在SY5Y细胞中瞬时表达的FLAG-融合的Tau蛋白异型。FAT/6-和FFT/6-转染的SY5Y细胞裂解物各30μg，FAT/6d和FFT/6d转染的SY5Y细胞裂解物各50μg经10％SDS-PAGE分离，右侧为蛋白质分子量标准；(B)用anti-FLAG(M2)单克隆抗体检测所表达的Tau蛋白异型.；(C)将(B)的膜洗脱后再用anti-6d的多克隆抗体检测所表达的Tau蛋白异型；(D)用5A6单克隆抗体检测所表达的Tau蛋白异型，结果与(B)一致。(E)FAT/6d和FFT/6d经脱磷酸化后分子量降到预计值；图6人脑组织中内源性Tau蛋白异型6d的时空分布。所用抗体标于左侧，蛋白质分子量标准列于右侧。(A-C)用5A6单克隆抗体经WesternBlotting检测100μg各样本中的内源性Tau蛋白异型，(A)49kD以上的传统Tau，(B)36KD以下的Tau蛋白异型6d。(C)将(A)和(B)的膜洗脱后，再用anti-6d的多克隆抗体检测，仅检测到25-36Kd范围的信号，与(B)相似。(D-F)进行定量图7内源性Tau蛋白异型6d在成人海马中的分布，与MAP2的共定位。
(A-D)Tau蛋白异型6d分布，一抗为6d多克隆抗体，二抗为FITC标记的羊抗兔IgG；(A-D)的标尺为500μm。(E-G)Tau蛋白异型6d与MAP2在海马中的共定位情况。(E)Tau蛋白异型6d的分布，抗体与图4(A-D)同；(F)MAP2在海马中的分布，一抗为MAP2单克隆抗体，二抗为Cy3标记的羊抗鼠IgG；(G)为4E和4F叠加后的图象。
具体实施例实施例1多肽抗原的制备本发明提供的多肽抗原具有SEQ ID No.1所述的氨基酸序列，即FWSKGDETQGG。可以通过商业公司合成。本申请中该多肽抗原由Zymed公司合成、纯化，冻干，结果见图2、3。
实施例2Tau蛋白异型6d的特异性多克隆抗体(6d)的制备上述得到的抗原与KLH偶联[5]后，免疫动物(兔)[6，7]制备抗血清，纯化抗血清获得6d抗体[8，9]，纯化的6d抗体用10％SDS-PAGE分离后经Coomassi染色检测(图4)[10]。
(1)免疫动物(兔)[6，7]制备抗血清在1ml多肽抗原溶液(1mg/ml，溶于PBS)中加等量弗氏完全佐剂，用双管微型乳化针(Thomas Scientific 345OD46)进行乳化。刮除兔背部毛，70％酒精消毒。用3ml注射器(24-G)针头以与皮肤呈30°角进行皮内注射，分24个点进行注射，各注射点注射25μl，共免疫3只兔。6周后分别于兔的两后腿大腿肌肉内注射0.5ml新鲜配制的抗原-弗氏完全佐剂乳化液进行加强免疫，同上隔2周加强免疫1次，于加强免疫后10天采血经ELISA检测抗体产生水平，加强免疫3次，心脏采血，凝集后收集血清。
(2)纯化抗血清获得6d抗体[8，9]A.饱和硫酸铵法沉淀IgG于4C°用滴管缓慢向血清中加1/2体积的饱和硫酸铵，持续搅拌4h，12,000Xg离心20min沉淀IgG将沉淀物重悬于33％的饱和硫酸铵至原血清体积，离心洗涤。重洗1次。将沉淀物于4C°缓慢振动溶于PBS至原血清体积的10％，4C°透析48h，换透析缓冲液3次，移去所有的硫酸铵。
B.用抗原-Sepharose经免疫亲和层析进行纯化1)制备抗原-Sepharose柱用1mM HCl膨化CNBr-Sepharose 4B，相继以1mM HCl 300ml和偶联缓冲液(pH8.3，0.125M Na2HPO4)300ml洗涤膨化的CNBr-Sepharose 4B，加入合成的6d多肽抗原至终浓度为2mg/ml，4C°振动过夜，250Xg离心10min，加入偶联缓冲液，250Xg离心10min。与1M乙醇胺(pH8.0)在4C°孵育5h，250Xg离心10min，以PBS离心洗涤后，装柱并用PBS平衡。
2)加样将样品1-5ml/min加至抗原-Sepharose柱，用30ml PBS洗脱未结合的成分。
3)洗脱结合的成分用pH2.3的盐酸-甘氨酸缓冲液(2-3倍柱体积)进行洗脱。
4)收集洗脱液，用离心过滤装置浓缩获得的抗体。
实施例36d抗体用于检测和鉴定Tau蛋白异型6d是否以蛋白质的形式存在用6d为一抗，经Western Blotting，检测不同部位的脑组织中内源性Tau蛋白异型6d的表达水平和时空分布；同时克隆Tau蛋白异型6d基因并导入COS细胞等进行体外表达，经Western Blotting对外源性Tau蛋白异型6d进行检测鉴定，结果显示A.新的Tau蛋白异型6d确实以蛋白质的形式存在着(图5，6)；B.所制备的6d抗体为高度特异的抗体(图5，6)[11]。
