专利名称：具有人群广谱性的抗肿瘤ctl表位肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤疫苗，尤其是涉及一种具有人群广谱性的抗肿瘤CTL表位肽。
背景技术：
随着肿瘤分子免疫学与分子生物学研究的进展，细胞毒T细胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)介导的特异性细胞免疫成为主要的抗肿瘤机制，研制肿瘤相应的CTL表位肽疫苗，是肿瘤特异性免疫治疗的一种途径，寻找有效的优势CTL表位成为肿瘤特异性免疫治疗及治疗性多肽疫苗研究的重要前提。然而，单一HLA(人类白细胞抗原)限制性CTL表位受MHC(组织相容性复合物)多态性的限制，对不表达该等位基因HLA分子的肿瘤细胞缺乏免疫活性。又由于恶性肿瘤的部分HLA等位基因表达下调，单一HLA限制性表位容易发生免疫逃避而丧失免疫活性。因此，探索HLA多等位基因限制性CTL表位，发展以CTL表位为基础的广谱疫苗，既可以扩大覆盖面又可以降低因HLA表达下调带来的免疫逃避风险。HLA-A2与HLA-A3两个超型在中国人中的总平均分布频率就超过85％，而同一超型识别的肽序列非常相似。因此，采用同时与几种超型具有亲和力的广谱表位就有可能成为覆盖大部分人群的肿瘤表位肽，能够克服MHC多态性的障碍，为研制出覆盖大部分人群的肿瘤表位疫苗奠定基础，但目前还未见诸有关这方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对肿瘤细胞有明显杀伤活性的具有人群广谱性的抗肿瘤CTL表位肽。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案本发明所述的具有人群广谱性的抗肿瘤CTL表位肽，该肽由九个天然氨基酸残基组成，其序列为Ala-Leu-Tyr-Gly-Asp-Ile-Asp-Ala-Val(ALYGDIDAV丙氨酸-亮氨酸-酪氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-缬氨酸)。
选择COX-2(环氧合酶-2)作为目的抗原，氨基酸序列引自GENEBANK。
所述的活性检测材料和试剂为T2A2细胞、T2A3细胞、EC-1、EC-109和EC-9706肿瘤细胞株、RPMI1640培养基、胎牛血清、重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL(白介素)-2、IL-4、IL-7、尼龙毛柱、鼠抗人β2微球蛋白、鼠抗人HLA-A2、异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG、Brefeldin A、HLA-A分型试剂盒、ELISPOT试剂盒。
将T2细胞、EC-1、EC-109和EC-9706细胞株和人PBMC(外周血单核细胞)，采用常规培养细胞的培养条件均为37℃、5％CO2饱和湿度，常规传代。
运用SYFPEITHI预测，再基于结构的表位预测算法(MHC-Pred)结构亲和性分析。初选九肽通过蛋白酶体裂解基序(Proteasomal cleavage motifs)酶切分析进行初筛，经BLAST分析仅与COX-2有同源性。
采用标准Fmoc方案进行合成，经HPLC(高效液相)纯化后，其纯度大于90％，质谱分析证实其分子量符合理论值。
试验分析1、T2细胞结合力试验将本肽(50μg/mL)加入含β2微球蛋白(3μg/mL)的无血清RPMI1640培养基中37℃共孵育18h-24h后，冷PBA(等渗磷酸盐缓冲液)洗涤3次，加100μL稀释度为1∶200的一抗(T2A2细胞加单克隆抗体BB7.2，T2A3细胞加单克隆抗体鼠抗人β2-M)，4℃放置30min。冷PBA洗涤3次后，加50μL稀释度为1∶50的FITC-羊抗鼠IgG溶液，4℃放置30min，洗涤后于流式细胞仪检测。另外，已被鉴定的Flu matrix58-66(GILGFVFTL)和Flu NP265-273(ILRGSVAHK)在该实验中分别作为T2A2和T2A3的阳性肽，PBS(磷酸盐缓冲液)作为阴性对照。结果用荧光系数(FI)表示荧光系数(FI)＝(表位肽平均荧光强度-背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度2、肽/HLA-I复合物稳定性分析本肽(50μg/mL)加入含β2微球蛋白(3μg/mL)的无血清RPMI1640培养基中37℃共孵育18h后，冷PBA洗涤4次，洗净未结合的肽。加入10μg/mL的BrefeldinA孵育1h，洗涤。37℃，5％CO2孵育0、2、4、8h。然后，冷PBA洗涤3次，加一抗(T2A2细胞加单克隆抗体BB7.2，T2A3细胞加单克隆抗体鼠抗人β2-M)，4℃放置30min，冷PBA洗涤3次后，加FITC-羊抗鼠IgG溶液，4℃放置30min，洗涤后于流式细胞仪检测。结果以DC50(即肽/HLA-I复合物的半衰期)表示。
