人抑癌基因，其编码的蛋白，含有其的表达载体和由该载体转化的细胞的制作方法

专利名称：人抑癌基因，其编码的蛋白，含有其的表达载体和由该载体转化的细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及人抑癌基因，其编码的蛋白，含有其的表达载体和由所述载体 转化的细胞。
背景技术：
肿瘤抑制基因产物在抑制正常细胞被转化成某些癌细胞方面起作用，因此，丧失肿瘤抑制基因产物这一功能使得正常细胞成为恶性转化细胞(Klein， G.， /^S五BJ， 7， 821-825 (1993))。为了使得癌细胞生长成为肿瘤，细胞要 丧失控制肿瘤抑制基因的正常拷贝数这一功能。已发现在人类癌症中，对一 p53肿瘤抑制基因编码序列的修饰是最普遍的遗传改变方法之一 (Bishop，J.M.， Cell, 64， 235-248(1991); and Weinberg, R.A., 5We"ce, 254, 1138-1146 (19W))。然而，据估计，只有-些乳腺癌组织显示出p53突变，因为在乳腺癌中已 报道的p53突变在30%以内(Keen, J.C. & Davidson, N. E., Owe", 97, 825-833 (2003)) and Borresen-Dale, A-L.， //翻朋Mw她'ow, 21, 292-300 (2003》。在肝癌中，p53突变至少占50。/。，尤其是在暴露于黄曲霉素B1的区域或 者具有被乙型肝炎病毒感染的高频区域，并且其主要以p53肿瘤基因第249 密码子的错义突变为特征(Montesano， R. a/., Ato/. 89， 1844-1851 (1997); Szymanska, K. & Hainaut, P. Jcta肠c/u'脂'ca Pofom'ca， 50， 231-238 (2003))。然而，在美国和西欧，p53突变只占乳腺癌的30%以内，并 且没有这些突变更频繁发生的热点区域(Szymanska， K. & Hainaut, P. 历oc/w'm/c"尸o/om.ca, 50， 231-238 (2003》。因此，本发明人强烈地试图利用mRNA差异显示(DD)方法从正常乳腺 组织中分离一新的肿瘤抑制基因，该方法有效地显示在正常乳腺组织和乳腺癌 之间，或者在正常肝组织和肝癌之间差异表达的基因(Liang, P. and Pardee, A. B.. Scz'e"ce, 257， 967-971 (1992); and Liang, P. et al" C離er i 饥，52, 6966-6968 (1993))
发明内容
技术问题因此，本发明意欲解决现有技术的问题，并因此本发明的一个目的是提供 一新的人抑癌基因。本发明的另一目的是提供-一由所述基因编码的抑癌蛋白。 本发明的又一 目的是提供一含有所述基因的表达载体。 本发明的再一目的是提供一由所述表达载体转化的细胞。技术方案为了实现上述目的，本发明提供了一人抑癌基因(生长抑制基因12;也称为GIG12)，其具有如SEQIDNO: 1所示的DNA序列。为了实现另一目的，本发明提供了一人抑癌蛋白，其由GIG12基因编码， 具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。本发明还提供了一人抑癌基因(生长抑制基因17;也称为GIG17)，其具 有如SEQ ID NO: 5所示的DNA序列。本发明提供了一人抑癌蛋白，其由GIG17基因编码，具有如SEQIDNO: 6所示的氨基酸序列。本发明还提供了一人抑癌基因(生长抑制基因19;也称为GIG19)，其具 有如SEQ ID NO: 9所示的DNA序列。本发明提供了一人抑癌蛋白，其由GIG19基因编码，具有如SEQIDNO: IO所示的氨基酸序列。本发明还提供了一人抑癌基因(生长抑制基因20;也称为GIG20)，其具 有如SEQ ID NO: 13所示的DNA序列。本发明提供了一人抑癌蛋白，其由GIG20基因编码，具有如SEQIDNO: "所示的氨基酸序列。本发明还提供了一人抑癌基因(生长抑制基因22;也称为GIG22),其具 有如SEQIDNO: 17所示的DNA序列。本发明提供了一人抑癌蛋白，其由GIG22基因编码，具有如SEQIDNO: 18^f示的氨基酸序列。本发明还提供了一人抑癌基因(生长抑制基因25;也称为GIG25)，其具
有如SEQ ID NO: 21所示的DNA序列。本发明提供了一人抑癌蛋白，其由GIG25基因编码，具有如SEQIDNO:22所示的氨基酸序列。本发明还提供了一人抑癌基因(生长抑制基因36;也称为GIG36)，其具 有如SEQ ID NO: 25所示的DNA序列。本发明提供了一人抑癌蛋白，其由GIG36基因编码，具有如SEQ ID NO: 26所示的氨基酸序列。本发明还提供了一人抑癌基因(生长抑制基因2;也称为GIG2)，其具有 如SEQ ID NO: 29所示的DNA序列。本发明提供了一人抑癌蛋白，其由GIG2基因编码，具有如SEQIDNO: 30所示的氨基酸序列。根据另一目的，本发明提供了一含有上述每个基因的表达载体。根据又一目的，本发明提供了一由上述每个表达载体转化的细胞。


结合附图，将在下述具体说明中对本发明优选的具体实施方式
的上述和其他特性及优点进行更全面的描述。在附图中图1是显示使用SEQ ID NO: 3所示的5，-13-mer随机引物H-AP32和SEQ ID NO: 4所示的锚定oligo-dT引物的PCR结果凝胶图像；图2是显示使用SEQ ID NO: 7所示的5'-13-mer随机引物H-AP7和SEQ ID NO: 8所示的锚定oligo-dT引物的PCR结果凝胶图像；图3是显示使用SEQ ID NO: 11所示的5'-13-mer随机引物H-AP45和SEQ ID NO: 12所示的锚定oligo-dT引物的PCR结果凝胶图像；图4是显示使用SEQ ID NO: 15所示的5'-13-mer随机引物H-AP40和SEQ ID NO: 16所示的锚定oligo-dT引物的PCR结果凝胶图像；图5是显示使用SEQ ID NO: 19所示的5'-13-mer随机引物H-AP30和SEQ ID NO: 20所示的锚定oligo-dT引物的PCR结果凝胶图像；图6是显示使用SEQ ID NO. 23所示的5，-13-mer随机引物H-AP40和SEQ ID NO: 24所示的锚定oligo-dT引物的PCR结果凝胶图像；图7是显示使用SEQ ID NO: 27所示的5'-13-mer随机引物H-AP29和SEQID NO: 28所示的锚定oligo-dT引物的PCR结果凝胶图像；图8是显示使用SEQ ID NO: 31所示的5，-13-mer随机引物H-AP32和SEQID NO: 32所示的锚定oligo-dT引物的PCR结果凝胶图像；图9是显示SDS-PAGE分析GIG12基因产物的结果的图像；图10是显示SDS-PAGE分析GIG17基因产物的结果的图像；图H是显示SDS-PAGE分析GIG19基因产物的结果的图像；图12是显示SDS-PAGE分析GIG20基因产物的结果的图像；图13是显示SDS-PAGE分析GIG22基因产物的结果的图像；图14是显示SDS-PAGE分析GIG25基因产物的结果的图像；图15是显示SDS-PAGE分析GIG36基因产物的结果的图像；图16是显示SDS-PAGE分析GIG2基因产物的结果的图像；图17 (a)是显示GIG12基因在正常乳腺组织，原发性乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中差异表达的Northern杂交结果的图像，和图17 (b)是显示将其与卩-肌动蛋白探针杂交得到的Northern杂交结果的图像，-图18 (a)是显示GIG17基因在正常乳腺组织，原发性乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中差异表达的Northern杂交结果的图像，和图18 (b)是显示将其与p-肌动蛋白探针杂交得到的Northern杂交结果的图像；图19 (a)是显示GIG19基因在正常乳腺组织，原发性乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中差异表达的Northern杂交结果的图像，和图19 (b)是显示将其与卩-肌动蛋白探针杂交得到的Northern杂交结果的图像；图20 (a)是显示GIG20基因在正常乳腺组织，原发性乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中差异表达的Northern杂交结果的图像，和图20 (b)是显示将其与卩-肌动蛋白探针杂交得到的Northern杂交结果的图像；图21 (a)是显示GIG22基因在正常乳腺组织，原发性乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中差异表达的Northern杂交结果的图像，和图21 (b)是显示将其与卩-肌动蛋白探针杂交得到的Northern杂交结果的图像；图22 (a)是显示GIG25基因在正常乳腺组织，原发性乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中差异表达的Northern杂交结果的图像，和图22 (b)是显示将其与(3-肌动蛋白探针杂交得到的Northern杂交结果的图像；图23 (a)是显示GIG36基因在正常乳腺组织，原发性乳腺癌组织和乳腺
癌细胞系中差异表达的Northern杂交结果的图像，和图23 (b)是显示将其与 卩-肌动蛋白探针杂交得到的Northern杂交结果的图像；图24 (a)是显示GIG2基因在正常肺组织，原发性肺癌组织，转移性肺 癌组织和肺癌细胞系中差异表达的Northern杂交结果的图像，和图24 (b)是 显示将其与(3-肌动蛋白探针杂交得到的Northern杂交结果的图像；图25 (a)是显示GIG12基因在各种正常组织中差异表达的Northern杂交 结果的图像，和图25 (b)是显示将其与(3-肌动蛋白探针杂交得到的Northern 杂交结果的图像；图26 (a)是显示GIG17基因在各种正常组织中差异表达的Northern杂交 结果的图像，和图26 (b)是显示将其与P-肌动蛋白探针杂交得到的Northern 杂交结果的图像；图27 (a)是显示GIG19基因在各种正常组织中差异表达的Northern杂交 结果的图像，和图27 (b)是显示将其与(3-肌动蛋白探针杂交得到的Northern 杂交结果的图像；图28 (a)是显示GIG20基因在各种正常组织中差异表达的Northern杂交 结果的图像，和图28 (b)是显示将其与(3-肌动蛋白探针杂交得到的Northern 杂交结果的图像；图29 (a)是显示GIG22基因在各种正常组织中差异表达的Northern杂交 结果的图像，和图29 (b)是显示将其与(3-肌动蛋白探针杂交得到的Northern 杂交结果的图像-，图30 (a)是显示GIG25基因在各种正常组织中差异表达的Northern杂交 结果的图像，和图30 (b)是显示将其与(3-肌动蛋白探针杂交得到的Northern 杂交结果的图像；图31 (a)是显示GIG36基因在各种正常组织中差异表达的Northern杂交 结果的图像，和图31 (b)是显示将其与P-肌动蛋白探针杂交得到的Northern 杂交结果的图像；图32 (a)是显示GIG2基因在各种正常组织中差异表达的Northern杂交 结果的图像，和图32 (b)是显示将其与P-肌动蛋白探针杂交得到的Northern 杂交结果的图像；图33 (a)是显示GIG12基因在各种癌细胞系中差异表达的Northern杂交 结果的图像，和图33 (b)是显示将其与(3-肌动蛋白探针杂交得到的Northern 杂交结果的图像；图34 (a)是显示GIG17基因在各种癌细胞系中差异表达的Northern杂交 结果的图像，和图34 (b)是显示将其与p-肌动蛋白探针杂交得到的Northern 杂交结果的图像；图35 (a)是显示GIG19基因在各种癌细胞系中差异表达的Northern杂交 结果的图像，和图35 (b)是显示将其与(3-肌动蛋白探针杂交^l到的Northern 杂交结果的图像；图36 (a)是显示GIG20基因在各种癌细胞系中差异表达的Northern杂交 结果的图像，和图36 (b)是显示将其与P-肌动蛋白探针杂交得到的Northern 杂交结果的图像；图37 (a)是显示GIG22基因在各种癌细胞系中差异表达的Northern杂交 结果的图像，和图37 (b)是显示将其与P-肌动蛋白探针杂交得到的Northern 杂交结果的图像；图38 (a)是显示GIG25基因在各种癌细胞系中差异表达的Northern杂交 结果的图像，和图38 (b)是显示将其与(3-肌动蛋白探针杂交得到的Northern 杂交结果的图像；图39 (a)是显示GIG36基因在各种癌细胞系中差异表达的Northern杂交 结果的图像，和图39 (b)是显示将其与(3-肌动蛋白探针杂交得到的Northern 杂交结果的图像；图40 (a)是显示GIG2基因在各种癌细胞系中差异表达的Northern杂交 结果的图像，和图40 (b)是显示将其与(3-肌动蛋白探针杂交得到的Northern 杂交结果的图像；图41是显示野生型MCF-7细胞，由GIG12基因转染的MCF-7乳腺癌细 胞和由表达载体pcDNA3.1转染的MCF-7细胞的生长曲线的图像；图42是显示野生型HepG2肝癌细胞系，由GIG17基因转染的H印G2肝 癌细胞和由表达载体pcDNA3.1转染的HepG2细胞的生长曲线的图像；图43是显示野生型HepG2肝癌细胞系，由GIG19基因转染的H印G2肝 癌细胞和由表达载体pcDNA3.1转染的HepG2细胞的生长曲线的图像；图44是显示野生型HepG2肝癌细胞系，由GIG20基因转染的HepG2肝
癌细胞和由表达载体pcDNA3.1转染的HepG2细胞的生长曲线的图像；图45是显示野生型HepG2肝癌细胞系，由GIG22基因转染的HepG2肝 癌细胞和由表达载体pcDNA3.1转染的H印G2细胞的生长曲线的图像；图46是显示野生型HepG2肝癌细胞系，由GIG25基因转染的HepG2肝 癌细胞和由表达载体pcDNA3.1转染的HepG2细胞的生长曲线的图像；图47是显示野生型HepG2肝癌细胞系，由GIG36基因转染的HepG2肝 癌细胞和由表达载体pcDNA3.1转染的HepG2细胞的生长曲线的图像；和图48是显示野生型A549肺癌细胞系，由GIG2基因转染的A549肺癌细 胞和由表达载体pcDNA3.1转染的A549细胞的生长曲线的图像。最佳实施方式以下，将参考附图对本发明的优选具体实施方式
