专利名称：一种用于核酸分离的磁性纳米粒子复合物及其制法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属纳米材料领域，更具体地，是涉及应用于生物技术领域的纳米材料。
背景技术：
核酸提取特别是mRNA提取技术不仅是分子生物学技术的重要组成部分，也是功能基因组学科研技术的重要基础。随着后基因组时代的到来，寻求一种有效的提取核酸特别是mRNA的方法成为迫切需要解决的问题。mRNA即信使核糖核酸(messenger RNA)。它是存在于生物细胞内将遗传信息从DNA上转移到功能蛋白上的信使，或称模板。通过研究基因表达谱分析来阐释基因的功能和基因表达调控机制已成为目前研究的热点。然而，进行基因表达谱分析的一个最大挑战就是mRNA的提取和特异性标记。这也是原核生物的基因表达谱分析比真核生物落后得多的一个原因。因此，mRNA提取技术不仅是分子生物学技术的重要组成部分，也是功能基因组学科研技术的重要基础。由于mRNA在细胞内半衰期很短，直到20多年前，人类才首次将这一重要物质从真核细胞中分离出来。近几年来，随着科学技术的不断进步，细菌mRNA的提取也有所突破。
在mRNA提取过程中，如何快速地稳定样品中mRNA群体使细胞保持原有的表达模式至关重要。传统的从总RNA中分离mRNA是用带Oligo(dT)的纤维素或者琼脂糖亲和层析柱，用传统方法从细菌中分离RNA，有两个主要因素会导致细菌表达模式的改变，影响基因表达分析。一是由于RNA酶的降解导致一些转录本的损失甚至丢失，这一点对细菌mRNA的影响尤为严重，因为细菌mRNA的半衰期很短，往往只有几分钟。二是某些基因在操作过程中(裂解前)被诱导表达，导致这些基因表达增高。
而现在的生物磁珠分离法则更加有效、方便。先用生物素标记的Oligo(dT)和mRNA杂交，再由包被亲和素或抗生物素的磁珠捕获杂交复合物，在外磁场作用下收集磁性粒子，然后将分离的mRNA洗脱下来。除此以外，还可用磁珠法分离特定的mRNA，即以生物素标记的单链DNA为探针和目的mRNA杂交，再用带亲和素或抗生物素的磁珠捕获杂交复合物。这与传统的选择杂交法、多聚体核糖免疫沉淀法相比，更加快速、简便、捕获率高。所分离的mRNA可用于Nothern印迹、cDNA的合成、RT-PCR和体外翻译等许多分子生物学的后继实验。磁珠法也应用于DNA的分离，区别只是以生物素标记的DNA探针和目标DNA杂交。
纳米粒子以其独特的性质在生物技术领域中的应用前景日益受到人们的关注。磁性纳米粒子被用作生物样品磁场分离介质，在分子生物学、临床诊断、医疗等领域中的应用日益广泛，由于粒径在纳米尺度，粒子具有超顺磁性和巨大表面积。普通的磁珠不具备纳米粒子的超顺磁性和表面效应，将其应用于复杂体系中生物样品的分离可以分离速度慢、分离效率低、反应专一性受到影响，最为致命的缺陷是不能确保分离样品的生物活性，而且不能进行微量样品的分离。
目前尚未见到有在磁性纳米粒子的表面修饰能特异性结合生物素的亲和素或抗生物素，然后向含有目的核酸特别是mRNA的体系中加入修饰有生物素的探针。待探针与目的核酸或mRNA形成杂交复合物后，加入包覆有亲和素或抗生物素的粒子去捕获杂交复合物，再在外磁场的作用下分离、洗脱DNA或mRNA的技术。
发明内容
所要解决的技术问题本发明需要解决的技术问题是提供一种用于核酸分离的磁性纳米粒子复合物及其制备方法和应用，以克服现有技术中仅以普通粒径的磁性颗粒来进行核酸分离，由于颗粒表面积小，无法使目标核酸在短时间内高效地获得分离的缺陷。
技术方案本发明的技术方案之一是提供一种用于核酸分离的磁性纳米粒子复合物，具备内核和外壳的核壳型结构，包括如下的结构(1)由具有超顺磁性的磁性纳米粒子构成的内核层；(2)包覆内核层的生物学惰性外壳层；(3)外壳层表面为亲和素或抗生物素的修饰层。