3、树突状细胞的诱导抽取健康供者的外周血，以无菌生理盐水稀释后经Ficoll-Paque密度梯度离心分离，吸取白膜层PBMC，将PBMC在24孔板中贴壁培养，分离贴壁的单核细胞，每孔加2mL含10％FBS(胎牛血清)、100μg/L GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)和50μg/L IL-4的1640培养基，于37℃、5％CO2孵箱中，每三天半量换液，培养至第5天加LPS(脂多糖)(100ng/mL)诱导成熟，48h后收集细胞，用相差显微镜观察DC(树突细胞)诱导培养过程中的细胞形态学变化。
4、成熟DC表型流式细胞仪分析收集第8天的DC并调整细胞浓度为1×106/ml，加入流式细胞检测管，100μL/管，加入标记抗体(anti-CD83-FITC，anti-CD1a-PE，anti-CD80-FITC，anti-HLA-DR-PE)终浓度为5μg/ml，4℃暗处静置标记40min，PBS缓冲液洗2次，以FITC(异硫氰酸荧光素)、PE标记的小鼠IgG作阴性同型对照。每个检测样本所分析细胞数大于10000。
5、尼龙毛柱法分离T淋巴细胞及其纯度鉴定抽取健康供者的外周血，以无菌生理盐水稀释后经Ficoll-Paque密度梯度离心分离PBMC，使PBMC在24孔板中贴壁，收集未贴壁细胞，用RPMI1640培养液调整细胞数为5×107/mL，将细胞悬液加到尼龙毛柱中，37℃、5％CO2饱和湿度条件下孵育1h，用预温37℃的RPMI1640培养液洗柱2次，洗脱液中富含T淋巴细胞，经α-乙酸萘酯酶(ANAE)染色法鉴定T淋巴细胞纯度。
6、肿瘤细胞HLA-I类分型HLA-I类分型实验使用分型试剂盒。HLA基因分型采用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)的方法进行分型。基本步骤为提取肿瘤细胞EC-1，EC-109和EC-9706的DNA后，用序列特异性引物进行常规PCR扩增，琼脂糖电泳观察结果，进行HLA-A位点表型分析。结果EC-1为HLA-A3+，EC-109为HLA-A3+，EC-9706为HLA-A68+(属HLA-A2超型)。
7、RT-PCR检测COX-2在肿瘤细胞株中的表达引物的序列如下β-actinsense5′ACC AAC TGG GAC GAC ATG GAG AAA ATC 3′，antisense5′GTA GCC GCG CTC GGT GAG GAT CTT CAT 3′；COX-2sense5′ACCAAC TGGGAC GAC ATG GAG AAA ATC 3′，antisense5′GTA GCC GCG CTC GGT GAG GAT CTTCAT 3′。β-actin和COX-2目的片段的长度分别为409bp和242bp。PCR条件如下95℃变性10min后，循环开始，94℃变性60s→55℃退火60s→72℃延伸60s，共30个循环，最后72℃延伸10min。RT-PCR结果EC-1和EC-9706细胞都表达COX-2蛋白，而EC-109细胞未检测到表达COX-2蛋白。
8、细胞毒T淋巴细胞的体外诱导DC诱导至第5天，加入待测肽，浓度达到50μg/mL，同时加入脂多糖(LPS，100ng/mL)，第7天收获DC，调整细胞数为1×105mL-1。尼龙毛柱分离新鲜T淋巴细胞，调整细胞数为1×106mL-1，于24孔板中加入1×105/孔T淋巴细胞作为反应细胞，1×103/孔DC作为刺激细胞，第2天加IL-2至100U/mL，每孔体积1mL，置37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，每三天半量换液。用肽负载的DC按前述方法再重复刺激1次，再次加入CTL中。第12天收获CTL用于细胞毒实验。
9、细胞毒实验诱导的CTL作为效应细胞，EC-1、EC-109和EC-9706癌细胞作为靶细胞，按效靶比20∶1加入96孔板中，靶细胞每孔1×103个，设单独靶细胞孔和单独CTL孔，每组3复孔，每孔200μL，置37℃5％CO2，饱和湿度条件下培养4h，MTT(噻唑蓝)法检测各孔A570nm值。