进行具体描述。 1、 GIG12本发明的基因是一人抑癌基因36 (GIG36)，其具有SEQIDNO: 1所示 的DNA序列，登录于美国国立卫生研究所(NIH)的GenBank数据;车(公开 日2005年3月1日)，登录号为AY493417，并且所述基因的一些DNA序 列与数据库中登录号为NM一002343的乳运铁蛋白的序列相同。乳运铁蛋白主 要在牛奶和血清中大量分布，并且其已知的作用只是铁离子的载体 (Kanyshkova, G.T., " a/"伤0c/2emW7 fMoscow人66， 1-7 (2001))。同时，已发 现乳运铁蛋白只具有强的抗菌活性(Oppenheimer， J.S. W"化，131, 6165-6335 (2001); Shugars, C.D.,Gera"to/ogy, 47， 246-253 (2001))。然而，与以前所报道的功能相反，本研究的结果发现乳运铁蛋白和各种癌 症的发生紧密相关。还发现GIG12肿瘤抑制基因在包括乳腺癌在内的各种人 肿瘤中根本不表达，而在各种正常组织中其表达增强。SEQ ID NO: 1所示的DNA序列具有一开放读码框(ORF)，其对应于 DNA序列的111 2246的碱基位置(碱基位置2244 2246代表一终止密码 子)。然而，由于密码子简并性或者考虑到不同生物体基因表达的密码子偏爱 性，本发明的基因可以在编码区进行各种修饰而不改变由编码区所表达的蛋白 质的氨基酸序列，并且也可以在不影响基因表达的限度下，在除编码区以外的 区域进行各种修饰或改变。所述修饰的基因也包括在本发明的范围内。因此， 本发明还包括一具有与所述基因，以及所述基因片段的DNA序列基本上相同的寡核苷酸。术语"基本上相同的寡核苷酸"意指具有至少80。/oDNA序列同源 性的寡核苷酸，优选至少卯％，和最优选至少95%。本发明的基因所表达的蛋白由711个氨基酸残基组成，并具有SED ID NO: 2所示的氨基酸序列和分子量大约为78 kDa。然而，在不影响蛋白功能 的限度下，在氨基酸序列中也可以替换，增加或缺失一个或多个氨基酸，以及 根据其用法，所述蛋白只有一部分可以被使用。所述修饰的氨基酸序列也包括 在本发明的范围内。因此，本发明也包括一具有与所述蛋白，及蛋白片段的氨 基酸序列基本上相同的多肽。术语"基本上相同的多肽"意指具有至少80%序 列同源性的多肽，优选至少90%，和最优选至少95%。本发明的基因和蛋白可以从人组织中分离，或者根据已知的合成DNA或 肽的方法合成。例如，可以在SEDIDNO: 1所示的DNA序列信息的基础上， 根据常规方法筛选和克隆本发明的基因。作为另一个实例，通过使用SEQID NO: 3(5'-AAGCTTCCTGCAA-3')所示的随机引物H-AP32和SEQ II) NO: 4 (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3')所示的锚定oligo-dT引物，对从正常组织，和癌 组^^或癌细胞系中提取的总RNA进行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，可 以获得一 680-bp的cDNA片段，其在癌组织或癌细胞系中不表达，而仅在正 常组织中差异表达，而反应产物片段作为探针，可以与cDNA文库进行噬菌斑 杂交以获得全长cDNA克隆。因此，所制备的基因可以插入到一本领域公知的用于在微生物或动物细胞 中表达的载体中以获得一表达载体，然后，可以大量复制基因的cDNA或者通 过将表达载体引入适宜的宿主细胞以工业规模地生产其蛋白，所述宿主细胞例 如大肠杆菌五"/^^/^^//，1^€ -7细胞系等。在构建表达载体时，根据被设 计用于产生所述基因或蛋白的各种宿主细胞，可以适当地选择和结合DNA调 控序列，例如启动子和终止子，自主复制序列，释放信号序列等。本发明将GIG12全长cDNA插入到一表达载体pcDNA3.1 (Invitrogen， U.S.)中，然后用该表达载体产物转化&c&hc/^ "DH5a,其随后被命名为 E co/ZDH5a/GIG12/pcDNA3.1，并于2004年5月24日保藏于韩国典型培养物 保藏中心，保藏号为KCTC 10642BP。本发明的基因被认为是在正常组织中过量表达以抑制癌的发生，所述组织
优选乳腺，肺，胸腺，肝，骨骼肌，肾，脾，心脏，胎盘和外周血液。本发明的基因在这些组织中主要作为具有约2.4kb大小的mRNA转录体过量表达。尤其是，本发明的基因只在正常组织中差异表达。例如，本发明的基因在癌组织和癌细胞中不表达，例如乳腺癌组织，乳腺癌细胞系MCF-7等，而只在正 常组织中差异表达。引入了本发明基因的癌细胞系显示出高死亡率，并因此本发明的基因可以 有效地用于治疗和预防癌症。2、 GIG17本发明的基因是一人抑癌基因17 (GIG17)，其具有SEQIDNO: 5所示 的DNA序列，其登录于美国国立卫生研究所(NIH)的GenBank数据库(公 开曰2005年12月31日)，登录号为AY544122，并且所登录基因的3个碱 基对具有不同于该数据库中登录号为M19922的人果糖1， 6-二磷酸酶的多态 性。在葡萄糖代谢中的一个最重要的反应是果糖1， 6-二磷酸水解为果糖-6-磷 酸(Marcus， F. d a/.， i/z.肠/. 20, 371-378 (1987); Okar， D，A. &Lange,A丄肌o/actors， 10,1-14(1999))。人果糖1, 6-二磷酸酶是催化所述代谢 的一个酶，其存在于所有生物体中。然而，与以前所报道的葡萄糖代谢相反，本研究的结果发现GIG17肿瘤 抑制基因在包括肝癌在内的各种人肿瘤中根本不表达，而在各种正常组织中其 表达显著增强。SEQ ID NO: 5所示的DNA序列具有一开放读码框(ORF)，其对应于 DNA序列的88 1104的碱基位置(碱基位置1102 1104代表一终止密码子)。 然而，由于密码子简并性或者考虑到不同生物体基因表达的密码子偏爱性，本 发明的基因可以在编码区进行各种修饰而不改变由编码区所表达的蛋白质的 氨基酸序列，并且也可以在不影响基因表达的限度下，在除编码区以外的区域 进行各种修饰或改变。所述修饰的基因也包括在本发明的范围内。因此，本发 明还包括一具有与所述基因，以及所述基因片段的DNA序列基本上相同的寡 核苷酸。术语"基本上相同的寡核苷酸"意指具有至少80。/。DNA序列同源性的 寡核苷酸，优选至少90%，和最优选至少95%。由本发明的基因表达的蛋白由338个氨基酸残基组成，并具有SED IDNO: 6所示的氨基酸序列和分子量大约为37 kDa。然而，在不影响蛋白功能的限度下，在氨基酸序列中也可以替换，增加或缺失一个或多个氨基酸，以及 根据其用法，所述蛋白只有一部分可以被使用。所述修饰的氨基酸序列也包括 在本发明的范围内。因此，本发明也包括一具有与所述蛋白，及蛋白片段的氨基酸序列基本上相同的多肽。术语"基本上相同的多肽"意指具有至少80%序 列同源性的多肽，优选至少90%，和最优选至少95%。本发明的基因和蛋白可以从人组织中分离，或者根据已知的合成DNA或 肽的方法合成。例如，可以在SEDIDNO: 5所示DNA序列信息的基础上， 根据常规方法筛选和克隆本发明的基因。作为另一个实例，通过使用SEQID NO: 7 (5'-AAGCTTAACGAGG-3')所示的随机引物H-AP7和SEQ ID NO: 8 (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3')所示的锚定oligo-dT引物，对从正常组织，和癌 组织或癌细胞系中提取的总RNAs进行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)， 可以获得一 250-bp的cDNA片段，其在癌组织或癌细胞系中不表达，而仅在 正常组织中差异表达，而反应产物片段作为探针，可以与cDNA文库进行噬菌 斑杂交以获得全长cDNA克隆。因此，所制备的基因可以插入到一本领域公知的用于在微生物或动物细胞 中表达的载体中以获得一表达载体，然后，可以大量复制基因的cDNA或者通 过将表达载体引入适宜的宿主细胞以工业规模地生产其蛋白，所述宿主细胞例 如大肠杆菌&c/^/c/^co", HepG2细胞系等。在构建表达载体时，根据被设 计用于产生所述基因或蛋白的各种宿主细胞，可以适当地选择和结合DNA调 控序列，例如启动子和终止子，自主复制序列，释放信号序列等。本发明将GIG17全长cDNA插入到一表达载体pcDNA3.1 (Invitrogen , U.S.)中，然后用该表达载体产物转化￡"/^"^/"^0//011501，其随后被命名为 ￡. co/f DH5a/GIG17/pcDNA3.1 ，并于2004年6月14日保藏于韩国典型培养物 保藏中心，保藏号为KCTC 10655BP。本发明的基因被认为是在正常组织中过量表达以抑制癌的发生，所述组织 优选肝，肾，脾和肺。甚至本发明的基因也被认为在白血病，子宫癌，恶性淋 巴瘤，结肠癌和皮肤癌中受到抑制从而诱发癌的发生。本发明的基因在这些组 织中主要作为具有约1.3kb大小的mRNA转录体过量表达。尤其是，本发明 的基因只在正常组织中差异表达。例如，本发明的基因在癌组织和癌细胞中
表达，例如肝癌组织，肝癌细胞系HepG2等，而只在正常肝组织中差异表达。引入了本发明基因的癌细胞系显示出高死亡率，并因此本发明的基因可以 有效地用于治疗和预防癌症。3、 GIG19本发明的基因是一人抑癌基因19 (GIG19)，其具有SEQIDNO: 9所示 的DNA序列，登录于美国国立卫生研究所(NIH)(
公开日2005年12月31 日)的GenBank数据库，登录号为AY544123，并且所登录基因的DNA序列 与该数据库中的登录号分别为BC041593和X04225的人a-l-微球蛋白/bikunin 前体和HC蛋白(cx-l-微球蛋白)的人mRNA序列相同。a-l-微球蛋白也称为 HC蛋白，是具有免疫抑制作用的脂蛋白(Akerstrom, B. " a/.,所oc/n7m-ca 5Zo/ /z拜.ca爿c/a, 1482, 172-184 (2002); Xu, S. & Venge, P.， &'oc/ 'w/ca历op/z，.ca 1482,298-307(2002))。然而，与以前所报道的肿瘤抑制基因的功能相反， 本^J开究的结果发现GIG19肿瘤抑制基因在肝癌中根本不表达，而在各种正常 肝组织中其表达显著增强。SEQ ID NO: 9所示的DNA序列具有一开放读码框(ORF入其对应十 DNA序列的61 1119的碱基位置(碱基位置59 61代表一终止密码子)。然 而，由于密码子简并性或者考虑到不同生物体基因表达的密码子偏好，本发明 的基因可以在编码区进行各种修饰而不改变由编码区所表达的蛋白质的氨基 酸序列，并且也可以在不影响基因表达的限度下，在除编码区以外的区域进行 各种修饰或改变。所述修饰的基因也包括在本发明的范围内。因此，本发明还 包 舌一具有与所述基因，以及所述基因的片段的DNA序列基本上相同的寡核 苷酸。术语"基本上相同的寡核苷酸"意指具有至少80% DNA序列同源性的寡 核苷酸，优选至少90%，和最优选至少95%。本发明的基因所表达的蛋白由352个氨基酸残基组成，并具有SED ID NO: 10所示的氨基酸序列和分子量大约为39kDa。然而，在不影响蛋白功能 的限度下，在氨基酸序列中也可以替换，增加或缺失一个或多个氨基酸，以及 根据其用法，所述蛋白只有一部分可以被使用。所述修饰的氨基酸序列也包括 在本发明的范围内。因此，本发明也包括一具有与所述蛋白，及蛋白片段的氨 基酸序列基本上相同的多肽。术语"基本上相同的多肽"意指具有至少80%序 列同源性的多肽，优选至少卯％，和最优选至少95%。
本发明的基因和蛋白可以从人组织中分离，或者根据已知的合成DNA或肽的方法合成。例如，可以在SEDIDNO: 9所示DNA序列信息的基础上， 根据常规方法筛选和克隆本发明的基因。作为另一个实例，通过使用SEQID NO: 11 (5'-AAGCTTGTCAGCC-3')所示的随机引物H-AP40和SEQ ID NO: 12 (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3')所示的锚定oligo-dT引物，对从正常组织，和癌 组织或癌细胞系中提取的总RNAs进行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)， 可以获得一281-bp的cDNA片段，其在癌组织或癌细胞系中不表达，而仅在 正常组织差异表达，而反应产物片段作为探针，可以与cDNA文库进行噬菌斑 杂交以获得全长cDNA克隆。因此，所制备的基因可以插入到一本领域公知的用于在微生物或动物细胞 中表达的载体中以获得一表达载体，然后，可以大量复制基因的cDNA或者通 过将表达载体引入适宜的宿主细胞以工业规模地生产其蛋白，所述宿主细胞例 如大肠杆菌^c/^/c/^c^'，HepG2细胞系等。在构建表达载体时，根据被设计的用于产生所述基因或蛋白的各种宿主细胞，可以适当地选择和结合DNA '调控序列，例如启动子和终止子，自主复制序列，释放信号序列等。本发明将GIG19全长cDNA插入到一表达载体pcDNA3.1 Gnvitrogen， U.S.)中，然后用该表达载体产物转化J^c/2en'c/2^co/z'DH5a,其随后被命名为 co//DH5a/GIG19/pcDNA3.1，并于2004年6月14日保藏于韩国典型培养物 保藏中心，保藏号为KCTC 10656BP。本发明的基因被认为是在正常组织中过量表达以抑制癌的发生，所述组织 优选肝组织。本发明的基因在这些组织中主要作为具有大小约1.2kb的mRNA 转录体过量表达。尤其是，本发明的基因在正常组织中差异表达。例如，本发 明的基因在癌组织和癌细胞中不表达，例如肝癌组织，肝癌细胞系HepG2等， 而只在正常肝组织中差异表达。引入了本发明基因的肝癌细胞系显示出高死亡率，并因此本发明的基因可以有效地用于治疗和预防癌症。 4、 GIG20本发明的基因是一人抑癌基因20 (GIG20)，其具有SEQIDNO: 13所示 的DNA序列，登录于美国国立卫生研究所(NIH)(
公开日2005年12月31 日)的GenBank数据库，登录号为AY544124，并且所登录基因的DNA序列
与该数据库中登录号为BC041789的人白蛋白相同。已知白蛋白是在供给营养 中起作用的蛋白(Grant,J.P"J"".S"rg.， 220， 610-616 (1994))。然而，与以前所 报道的肿瘤抑制基因的功能相反，本研究的结果发现GIG20肿瘤抑制基因在 肝癌中根本不表达，而在各种正常肝组织中其表达显著增强。本发明的基因是 肿瘤抑制基因的证据是基于核酸酶中的白蛋白基因存在于肝细胞中，因此白蛋 白在正常肝细胞中产生。此即正常肝细胞是白蛋白基因正常工作的细胞的原 因，但如果在肝细胞中的白蛋白水平比正常水平低，那么白蛋白基因在肝细胞 中不会正常工作，或者正常白蛋白基因的数量减少，这可能在肝癌的病例中出 现。SEQ ID NO: 13所示的DNA序列具有一开放读码框(ORF)，其对应于 DNA序列的8 1261的碱基位置(碱基位置1259 1261代表一终止密码子)。 然而，由于密码子简并性或者考虑到不同生物体基因表达的密码子偏爱性，本 发明的基因可以在编码区进行各种修饰而不改变由编码区所表达的蛋白质的 氨基酸序列，并且也可以在不影响基因表达的限度下，在除编码区以外的区域 进行各种修饰或改变。所述修饰的基因也包括在本发明的范围内。因此，本友 明还包括一具有与所述基因，以及所述基因的片段的DNA序列基本上相同的 寡核苷酸。术语"基本上相同的寡核苷酸"意指具有至少80MDNA序列同源性 的寡核苷酸，优选至少90%，和最优选至少95%。本发明的基因所表达的蛋白由417个氨基酸残基组成，并具有SED ID NO: 14所示的氨基酸序列和分子量大约为47kDa。然而，在不影响蛋白功能 的限度下，在氨基酸序列中也可以替换，增加或缺失一个或多个氨基酸，以及 根据其用法，所述蛋白只有一部分可以被使用。所述修饰的氨基酸序列也包括 在本发明的范围内。因此，本发明也包括一具有与所述蛋白，及蛋白片段的氨 基酸序列基本上相同的多肽。术语"基本上相同的多肽"意指具有至少80%序 列同源性的多肽，优选至少90%，和最优选至少95%。本发明的基因和蛋白可以从人组织中分离，或者根据已知的合成DNA或 肽的方法合成。例如，可以在SEDIDNO: 13所示DNA序列信息的基础上， 根据常规方法筛选和克隆本发明的基因。作为另一个实例，通过使用SEQID NO: 15 (5'-AAGCTTGTCAGCC-3')所示的随机引物H-AP40和SEQ ID NO: 16 (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3')所示的锚定oligo-dT引物，对从正常组织，和癌组织或癌细胞系中提取的总RNAs进行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)， 可以获得一 256-bp的cDNA片段，其在癌组织或癌细胞系中不表达，而仅在 正常组织中差异表达，而反应产物片段作为探针，可以与cDNA文库进行噬菌 斑杂交以获得全长cDNA克隆。因此，所制备的基因可以插入到一本领域公知的用于在微生物或动物细胞 中表达的载体中以获得一表达载体，然后，可以大量复制基因的cDNA或者通 过将表达载体引入适宜的宿主细胞以工业规模地生产其蛋白，所述宿主细胞例 如大肠杆菌&c/^r/A/" //, HepG2细胞系等。在构建表达载体时，根据所设 计的用于产生所述基因或蛋白的各种宿主细胞，可以适当地选择和结合DNA 调控序列，例如启动子和终止子，自主复制序列，释放信号序列等。本发明将GIG20全长cDNA插入到一表达载体pcDNA3.1 (Invitrogen， U.S.)中，然后用该表达载体产物转化￡^/7^^/^^//01150[,其随后被命名为 co/z'DH5a/GIG20/pcDNA3.1，并于2004年6月14日保藏于韩国典型培养物 保藏中心，保藏号为KCTC 10657BP。本发明的基因被认为是在正常组织中过量表达以抑制癌的发生，所述组织 优选肝组织。本发明的基因在这些组织中主要作为具有大小约2.4kb的mRNA 转录体过量表达。尤其是，本发明的基因只在正常组织中差异表达。例如，本 发明的基因在癌组织和癌细胞中不表达，例如肝癌组织，肝癌细胞系HepG2 等，而只在正常肝组织中差异表达。引入了本发明基因的肝癌细胞系显示出高死亡率，并因此本发明的基因可 以有效地用于治疗和预防癌症。5、 GIG22本发明的基因是一人抑癌基因22 (GIG22)，其具有SEQIDNO: 17所示 的DNA序列，登录于美国国立卫生研究所(NIH)(
