专利名称：一种莱菔硫烷的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种以芸苔属蔬菜为原料制备莱菔硫烷的方法。
背景技术：
莱菔硫烷(sulforaphane，1-异硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷)广泛存在于十字花科植物中芸苔属(Brassica)蔬菜中。人们日常食用的蔬菜，如结球甘蓝、抱子甘蓝、散叶甘蓝、球茎甘蓝、青花菜、芥菜和辣根等都属于这一类蔬菜。葡萄糖莱菔硫烷(glucoraphanin)是莱菔硫烷的前体物，葡萄糖莱菔硫烷经芥子硫苷酸酶(myrosinase)水解可生成莱菔硫烷。
莱菔硫烷的生理功能1、莱菔硫烷不具有任何细胞毒性；2、抑制肿瘤的形成；大量实验证明，莱菔硫烷对食道癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌及大肠癌等都有很好的防治效果；3、莱菔硫烷提高组织的谷胱甘肽水平；4、莱菔硫烷可以诱导细胞合成II型解毒酶，如谷胱甘肽转移酶、NAD(P)H-醌还原酶、血红素氧化酶，使细胞免受活性氧的攻击；5、抑制并杀死幽门螺杆菌。
近几年，随着人们逐渐认识到莱菔硫烷所具有的卓越的生理功能，莱菔硫烷的制备也倍受关注。目前莱菔硫烷的制备方法主要有化学合成和天然产物提取。
(1)化学合成法最初的化学合成制备莱菔硫烷的方法虽然反应过程简单，但是合成出来的莱菔硫烷为外消旋体(D型和L型的莱菔硫烷的混合物)，而天然的莱菔硫烷为L型的。现今大多采用立体化学手性合成的方法制备(Schenk，W.A.；Durr，M.；Steinmetz，B.；Adam，W.；Saha-Moller，C.R.Enantioselective oxidation of thioethers using ruthenium complexesas chiral auxiliaries.Proceedings of the Symposium，3rd，Wuerzburg，Germany，Sept.17-19，1997，Meeting Date 1997，245-246.)。该方法以1-氧-R-甲基亚硫酰基-2-苯基环己烷为原料，在室温、四氢呋喃为溶剂的条件下与活性金属分子试剂反应，生成的中间产物在与氢氟酸反应，生成1-羟基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷，在与叠氮化钠、二硫化碳回流反应最终生成L型的莱菔硫烷。手性合成法虽然只合成L型的莱菔硫烷，但是存在反应机理复杂，反应步骤多，产率不高，副产物多，原料毒性较大，分离提取困难等缺点，再加上原材料成本高，难以大规模工业化生产。
(2)天然产物提取该方法是利用植物自身的芥子硫苷酸酶或添加外源的芥子硫苷酸酶水解葡糖莱菔硫烷生成莱菔硫烷后，在采用有机溶剂萃取和层析等分离纯化工艺制备莱菔硫烷。采用萃取法处理水解产物后得到的往往是几种水解产物的混合物，须进行进一步的分离纯化。目前主要采用二氯甲烷萃取青花菜的水解物，再利用制备型反相C18色谱分离纯化莱菔硫烷(Nathan V.Matusheski，Mathew A.Wallin，et al.PreparationHPLC Method for the purification of sulforaphane Nitrile from Brassicaoleracea.J.Agric.Chem，2001，49，1867-1872.)。该方法虽然可以获得高纯度的产品，但萃取所采用的溶剂为毒性较大的二氯甲烷，难以避免残留于最终的产品中，从而限制产品的使用；分离纯化所选用的制备型反相C18高效液相色谱柱价格十分昂贵，流动相为低浓度的乙腈水溶液，很难回收重复利用，因而该方法生产成本很高，只限于实验规模制备少量产品，难于大规模生产。