按以下公式计算杀伤率杀伤率＝[1-(试验孔A值-效应细胞孔A值)/靶细胞孔A值]×100％
细胞毒实验结果对于COX-2+食管癌细胞株EC-1(HLA-A3+)和EC-9706(HLA-A68+)，本肽有明显的杀伤活性(P＜0.01)，对于COX-2-食管癌细胞株EC-109(HLA-A3+)，本肽也有一定的杀伤活性(P＜0.05)。
10、分泌IFN-γ(干扰素)的T细胞数的检测采用ELISPOT试验。靶细胞分别为EC-1、EC-109和EC-9706。各靶细胞的密度均为1×103/mL，效靶细胞的比例为20∶1，将靶细胞和效应细胞各取100μL，加入到预先包被了抗IFN-γmAb的96孔平底板中，于37℃、5％CO2孵箱中培养24h，参照ELISPOT试剂盒中的说明书进行洗板后，依次加入生物素标记的抗IFN-γ多抗、碱性磷酸酶标记的链亲合素及显色剂BCIP/NBT等。用ELISPOT图象分析仪计数96孔板中每孔形成的斑点数，计算斑点数/1×105CTL和分泌IFN-γ的T细胞的百分率。
ELISPOT检测抗原特异性CTL中分泌IFN-γ的细胞数ELISPOT试验的结果显示，本肽诱导的CTL对COX-2+的EC-1(HLA-A3+)和EC-9706(HLA-A68+)细胞提呈的抗原能发生应答而活化，并能分泌IFN-γ的T细胞的百分率0.293％和0.415％明显高于对照组0.169％和0.220％(P＜0.05)。
表1本肽介导的CTL细胞毒试验结果
*P＜0.05**P＜0.01EC-1COX-2+HLA-A3+；TE-1COX-2+HLA-A2+；EC109COX-2-HLA-A3+表2本肽介导的CTL的IFN-γELISPOT检测结果
*P＜0.05**P＜0.01本发明的优点在于1、突破MHC多态性限制，能同时被HLA-A2和HLA-A3提呈；2、对上皮组织肿瘤具有普遍适应性；3、对其它表达COX-2的肿瘤也同样适用。
图1是本发明的质谱分析结果图。
图2是本发明的肽/HLA-I结合力及稳定性结果图。
具体实施例方式
本发明所述的具有人群广谱性的抗肿瘤CTL表位肽，选择COX-2(604aa)作为目的抗原，氨基酸序列引自GENEBANK。
T2A2细胞、T2A3细胞、EC-1、EC-109和EC-9706肿瘤细胞株均为本实验室常规保存。RPMI1640培养基购自GIBCO公司，胎牛血清购于Hyclone公司，重组人GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-7购于R&D公司，尼龙毛柱购于Wako公司，鼠抗人β2微球蛋白购于Biolegend公司，鼠抗人HLA-A2(BB7.2)、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG及Brefeldin A购于Sigma公司。HLA-A分型试剂盒购于BAG公司，ELISPOT试剂盒购于Millipore公司。
合成方法本肽的合成采用标准Fmoc方案进行合成ALYGDIDAV第一步C端第一个氨基酸V接到Wang树脂上，1.称Wang树脂0.3克置于合成仪中，先用DMF溶胀十分钟。
2.称量Fmoc-Val0.4254g(2.5eq)Hobt0.1694g(2.5eq)DIC0.1528mL加入合成仪，搅拌10分钟加入DMAP0.1531g(0.5eq)搅拌4小时3.洗涤DMF 2分钟2次，MeOH 2分钟3次，DCM 2分钟3次，DMF 2分钟2次。
4.封头醋酸酐∶吡啶＝1∶1，搅拌30分钟5.洗涤同步骤36.取出树脂，干燥过夜，称重0.8357g7.计算取代值(loading)Loading＝(W2-W1)/(MWa-MWb)/W1(mmol/g)其中W1＝树脂重量W2＝Fmoc-氨基酸—树脂的重量MWa＝Fmoc-氨基酸分子量MWb＝18
第二步加第二个氨基酸A1.脱保护20％哌啶/DMF溶液2×15min，2.洗涤同上3.自由氨基检测试剂A5％茚三酮乙醇溶液(g/L)试剂B0.1％KCN 2mL加入98mL吡啶液试剂C80％苯酚乙醇溶液按顺序加入三种试剂1∶2∶1，沸水浴。显蓝色表示自由氨基酸阳性。