公开日2005年5月31 日)的GenBank数据库，登录号为AY512565，并且所登录基因的一些DNA 序列与该数据库中登录号为AF126743的人含DNAJ结构域蛋白MCJ基因的 DNA序列不同，并且其表达的氨基酸序列也与人含DNAJ结构域蛋白MCJ不 同。已报道在卵巢癌中MCJ基因的表达有所减弱(Shridhar， V. "a/.， Owcwi es. 61,4258-4265 (2001))，但是，本研究的结果发现GIG22肿瘤抑制基因在包括 肝癌在内的各种人肿瘤中根本不表达，而在各种正常组织中其表达显著SEQIDNO: 17所示的DNA序列具有一开放读码框(ORF)，其对应于 DNA序列的95 547的碱基位置(碱基位置545 547代表一终止密码子)。 然而，由于密码子简并性或者考虑到不同生物体基因表达的密码子偏好，本发 明的基因可以在编码区进行各种修饰而不改变由编码区所表达的蛋白质的氮 基酸序列，并且也可以在不影响基因表达的限度下，在除编码区以外的区域进 行各种修饰或改变。所述修饰的基因也包括在本发明的范围内。因此，本发明 还包括一具有与所述基因，以及所述基因的片段的DNA序列基本上相同的寡 核苷酸。术语"基本上相同的寡核苷酸"意指具有至少80。/。DNA序列同源性的 寡核苷酸，优选至少90%，和最优选至少95%。本发明的基因所表达的蛋白由150个氨基酸残基组成，并具有SED ID NO: 18所示的氨基酸序列和分子量大约为16kDa。然而，在不影响蛋白功能 的限度下，在氨基酸序列中也可以替换，增加或缺失一个或多个氨基酸，以及 根据其用法，所述蛋白只有一部分可以被使用。所述修饰的氨基酸序列也包括 在本发明的范围内。因此，本发明也包括一具有与所述蛋白，及蛋白片段的氨 基酸序列基本上相同的多肽。术语"基本上相同的多肽"意指具有至少80%序 列同源性的多肽，优选至少90%，和最优选至少95%。本发明的基因和蛋白可以从人组织中分离，或者根据已知的合成DNA或 肽的方法合成。例如，可以在SEDIDNO: 17所示DNA序列信息的基础上， 根据常规方法筛选和克隆本发明的基因。作为另一个实例，通过使用SEQID NO: 19 (5'-AAGCTTCGTACGT-3')所示的随机引物H-AP30和SEQ ID NO: 20 (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3')所示的锚定oligo-dT引物，对从正常组织，和癌 组织或癌细胞系中提取的总RNAs进行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)， 可以获得一281-bp的cDNA片段，其在癌组织或癌细胞系中不表达，而仅在 正常组织差异表达，而反应产物片段作为探针，可以与cDNA文库进行噬菌斑 杂交以获得全长cDNA克隆。因此，所制备的基因可以插入到一本领域公知的用于在微生物或动物细胞 中表达的载体中以获得一表达载体，然后，可以大量复制基因的cDNA或者通 过将表达载体引入适宜的宿主细胞以工业规模地生产其蛋白，所述宿主细胞例 如大肠杆菌&cten'c/u'aco"，HepG2细胞系等。在构建表达载体时，根据被设计的用于产生所述基因或蛋白的各种宿主细胞，可以适当地选择和结合DNA 调控序列，例如启动子和终止子，自主复制序列，释放信号序列等。本发明将GIG22全长cDNA插入到一表达载体pcDNA3.1 (Invitrogen， U.S.)中，然后用该表达载体产物转化￡化/7^^'^0//0出01，其随后被命名为 cWDH5a/GIG22/pcDNA3.1，并于2004年6月14日保藏于韩国典型培养物 保藏中心，保藏号为KCTC 10658BP。本发明的基因被认为是在正常组织中过量表达以抑制癌的发生，所述组织 优选心脏，肌肉，肝，肾，胎盘，脾，肺，大小肠，脾，胸腺和白细胞。甚至 本发明的基因也被认为在白血病，子宫癌，恶性淋巴瘤，结肠癌和皮肤癌中受 到抑制从而诱发癌的发生。本发明的基因在这些组织中主要作为具有约0.6kb 大小的mRNA转录体过量表达。尤其是，本发明的基因只在正常组织中差异 表达。例如，本发明的基因在癌组织和癌细胞中不表达，例如肝癌组织，肝癌 细胞系HepG2等，而只在正常肝组织中差异表达。引入了本发明基因的癌细胞系显示出高死亡率，并因此本发明的基因可以 有效地用于治疗和预防癌症。6、 G1G25本发明的基因是一人抑癌基因25 (GIG25)，其具有SEQIDNO: 21所示 的DNA序列，登录于美国国立卫生研究所(NIH)(
公开日2005年12月31 日)的GenBank数据库，登录号为AY513276，并且所登录基因的一些DNA 序列与该数据库中登录号为BC0110530的人丝氨酸(或半胱氮酸)蛋白酶抑 制剂，clade A (al-抗蛋白酶，抗胰蛋白酶)，成员8基因不同。al-抗胰蛋白 酶是丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂的典型成员，并且已知cd-抗胰蛋白 酶是一急性时相蛋白且其表达水平在炎症反应中增强3到4倍(Morgan, K., & Kalsherker, N.A.,/"A J飾ctew. Ce諸o/" 29, 1501-1511 (1997))。然而，与以 前戶万报道的肿瘤抑制基因的功能相反，本研究的结果发现GIG25肿瘤抑制基 因在肝癌中根本不表达，而在各种正常肝组织中其表达显著增强。SEQIDNO: 21所示的DNA序列具有一开放读码框(ORF)，其对应于 DNA序列的436 1299的碱基位置(碱基位置434 436代表一终止密码子)。 然而，由于密码子简并性或者考虑到不同生物体基因表达的密码子偏好，本发 明的基因可以在编码区进行各种修饰而不改变由编码区所表达的蛋白质的氨 基酸序列，并且也可以在不影响基因表达的限度下，在除编码区以外的区域进 行各种修饰或改变。所述修饰的基因也包括在本发明的范围内。因此，本发明 还包括一具有与所述基因，以及所述基因的片段的DNA序列基本上相同的寡核苷酸。术语"基本上相同的寡核苷酸"意指具有至少80。/。DNA序列同源性的 寡核苷酸，优选至少90%，和最优选至少95%。本发明的基因所表达的蛋白由287个氨基酸残基组成，并具有SED ID NO: 22所示的氨基酸序列和分子量大约为33kDa。然而，在不影响蛋白功能 的限度下，在氨基酸序列中也可以替换，增加或缺失一个或多个氨基酸，以及 根据其用法，所述蛋白只有一部分可以被使用。所述修饰的氨基酸序列也包括 在本发明的范围内。因此，本发明也包括一具有与所述蛋白，及蛋白片段的氨 基酸序列基本上相同的多肽。术语"基本上相同的多肽"意指具有至少80%序 列同源性的多肽，优选至少90%，和最优选至少95%。本发明的基因和蛋白可以从人组织中分离，或者根据己知的合成DNA或 肽的方法合成。例如，可以在SEDIDNO: 21所示DNA序列信息的基础上， 根据常规方法筛选和克隆本发明的基因。作为另一个实例，通过使用SEQID NO: 23 (5'-AAGCITGTCAGCC-3')所示的随机引物H-AP40和SEQ ID NO: 24 (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3')所示的锚定oligo-dT引物，对从正常组织，和癌 组织或癌细胞系中提取的总RNAs进行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)， 可以获得一 250-bp的cDNA片段，其在癌组织或癌细胞系中不表达，而仅在 正常组织差异表达，而反应产物片段作为探针，可以与cDNA文库进行噬菌斑 杂交以获得全长cDNA克隆。因此，所制备的基因可以插入到一本领域公知的用于在微生物或动物细胞 中表达的载体中以获得一表达载体，然后，可以大量复制基因的cDNA或者通 过将表达载体引入适宜的宿主细胞以工业规模地生产其蛋白，所述宿主细胞例 如大肠杆菌&c/7mW^co", HepG2细胞系等。在构建表达载体时，根据被设 计的用于产生所述基因或蛋白的各种宿主细胞，可以适当地选择和结合DNA 调控序列，例如启动子和终止子，自主复制序列，释放信号序列等。本发明将GIG25全长cDNA插入到一表达载体pcDNA3.1 (Invitrogen， U.S.)中，然后用该表达载体产物转化Esc/ien'c/n'acoA'DH5a,其随后被命名为 ￡. co/f DH5a/GIG25/pcDNA3.1，并于2004年6月14日保藏于韩国典型培养物 保藏中心，保藏号为KCTC 10659BP。 本发明的基因被认为是在正常组织中过量表达以抑制癌的发生，所述组织优选肝组织。本发明的基因在这些组织中主要作为具有约1.5kb大小的mRNA转录体过量表达。尤其是，本发明的基因只在正常组织中差异表达。例如，本发明的基因在癌组织和癌细胞中不表达，例如肝癌组织，肝癌细胞系HepG2 等，而只在正常肝组织中差异表达。引入了本发明基因的肝癌细胞系显示出高死亡率，并因此本发明的基因可 以有效地用于治疗和预防癌症。7、 GIG36本发明的基因是一人抑癌基因36 (GIG36)，其具有SEQIDNO: 25所示 的DNA序列，登录于美国国立卫生研究所(NIH)(
公开日2005年12月31 日)的GenBank数据库，登录号为AY542304，并且所登录基因的DNA序列 与该数据库中登录号为M58549的基质Gla蛋白相同，和其DNA序列中只有 一对碱基对和登录号为BC005272的基质Gla蛋白不同。已报道基质Gla蛋 白主要在导管平滑肌细胞(Shanahan， C.M., " a/.， OzY. Wev.8, 357-375 (1998))和软骨细胞中(Hale, J.E., " a/" J.飾/. Oz缝，263, 5820-5824 (1988))分泌，并且其功能是抑制矿化(Luo, G， " fl/.， 7Va/ww， 386, 78-81 (1997); Price, P.A., " a/"爿/"fen'osc/^: TTzramZ . J^wc. S/o/.， 18， 1400-1407 (1998); Price, RA.， "a/" /i"e"'ayc/^: 7T2raw^ ^wc. 5/。/., 20, 317-327 (2000)。也 有报道在包括卵巢癌(Colleen， D., "a/.， Owcer/ "., 61， 3869-3876 (2001))和乳 腺癌(Chen,L.， "a/., (9"co取"e, 5, 1391-1395 (1990))在内的一些癌症中基质Gla 基因的表达增强。然而，与以前所报道相反，本研究的结果发现GIG36肿瘤 抑制基因在包括肝癌在内的各种人肿瘤中根本不表达，而在各种正常组织中其 表达显著增强。SEQIDNO: 25所示的DNA序列具有一开放读码框(ORF)，其对应于 DNA序列的12 323的碱基位置(碱基位置321 323代表一终止密码子)。 然而，由于密码子简并性或者考虑到不同生物体基因表达的密码子偏好，本发 明的基因可以在编码区进行各种修饰而不改变由编码区所表达的蛋白质的氨 基酸序列，并且也可以在不影响基因表达的限度下，在除编码区以外的区域进 行各种修饰或改变。所述修饰的基因也包括在本发明的范围内。因此，本发明 还包括一具有与所述基因，以及所述基因的片段的DNA序列基本上相同的寡
核苷酸。术语"基本上相同的寡核苷酸"意指具有至少80Y。DNA序列同源性的寡核苷酸，优选至少90%，和最优选至少95%。本发明的基因所表达的蛋白由103个氨基酸残基组成，并具有SED ID NO: 26所示的氨基酸序列和分子量大约为12kDa。然而，在不影响蛋白功能 的限度下，在氨基酸序列中也可以替换，增加或缺失一个或多个氨基酸，以及 根据其用法，所述蛋白只有一部分可以被使用。所述修饰的氨基酸序列也包括 在本发明的范围内。因此，本发明也包括一具有与所述蛋白，及蛋白片段的氨 基酸序列基本上相同的多肽。术语"基本上相同的多肽"意指具有至少80%序 列同源性的多肽，优选至少90%，和最优选至少95%。本发明的基因和蛋白可以从人组织中分离，或者根据已知的合成DNA或 肽的方法合成。例如，可以在SEDIDNO: 25所示DNA序列信息的基础上， 根据常规方法筛选和克隆本发明的基因。作为另一个实例，通过使用SEQID NO: 27 (5'-AAGCTTAGCAGCA-3')所示的随机引物H-AP29和SEQ ID NO: 28 (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3')所示的锚定oligo-dT引物，对从正常组织，和癌 组织、或癌细胞系屮提取的总RNAs进行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)， 可以获得一 182-bp的cDNA片段，其在癌组织或癌细胞系中不表达，而仅在 正常组织差异表达，而反应产物片段作为探针，可以与cDNA文库进行噬菌斑 杂交以获得全长cDNA克隆。因此，所制备的基因可以插入到一本领域公知的用于在微生物或动物细胞 中表达的载体中以获得一表达载体，然后，可以大量复制基因的cDNA或者通 过将表达载体引入适宜的宿主细胞以工业规模地生产其蛋白，所述宿主细胞例 如大肠杆菌&cfeWc/^co", MCF-7细胞系等。在构建表达载体时，根据被设 计的用于产生所述基因或蛋白的各种宿主细胞，可以适当地选择和结合DNA 调控序列，例如启动子和终止子，自主复制序列，释放信号序列等。本发明将GIG36全长cDNA插入到一表达载体pcDNA3.1 (Invitrogen， U.S.)中，然后用该表达载体产物转化&^^^/^ >//0{15(1,其随后被命名为 co"DH5a/GIG36/pcDNA3.1，并于2004年5月24日保藏于韩国典型培养物 保藏中心，保藏号为KCTC 10643BP。本发明的基因被认为是在正常组织中过量表达以抑制癌发生，所述组织优 选肝，肾，脾和肺。甚至本发明的基因也被认为在白血病，子宫癌，恶性淋巴