公开号为CN 1149986A的中国专利申请公开了一种制备含莱菔硫烷的芸苔属蔬菜压片的制备方法。该方法通过蒸汽加热钝化芸苔属蔬菜中内生的黑芥子硫苷酸酶，添加外生的黑芥子硫苷酸酶将硫代葡萄糖苷转化成为莱菔硫烷。该方法原材料的选取范围十分有限，以青花菜为例，该方法只适用于以青花菜的花作为原料，而对于青花菜的种子、茎、叶子等组织则只能弃置不用。此外，该方法必须添加外源的芥子硫苷酸酶，这需要建立外源芥子硫苷酸酶的生产线或高价购买其酶制剂，以上这些因素导致该方法在实际生产应用中具有局限性，而且生产成本很高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以芸苔属蔬菜的种子、花、茎、叶为原料制备莱菔硫烷的方法。原料经粉碎后，利用植物自身的芥子硫苷酸酶在特定pH值下水解，采用乙酸乙酯萃取，采用价格低廉的硅胶吸附莱菔硫烷，乙酸乙酯除杂，异丙醇、乙醇、异丙醇与石油醚、或乙醇与石油醚的混合溶液洗脱莱菔硫烷，从而有效地提高莱菔硫烷的含量，同时降低成本。
发明要点本发明的原料采用芸苔属蔬菜，包括，但不仅限于，结球甘蓝、抱子甘蓝、散叶甘蓝、球茎甘蓝、青花菜、芥菜或辣根，本方法适用于以芸苔属蔬菜的种子、花、茎或叶等组织作为原料。对于本方法优选的芸苔属蔬菜是青花菜(别名绿菜花、西兰花)，最优选的原料是青花菜的花或种子。
具体方法和步骤如下A.水解生成莱菔硫烷将芸苔属蔬菜的种子、花、茎或叶粉碎，加入质量为1-3倍的去离子水，调节pH值为2-7.5，室温下搅拌水解2-8小时；pH值可以采用pH值缓冲溶液或加入碳酸钙或盐酸进行调控；其中pH值缓冲溶液可以为Na2HPO4-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸缓冲液、KH2PO4-NaOH缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液。
B.乙酸乙酯萃取将步骤A得到的莱菔硫烷水解液，加入乙酸乙酯萃取2-3次，加入的量没有特别要求，以莱菔硫烷水解液体积的1-2倍即可，得到的莱菔硫烷乙酸乙酯提取液，减压蒸馏，回收乙酸乙酯后，得到莱菔硫烷的粗产品。
C.硅胶分离纯化将步骤B得到的莱菔硫烷粗产品溶解于乙酸乙酯体积百分含量为10-40％的石油醚和乙酸乙酯混合溶液中，经硅胶吸附后，再用乙酸乙酯洗去硅胶上吸附的低极性杂质，此时乙酸乙酯的用量以洗去低极性杂质而同时不损失莱菔硫烷为限；最后用异丙醇、乙醇或异丙醇与石油醚、乙醇与石油醚的混合溶液洗脱莱菔硫烷，减压蒸馏以除去有机溶剂，得到莱菔硫烷产品。
上述方法中，步骤A所采用的蔬菜种子可以为脱脂或未脱脂的种子。
上述方法步骤C所用的异丙醇与石油醚、乙醇与石油醚的混合溶液，石油醚在混合溶液中的体积百分含量不超过50％。
上述方法中，步骤C所采用的硅胶为层析用硅胶，可以为无定形或球形，硅胶粒径最好为60-300目，优选为200-300目。
发明效果本发明将芸苔属蔬菜的种子、花、茎、叶粉碎后，利用植物自身的芥子硫苷酸酶在特定pH值下水解，采用乙酸乙酯萃取，硅胶吸附，乙酸乙酯除杂，异丙醇、乙醇、异丙醇与石油醚、或乙醇与石油醚的混合溶液洗脱莱菔硫烷，从而有效地提高菜菔硫烷的含量。此方法原料适用范围广，无需添加外源的芥子硫苷酸酶，在特定pH值下水解利用原材料自身的芥子硫苷酸酶水解硫代葡萄糖苷，降低了生产成本，简化了提取纯化工艺，易于自动化操作，适合大规模工业生产。
具体实施例方式实施例1(1)水解生成莱菔硫烷称取100g青花菜种子，研磨成粉末状，加入250ml去离子水，用碳酸钙调节pH为5-7，在室温下搅拌水解5h；(2)乙酸乙酯萃取水解后的混合物加入500ml的乙酸乙酯，离心，收集乙酸乙酯，重复此步骤3次，将三次得到的乙酸乙酯相混合，减压蒸馏浓缩为黄褐色油状的莱菔硫烷粗产品，含量为5.5％；(3)硅胶分离纯化上述得到的莱菔硫烷粗产品溶解于600ml体积比为8∶2的石油醚和乙酸乙酯溶液，经30克100-200目的层析用硅胶吸附后，再用100ml乙酸乙酯除杂，最后用300ml乙醇洗脱莱菔硫烷，减压蒸馏回收乙醇，纯度为54.2％，收率为71.3％。
实施例2(1)水解生成莱菔硫烷称取经石油醚脱脂的100g青花菜种子粉末，加入300mL pH值为5-7的Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液，在室温下搅拌水解3h；2)乙酸乙酯萃取水解后的混合物加入500ml的乙酸乙酯，离心，收集乙酸乙酯，重复此步骤3次，将三次得到的乙酸乙酯相混合，减压蒸馏浓缩为黄褐色油状的莱菔硫烷粗产品，含量为15.5％；(3)硅胶分离纯化上述得到的莱菔硫烷粗产品溶解于600ml体积比为6∶4的石油醚和乙酸乙酯溶液，经50克200-300目的层析用硅胶吸附后，再用100ml乙酸乙酯除杂，最后用800ml体积比为4∶6的石油醚和乙醇溶液洗脱莱菔硫烷，收集含莱菔硫烷的组分，减压蒸馏回收石油醚和乙醇，纯度为84.2％，收率为66.2％。