检测结果深蓝色4.Fmoc-Ala-OH0.2578g(2.5eq)Hobt0.1119g(2.5eq)DIC0.1045mL(2.5eq)5.搅拌4小时6.洗涤同上7.自由氨基检测黄色第三步加第三个氨基酸D(Otbu保护)1、脱保护20％哌啶/DMF溶液2×15min，2、洗涤同上3、自由氨基检测结果蓝色4、Fmoc-Asp(Otbu)-OH0.3407g(2.5eq)Hobt0.1119g(2.5eq)DIC0.1045mL(2.5eq)5、搅拌4小时6、洗涤同上7、自由氨基检测黄色第四步加第四个氨基酸I1、脱保护20％哌啶/DMF溶液2×15min，2、洗涤同上3、自由氨基检测结果蓝色4、Fmoc-Ile-OH0.2926g(2.5eq)Hobt0.1119g(2.5eq)DIC0.1045mL(2.5eq)5、搅拌4小时6、洗涤同上7、自由氨基检测黄色第五步加第五个氨基酸D(Otbu保护)1.脱保护20％哌啶/DMF溶液2×15min，2.洗涤同上3.自由氨基检测结果蓝色4、Fmoc-Asp(Otbu)-OH0.3407g(2.5eq)Hobt0.1119g(2.5eq)DIC0.1045mL(2.5eq)5、搅拌4小时6、洗涤同上7、自由氨基检测黄色第六步加第六个氨基酸G1.脱保护20％哌啶/DMF溶液2×15min，2.洗涤同上3.自由氨基检测结果蓝色4.Fmoc-Gly-OH0.2462g(2.5eq)Hobt0.1119g(2.5eq)DIC0.1045mL(2.5eq)5、搅拌4小时6、洗涤同上7、自由氨基检测黄色第七步加第七个氨基酸Y1.脱保护20％哌啶/DMF溶液2×15min，2.洗涤同上3.自由氨基检测结果蓝色4.Fmoc-Tyr-OH0.3858g(2.5eq)Hobt0.1119g(2.5eq)DIC0.1045mL(2.5eq)5.搅拌4小时6.洗涤同上7.自由氨基检测黄色第八步加第八个氨基酸L1.脱保护20％哌啶/DMF溶液2×15min，2.洗涤同上3.自由氨基检测结果蓝色
4.Fmoc-Leu-OH0.2926g(2.5eq)Hobt0.1119g(2.5eq)DIC0.1045mL(2.5eq)5.搅拌4小时6.洗涤同上7.自由氨基检测黄色第九步加第九个氨基酸A1.脱保护20％哌啶/DMF溶液2×15min，2.洗涤同上3.自由氨基检测结果蓝色4.Fmoc-Ala-OH0.2578g(2.5eq)Hobt0.1119g(2.5eq)DIC0.1045mL(2.5eq)5.搅拌4小时6.洗涤同上7.自由氨基检测黄色第十步从树脂上切割1.脱保护20％哌啶/DMF溶液2×15min，2.洗涤同上3.自由氨基检测结果蓝色4、冰浴下配切割试剂10mL(TFA8.25mL+水0.5mL+苯酚0.5mL+苯甲硫醚0.5mL+乙二硫醇0.25mL)5.抽虑，少量TFA洗涤6.收集抽虑后产物，缓慢加入预冷乙醚，剧烈振荡，封口，-20℃过夜7.布氏漏斗抽虑，冰乙醚洗涤至衡重8.干燥，称重9.产率47.7％。
权利要求
1.一种具有人群广谱性的抗肿瘤CTL表位肽，其特征在于该肽由九个天然氨基酸残基组成，其序列为Ala-Leu-Tye-Gly-Asp-Ile-Asp-Ala-Val。
2.根据权利要求1所述的具有人群广谱性的抗肿瘤CTL表位肽，其特征在于选择COX-2作为目的抗原，氨基酸序列引自GENEBANK。
3.根据权利要求1或2所述的具有人群广谱性的抗肿瘤CTL表位肽，其特征在于所述的活性检测材料和试剂为T2A2细胞、T2A3细胞、EC-1、EC-109和EC-9706癌细胞株、RPMI1640培养基、胎牛血清、重组人GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-7、尼龙毛柱、鼠抗人β2微球蛋白、鼠抗人HLA-A2、异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG、Brefeldin A、HLA-A分型试剂盒、ELISPOT试剂盒。
全文摘要
本发明公开了一种具有人群广谱性的抗肿瘤CTL表位肽，该肽由九个天然氨基酸残基组成，其序列为Ala－Leu－Tyr－Gly－Asp－Ile－Asp－Ala－Val(ALYGDIDAV丙氨酸－亮氨酸－酪氨酸－甘氨酸－天冬氨酸－异亮氨酸－天冬氨酸－丙氨酸－缬氨酸)。选择COX－2(环氧合酶－2)作为目的抗原，氨基酸序列引自GENEBANK。本发明的优点在于1.突破MHC多态性限制，能同时被HLA－A2和HLA－A3提呈；2.对上皮组织肿瘤具有普遍适应性；3.对其它表达COX－2的肿瘤也同样适用。
文档编号C07K7/06GK101066990SQ20071005430
公开日2007年11月7日 申请日期2007年4月27日 优先权日2007年4月27日
发明者祁元明, 孙战强, 陈鲤翔, 李永欣, 祁峰, 娄慧萍, 李静静, 胡红敏 申请人:郑州大学