瘤，结肠癌和皮肤癌中受到抑制从而诱发癌的发生。本发明的基因在这些组织中主要作为具有约1.3kb大小的mRNA转录体过量表达。尤其是，本发明的基因只在正常组织中差异表达。例如，本发明的基因在癌组织和癌细胞中不表达，例如肝癌组织，肝癌细胞系HepG2等，而只在正常肝组织中差异表达。 引入了本发明基因的癌细胞系显示出高死亡率，并因此本发明的基因可以有IW也用于治疗和预防癌症。 8、 GIG2本发明的基因是一人抑癌基因2 (GIG2)，其具有SEQIDNO: 29所示的 DNA序列，登录于美国国立卫生研究所(NIH)(
公开日2004年12月31日) 的GenBank数据库，登录号为AY423720，并且所登录基因的DNA序列与该 数据库中登录号分别为X60111和NMJ)0n69的运动相关蛋白(MRP-l)基因的 人mRNA和人CD9抗体(p24)(CD9)基因的序列相同。换句话说，已报道登录 号为X60111的运动相关蛋白(MRP-l)基因的人mRNA与细胞转移相关(Miyake: M., d a/., J ￡平Med， 174, 1347-1354 (1991))。也有报道登录号为画—001769 的人CD9抗体(p24) (CD9)基因与乳腺癌(Sauer, G. " "/.' 6>,/.鄉.，10， 405-410 (2003))和肺癌中(Funakoshi, T. ef "/.， 22, 674-687 (2003))细胞转移以及侵袭能力相关。然而，与以前所报道的细胞转移和侵袭能力相反，本研究的结果发现GIG2 肿瘤抑制基因在包括肺癌在内的各种人肿瘤中微量表达或根本不表达，而在各 种正常组织中其表达显著增强。SEQIDNO: 29所示的DNA序列具有一开放读码框(ORF)，其对应于 DNA序列的18 704的碱基位置(碱基位置702 704代表一终止密码子)。 然而，由于密码子简并性或者考虑到不同生物体基因表达的密码子偏好，本发 明的基因可以在编码区进行各种修饰而不改变由编码区所表达的蛋白质的氨 基酸序列，并且也可以在不影响基因表达的限度下，在除编码区以外的区域进 行各种修饰或改变。所述修饰的基因也包括在本发明的范围内。因此，本发明 还包括一具有与所述基因，以及所述基因的片段的DNA序列基本上相同的寡 核苷酸。术语"基本上相同的寡核苷酸"意指具有至少80。/。DNA序列同源性的 寡1^苷酸，优选至少90%，和最优选至少95%。本发明的基因所表达的蛋白由228个氨基酸残基组成，并具有SED IDNO: 30所示的氨基酸序列和分子量大约为25kDa。然而，在不影响蛋白功能的限度下，在氨基酸序列中也可以替换，增加或缺失一个或多个氨基酸，以及 根据其用法，所述蛋白只有一部分可以被使用。所述修饰的氨基酸序列也包括 在本发明的范围内。因此，本发明也包括一具有与所述蛋白，及蛋白片段的氨基酸序列基本上相同的多肽。术语"基本上相同的多肽"意指具有至少80%序 列同源性的多肽，优选至少90%，和最优选至少95%。本发明的基因和蛋白可以从人组织中分离，或者根据己知的合成DNA或 肽的方法合成。例如，可以在SEDIDNO: 29所示DNA序列信息的基础上， 根据常规方法筛选和克隆本发明的基因。作为另一个实例，通过使用SEQID NO: 31 (5'-AAGCTTCTTGCAA-3')所示的随机引物H-AP32和SEQ ID NO: 32 (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3')所示的锚定oligo-dT引物，对从正常组织，和癌 组织或癌细胞系中提取的总RNAs进行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)， 可以获得一 240-bp的cDNA片段，其在癌组织或癌细胞系中不表达，而仅在 正常组织中差异表达，而反应产物片段作为探针，可以与cDNA文库进行噬菌 斑杂交以获得全长cDNA克隆。因此，所制备的基因可以插入到一本领域公知的用于在微生物或动物细胞 中表达的载体中以获得一表达载体，然后，可以大量复制基因的cDNA或者通 过将表达载体引入适宜的宿主细胞以工业规模地生产其蛋白，所述宿主细胞例 如大肠杆菌&^^/^'"0//,八549细胞系等。在构建表达载体时，根据被设计 的用于产生所述基因或蛋白的各种宿主细胞，可以适当地选择和结合DNA调 控序列，例如启动子和终止子，自主复制序列，释放信号序列等。本发明将GIG2全长cDNA插入到一表达载体pcDNA3.1 (Invitrogen， U.S.) 中，然后用该表达载体产物转化^Wm'c/n'a DH5a，其随后被命名为co" DH5oi/GIG2/pcDNA3.1，并于2004年5月31日保藏于韩国典型培养物保藏中 心，保藏号为KCTC 10641BP。本发明的基因被认为是在正常组织中过量表达以抑制癌的发生，所述组织 优选大脑，心脏，肌肉，大肠，胸腺，脾，肾，肝，小肠，胎盘，肺和白细胞。 甚至本发明的基因也被认为在急性白血病(HL-60细胞系)和恶性淋巴瘤 (RaJi癌细胞系)中根本不表达从而诱发癌症，和在子宫癌，慢性白血病，结肠 癌，肺和和皮肤癌中仅微量表达从而诱发癌的发生。本发明的基因在这些组织 中主要作为具有约1.3kb大小的mRNA转录体过量表达。尤其是，本发明的 基因只在正常组织中差异表达。例如，本发明的基因在癌组织和癌细胞中不表 达，例如肺癌组织，转移性肺癌组织，肺癌细胞系(A549和NCI-H358)等，而只在正常肺组织中差异表达。引入了本发明基因的癌细胞系显示出高死亡率，并因此本发明的基因可以 有效地用于治疗和预防癌症。
具体实施方式
在下文中，将参考优选实施例对本发明进行具体说明。因此，本文提供的 说明仅仅是优选实施例，其仅仅为了例证说明的目的，不意图限制发明的范围。 参考实施例总RNA的分离使用RNeasy total認A Kit (QiagenInc.， Germany)从新鲜组织或培养的 细胞中分离总RNA的样品，然后使用message clean kit(GenHunter Corp., MA， U.S.)从总RNA样品中移除污染的DNA。实施例1:总RNA的分离和mRNA差异显示1-1. GIG12如下，对正常乳腺组织，原发性乳腺癌组织和乳腺癌细胞系进行目的基因 的差异表达类型测定。在乳房切除手术时从一乳腺癌患者处获得正常乳腺组织样品，和在根治性 乳房切除手术时，从一在手术治疗之前未经历放射或抗-癌治疗的患者处获得 原发性乳腺癌组织样品。使用MCF-7 (美国典型培养物保藏中心；ATCC保藏 号HTB-22)作为人乳腺癌细胞系。以和参考实施例相同的方式重复本实验以 分别从这些组织和细胞中分离总RNA。如下，按照文献公开的改良的方法(Liang, P. and Pardee, A. B., &k"ce， 257, 967-971 (1992); and Liang, P. a/.， Ca"cer i &s" 52， 6966-6968 (1993))，使用从 组织、和细胞中分离的每个总RNA样品进行RT-PCR反应。取0.2俾总RNA， 使用SEQ ID NO: 4所示的锚定oligo-dT引物利用试剂盒(a RNAimage kit, GenHunter)进行反转录，然后在0.5 mM
-标记的dATP (1,200 Ci/mmol) 存在下，使用相同的锚定oUgo-dT引物和SEQIDNO:3所示的5'13-mer随机 弓l物H-AP32 (RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, U.S.)进t亍PCR反
应。PCR反应按下述条件进行总计40个扩增循环由下述步骤组成变性步骤为95。C40秒，退火歩骤为40。C2分钟和延伸步骤为72-C40秒，循环后进 行72'C 5分钟的延伸步骤。在6%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分析扩增片段以进行 DNA测序，然后放射自显影。
图1显示了使用SEQ ID NO: 3所示的5'13-mer随机引物H-AP32和SEQ IDNO:4所示的锚定oligo-dT引物进行PCR的结果。在图1中，第l， 2和3 泳道代表正常乳腺组织；第4， 5和6泳道代表乳腺癌组织；和第7泳道代表 乳腺癌细胞系MCF-7。如图1所示，己确认一 680-bp的cDNA片段在乳腺癌 组织和乳腺癌细胞系中不表达，而只在正常乳腺组织中差异表达G咸基位置在 全长GIG12基因序列的1614 2283)。所述cDNA片段命名为FC26。
从干胶中切下680-bp的条带，FC5片段，煮沸15分钟以洗脱cDNA，然 后在同上述相同的条件下，使用上述相同的引物对进行PCR反应以再扩增 cDNA，此处未使用[a-"S]-标记的dATP和20 (xM dNTP。使用TA克隆系统
(Promega)将再扩增的cDNA片段FC26克隆到表达载体pGEM-T Easy中， 然后使用 Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System (United States Biochemical Co.)进行测序。使用BLAST和FASTA程序在美国全国卫生研究 所(NIH)的GenBank数据库中检索所述DNA序列。结果是，所述DNA序 列与该数据库中登录号为M58549和BC005272的基质Gla蛋白的DNA序列 相同。1-2. GIG17如下，对正常肝组织，原发性肝癌组织和肝癌细胞系进行目的基因的差异 表达类型测定。在组织活体检测时从肝癌患者处获得正常肝组织和肝癌组织的样品，和使 用HepG2 (美国典型培养物保藏中心；ATCC保藏号HB-8065)作为人肝癌细 胞系。以和参考实施例相同的方式重复本实验以分别从这些组织和细胞中分离 总RNAo如下，按照文献公开的改良的方法(Liang, P. and Pardee, A. B., 5We"ce, 257， 967-971 (1992); and Liang, R " a/.' Ca"cer i ^.， 52, 6966-6968 (1993))，使用从 组织和细胞中分离的每个总RNA样品进行RT-PCR反应。取0.2 Ag总RNA， 使用SEQ ID NO: 8所示的锚定oligo-dT引物利用试剂盒(a RNAimage kit,GenHunter)进行反转录，然后在0.5 mM [^358]-标记的dATP (1,200 Ci/mmol) 存在下，使用相同的锚定oligo-dT引物和SEQIDNO:7所示的5'13-mer随机 引物H-AP7 (RNAimage primer set 1， GenHimter Corporation, U.S.)进碎亍PCR反应。PCR反应按下述条件进行总计40个扩增循环由下述步骤组成变性歩骤为95r40秒，退火歩骤为4(TC2分钟和延伸步骤为72t:40秒，循环后进 行72°C 5分钟的延伸歩骤。在6%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分析扩增片段以进行 DNA测序，然后放射自显影。图2显示了使用SEQ ID NO: 7所示的5'13-mer随机引物H-AP7和SEQ ID NO:8所示的锚定oligo-dT引物进行PCR的结果。在图1中，第l， 2和3泳 道代表正常肝组织；第4， 5和6泳道代表肝癌组织；和第7泳道代表肝癌细 胞系HepG2。如图2所示，己确认-一 250-bp的cDNA片段在肝癌组织中微量 表达，在肝癌细胞系中不表达，和只在正常肝组织中差异表达(碱基位置在全 长GIG17基因序列的721 970)。所述cDNA片段命名为HP24。从干胶中切下250-bp的条带，HP24片段，煮沸15分钟以洗脱cDNA， 然后在同上述相同的条件卜，使用上述相同的引物对进行PCR反应以再扩增 cDNA，此处未使用[a-"S]-标记的dATP和20 dNTP。使用TA克隆系统(Promega)将再扩增的cDNA片段FC5克隆到表达载体pGEM-T Easy中， 然后"f吏用 Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System (United States Biochemical Co.)进行测序。使用BLAST和FASTA程序在美国国立卫生研究 所(NTH)的GenBank数据库中检索所述DNA序列。结果是，所述DNA序 列与该数据库中登录号为M19922的人果糖1， 6-二磷酸酶的序列相同。1-3. GIG19如下，对正常肝组织，原发性肝癌组织和肝癌细胞系进行目的基因的差异 表达类型测定。在组织活体检测时从肝癌患者处获得正常肝组织和肝癌组织的样品，和使 用HepG2 (美国典型培养物保藏中心；ATCC保藏号HB-8065)作为人肝癌细 胞系。以和参考实施例相同的方式重复本实验以分别从这些组织和细胞中分离 总RNA。如下，按照文献公开的改良的方法(Liang, P. and Pardee, A. B., 5Wwce, 257， 967-971 (1992); and Liang, P.a/" C騰er i es.， 52, 6966-6968 (1993》，使用从 组织和细胞中分离的每个总RNA样品进行RT-PCR反应。取0.2滞总RNA， 使用SEQ ID NO: 12所示的锚定oligo-dT引物利用试剂盒(a RNAimage kit， GenHunter)进行反转录，然后在0.5 mM
-标记的dATP (1,200 Ci/mmol) 存在下，使用相同的锚定oligo-dT引物和SEQ ID NO: 11所示的5'13-mer随 机引物H-AP40(RNAimage primer set 1, GenHimter Corporation, U.S.)进行PCR反应。PCR反应按F述条件进行总计40个扩增循环由下述步骤组成变性步骤为95X: 40秒，退火歩骤为40。C2分钟和延伸步骤为72。C40秒，循环后 进行72°C 5分钟的延伸步骤。在6%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分析扩增片段以进 行DNA测序，然后放射自显影。图3显示了使用SEQ ID NO: 11所示的5'13-mer随机引物H-AP40和SEQ ID NO: 12所示的锚定oligo-dT引物进行PCR的结果。在图3中，第l， 2和 3泳道代表正常肝组织；第4， 5和6泳道代表肝癌组织；和第7泳道代表肝 癌细胞系HepG2。如图3所示，已确认一281-bp的cDNA片段在肝癌组织和 肝癌细胞系中不表达，而只在正常肝组织中差异表达(碱基位置在全长GIG19 基因序列的781 1061)。所述cDNA片段命名为HP48。从干胶中切下281-bp的条带，HP48片段，煮沸15分钟以洗脱cDNA， 然后在同上述相同的条件下，使用上述相同的引物对进行PCR反应以再扩增 cDNA，此处未使用[a-"S]-标记的dATP和20 )iM dNTP。使用TA克隆系统(Promega)将再扩增的cDNA片段FC5克隆到表达载体pGEM-T Easy中， 然后"f吏用 Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System (United States Biochemical Co.)进行测序。使用BLAST和FASTA程序在美国全国卫生研究 所(NIH)的GenBank数据库中检索所述DNA序列。结果是，所述DNA序 列与该数据库中登录号为BC041593的人a-l-微球蛋白/bikunin前体和HC蛋 白(a-l-微球蛋白)的人mRNA序列相同。1-4. GIG20如下，对正常肝组织，原发性肝癌组织和肝癌细胞系进行目的基因的差异 表达类型测定。在组织活体检测时从肝癌患者处获得正常肝组织和肝癌组织的样品，和使 用HepG2 (美国典型培养物保藏中心；ATCC保藏号HB-8065)作为人肝癌细 胞系。以和参考实施例相同的方式重复本实验以分别从这些组织和细胞中分离 总RNA。如下，按照文献公开的改良的方法(Liang, P. and Pardee, A. B., 5We"ce， 257, 967-971 (1992); and Liang, P. " "/" Ca打cer Was" 52, 6966-6968 (1993)),使用从 组织和细胞中分离的每个总RNA样品进行RT-PCR反应。取0.2滞总RNA， 使用SEQ ID NO: 16所示的锚定oligo-dT引物利用试剂盒(a RNAimage kit, GenHunter)进行反转录，然后在0.5 mM
