专利名称：一种新型阳离子类脂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的单链阳离子类脂及其制备方法和在荷基因纳米载体中的应用，属 于化学技术领域。
背景技术：
基因治疗是现代癌症治疗的热点，并且正在逐步变成现实。基因治疗的主要目的是成功 的将遗传物质传递到目标组织、器官或者细胞。然而裸露的治疗基因容易被核酸酶降解，表 现出很差的细胞摄取效率。因此制备安全高效的基因载体就成为成功的基因治疗的一个必要 条件。
病毒载体可以有效的转染遗传物质进入宿主细胞，但是它们有很多不足，比如容易致癌， 致突变，可能诱导免疫应答从而使得转基因表达消失。因此人们越来越多的把目光投向了非 病毒载体。非病毒载体中的纳米载体有一系列的工艺优势，比如制备简单，储存稳定，耐热 压灭菌和冷冻干燥等等。阳离子纳米载体由于可以静电吸附基因，构成稳定的荷基因纳米复 合物而日益得到了广泛的研究。目前的研究主要集中在体外实验，毒性仍然是这类载体应用 于基因治疗的主要障碍，而载体的毒性则主要取决于制备过程中使用的阳离子类脂。
单链阳离子类脂，如溴化十六垸基三甲铵(CTAB)，被作为表面活性剂广泛用于多种纳 米载体的制备，其制备的阳离子纳米载体展现出较强的荷基因能力和较高的转染效率。但是 据报道单链的阳离子脂质和双链的相比毒性较高，影响了细胞的耐受和基因的转染。有学者 指出，含有酯键的单链阳离子脂质由于可以易生物降解和代谢，毒性则会大大降低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效低毒的单链阳离子类脂；本发明的另一 目的在于提供该 单链阳离子类脂的制备方法；本发明的再一目的在于应用该单链阳离子类脂作为表面活性剂 用于荷基因纳米载体的构建。
本发明的技术方案是
本发明合成了一种作为乳化剂的单链阳离子类脂，具有如下结构通式
O O
式(IV)
其中n为4一12的整数，R为碳原子数为8 — 20的直链垸烃基团。
优选的，n为5 — 8， R为10_14的直链烷烃基团；更优选地，n为6， R为12的直链烷 烃基团。
本发明单链阳离子类脂的制备方法包括如下步骤
4式(IV)
(1) 赖氨酸在碱性条件下加入二碳酸二叔丁酯(Boc)保护氨基，得式(I)所示二碳酸 二叔丁酯(Boc)保护的赖氨酸；于二碳酸二叔丁酯(Boc)保护的赖氨酸中加入直链烷烃的 二醇混合用无水二氯甲垸溶解，在催化剂4-二甲氨基吡啶，脱水剂l-乙基-(3-一-甲基氨基 丙基)碳二亚胺盐酸盐和三乙胺或者N， N' -二环己基碳二亚胺的混合物作用下反应，形成第一
个酯键，得到式(n)的产物；
(2) 于甘氨酸垸基二醇酯中加入垸酸用无水二氯甲垸溶解，在催化剂4-二甲氨基吡啶， 脱水剂l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和三乙胺或者N， N' -二环己基碳二亚胺 的混合物作用下反应，形成第二个酯键，得式(ni)中的产物之后用硅胶柱分离纯化，加 入饱和浓盐酸反应脱去二碳酸二叔丁酯(Boc)保护基得式(iV)中最终的产物。本发明单链阳离子类脂的制备方法优选的包括如下步骤
(1) 赖氨酸用l一3mol/L的氢氧化钠溶解，二碳酸二叔丁酯(Boc)用四氢呋喃稀释后滴加进入赖氨酸溶液中，冰浴反应1 —3小时，之后室温反应，每隔2 — 5小时加入氢氧化钠控制pH值在8 — 9，反应24 — 48小时后，萃取分离，减压蒸干水，即得二碳酸二叔丁酯(Boc)保护的赖氨酸；
(2) 二碳酸二叔丁酯(Boc)保护的赖氨酸和直链烷烃的二醇混合，加入催化剂4-二甲氨基吡啶，脱水剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和三乙胺或者N,N'-二环己基碳二亚胺的混合物，用无水二氯甲烷溶解，冰浴反应1一3小时，再室温搅拌24 — 72小时
后，同(i)中后处理得到式(n)的产物；
(3) 上述(2)中产物加入烷酸，催化剂4-二甲氨基吡啶，脱水剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和三乙胺或者N， N' -二环己基碳二亚胺的混合物，用无水二氯甲垸溶解，冰浴反应1一3小时，再室温搅拌24 — 72小时后，同(1)中后处理得式(III)中的产物；
(4) 上述(3)中所得产物用硅胶柱分离纯化后，加入3mol/L的浓盐酸，冰浴下搅拃8一12小时脱去二碳酸二叔丁酯(Boc)保护基，得最的产物。
本发明中所述的宇智阳离子类脂用做表面活性剂制备纳米载体，使用该类脂、固体脂质或多聚物、乳化剂，构建多种纳米载体，包括脂质体、固体脂质纳米粒、聚乳酸纳米粒、聚乳酸乙醇酸共聚物纳米粒、聚乳酸一聚乙二醇纳米粒、聚乙烯亚胺一聚乙二醇纳米粒、多聚赖氨酸纳米粒、聚乙二醇一聚己内酯嵌段共聚物纳米粒等等。各成分用量如下含类脂IO一30mg的双蒸水溶液15 — 30mL，固体脂质或者多聚物15 — 30mg，乳化剂5 — 25mg。
上述的固体脂质选自硬脂酸、棕榈酸、胆固醇、单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、山榆酸甘油酯、三月桂酸甘油酯等材料之一或者它们的组合。
上述的多聚物选自聚乳酸、聚己内酯、多聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、聚乳酸/乙醇酸共聚物等材料之一或者它们的组合或嵌段共聚物。