实施例3(1)水解生成莱菔硫烷称取500g新鲜青花菜，加入500ml去离子水，用盐酸调pH值为2-3，匀浆，在室温下搅拌水解7小时；(2)乙酸乙酯萃取上述水解液加入500ml乙酸乙酯，萃取，离心，收集乙酸乙酯相，如此重复三次.合并三次得到的乙酸乙酯相，减压蒸馏浓缩为黄褐色油状的莱菔硫烷粗产品，含量为1.98％；(3)硅胶分离纯化上述得到的莱菔硫烷粗产品溶解于100ml体积比为7∶3的石油醚和乙酸乙酯溶液，经30克100-200目的层析用硅胶吸附后，再用20ml乙酸乙酯除杂，最后用1000ml异丙醇洗脱莱菔硫烷，收集含莱菔硫烷的组分，减压蒸馏回收异丙醇，含量为8.37％，产品回收率为82.6％。
实施例4(1)水解生成莱菔硫烷称取500g新鲜青花菜，加入1000ml柠檬酸-柠檬酸钠的缓冲溶液调pH值为3-4，匀浆，在室温下搅拌水解8小时；(2)乙酸乙酯萃取上述水解液加入1000ml乙酸乙酯，萃取，离心，收集乙酸乙酯相，如此重复三次.合并三次得到的乙酸乙酯相，减压蒸馏浓缩为黄褐色油状的莱菔硫烷粗产品，含量为0.85％；(3)硅胶分离纯化上述得到的莱菔硫烷粗产品溶解于100ml体积比为9∶1的石油醚和乙酸乙酯溶液，经30克100-200目的层析用硅胶吸附后，再用15ml乙酸乙酯除杂，最后用1000ml体积比为2∶8的石油醚和异丙醇溶液洗脱莱菔硫烷，收集含莱菔硫烷的组分，减压蒸馏回收异丙醇，含量为12.56％，产品回收率为85.8％。
权利要求
1.一种莱菔硫烷的制备方法，以芸苔属蔬菜为原料，依次包括如下步骤A.水解生成莱菔硫烷将芸苔属蔬菜的种子、花、茎、叶粉碎，加入质量为1-3倍的去离子水，调节pH值为2-7.5，室温下搅拌水解2-8小时；pH值可以采用pH值缓冲溶液或加入碳酸钙、盐酸进行调控；B.乙酸乙酯萃取将步骤A得到的莱菔硫烷水解液，加入乙酸乙酯萃取2-3次，得到莱菔硫烷的乙酸乙酯提取液，减压蒸馏，得到莱菔硫烷的粗产品；C.硅胶分离纯化将步骤B得到的莱菔硫烷粗产品溶解于乙酸乙酯体积百分含量为10-40％的石油醚和乙酸乙酯混合溶液中，经硅胶吸附后，再用乙酸乙酯洗去硅胶上吸附的低极性杂质，最后用异丙醇、乙醇、异丙醇与石油醚或乙醇与石油醚的混合溶液洗脱莱菔硫烷，经减压蒸馏除去有机溶剂，得到莱菔硫烷产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤A中所说的pH值缓冲溶液为Na2HPO4-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸缓冲液、KH2PO4-NaOH缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤A中采用青花菜的花或种子为原料。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤C所用的硅胶粒径为60-300目。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是步骤C所用的硅胶粒径为200-300目。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤C所用的异丙醇与石油醚或乙醇与石油醚的混合溶液中石油醚在混合溶液中的体积百分含量不超过50％。
全文摘要
本发明涉及一种以芸苔属蔬菜为原料制备莱菔硫烷的方法。本发明的方法将芸苔属蔬菜的种子、花、茎、叶粉碎后，利用植物自身的芥子硫苷酸酶在特定pH值下水解，采用乙酸乙酯萃取，硅胶吸附，乙酸乙酯除杂，异丙醇、乙醇、异丙醇与石油醚、或乙醇与石油醚的混合溶液洗脱莱菔硫烷，从而有效地提高莱菔硫烷的含量。本方法原料适用范围广，无需添加外源的芥子硫苷酸酶，降低了生产成本，简化了提取纯化工艺，易于自动化操作，适合大规模工业生产。
文档编号C07C319/00GK1982294SQ20051013046
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月13日 优先权日2005年12月13日
发明者袁其朋, 梁浩, 候晓丹, 肖倩 申请人:北京化工大学