-标记的dATP (1,200 Ci/mmol) 存在下，使用相同的锚定oligo-dT引物和SEQ ID NO: 15所示的5'13-mer随 机引物H-AP40(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, U.S.)进行PCR反应。PCR反应按下述条件进行总计40个扩增循环由下述步骤组成变性歩骤为95'C40秒，退火步骤为4(TC2分钟和延伸步骤为72"C40秒，循环后 进行72°C 5分钟的延伸步骤。在6%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分析扩增片段以进 行DNA测序，然后放射自显影。图4显示了使用SEQ ID NO: 15所示的5'13-mer随机引物H-AP40和SEQ ID NO: 16所示的锚定oligo-dT引物进行PCR的结果。在图4中，第1， 2和 3泳道代表止常肝组织；第4， 5和6泳道代表肝癌组织；和第7泳道代表肝 癌细胞系H印G2。如图4所示，已确认一 256-bp的cDNA片段在肝癌组织和 肝癌细胞系中不表达，而只在正常肝组织中差异表达(碱基位置在全长GIG19 基因序列的776 1031)。所述cDNA片段命名为HP50。从干胶中切下256-bp的条带，HP50片段，煮沸15分钟以洗脱cDNA， 然后在同上述相同的条件下，使用上述相同的引物对进行PCR反应以再扩增 cDNA，此处未使用[a-"S]-标记的dATP和20 pM dNTP。使用TA克隆系统 (Promega)将再扩增的cDNA片段HP50克隆到表达载体pGEM-TEasy中， 然后使用 Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System (United States Biochemical Co.)进行测序。使用BLAST和FASTA程序在美国国立卫生研究 所(NIH)的GenBank数据库中检索所述DNA序列。结果是，所述DNA序 列与该数据库中登录号为BC041789的人白蛋白的序列相同。1-5. GIG22如下，对正常肝组织，原发性肝癌组织和肝癌细胞系进行目的基因的差异 表达类型测定。在组织活体检测时从肝癌患者处获得正常肝组织和肝癌组织的样品，和使
用HepG2 (美国典型培养物保藏中心；ATCC保藏号HB-8065)作为人肝癌细 胞系。以和参考实施例相同的方式重复本实验以分别从这些组织和细胞中分离 总RNA。如下，按照文献公开的改良的方法(Liang， P. and Pardee, A. B., 5We"ce, 257， 967-971 (1992); and Liang， P. " a/., Owcer 52， 6966-6968 (1993))，使用从 组织和细胞中分离的每个总RNA样品进行RT-PCR反应。取0.2ug总RNA， 使用SEQ ID NO: 20所示的锚定oligo-dT引物利用试剂盒(a RNAimage kit, GenHunter)进行反转录，然后在0.5 mM
-标记的dATP (1,200 Ci/mmol) 存在下，使用相同的锚定oligo-dT引物和SEQIDNO: 19所示的5'13-mer随 机引物H-AP30(RNAimage primer set 1, GenHimter Corporation, U.S.)进行PCR 反应。PCR反应按下述条件进行总计40个扩增循环由下述步骤组成变性 步骤为95t:40秒，退火步骤为4(TC2分钟和延伸步骤为72'C40秒，循环后 进行72°C 5分钟的延伸步骤。在6%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分析扩增片段以进 行DNA测序，然后放射自显影。图3显示了使用SEQ ID NO: 19所示的5'13-mer随机引物H-AP30和SEQ IDNO: 20所示的锚定oligo-dT引物进行PCR的结果。在图5中，第1， 2和 3泳道代表正常肝组织；第4， 5和6泳道代表肝癌组织；和第7泳道代表肝 癌细胞系HepG2。如图5所示，已确认一 281-bp的cDNA片段在肝癌组织和 肝癌细胞系中不表达，而只在正常肝组织中差异表达(碱基位置在全长GIG22 基因序列的262 542)。所述cDNA片段命名为HP59。从干胶中切下281-bp的条带，HP59片段，煮沸15分钟以洗脱cDNA， 然后在同上述相同的条件下，使用上述相同的引物对进行PCR反应以再扩增 cDNA，此处未使用[a-"S]-标记的dATP和20 dNTP。使用TA克隆系统(Promega)将再扩增的cDNA片段HP59克隆到表达载体pGEM-T Easy中， 然后使用 Sequenase Version 2,0 DNA Sequencing System (United States Biochemical Co.)进行测序。1-6. GIG25如下，对正常肝组织，原发性肝癌组织和肝癌细胞系进行目的基因的差异 表达类型测定。在组织活体检测时从肝癌患者处获得正常肝组织和肝癌组织的样品，和使
用HepG2 (美国典型培养物保藏中心；ATCC保藏号HB-8065)作为人肝癌细 胞系。以和参考实施例相同的方式重复本实验以分别从这些组织和细胞中分离 总訓A。如下，按照文献公开的改良的方法(Liang, P. and Pardee, A. B., Sc&"ce， 257, 967-971 (1992); and Liang, P. " "/.， C""cw 52， 6966-6968 (1993))，使用从 组织和细胞中分离的每个总RNA样品进行RT-PCR反应。取0.2ug总RNA， 使用SEQ ID NO: 24所示的锚定oligo-dT引物利用试剂盒(a RNAimage kit， GenHunter)进行反转录，然后在0.5 mM [ -358]-标记的dATP (1,200 Ci/mmol) 存在下，使用相同的锚定oligo-dT引物和SEQ ID NO: 23所示的5'13-mer随 机引物H-AP40(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, U.S.)进《亍PCR 反应。PCR反应按下述条件进行总计40个扩增循环由下述步骤组成变性步骤为95"C40秒，退火歩骤为4(TC2分钟和延伸歩骤为72'C40秒，循环后 进行72°C 5分钟的延伸步骤。在6%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分析扩增片段以进 行DNA测序，然后放射自显影。图6显示了使用SEQ ID NO: 23所示的5'13-mer随机引物H-AP40和SEQ ID NO: 24所示的锚定oligo-dT引物进行PCR的结果。在图6中，第1 ， 2和 3泳道代表正常肝组织；第4， 5和6泳道代表肝癌组织；和第7泳道代表肝 癌细胞系HepG2。如图6所示，已确认一 250-bp的cDNA片段在肝癌组织和 肝癌细胞系中不表达，而只在正常肝组织中差异表达(碱基位置在全长GIG19 基因序列的1201 1450)。所述cDNA片段命名为HP74。从干胶中切下250-bp的条带，HP74片段，煮沸15分钟以洗脱cDNA， 然后在同上述相同的条件下，使用上述相同的引物对进行PCR反应以再扩增 cDNA,此处未使用[a-"S]-标记的dATP和20 |iM dNTP。使用TA克隆系统(Promega)将再扩增的cDNA片段HP74克隆到表达载体pGEM-TEasy中， 然后〗吏用 Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System (United States Biochemical Co.)进行测序。使用BLAST和FASTA程序在美国国立卫生研究 所(NIH)的GenBank数据库检索所述DNA序列。结果是，其一些DNA序 列与该数据库中登录号为BC0110530的人丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制 齐O， dadeA (cd-抗蛋白酶，抗胰蛋白酶)，成员S的序列不同。1-7. GIG36 如下，对正常乳腺组织，原发性乳腺癌组织和乳腺癌细胞系进行目的基因 的差异表达类型测定。在乳房切除手术时从一乳腺癌患者处获得正常乳腺组织样品，和在根治性 乳房切除手术时从一在手术治疗之前未经历放射或抗-癌治疗的患者处获得原 发性乳腺癌组织样品。使用MCF-7 (美国典型培养物保藏中心；ATCC保藏号HTB-22)作为人乳腺癌细胞系。以和参考实施例相同的方式重复本实验以分 别从这些组织和细胞中分离总RNA。如下，按照文献公开的改良的方法(Liang, P, and Pardee, A. B.， Sc&"ce, 257， 967-971 (1992); and Liang, P. a/" Owcer i es.， 52, 6966-6968 (1993))，使用从 组织和细胞中分离的每个总RNA样品进行RT-PCR反应。取0.2战总RNA， 使用SEQ ID NO: 28所示的锚定oligo-dT引物利用试剂盒(a RNAimage kit， GenHunter)进行反转录，然后在0.5 mM [(1-358]-标记的dATP (1，200 Ci/mmol) 存在下，使用相同的锚定oligo-dT引物和SEQ ID NO: 27所示的5'13-mer随 机引物H-AP29(RNAimage primer set 1, GenHunter Corporation, U.S.)进行PCR反应。PCR反应按卜述条件进行总计40个扩增循环由F述歩骤组成变性步骤为95。C40秒，退火步骤为40。C2分钟和延伸歩骤为72。C'40秒，循环后 进行72°C 5分钟的延伸步骤。在6%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分析扩增片段以进 行DNA测序，然后放射自显影。图7显示了使用SEQ ID NO: 27所示的5'13-mer随机引物H-AP29和SEQ IDNO: 28所示的锚定oligo-dT引物进行PCR的结果。在图7中，第l， 2和 3泳道代表正常乳腺组织；第4， 5和6泳道代表乳腺癌组织；和第7泳道代 表乳腺癌细胞系MCF-7。如图7所示，己确认一182-bp的cDNA片段在乳腺 癌组织和乳腺癌细胞系中不表达，而只在正常乳腺组织中差异表达(碱基位置 在全长GIG36基因序列的183 364)。所述cDNA片段命名为FC5。从干胶中切下182-bp的条带，FC5片段，煮沸15分钟以洗脱cDNA，然 后在同上述相同的条件下，使用上述相同的引物对进行PCR反应以再扩增 cDNA，此处未使用[a-"S]-标记的dATP和20 dNTP。使用TA克隆系统(Promega)将再扩增的cDNA片段FC5克隆到表达载体pGEM-T Easy中， 然后使用 Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System (United States Biochemical Co.)进行测序。使用BLAST和FASTA程序在美国国立卫生研究 所(MH)的GenBank数据库检索所述DNA序列。结果是，所述DNA序列 与该数据库中登录号为M58549和BC005272的基质Gla蛋白相同。 1-8. GIG2如下，对正常肺组织，原发性肺癌组织，转移性肺癌组织和肺癌细胞系中 进行目的基因的差异表达类型测定。从手术中的肺癌患者处获得正常肺组织， 原发性肺癌组织，转移性肺癌组织样品，和使用A549 (美国典型培养物保藏 中心；ATCC保藏号CCL-85)以及NCI-358(美国典型培养物保藏中心；ATCC 保藏号CRL-5807)作为人肺癌细胞系。以和参考实施例相同的方式重复本实 验以分别从这些组织和细胞中分离总RNA。如下，按照文献公开的改良的方法(Liang， P. and Pardee, A. B.， 5We"ce, 257， 967-971 (1992); and Liang, P. " a/.' Owcer i es.， 52， 6966-6968 (1993))，使用从 组织和细胞中分离的每个总RNA样品进行RT-PCR反应。取0.2滞总RNA， 使用SEQ ID NO: 32所示的锚定oligo-dT引物利用试剂盒(a RNAimage kit, GenHunter)进行反转录，然后在0.5 mM
-标记的dATP (1,200 Ci/mmol) 存在下，使用相问的锚定oligo-dT引物和SEQ ID NO: 31所小的5'13-mer随 机引物H-AP32(RNAimage primer set 1， GenHunter Corporation, U.S.)进行PCR反应。PCR反应按下述条件进行总计40个扩增循环由下述步骤组成变性步骤为95'C40秒，退火步骤为4(TC2分钟和延伸步骤为72t:40秒，循环后 进t亍72°C 5分钟的延伸歩骤。在6%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分析扩增片段以进 行DNA测序，然后放射自显影。图8显示了使用SEQ ID NO: 31所示的5'13-mer随机引物H-AP32和SEQ IDNO: 32所示的锚定oligo-dT引物进行PCR的结果。在图8中，第1， 2和 3泳道代表正常肺组织；第4， 5和6泳道代表肺癌组织；和第7泳道代表肺 癌细胞系NCI-H358。如图8所示，已确认一 240-bp的cDNA片段在肺癌组织， 转移性肺癌组织和肺癌细胞系中不表达，而只在正常肺组织中差异表达(碱基 位置在全长GIG2基因序列的371 610)。所述cDNA片段命名为L933。从干胶中切下240-bp的条带，L933片段，煮沸15分钟以洗脱cDNA，然 后在同上述相同的条件下，使用上述相同的引物对进行PCR反应以再扩增 cDNA，此处未使用[a-"S]-标记的dATP和20 dNTP。使用TA克隆系统 (Promega)将再扩增的cDNA片段L933克隆到表达载体pGEM-T Easy中，
然后1吏用 Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing System (United States Biochemical Co.)进行测序。
实施例2: cDNA文库筛选
按照文献公开的方法(Feinberg, A.P. and Vogelstein， B., ^"a/.所oc/ze附.，132, 6-13 (1983))，将从实施例1-1中获得的cDNA片段FC26，实施例1-2中获得 的cDNA片段HP24，实施例1-3中获得的cDNA片段HP48，实施例1-4中获 得的cDNA片段HP50，实施例1-5中获得的cDNA片段HP59，实施例1-6中 获得的cDNA片段HP74，实施例1-7中获得的cDNA片段FC5和实施例1-8 中获得的cDNA片段L933分别进行标记以获得"P-标记的cDNA探针，和按 照文献公开的方法(Sambrook，丄d 她/ecw/"r C7o"/"g.' J ￡aZ>orato^ wamwa/' iVew fe^:: Cold Spring Harbor Laboratory (1989))将生成的"P-标记的 cDNA探针与细菌噬菌体)ugtll人胚肺成纤维cDNA文库(Miki, T. " a/.， Gewe, 83， 137-146 (1989))进行噬菌斑杂交以分别获得人抑癌基因GIG12, GIG17, GIG19, GIG20, GIG22, GiG25， GIG36和GIG2的全长cDNA克隆。