优选其外壳层包覆的修饰层为链酶亲和素。
上述的用于核酸分离的磁性纳米粒子复合物的优选技术方案之一为，所说的生物学惰性外壳层的成分为二氧化硅、琼脂糖、壳聚糖、葡聚糖、糖苷、烯烃聚合物、聚丙烯腈、环氧化合物、或者其组合；最优选为二氧化硅。
上述的用于核酸分离的磁性纳米粒子的优选技术方案之二为，所说的内核层的成分为铁的氧化物、铁、镍、镍-铁合金、或者其组合；最优选的成分为铁的氧化物。
该磁性纳米粒子—亲和素或抗生物素复合物可以与标记有生物素并且可以特异性识别、结合目的核酸分子的探针一起形成磁性纳米粒子生物分子分离系统。
本发明的技术方案之二是提供一种上述的磁性纳米粒子—亲和素或抗生物素复合物的制备方法，包括以下步骤(1)在含内核层和外壳层的形成剂的微乳液体系中，通过油包水型反相微乳液法，形成核壳型磁性纳米粒子；(2)用固化剂或交联剂对核壳型磁性纳米粒子的表面进行修饰；(3)将亲和素或抗生物素对步骤(2)中修饰好的磁性纳米粒子进行反应。
上述的磁性纳米粒子—亲和素或抗生物素复合物的制备方法的优选技术方案之一为，步骤(2)所说的固化剂或交联剂为聚乙二醇或者戊二醛、甲醛、乙二醛、或冠醚交联剂。
11.上述的磁性纳米粒子—亲和素或抗生物素复合物的制备方法的优选技术方案之一为，步骤(1)所说的形成剂为正硅酸乙酯、琼脂糖、壳聚糖、葡聚糖、糖苷、烯烃化合物、丙稀腈、环氧化合物等。
适用于本发明的亲和素或抗生物素没有特别的限制。只需能结合修饰在可以特异性识别并结合目的核酸特别是mRNA的探针上的生物素。
核壳型磁性纳米粒子内核层的外壳成分除了二氧化硅等无机包裹层以外，还有琼脂糖、烯烃聚合物、聚丙烯腈、环氧化合物等有机包裹层。对于选定的外壳成分，可根据现有技术选用合适的内核层外壳形成剂。例如当外壳成分为二氧化硅时，可选用正硅酸乙酯或其它合适的内核层外壳形成剂。
本发明的技术方案之三是提供一种上述的磁性纳米粒子—亲和素或抗生物素复合物在核酸分离中的应用，包括如下步骤(1)将标记有生物素的核酸探针与含有目标核酸的溶液混合，形成杂交复合物；
(2)加入磁性纳米粒子—亲和素或抗生物素复合物，与杂交复合物进行反应；(3)在磁场的引导下分离磁性纳米粒子，并洗脱目标核酸；或者，包括如下步骤(1)将磁性纳米粒子—亲和素或抗生物素复合物与标记有生物素的核酸探针溶液混合，形成探针复合物；(2)加入目标核酸溶液，与探针复合物进行反应；(3)在磁场的引导下分离磁性纳米粒子，并洗脱目标核酸；上述的磁性纳米粒子—亲和素或抗生物素复合物在核酸分离中的应用的优选技术方案为，其特征在于，所说的目标核酸为来自于动物、植物或微生物细胞、病毒、人体组织、动物或人全血中的mRNA、DNA、rRNA或者tRNA。
有益效果(1)本发明使用的磁性纳米粒子是单分散性的，不产生团聚现象，磁性纳米粒子的形状和直径易于控制。
(2)由于粒径在纳米尺度，粒子具有超顺磁性和巨大表面积。利用纳米粒子的超顺磁性和表面效应，可以大大提高分离速度、分离效率和专一性，确保分离样品的生物活性，而且可以进行微量样品的分离。
(3)生物素标记对探针影响较少，探针可以充分、高效地与体系中的目的DNA或mRNA杂交。
(4)亲和素和生物素的结合反应呈高度特异性，生物素和亲和素一旦结合，则很难分离，这种高度稳定的特异结合，可明显降低或避免反应中可能发生的非特异性作用。另外，亲和素具有四个相同亚基，可以同时以多价桥连结生物素化的探针及其标记物。这种多价放大作用赋予亲和素极高的灵敏度。
(5)亲和素和生物素间非共价的相互作用很强，亲和常数为1015/mol，结合快，呈不可逆反应，并且对各种试剂的环境因素不敏感，以致产物可保持高度稳定。