实施例4经免疫组化法对Tau蛋白异型6d在脑组织和脊髓中定位研究冻存的脊髓、新鲜前海马和海马组织(Harvard Brain Tissue ResourceCenter in Boston和Brain and Tissue Bank for Developmental Disorders inBaltimore)按Jones的方法[12]进行防冻处理将盛有固定液(用PBS配制的6％多聚甲醛，20％蔗糖，20％乙醇，20％乙烯二醇，10％甘油)的容器浸入另一装有100％乙醇而且四周围着干冰的容器中迅速制冷，直到固定液开始变硬(约-60C°)。将组织块放入固定液中，然后转到-20C°，每8小时轻轻摇动一次，这样维持7天，再转至4C°并持续摇动，直到组织块和固定液的温度平衡到4C°。
防冻处理后的组织块转入用PBS配制的30％蔗糖液中，于4C°摇动24小时，期中12小时后更换蔗糖溶液一次。然后组织块可冻存于-70C°或切成50μm厚的切片。切片以预冷的50mM PBS(pH7.4)洗3次，每次10分钟；100mMPBS(pH7.4)洗2次，每次10分钟；含1％BSA和0.3％Triton X-100的PBS封闭30分钟；一抗于4C°染色过夜；以含0.02％Triton X-100的PBS洗4次，每次15分钟；二抗室温染色2小时，以PBS洗4次，每次15分钟；将切片铺于载玻片上，干后封片并于荧光显微镜下观察。
所用抗体一抗有抗-6d的多克隆抗体，1∶200稀释；Tau5单克隆抗体，1∶500稀释；MAP2单克隆抗体(Zymed)1∶200稀释。二抗有FITC-羊抗兔IgG(Zymed)，1∶500稀释；Cy3-羊抗鼠IgG(Zymed)，1∶1,000稀释。(图7)实施例5用本发明提供的抗体检测人脊液中Tau蛋白异型6d的ELISA检测结果(见表1)。结果显示，用本发明提供的抗体对Tau蛋白的检测具有特异性。
表1
表中上半部为对病人组的检测结果，下半部为对照组。其中，20例病人组中只有A3和C8呈阴性，其余18个为阳性。
参考文献1.Wei ML，Andreadis A.Splicing of a regulated exon reveals additional complexity in theaxonal microtubule-associated protein tau.J Neurochem 1998 Apr；70(4)1346-562.Wei ML，Memmott J，Screaton G，Andreadis A.The splicing determinants of a regulatedexon in the axonal MAP tau reside within the exon and in its upstream intron.Brain ResMol Brain Res.2000 Sep 15；80(2)207-18.
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4.Frischmeyer PA.Dietz HC.Nonsense-mediated mRNA decay in health and disease.HumMol Genet 1999；81893-1900.
5.金冬雁，黎孟枫译。分子克隆实验指南第二版.科学出版社1998年P856-857.
6.金冬雁，黎孟枫译。分子克隆实验指南第二版.科学出版社1998年P854-855.
7.Current Protocols of Immunology，Chapter 11.12--Preparation of polyclpnal antisera.
8.Current Protocols of Immunology，Chapter 10.11--Immunoaffinity chromatography9.Current Protocols of Immunology，Chapter 10.13--Purification if IgG fraction fromantiserum，ascites fluid，or hybridoma supernatent10.Current Protocols of Immunology，(HPLC)
权利要求
1.一种多肽，具有SEQ ID No.1氨基酸序列。
2.一种抗权利要求1所述多肽的抗体。
3.一种试剂盒，含有权利要求2所述的抗体。
4.一种检测脑脊液中Tau蛋白6d的方法，其特征在于用抗权利要求1所述的多肽的抗体进行检测。
全文摘要
本发明涉及Tau蛋白相关的多肽抗原及抗体。本发明提供的特异性多肽抗原具有SEQ ID No.1的氨基酸序列。用现有的方法可以获得多克隆或单克隆抗体。本发明提供的抗体可以制备成试剂盒，用于检测和诊断老年性痴呆致病。
文档编号C07K16/18GK1721437SQ20041004503
公开日2006年1月18日 申请日期2004年7月13日 优先权日2004年7月13日
发明者罗敏华 申请人:中南大学