対全长cDNAs测序，囚此其DNA序列分别同SEQ ID NO: 1 (GIG12)， SEQ ID NO: 5 (GIG17), SEQ ID NO: 9 (GIG19)， SEQ ID NO: 13 (GIG20), SEQ ID NO: 17 (GIG22), SEQ ID NO: 21 (GIG25)， SEQ ID NO: 25 (GIG36)和SEQ ID NO: 29 (GIG2)所示的序列相同。
GIG12序列具有一编码711个氨基酸残基的开放读码框，和从开放读码框 得到的氨基酸序列与SEQIDNO: 2所示的序列相同。所得到的蛋白分子量也 约为78kDa。
GIG17序列也具有一编码388个氨基酸残基的开放读码框，和从开放读码 框得到的氨基酸序列与SEQIDNO: 6所示的序列相同。所得到的蛋白分子量 也约为37kDa。
GIG19序列也具有一编码352个氨基酸残基的开放读码框，和从开放读码 框得到的氨基酸序列与SEQIDNO: 10所示的序列相同。所得到的蛋白分子 量也约为39kDa。
GIG20序列也具有一编码417个氨基酸残基的开放读码框，和从开放读码 框得到的氨基酸序列与SEQ ID NO: 14所示的序列相同。所得到的蛋白分子 量也约为47kDa。
GIG22序列也具有一编码150个氨基酸残基的开放读码框，和从开放读码 框得到的氨基酸序列与SEQIDNO: 18所示的序列相同。所得到的蛋白分子 量也约为16kDa。
GIG25序列也具有一编码287个氨基酸残基的开放读码框，和从开放读码 框得到的氨基酸序列与SEQ ID NO: 22所示的序列相同。所得到的蛋白分子 量也约为33kDa。
GIG36序列也具有一编码103个氨基酸残基的开放读码框，和从开放读码 框得到的氨基酸序列与SEQ ID NO: 26所示的序列相同。所得到的蛋白分子 量也约为12kDa。
GIG2序列也具有一编码228个氨基酸残基的开放读码框，和从开放读码 框得到的氨基酸序列与SEQIDNO: 30所示的序列相同。所得到的蛋白分子 量也约为25kDa。
将每个获得的全长GIG cDNA克隆插入到真核表达载体pcDNA3.1 (Invitrogen, U.S.)以获得真核表达载体，然后用获得的真核表达载体转化 Eyc/^nc/ a co// DH5a以获得转化体。将每个转化体命名为E c-o// DH5a/GIG12/pcDNA3.1，然后于2004年5月24日以保藏号KCTC 10642BP
(GIG12)保藏于韩国典型培养物保藏中心；获得的转化体命名为￡. DH5a/GIG17/pcDNA3.1，然后于2004年6月14日以保藏号KCTC 10655BP
(GIG17)保藏于韩国典型培养物保藏中心；获得的转化体命名为￡. DH5a/GIG19/pcDNA3.1 ，然后于2004年6月14日以保藏号KCTC 10656BP
(GIG19)保藏于韩国典型培养物保藏中心；获得的转化体命名为￡. DH5a/GIG20/pcDNA3.1，然后于2004年6月14日以保藏号KCTC 10657BP
(GIG20)保藏于韩国典型培养物保藏中心；获得的转化体命名为co// DH5a/GIG22/pcDNA3.1,然后于2004年6月14日以保藏号KCTC 10658BP
(GIG22)保藏于韩国典型培养物保藏中心；获得的转化体命名为co// DH5a/GIG25/pcDNA3.1，然后于2004年6月14日以保藏号KCTC 10659BP
(GIG25)保藏于韩国典型培养物保藏中心；获得的转化体命名为五. DH5a/GIG36/pcDNA3.1，然后于2004年5月24日以保藏号KCTC 10643BP
(GIG36)保藏于韩国典型培养物保藏中心；和GIG2全长cDNA克隆插入到 真核表达载体pcDNA3.1 (Invitrogen, U.S.)，然后用获得的真核表达载体转化
Esc/zen'c/z/a DH5a，获得的转化体命名为co// DH5a/GIG2/pcDNA3.1 ，然 后于2004年5月31日以保藏号KCTC 10641BP (GIG2)保藏于韩国典型培 养物保藏中心。
于LB肉汤中培养转化的五.co/f菌株，并向培养基中加入0.2 M的L-阿拉 伯糖(Sigma,U.S.)，然后于37i:反应3小时以表达GIG36基因。从生成物培养 基中获得蛋白样品，然后按照如文献所公开的方法(Sambrook， J. a "/.， Afo/ecw/ar C7om.wgv J Z^6on3to^附awwwa/' A^ew K r^:.. Cold Spring Harbor Laboratory (1989))对生成物蛋白样品进行十二垸基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS-PAGE)。
图9， 10， 11， 12， 13， 14， 15和16显示分别对GIG12， GIG17, GIG19， GIG20， GIG22, GIG25， GIG36和GIG2的SDS-PAGE分析结果。在图2中， 第1泳道代表IPTG诱导前的蛋白样品，和第2泳道分别代表GIG基因受IPTG 诱导表达后的蛋白样品。如图2所示，表达的GIG12蛋白分子量约为78kDa， 这与从其DNA序列中得到的分子量一致；表达的GIG17蛋白分子量约为 37kDa,这与从其DNA序列中得到的分子量一致；表达的GIG19蛋白分子量 约为39kDa，这与从其DNA序列中得到的分子量一致；表达的GIG20蛋白分 子量约为47kDa，这与从其DNA序列中得到的分子量一致；表达的GIG22蛋 白分子量约为16kDa，这与从其DNA序列中得到的分子量一致;表达的GIG25 蛋白分子量约为33kDa，这与从其DNA序列中得到的分子量一致；表达的 GIG36蛋白分子量约为12kDa，这与从其DNA序列中得到的分子量一致；表 达的GIG2蛋白分子量约为25kDa，这与从其DNA序列中得到的分子量一致。
实施例3: GIG基因Northern杂交
3-1、 GIG12基因Northern杂交
如下，为了评价GIG12基因的表达水平，进行Northern杂交。 将从如实施例1所述的三种正常乳腺组织，三种原发性乳腺癌组织和乳腺 癌细胞系MCF-7中获得的总RNA样品，各取20傳变性并于1%丙烯酰胺琼 脂糖凝胶中电泳，然后将得到的琼脂糖凝胶转移到尼龙膜上 (Boehringer-Mannheim, Germany)。将利用Rediprime II随机引物标记系统 (Amersham, United Kingdom)从GIG12全长cDNA的部分序列FC26 cDNA中 制备的3￥-标记的引物探针与尼龙膜于42'C过夜杂交。重复两次Northern杂
交步骤；其一使用光密度仪定量和另一个与P-肌动蛋白探针杂交以测定总
图17 (a)显示了 GIG12基因在正常乳腺组织，原发性乳腺癌组织和乳腺 癌细胞系中差异表达的Northern杂交的结果，和图17 (b)显示了将上述印迹 同(3-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern杂交的结果。如图17 (a)和(b) 所示，其显示在正常乳腺组织的三种样品中检测出GIG12基因的高度表达， 但在乳腺癌组织的三种样品中其表达水平显著低于正常组织，而且在乳腺癌细 胞系的一样品中未检测到其表达。
对正常的人多种组织(Clontech)和人癌细胞系(Clontech)进行Northern杂 交。也就是说，按照上述相同的方式，将每种从正常组织和癌细胞系中提取的 总RNA样品转移到杂交印迹上进行Northern杂交，其中所述印迹从Clontech (U.S)公司购得。例如，正常组织选自脑，心脏，骨骼肌，结肠，胸腺，脾， 肾，肝，小肠，胎盘，肺和外周血白细胞；和例如，癌细胞系选自早幼粒细胞 白血病HL-60， HeLa子宫颈癌细胞，慢性髓细胞性白血病细胞系K-562，淋 巴细胞白血病MOLT-4， Burkitt，s淋巴瘤(Raji)， SW480结肠癌细胞，A549 肺癌细胞和G361黑色素瘤细胞。
图25 (a)显示GIG12基因在各种正常组织差异表达的Northern杂交的结 果，和图25 (b)显示将上述印迹同(3-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern杂 交的结果。如图25 (a)所示，大小约为2.4kb的显性GIG12mRNA转录体在 正常组织中过量表达，所述组织例如肺，胸腺，肝脏，骨骼肌，肾，脾，心脏， 胎盘和外周血。
图33 (a)显示GIG12基因在各种癌细胞系中差异表达的Northern杂交的 结果，和图25 (b)显示将上述印迹同p-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern 杂交的结果。如图33 (a)所示，GIG12基因在组织中不表达，所述组织例如 早幼粒细胞白血病HL-60, HeLa子宫颈癌细胞，慢性髓细胞性白血病细胞系 K-562，淋巴细胞白血病MOLT-4， Burkitt，s淋巴瘤(Raji)， SW480结肠癌细 胞，A549肺癌细胞和G361黑色素瘤细胞。因此表明，本发明的GIG12基因 对正常组织具有肿瘤抑制作用，所述组织例如乳腺，肺，胸腺，肝脏，骨骼肌， 肾，脾，心脏，胎盘和外周血。
3-2、 GIG17基因的Northern杂交
如下，为了评价GIG17基因的表达水平，进行Northern杂交。将从如实施例1所述的三种正常肝组织，三种原发性肝癌组织和肝癌细胞 系HepG2中获得的总RNA样品，各取20能变性并于1%丙烯酰胺琼脂糖凝胶 中电泳，然后将生成的琼脂糖凝胶转移到尼龙膜上(Boehringer-Mannheim, Germany)。将利用Rediprime II随机引物标记系统(Amersham， United Kingdom) 从GIG17全长cDNA中制备的"P-标记的引物探针与尼龙膜于42t:过夜杂交。 重复两次Northern杂交步骤；其一使用光密度仪定量和另一个与(3-肌动蛋白 探针杂交以测定总mRNA。图18 (a)显示了 GIG17基因在正常肝组织，原发性肝癌组织和肝癌细胞 系中差异表达的Northern杂交的结果，，和图18 (b)显示了将上述印迹同p_ 肌动蛋白探针杂交所获得的Northern杂交的结果。如图18 (a)和(b)所示， 其显示在正常肝组织的三种样品中检测出GIG17基因的高度表达，但在肝癌 组织的三种样品中其表达水平显著低于正常组织，而且在肝癌细胞系的一样品 中未检测到其表达。对止常的人多种组织(Clontech)和人癌细胞系(Clontech)进行Northern杂 交。也就是说，按照上述相同的方式，将每种从正常组织和癌细胞系中提取的 总RNA样品转移到杂交印迹上进行Northern杂交，其中所述印迹从Clontech(U.S)公司购得，和例如，正常组织选自脑，心脏，骨骼肌，结肠，胸腺， 脾，肾，肝，小肠，胎盘，肺和外周血白细胞，和例如，癌细胞系选自早幼粒 细胞白血病HL-60， HeLa子宫颈癌细胞，慢性髓细胞性白血病细胞系K-562, 淋巴细胞白血病MOLT-4， Burkitt，s淋巴瘤(Raji)， SW480结肠癌细胞，A549 肺癌细胞和G361黑色素瘤细胞。图26 (a)显示GIG17基因在各种正常组织中差异表达的Northern杂交的 结果，和图26 (b)显示将上述印迹同P-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern 杂交的结果。如图26 (a)所示，大小约为1.7kb的显性GIG17mRNA转录体 在正常组织中过量表达，所述组织例如肝，肾，脾，和肺。图34 (a)显示GIG17基因在各种癌细胞系中差异表达的Northern杂交的 结果，和图34 (b)显示将上述印迹同P-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern 杂交的结果。如图34 (a)所示，GIG17基因在组织中不表达，所述组织例如 早幼粒细胞白血病HL-60， HeLa子宫颈癌细胞，慢性髓细胞性白血病细胞系 K-562，淋巴细胞白血病MOLT-4， Burkitt，s淋巴瘤(Raji)， SW480结肠癌细 胞，A549肺癌细胞和G361黑色素瘤细胞。因此表明，本发明的GIG17基因 对正常组织具有肿瘤抑制作用，所述组织例如肝，肾，脾，和肺。另外考虑到 GIG17基因的表达在组织中受到抑制，所述组织例如白血病，子宫癌，恶性淋 巴癌，结肠癌，皮肤癌等抑制GIG17基因的表达从而致使癌的发生，也显示 出本发明的GIG17基因具有肿瘤抑制作用。 3-3、 GIG19基因的Northern杂交如下，为了评价GIG19基因的表达水平，进行Northern杂交。将从如实施例1所述的三种正常肝组织，三种原发性肝癌组织和肝癌细胞 系HepG2中获得的总RNA样品，各取20 /zg变性并于1%丙烯酰胺琼脂糖凝胶 中电泳，然后将生成的琼脂糖凝胶转移到尼龙膜上(Boehringer-Mannheim, Germany)。将利用Rediprime II随机引物标记系统(Amersham, United Kingdom) 从HP48 cDNA中制备的3*-标记的引物探针与尼龙膜于42'C过夜杂交。重复 两次Northern杂交步骤；其一使用光密度仪定量和另一个与P-肌动蛋白探针 杂交以测定总mRNA。图19 (a)显示了 GIG19基因在正常肝组织，原发性肝癌组织和肝癌细胞 系中差异表达的Northern杂交的结果，和图19 (b)显示了将上述印迹同|3-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern杂交的结果。如图19 (a)和(b)所示， 其显示在正常肝组织的三种样品中检测出GIG19基因的高度表达，但在肝癌 组会只的三种样品和肝癌细胞系的一样品中未检测到其表达。对正常的人多种组织(Clontech)和人癌细胞系(Clontech)进行Northern杂 交。也就是说，按照上述相同的方式，将每种从正常组织和癌细胞系中提取的 总RNA样品转移到杂交印迹上进行Northern杂交，其中所述印迹从Clontech (U.S)公司购得。例如，正常组织选自脑，心脏，骨骼肌，结肠，胸腺，脾， 肾，肝，小肠，胎盘，肺和外周血白细胞；和例如，癌细胞系选自早幼粒细胞 白血病HL-60， HeLa子宫颈癌细胞，慢性髓细胞性白血病细胞系K-562,淋 巴细胞白血病MOLT-4， Burkitt，s淋巴瘤(Raji)， SW480结肠癌细胞，A549 肺癌细胞和G361黑色素瘤细胞。图27 (a)显示GIG19基因在各种正常组织中差异表达的Northern杂交的 结果，和图27 (b)显示将上述印迹同(3-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern 杂交的结果。如图27 (a)所示，大小约为1.2kb的显性GIG19mRNA转录体 只在正常肝组织中过量表达。图35 (a)显示GIG19基因在各种癌细胞系中差异表达的Northern杂交的 结果，和图35 (b)显示将上述印迹同(3-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern 杂交的结果。如图35 (a)所示，GIG19基因在组织中不表达，所述组织例如 早幼粒细胞白血病HL-60， HeLa子宫颈癌细胞，慢性髓细胞性白血病细胞系 K-562，淋巴细胞白血病MOLT-4， Burkitt，s淋巴瘤(Raji)， SW480结肠癌细 胞，A549肺癌细胞和G361黑色素瘤细胞。因此表明，本发明的GIG19基因 对正常肝组织具有肿瘤抑制作用。3-4、 GIG20基因的Northern杂交如下，为了评价GIG20基因的表达水平，进行Northern杂交。将从如实施例1所述的三种正常肝组织，三种原发性肝癌组织和肝癌细胞 系HepG2中获得的总RNA样品，各取20巡变性并于1%丙烯酰胺琼脂糖凝胶 中电泳，然后将生成的琼脂糖凝胶转移到尼龙膜上(Boehringer-Mannheim, Germany)。将利用Rediprime II随机引物标记系统(Amersham, United Kingdom) 从HP50 cDNA中制备的"P-标记的引物探针与尼龙膜于42。C过夜杂交。重复 两次Northern杂交步骤；其一使用光密度仪定量和另一个与|3-肌动蛋白探针 杂交以测定总mRNA。图20 (a)显示了 GIG20基因在正常肝组织，原发性肝癌组织和肝癌细胞 系中差异表达的Northern杂交的结果，和图20 (b)显示了将上述印迹同(3-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern杂交的结果。如图20 (a)和(b)所示， 其显示在正常肝组织的三种样品中检测出GIG20基因的高度表达，但在肝癌 组会只的三种样品和肝癌细胞系的一样品中未检测到其表达。对正常的人多种组织(Clontech)和人癌细胞系(Clontech)进行Northern杂 交。也就是说，按照上述相同的方式，将每种从正常组织和癌细胞系中提取的 总RNA样品转移到杂交印迹上进行Northern杂交，其中所述印迹从Clontech (U.S)公司购得。 例如，正常组织选自脑，心脏，骨骼肌，结肠，胸腺， 脾，肾，肝，小肠，胎盘，肺和外周血白细胞；和例如，癌细胞系选自早幼粒 细胞白血病HL-60， HeLa子宫颈癌细胞，慢性髓细胞性白血病细胞系K-562， 淋巴细胞白血病MOLT-4， Burkitt，s淋巴瘤(Raji)， SW480结肠癌细胞，A549