(6)操作简单，整个分离过程约不超过30min，分离得到DNA或者mRNA能很好地用于后继的实验。
如本文所用，术语“反相微乳液法”指微乳液法是利用两种互补相溶的溶剂在表面活性剂的作用下形成一个均匀的乳液，从乳液中析出固体，这样可使成核、成长、聚结和团聚等过程局限在一个微小的球形液滴内，从而形成球形颗粒。微乳液通常由表面活性剂、助表面活性剂(通常为醇类)、油(通常为碳氢化合物)和水(或电解质的水溶液)组成的透明的各向同性的热力学稳定性体系。其中反相微乳液是指油包水(W/O)型乳液，即水相分散在油相而形成微小的不连续的“水池”，其大小可控制在几十到几百个埃之间。纳米粒子的微乳液制备方法正是利用微乳液的“水池”作为“微反应器”，从而达到控制纳米粒子的粒径和形状。
图1表面修饰有氨基的磁性粒子的红外谱图。3440处的峰对应为N-H伸缩振动峰，1660处对应的是N-H弯曲振动。该图表明在磁性纳米粒子表面已被修饰上了氨基。
图2表面连接链酶亲和素的磁性粒子的拉曼图谱。图中标出了链酶亲和素的特征峰，表明磁性纳米粒子的表面已被连有链酶亲和素。
图3分离出的mRNA的RT-PCR电泳图。图中M、a、b分别为分子量标记和两条扩增产物电泳道，箭头所指的P条带为目的基因扩增产物片断。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如化工产品手册，或按照制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂或者试剂购自上海化学试剂厂，电泳分子量标记购自上海Sangon公司。
实施例1制备磁性纳米粒子用二次蒸馏水分别配制FeSO4.7H2O和FeCl3.6H2O的混合溶液及NaOH溶液。在铁盐的混合溶液中Fe2+离子的浓度为0.1～0.2mol/L，Fe3+离子的浓度为0.1～0.3mol/L，NaOH溶液的浓度为2～3mol/L。在剧烈搅拌下将体积为混合盐溶液体积一半的NaOH溶液缓慢地滴加到混合盐溶液中。将所得到的固体沉淀在40℃～60℃下陈化12h，用二次蒸馏水将沉淀物清洗数次，过滤后再在40℃～80℃的条件下干燥24h，在玛瑙研钵中研磨后即得产物。
实施例2二氧化硅在γ-Fe2O3表面的修饰将TritonX-1 00、正己醇、环己烷按1∶(1～3)∶(4～6)的比例均匀混合，形成透明稳定的微乳液体系。将上述微乳液体系置于超声波中处理5-60分钟，再向其中加入0.01～1g的γ-Fe2O3(磁性纳米粒子)，用超声波处理1-30分钟后取出上层液倒入三颈烧瓶中，搅拌30～60分钟使之均匀。取1-10mL一定浓度的浓氨水用1-20mL二次蒸馏水稀释，将其缓慢加入到不断搅拌的微乳液中，持续搅拌10～60分钟使氨水均匀分散在微乳液中。1小时后，向微乳液中滴加1～5mL的正硅酸乙酯(内核层外壳形成剂)，同时不断地搅拌10小时，并将体系的温度保持在15～40℃之间。向体系中加入丙酮使粒子沉淀，或者将体系静置过夜使粒子自然沉淀，使用乙醇清洗粒子。将清洗后的粒子置于300～700℃的条件下锻烧1～5个小时，收集核壳型磁性纳米粒子。
实施例3用[N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷](AEAPS)修饰磁性纳米粒子表面取15mg磁性纳米粒子加入10～100mL的甲醇和丙三醇的混合液(甲醇∶丙三醇的体积比为2∶3-2∶1)中，用超声波处理5～60分钟；称取0.01～1gAEAPS([N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷])，用超声波处理5～60分钟；将这两种溶液混合均匀，在10～95℃的条件下反应1-10小时，然后取出粒子并用甲醇清洗3次，接着在100-300℃真空干燥，收集粒子(FSM)。