肺癌细胞和G361黑色素瘤细胞。图28 (a)显示GIG20基因在各种正常组织中差异表达的Northern杂交的 结果，和图28 (b)显示将上述印迹同(3-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern 杂交的结果。如图28 (a)所示，大小约为2.4kb的显性GIG20mRNA转录体 只在正常肝组织中过量表达。图36 (a)显示GIG20基因在各种癌细胞系中差异表达的Northern杂交的 结果，和图36 (b)显示将上述印迹同P-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern 杂交的结果。如图36 (a)所示，GIG20基因在组织中不表达，所述组织例如 早幼粒细胞白血病HL-60， HeLa子宫颈癌细胞，慢性髓细胞性白血病细胞系 K-562，淋巴细胞白血病MOLT-4， Burkitt，s淋巴瘤(Raji)， SW480结肠癌细 胞，A549肺癌细胞和G361黑色素瘤细胞。因此表明，本发明的GIG20基因对正常肝组织具有肿瘤抑制作用。 3-5、 GIG22基因Northern杂交如下，为了评价GIG22基因的表达水平，进行Northern杂交。将从如实施例1所述的二种正常肝组织，三种原发性肝癌组织和肝癌细胞 系HepG2中获得的总RNA样品，各取20 /ig变性并于1%丙烯酰胺琼脂糖凝胶 中电泳，然后将生成的琼脂糖凝胶转移到尼龙膜上(Boehringer-Mannheim, Germany)。将利用Rediprime II随机引物标记系统(Amersham, United Kingdom) 从全长GIG22 cDNA中制备的3￥-标记的引物探针与尼龙膜于42。C过夜杂交。 重复两次Northern杂交歩骤；其一使用光密度仪定量和另一个与p-肌动蛋白 探针杂交以测定总mRNA。图21 (a)显示了GIG22基因在正常肝组织，原发性肝癌组织和肝癌细胞 系中差异表达的Northern杂交的结果，，和图21 (b)显示了将上述印迹同(3-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern杂交的结果。如图21 (a)和(b)所示， 其显示在正常肝组织的三种样品中检测出GIG22基因的高度表达，但在肝癌 组^l的三种样品中其表达水平显著低于正常组织，而且在肝癌细胞系的一样品 中未检测到其表达。对正常的人多种组织(Clontech)和人癌细胞系(Clontech)进行Northern杂 交。也就是说，按照上述相同的方式，将每种从正常组织和癌细胞系中提取的 总RNA样品转移到杂交印迹上进行Northern杂交，其中所述印迹从Clontech(U.S)公司购得，例如，正常组织选自脑，心脏，骨骼肌，结肠，胸腺，脾， 肾，肝，小肠，胎盘，肺和外周血白细胞；和例如，癌细胞系选自早幼粒细胞白血病HL-60， HeLa子宫颈癌细胞，慢性髓细胞性白血病细胞系K-562，淋 巴细胞白血病MOLT-4， Burkitt，s淋巴瘤(Raji)， SW480结肠癌细胞，A549 肺癌细胞和G361黑色素瘤细胞。图29 (a)显示GIG22基因在各种正常组织中差异表达的Northern杂交的 结果，和图29 (b)显示将上述印迹同P-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern 杂交的结果。如图29 (a)所示，大小约为0.6kb的显性GIG22mRNA转录体 在正常组织中过量表达，所述组织例如心脏，肌肉，肝，肾，胎盘，脾，肺， 大小肠，脾，胸腺和白细胞。图37 (a)显示GIG22基因在各种癌细胞系中差异表达的Northern杂交的 结果，和图37 (b)显示将上述印迹同(3-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern 杂交的结果。如图37 (a)所示，GIG22基因在组织中不表达，所述组织例如 早幼粒细胞白血病HL-60， HeLa子宫颈癌细胞，慢性髓细胞性白血病细胞系 K-562,淋巴细胞白血病MOLT-4， Burkitt's淋巴瘤(Raji)， SW480结肠癌细 胞，A549肺癌细胞和G361黑色素瘤细胞。因此表明，本发明的GIG22基因 对正常组织具有肿瘤抑制作用，所述组织例如心脏，肌肉，肝，肾，胎盘，脾， 肺，大小肠，脾，胸腺和白细胞。另外考虑到GIG22基因的表达在组织中受 到抑制，所述组织例如白血病，子宫癌，恶性淋巴癌，结肠癌，皮肤癌等抑制 GIG22基因的表达从而致使癌的发生，也显示出本发明的GIG22基因具有肿 瘤抑制作用。3-6、 GIG25基因Northern杂交如下，为了评价GIG25基因的表达水平，进行Northern杂交。 将从如实施例1所述的三种正常肝组织，三种原发性肝癌组织和肝癌细胞 系HepG2中获得的总RNA样品，各取20巡变性并于1%丙烯酰胺琼脂糖凝胶 中电泳，然后将生成的琼脂糖凝胶转移到尼龙膜上(Boehringer-Mannheim, Germany)。将利用Rediprime II随机引物标记系统(Amersham, United Kingdom) 从HP74cDNA中制备的^P-标记的引物探针与尼龙膜于42"过夜杂交。重复 两7欠Northern杂交步骤；其一使用光密度仪定量和另一个与P-肌动蛋白探针 杂交以测定总mRNA。
图22 (a)显示了 GIG25基因在正常肝组织，原发性肝癌组织和肝癌细胞 系中差异表达的Northern杂交的结果，和图22 (b)显示了将上述印迹同p_ 肌动蛋白探针杂交所获得的Northern杂交的结果。如图22 (a)和(b)所示， 其显示在正常肝组织的三种样品中检测出GIG25基因的高度表达，但在肝癌 组织的三种样品和肝癌细胞系的一样品中未检测到其表达。对正常的人多种组织(Clontech)和人癌细胞系(Clontech)进行Northern杂 交。也就是说，按照上述相同的方式，将每种从正常组织和癌细胞系中提取的 总RNA样品转移到杂交印迹上进行Northern杂交，其中所述印迹从Clontech (U.S)公司购得。例如，正常组织选自脑，心脏，骨骼肌，结肠，胸腺，脾， 肾，肝，小肠，胎盘，肺和外周血白细胞；和例如，癌细胞系选自早幼粒细胞 白血病HL-60, HeLa子宫颈癌细胞，慢性髓细胞性白血病细胞系K-562,淋 巴细胞白血病MOLT-4， Burkitt，s淋巴瘤(Raji)， SW480结肠癌细胞，A549 肺癌细胞和G361黑色素瘤细胞。图30 (a)显示GIG25基因在各种正常组织中差异表达的Northern杂交的 结果，和图30 (b)显示将上述印迹同P-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern 杂交的结果。如图30 (a)所示，大小约为1.5kb的显性GIG25mRNA转录体 只在正常肝组织中过量表达。图38 (a)显示GIG25基因在各种癌细胞系中差异表达的Northern杂交的 结果，和图38 (b)显示将上述印迹同P-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern 杂交的结果。如图38 (a)所示，GIG25基因在组织中不表达，所述组织例如 早幼粒细胞白血病HL-60, HeLa子宫颈癌细胞，慢性髓细胞性白血病细胞系 K-562,淋巴细胞白血病MOLT-4， Burkitt，s淋巴瘤(Raji)， SW480结肠癌细 胞，A549肺癌细胞和G361黑色素瘤细胞。因此表明，本发明的GIG25基因 对正常肝组织具有肿瘤抑制作用。3-7、 GIG36基因Northern杂交如下，为了评价GIG36基因的表达水平，进行Northem杂交。 将从如实施例1所述的三种正常乳腺组织，三种原发性乳腺癌组织和乳腺 癌细胞系MCF-7中获得的总RNA样品，各取20 //g变性并于1%丙烯酰胺琼 脂糖凝胶中电泳，然后将生成的琼脂糖凝胶转移到尼龙膜上 (Boehringer-Mannheim, Germany)。将利用Rediprime II随机引物标记系统(Amersham, United Kingdom)从GIG36全长cDNA中制备的3￥-标记的引物探 针与尼龙膜于42'C过夜杂交。重复两次Northern杂交步骤；其一使用光密度 仪定量和另一个与P-肌动蛋白探针杂交以测定总mRNA。图23 (a)显示了GIG36基因在正常乳腺组织，原发性乳腺癌组织和乳腺 癌细胞系中差异表达的Northern杂交的结果，和图23 (b)显示了将上述印迹 同(3-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern杂交的结果。如图23 (a)和(b) 所示，其显示在正常乳腺组织的三种样品中检测出GIG36基因的高度表达， 但在乳腺癌组织的三种样品中其表达水平显著低于正常组织，而且在乳腺癌细 胞系的一样品中未检测到其表达。对正常的人多种组织(Clontech)和人癌细胞系(Clontech)进行northern杂 交。也就是说，按照上述相同的方式，将每种从正常组织和癌细胞系中提取的 总RNA样品转移到杂交印迹上进行Northern杂交，其中所述印迹从Clontech (U.S)公司购得。例如，正常组织选自脑，心脏，骨骼肌，结肠，胸腺，脾， 肾，肝，小肠，胎盘，肺和外周血白细胞；和例如，癌细胞系选自早幼粒细胞 白血病HL-60， HeLa子宫颈癌细胞，慢性髓细胞性白血病细胞系K-562，淋 巴细胞白血病MOLT-4， Burkitt，s淋巴瘤(Raji)， SW480结肠癌细胞，A549 肺癌细胞和G361黑色素瘤细胞。图31 (a)显示GIG36基因在各种正常组织中差异表达的Northern杂交的 结果，和图31 (b)显示将上述印迹同(3-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern 杂交的结果。如图31 (a)所示，大小约为0.4kb的显性GIG36mRNA转录体 在正常组织中过量表达，所述组织例如心脏，骨骼肌，肾，肺，大小肠，肝， 胎盘，胸腺和脾。图39 (a)显示GIG36基因在各种癌细胞系中差异表达的Northern杂交的 结果，和图39 (b)显示将上述印迹同(3-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern 杂交的结果。如图39 (a)所示，GIG36基因在组织中不表达，所述组织例如 早幼粒细胞白血病HL-60， HeLa子宫颈癌细胞，慢性髓细胞性白血病细胞系 K-562，淋巴细胞白血病MOLT-4， Burkitt，s淋巴瘤(Raji)， SW480结肠癌细 胞，A549肺癌细胞和G361黑色素瘤细胞。因此表明，本发明的GIG36基因 对正常组织具有肿瘤抑制作用，所述组织例如心脏，骨骼肌，肾，肺，大小肠， 肝，胎盘，胸腺和脾。3-8、 GIG2基因Northern杂交如下，为了评价GIG2基因的表达水平，进行Northern杂交。将从如实施例l-8所述的三种正常肺组织，两种原发性肺癌组织，两种转 移性肺癌组织和肺癌细胞系(A549和NCI-H358)中获得的总RNA样品，各 取20膽变性并于1%丙烯酰胺琼脂糖凝胶中电泳，然后将生成的琼脂糖凝胶转 移到尼龙膜上(Boehringer-Mannheim， Germany)。将利用Rediprime II随机引物 标记系统(Amersham, United Kingdom)从GIG2全长cDNA中制备的"P-标记的 引物探针与尼龙膜于42。C过夜杂交。重复两次Northern杂交步骤；其一使用 光密度仪定量和另一个与P-肌动蛋白探针杂交以测定总mRNA。图24 (a)显示了 GIG2基因在正常肺组织，原发性肺癌组织，转移性肺 癌组织和肺癌细胞系中差异表达的Northern杂交的结果，和图24 (b)显示了 将上述印迹同(3-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern杂交的结果。如图24(a) 和(b)所示，其显示在正常肺组织的三种样品中检测出GIG22基因高度表达， 但在原发性肺癌组织的两种样品，转移性肺癌组织的两种样品和癌细胞系的两 种样品中未检测到其表达。对正常的人多种组织(Clontech)和人癌细胞系(Ckmtech)进行Northern杂 交。也就是说，按照上述相同的方式，将每种从正常组织和癌细胞系中提取的 总RNA样品转移到杂交印迹上进行Northern杂交，其中所述印迹从Clontech (U.S)公司购得。例如，正常组织选自脑，心脏，骨骼肌，结肠，胸腺，脾， 肾，肝，小肠，胎盘，肺和外周血白细胞.，和例如，癌细胞系选自早幼粒细胞 白血病HL-60， HeLa子宫颈癌细胞，慢性髓细胞性白血病细胞系K-562，淋 巴细胞白血病MOLT-4， Burkitt，s淋巴瘤(Raji)， SW480结肠癌细胞，A549 肺癌细胞和G361黑色素瘤细胞。图32 (a)显示GIG2基因在各种正常组织中差异表达的Northern杂交的 结果，和图32 (b)显示将上述印迹同P-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern 杂交的结果。如图32 (a)所示，大小约为Okb的显性GIG2 mRNA转录体 在正常组织中高度过量表达，所述组织例如脑，心脏，骨骼肌，结肠，胸腺， 脾，肾，肝，小肠，胎盘，肺和外周血白细胞。图40 (a)显示GIG2基因在各种癌细胞系中差异表达的Northern杂交的 结果，和图40 (b)显示将上述印迹同P-肌动蛋白探针杂交所获得的Northern杂交的结果。