实施例4
亲和素或抗生物素在磁性纳米粒子表面的修饰取实施例3中制备的粒子，用磷酸盐缓冲液(pH为7.0-8.0)洗涤约1-10次(更佳地2-5次)，加至pH为7.0-8.0的磷酸盐缓冲体系中。所述的混合溶液用超声波处理5-60分钟。
然后取一定量的亲和素或抗生物素(与磁性纳米粒子的浓度比通常为1∶6-1∶1)，加入到上述粒子的混合溶液中。在0-30℃的反应温度下反应12-48小时，加入交联剂(或固化剂)聚乙二醇、戊二醛、甲醛、乙二醛、或冠醚交联剂在体系中的浓度约为0.5％-5％，形成混合溶液，从而将亲和素或抗生物素在固定剂的作用下与中间层上的氨基反应，使亲和素或抗生物素通过席夫键直接连接于中间层。反应结束后，磁性分离所述的粒子，用磷酸盐缓冲液洗涤约2-3次。这样得到的包覆有亲和素或抗生物素的磁性纳米粒子置于磷酸盐缓冲液中保存备用。
实施例5将磁性纳米粒子应用于mRNA的抽提，并将得到的mRNA进行RT-PCR从1×106-5×106个培养的动物细胞中抽提出约10-100μg的总RNA。将所得的总RNA溶解在500-1000μL无RNase水中，60-70℃加热1-10min，向其中加入生物素化的Oligo(dT)探针和15-30mL杂交缓冲溶液，冷却至室温，在冷却过程中每隔1-2min轻敲管子底部振荡一次。然后将混合溶液放置在磁力架上，在外磁场作用下收集磁性纳米粒子，再用500-300μL的缓冲溶液洗涤粒子1-5次。向清洗好的粒子中加入50-200μL 60-70℃的去RNase水，粒子重新分散后放置在磁力架上，1-5min后取出清夜，即为含mRNA的水溶液。
对所得的mRNA进行了RT-PCR，扩增片断为β-actin基因，所选引物序列为上游引物5’GCC TTC GCC TTT GCC GAT CC 3’下游引物5’GGATCC TTC ATG AGG TAG TCA GTC 3’实验结果如图3所示。
实施例6将磁性纳米粒子应用于DNA的抽提，并将得到的DNA进行PCR从1×106-5×106个培养的动物细胞中抽提出约100μg的总DNA。将所得的总DNA溶解在500-1000μL无DNase水中，60-70℃加热1-10min，向其中加入生物素化的DNA探针和15-30mL杂交缓冲溶液，冷却至室温，在冷却过程中每隔1-2min轻敲管子底部振荡一次。然后将混合溶液放置在磁力架上，在外磁场作用下收集磁性纳米粒子，再用500-300μL的缓冲溶液洗涤粒子1-5次。向清洗好的粒子中加入50-200μL 60-70℃的去DNase水，粒子重新分散后放置在磁力架上，1-5min后取出清夜，即为含DNA的水溶液。
对所得的DNA进行了PCR，获得阳性的扩增片断p53基因，所选引物序列为上游引物5’TCC GAG TGG AAG GAA AT 3’下游引物5’TCC GAG TGG AAG GAA AT 3’
序列表<110>上海师范大学<120>一种用于核酸分离的磁性纳米粒子复合物及其制法和应用<140>2006100231444<141>2006-04-13<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>β-actin基因片断<222>(1)..(20)<400>1gccttcgcct ttgccgatcc 20<210>2<211>24<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>β-actin基因片断<222>(1)..(24)<400>2ggatccttca tgaggtagtc agtc 24<210>3<211>17<212>DNA
<213>Homo sapiens<220>
<221>p53基因片断<222>(1)..(17)<400>3tccgagtgga aggaaat17<210>4<211>17<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>p53基因片段<222>(1)..(17)<400>4tccgagtgga aggaaat1权利要求
1.一种用于核酸分离的磁性纳米粒子复合物，具备内核和外壳的核壳型结构，包括如下的结构(1)由具有超顺磁性的磁性纳米粒子构成的内核层；(2)包覆内核层的生物学惰性外壳层；(3)外壳层表面为亲和素或抗生物素的修饰层。
2.根据权利要求1所述的用于核酸分离的磁性纳米粒子，其特征在于，所说的生物学惰性外壳层的成分为二氧化硅、琼脂糖、壳聚糖、葡聚糖、糖苷、烯烃聚合物、聚丙烯腈、环氧化合物、或者其组合。
3.根据权利要求2所述的用于核酸分离的磁性纳米粒子，其特征在于，所说的生物学惰性外壳层成分为二氧化硅。
4.根据权利要求1所述的用于核酸分离的磁性纳米粒子，其特征在于，所说的内核层的成分为铁的氧化物、铁、镍、镍-铁合金、或者其组合。
5.根据权利要求4所述的用于核酸分离的磁性纳米粒子，其特征在于，所说的内核层的成分为铁的氧化物。
6.一种权利要求1所述的磁性纳米粒子—亲和素或抗生物素复合物的制备方法，包括以下步骤(1)在含内核层和外壳层的形成剂的微乳液体系中，通过油包水型反相微乳液法，形成核壳型磁性纳米粒子；(2)用固化剂或交联剂对核壳型磁性纳米粒子的表面进行修饰；(3)将亲和素或抗生物素对步骤(2)中修饰好的磁性纳米粒子进行反应。
7.根据权利要求6所述的磁性纳米粒子—亲和素或抗生物素复合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)所说的固化剂或交联剂为聚乙二醇或者戊二醛、甲醛、乙二醛、或冠醚交联剂。
8.根据权利要求6所述的磁性纳米粒子—亲和素或抗生物素复合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所说的形成剂为正硅酸乙酯、琼脂糖、壳聚糖、葡聚糖、糖苷、烯烃化合物、丙稀腈、环氧化合物等。
9.一种权利要求1所述的磁性纳米粒子—亲和素或抗生物素复合物在核酸分离中的应用，包括如下步骤(1)将标记有生物素的核酸探针与含有目标核酸的溶液混合，形成杂交复合物；(2)加入磁性纳米粒子—亲和素或抗生物素复合物，与杂交复合物进行反应；(3)在磁场的引导下分离磁性纳米粒子，并洗脱目标核酸；或者，包括如下步骤(1)将磁性纳米粒子—亲和素或抗生物素复合物与标记有生物素的核酸探针溶液混合，形成探针复合物；(4)加入目标核酸溶液，与探针复合物进行反应；(5)在磁场的引导下分离磁性纳米粒子，并洗脱目标核酸。
10.权利要求9所述的磁性纳米粒子—亲和素或抗生物素复合物在核酸分离中的应用，其特征在于，所说的目标核酸为来自于动物、植物或微生物细胞、病毒、人体组织、动物或人全血中的mRNA、DNA、rRNA或者tRNA。
全文摘要
本发明涉及一种用于核酸分离的磁性纳米粒子复合物及其制备方法和应用，该复合物具有如下的三层结构(1)由具有超顺磁性的磁性纳米粒子构成的内核层；(2)包覆内核层的生物学惰性外壳层；(3)外壳层表面为亲和素或抗生物素的修饰层。本发明还提供该复合物分离核酸特别是mRNA的方法。本发明的磁性纳米粒子分离系统可简单、有效、方便、快捷地分离微量核酸。
文档编号C07H21/00GK1995052SQ20061002314
公开日2007年7月11日 申请日期2006年1月6日 优先权日2006年1月6日
发明者沈鹤柏, 徐文涛, 周海清 申请人:上海柏汇申生物科技有限公司