如图40 (a)所示，GIG2基因在组织中不表达，所述组织例如 早幼粒细胞白血病HL-60和Burkitt，s淋巴瘤(Raji)细胞系。因此表明，本发 明的GIG2基因对正常组织具有肿瘤抑制作用，所述组织例如脑，心脏，骨骼 肌，结肠，胸腺，脾，肾，肝，小肠，胎盘，肺和外周血白细胞。另外考虑到 GIG22基因的表达在组织中受到抑制，所述组织例如子宫癌，慢性白血病，结 肠癌，肺癌，皮肤癌等抑制GIG2基因的表达从而致使癌的发生，也显示出本 发明的GIG2基因具有肿瘤抑制作用。实施例4:表达载体的构建和转染4-1、 GIG12和GIG36如下，构建含有GIG12或者GIG36基因编码区的表达载体。首先，将实 施例2中制备的GIG12或GIG36的全长cDNA克隆插入到一真核表达载体 pcDNA3.1(Invitrogen, U.S.)中以分别获得表达载体pcDNA3.1/GIG12和表达载 体pcDNA3.1/GIG36。使用脂质体(lipofectamine) (Gibco BRL)将每个表达载 体转染到一 MCF-7乳腺癌细胞系，然后于含有0.6mg/ml G418 (Gibco)的 DMEM培养基屮培养以选择被转染的细胞。在这个时候，将由缺少GIG12 cDNA的表达载体pcDNA3.1转染的MCF-7细胞作为对照组。4-2、 GIG17， GIG19， GIG20， GIG22和GIG25基因的组如下，从上述一组GIG基因中，构建除GIG12和GIG36基因以外的GIG 基因编码区的表达载体。首先，将实施例2中制备的每个GIG的全长cDNA 克隆插入到一真核表达载体pcDNA3.1(Invitrogen, U.S.)中以分别获得表达载体 pcDNA3,l/GIG17, pcDNA3.1/GIG19, pcDNA3.1/GIG20, pcDNA3.1/GIG22禾口 pcDNA3.1/GIG25。使用脂质体(Gibco BRL)将每个表达载体转染到一 HepG2 肝癌细胞系，然后于含有0.6mg/ml G418 (Gibco)的DMEM培养基中培养以选 择lfe转染的细胞。在这个时候，将由不含GIG cDNA的表达载体pcDNA3.1 转染的HepG2细胞作为对照组。4-3、 GIG2如下，构建含有GIG2基因编码区的表达载体。首先，将实施例2中制备 的GIG2全长cDNA克隆插入到一真核表达载体pcDNA3.1(Invitrogen, U.S.)中 以获得表达载体pcDNA3.1/GIG2。使用脂质体(Gibco BRL)将表达载体转染到 一 A549肺癌细胞系，然后于含有0.6mg/ml G418 (Gibco)的DMEM培养基中 培养以选择被转染的细胞。在这个时候，将由不含GIG2 cDNA的表达载体 pcDNA3.1转染的A549细胞作为对照组。 实施例5:5-1、由GIG12基因转染的乳腺癌细胞的生长曲线为了测定GIG12基因对乳腺癌细胞生长的作用，将由实施例4制备的载 体pcDNA3.1/GIG12转染的野生型MCF-7细胞，MCF-7乳腺癌细胞，和只由 载体pcDNA3.1转染的MCF-7细胞分别于DMEM培养基中培养9天，细胞密 度为1 x 1()S细胞/ml。在每个培养液中用胰蛋白酶(trypsin) (Sigma)处理以 将贴在培养瓶上的细胞分离，然后根据台盼蓝(trypan blue)染色排除法于第1， 3 ， 5， 7和9天对存活细胞计数(Freshney， I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))。图41显示由实施例4制备的载体pcDNA3.1/GIG12转染的野生型MCF-7 细胞、MCF-7乳腺癌细胞，和只由载体pcDNA3.1转染的MCF-7细胞的生长 曲线。如图41所示，其揭示出与由表达载体pcDNA3.1转染的MCF-7细胞和 野生型MCF-7细胞相比，由载体pcDNA3.1/GIG12转染的MCF-7乳腺癌细胞 显示出更高的死亡率。培养9天后，和野生型MCF-7细胞相比，由载体 pcDNA3.1/GIG12转染的MCF-7乳腺癌细胞只有50%存活。通过上述结果， 可以看出GIG12基因抑制乳腺癌细胞的生长。5-2、 GIG17基因转染的肝癌细胞的生长曲线为了测定GIG17基因对肝癌细胞生长的作用，将由实施例4制备的载体 pcDNA3.1/GIG17转染的野生型HepG2细胞，HepG2肝癌细胞，和只由载体 pcDNA3.1转染的HepG2细胞分别于DMEM培养基中培养9天，细胞密度为 lxl()S细胞/inl。在每个培养液中用胰蛋白酶(Sigma)处理以将贴在培养瓶上 的细胞分离，然后根据台盼蓝染色排除法于第1， 3， 5， 7和9天对存活细胞 计数(Freshney, I.R.， Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987))。图42显示由实施例4制备的载体pcDNA3.1/GIG17转染的野生型HepG2 细胞、H印G2肝癌细胞，和只由载体pcDNA3.1转染的HepG2细胞的生长曲 线。如图42所示，其揭示出与由表达载体pcDNA3.1转染的HepG2细胞和野 生型HepG2细胞相比，由载体pcDNA3.1/GIG17转染的HepG2肝癌细胞显示 出更高的死亡率。培养9天后，和野生型HepG2细胞相比，由载体 pcDNA3.1/GIG17转染的HepG2肝癌细胞只有45%存活。通过上述结果，可 以看出GIG17基因抑制肝癌细胞的生长。5-3、 GIG19基因转染的肝癌细胞的生长曲线为了测定GIG19基因对肝癌细胞生长的作用，将由实施例4制备的载体 pcDNA3.1/GIG19转染的野生型HepG2细胞，HepG2肝癌细胞，和只由载体 pcDNA3.1转染的HepG2细胞分别于DMEM培养基中培养9天，细胞密度为 lxl()S细胞/ml。在每个培养液中用胰蛋白酶(Sigma)处理以将贴在培养瓶上 的细胞分离，然后根据台盼蓝染色排除法于第l， 3， 5， 7和9天对存活细胞 计数(Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987》。图43显示由实施例4制备的载体pcDNA3.1/GIG19转染的野生型HepG2 细胞、HepG2肝癌细胞，和只由载体pcDNA3.1转染的HepG2细胞的生长曲 线。如图43所示，其揭示出与由表达载体pcDNA3.1转染的HepG2细胞和野 生型HepG2细胞相比，由载体pcDNA3.1/GIG19转染的HepG2肝癌细胞显小 出更高的死亡率。培养9天后，和野生型HepG2细胞相比，由载体 pcDNA3.1/GIG19转染的HepG2肝癌细胞只有40%存活。通过上述结果，可 以看出GIG19基因抑制肝癌细胞的生长。5-4、 GIG20基因转染的肝癌细胞的生长曲线为了测定GIG20基因对肝癌细胞生长的作用，将由实施例4制备的载体 pcDNA3.1/GIG20转染的野生型HepG2细胞，HepG2肝癌细胞，和只由载体 pcDNA3.1转染的HepG2细胞分别于DMEM培养基中培养9天，细胞密度为 lxl()S细胞/rnl。在每个培养液中用胰蛋白酶(Sigma)处理以将贴在培养瓶上 的细胞分离，然后根据台盼蓝染色排除法于第l， 3， 5， 7和9天对存活细胞 计数(Freshney， I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss, New York (1987》。图44显示由实施例4制备的载体pcDNA3.1/GIG20转染的野生型HepG2 细胞、HepG2肝癌细胞，和只由载体pcDNA3.1转染的HepG2细胞的生长曲 线。如图44所示，其揭示出与由表达载体pcDNA3.1转染的HepG2细胞和野 生型HepG2细胞相比，由载体pcDNA3.1/GIG20转染的HepG2肝癌细胞显示出更高的死亡率。培养9天后，和野生型HepG2细胞相比，由载体 pcDNA3.1/GIG20转染的H印G2肝癌细胞只有35%存活。通过上述结果，可 以看出GIG20基因抑制肝癌细胞的生长。5-5、 GIG22基因转染的肝癌细胞的生长曲线为了测定GIG22基因对肝癌细胞生长的作用，将由实施例4制备的载体 pcDNA3.i/GIG22转染的野生型H印G2细胞，HepG2肝癌细胞，和只由载体 pcDNA3.1转染的HepG2细胞分别于DMEM培养基中培养9天，细胞密度为 lxl()S细胞/ml。在每个培养液中用胰蛋白酶(Sigma)处理以将贴在培养瓶上 的细胞分离，然后根据台盼蓝染色排除法于第1， 3， 5， 7和9天对存活细胞 计数(Freshney， I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss， New York (1987))。图45显示由实施例4制备的载体pcDNA3.1/GIG22转染的野生型HepG2 细胞、HepG2肝癌细胞，和只由载体pcDNA3.1转染的HepG2细胞的生长曲 线。如图45所示，其揭示出与由表达载体pcDNA3.1转染的HepG2细胞和野 生型HepG2细胞相比，由载体pcDNA3.1/GIG22转染的HepG2肝癌细胞显示 出更高的死亡率。培养9天后，和野生型HepG2细胞相比，由载体 pcDNA3.1/GIG22转染的HepG2肝癌细胞只有40%存活。通过上述结果，可 以看出GIG22基因抑制肝癌细胞的生长。5-6、 GIG25基因转染的肝癌细胞的生长曲线为了测定GIG25基因对肝癌细胞生长的作用，将由实施例4制备的载体 pcDNA3.1/GIG25转染的野生型HepG2细胞，HepG2肝癌细胞，和只由载体 pcDNA3.1转染的HepG2细胞分别于DMEM培养基中培养9天，细胞密度为 lxl0s细胞/ml。在每个培养液中用胰蛋白酶(Sigma)处理以将贴在培养瓶上 的细胞分离，然后根据台盼蓝染色排除法于第1， 3， 5， 7和9天对存活细胞 计数(Freshney， I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss， New York (1987))。图46显示由实施例4制备的载体pcDNA3.1/GIG25转染的野生型HepG2 细胞、HepG2肝癌细胞，和只由载体pcDNA3.1转染的H印G2细胞的生长曲 线。如图46所示，其揭示出与由表达载体pcDNA3.1转染的H印G2细胞和野 生型HepG2细胞相比，由载体pcDNA3.1/GIG25转染的HepG2肝癌细胞显示 出更高的死亡率。培养9天后，和野生型HepG2细胞相比，由载体 pcDNA3.1/GIG25转染的HepG2肝癌细胞只有35%存活。通过上述结果，可 以看出GIG25基因抑制肝癌细胞的生长。5-7、由GIG36基因转染的乳腺癌细胞的生长曲线为了测定GIG36基因对乳腺癌细胞生长的作用，将由实施例4制备的载 体pcDNA3.1/GIG36转染的野生型MCF-7细胞，MCF-7乳腺癌细胞，和只由 载体pcDNA3.1转染的MCF-7细胞分别于DMEM培养基中培养9天，细胞密 度为l x 1()S细胞/ml。在每个培养液中用胰蛋白酶(Sigma)处理以将贴在培 养瓶上的细胞分离，然后根据台盼蓝染色排除法于第1， 3， 5， 7和9天对存 活细胞计数(Freshney， I.R.， Culture of Animal Cells, 2nd Ed A.R. Liss， New York (1987》。图47显示由实施例4制备的载体pcDNA3.1/GIG36转染的野生型MCF-7 细胞、MCF-7乳腺癌细胞，和只由载体pcDNA3.1转染的MCF-7细胞的生长 曲线。如图47所示，其揭示出与由表达载体pcDNA3.1转染的MCF-7细胞和 野生型细胞相比，由载体pcDNA3.1/GIG36转染的MCF-7乳腺癌细胞 显示出更高的死亡率。培养9天后，和野生型MCF-7细胞相比，由载体 pcDNA3.1/GIG36转染的MCF-7乳腺癌细胞只有50%存活。通过上述结果， 可以看出GIG36基因抑制乳腺癌细胞的生长。5-8、由GIG2基因转染的肺癌细胞的生长曲线为了测定GIG2基因对肺癌细胞生长的作用，将由实施例4制备的载体 pcDNA3.1/GIG2转染的野生型A549细胞，A549肺癌细胞，和只由载体 pcDNA3.1转染的A549细胞分别于DMEM培养基中培养9天，细胞密度为1 x 10S细胞/ml。在每个培养液中用胰蛋白酶(Sigma)处理以将贴在培养瓶上 的细胞分离，然后根据台盼蓝染色排除法于第1， 3， 5， 7和9天对存活细胞 计数(Freshney, I.R., Culture of Animal Cells, 2nd Ed. A.R. Liss， New York (1987》。图48显示由实施例4-3制备的载体pcDNA3.1/GIG2转染的野生型A549 细胞、A549肺癌细胞，和只由载体pcDNA3.1转染的A549细胞的生长曲线。 如图48所示，其揭示出与由表达载体pcDNA3.1转染的A549细胞和野生型 A549细胞相比，由载体pcDNA3.1/GIG2转染的A549肺癌细胞显示出更高的 死亡率。培养9天后，和野生型A549细胞相比，由载体pcDNA3.1/GIG2转 染的A549肺癌细胞只有40。/。存活。通过上述结果，可以看出GIG2基因抑制 肺癌细胞的生长。工业实用性如上所述，本发明的GIG基因可以有效地用于人癌症的诊断，预防和治疗。
权利要求
1、 一人抑癌蛋白，其具有选自下组所示的氨基酸序列SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14， SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26和SEQ ID NO: 30。
2、 根据权利要求1的人抑癌蛋白，其中所述癌症是正常组织的癌症，所 述组织选自乳腺，肺，胸腺，肝，骨骼肌，肾，脾，心脏，胎盘和外周血。
3、 一人抑癌基因，其具有选自下组所示的DNA序列SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5， SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 29，其编码相应的蛋白。
4、 根据权利要求3的人抑癌基因，其中所述癌症是正常组织的癌症，所 述组织选自乳腺，肺，胸腺，肝，骨骼肌，肾，脾，心脏，胎盘和外周血。
5、 含有如权利要求3所定义的每个基因的表达载体。
6、 由权利要求5所定义的每个表达载体转化的细胞。
7、 根据权利要求6的细胞，其中所述细胞是微生物或动物细胞。
8、 根据权利要求7的细胞，其中所述细胞选自大肠杆菌五化/^n'c/^ //DH5a/GIG12/pcDNA3.1保藏号为KCTC賜42BP),co//DH5a/GIG 17/pcDNA3 1c保藏号为KCTC10655BP),<%>//DH5a/GIG 19/pcDNA3.1(保藏号为KCTC賜56BP)，co//DH5a/GIG20/pcDNA3.1(保藏号为KCTC10657BP),co/fDH5a/GIG22/pcDNA3.1(保藏号为KCTC10658BP),DH5a/GIG25/pcDNA3.1保藏号为KCTC10659BP),DH5a/GIG36/pcDNA3.1(保藏号为KCTC10643BP)和(%>//DH5a/GIG2/pcDNA3.1 (保藏号为KCTC 10641BP)。
全文摘要
本发明公开了一人抑癌基因，其编码的蛋白，含有其的表达载体和由该载体转化的细胞。本发明的基因可以用于人癌症的诊断，预防和治疗。
文档编号C07K14/47GK101146821SQ200580048563
公开日2008年3月19日 申请日期2005年12月22日 优先权日2004年12月22日
发明者金弦起, 金振宇 申请人:金弦起