上述的乳化剂选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、羊脑卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰乙醇胺以及合成磷脂二棕榈酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱，泊洛沙姆、泰洛沙姆等材料之一或者它们的组合。
本发明中所述的纳米载体的制备方法如下
方法一溶剂扩散法。将固体脂质或多聚物和乳化剂溶解于有机溶剂构成有机相，将单链阳离子类脂溶于双蒸水中构成水相，将有机相匀速滴加到水相，搅拌下挥发有机溶剂后得纳米载体混悬液。
方法二溶剂乳化—挥发法。将固体脂质或多聚物和乳化剂溶解于与水不相混溶的有机
溶剂构成有机相，加入溶解有单链阳离子类脂的水相中，搅拌下挥发有机溶剂后得纳米载体混悬液。
方法三薄膜分散法。将固体脂质或多聚物和乳化剂溶解于有机溶剂中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，形成一层脂质薄膜,加入含有单链阳离子类脂的水溶液，后进行超声分散。
方法四微乳法。将固体脂质或多聚物、乳化剂和单链阳离子类脂混合溶于水形成透明
的微乳体系，在将其迅速分散到冷水(2 — 3'C)中得纳米载体混悬液。上述方法中的有机溶剂，选自丙酮、二氯甲垸、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、乙醚中的一种或者它们的组合。
本发明所述的纳米载体用于制备荷基因纳米载体将DNA./RNA (如报告基因一增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)等)和所制备的纳米载体混合涡旋5 — 20秒，后静置室温孵育20 —40分钟。即得荷基因纳米复合物。
上述荷基因纳米复合物的制剂制备将所得的纳米复合物混悬液梯度通过微孔滤膜过滤后，加入冻干保护剂(如甘露醇)后，冷冻干燥，得冻干制剂。
本发明制得的单链阳离子类脂及其作为表面活性剂制备的荷基因纳米复合物的优点如
卜、
(1) 该类脂制备方法简单，水溶性好，表面活性强，毒性低，为制备高效安全的荷基因纳米载体提供了前提条件。
(2) 该类脂可以作为表面活性剂用于制备各种材料的阳离子型纳米载体，为纳米载体的制备提供了-种通用的材料。
(3) 使用该类脂制备的各种纳米载体，表面形态圆整光滑，粒径较小，粒度分布集中，可静电吸附目的基因于其表面.结合能力强，可以耐核酸酶降解和抵抗血浆蛋白的结合，并控制其缓慢释放。
(4) 使ffi该类脂制备的荷基因纳米复合物作用于多种肿瘤细胞，表现出较低的细胞毒性和较高的转染效率。
(5) 使用该类脂制备的荷基因纳米复合物还可以在其表面连接靶向因子，进行多种多样的主被动靶向修饰，从而进一步提高其基因治疗效果。
(6) 使用该类脂制备的荷基因纳米复合物可以通过冷冻干燥方法进行制剂，提高了复合物储存和运输的稳定性，延长了保质期。
图1是本发明制备的空白固休脂质纳米粒的透射电镜照片，放大io万倍。
图2是本发明制备的荷基因固体脂质纳米粒的透射电镜照片，放大10万倍。图3是荷基因固体脂质纳米粒的体外释放曲线图。
图4是荷基因固体脂质纳米粒的体外肿瘤细胞(A549细胞)中转染的荧光倒置显微镜照片。
图5是荷基因固体脂质纳米粒的体外肿瘤细胞(Hela细胞)屮转染的荧光倒置显微镜照片。
具体实施例方式
实施例l.十二垸酸6— (2， 6 — 二氨基一己酰氧基)己酯(LHLN)的合成称取赖氨酸(Lys) 15g (约O. lmol)，加入lmol/L的氢氧化钠200mL (0.2图1)溶解，冰浴下滴加四氢呋喃溶解的氨基保护剂二碳酸二叔丁酯(Boc)，控制pH值8 — 9，室温下搅拌反应24小时。萃取后减压蒸干水，得二碳酸二叔丁酯保护的赖氨酸(Boc — Lys)。称取二碳酸二叔丁酯保护的赖氨酸(Boc — Lys) 35g (约0. lmol)和己二醇11. 8g (0. lmol)混合，无水二氯甲烷溶解，冰浴下加入催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP) 2.44g (0.02mol)和脱水剂N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC) 22.66g (0. llmol)，室温下搅拌反应24小时。萃取后减压 蒸干水。再加入月桂酸20g (0. lmol)，无水一氯甲烷溶解，同上加入4-二甲氨基吡啶(DMAP) 2.44g和N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC) 22. 66g，室温下搅拌反应24小时，过硅胶柱分离 纯化，加入适量浓盐酸，冰浴下搅拌10小时脱去二碳酸二叔丁酯(Boc)保扩基，所得溶液 经二氯甲烷洗涤后，用氢氧化钠溶液调节pH至10，用二氯甲烷萃取，所得二氯甲垸萃取液 真空干燥后得白色粉末状十二垸酸6— (2， 6 — 一氨基一己酰氧基)己酯(LHLN) 35. 8g。 产率83.6%。产物在干燥器中放置6个月，性状未发生任何变化。
对目标化合物LHLN以质谱和核磁共振波谱进行结构确证'HNMR (CDC13， 300 MHZ) : 0. 88 [t， 3H， CHJ， 1.20 - 1.69 [m， 32H， 16*(CH2)]， 1.84 [d, 2H, NH2]， 2.10 [broads, 2H' 亂],2.28 [t， 2H' C0CH2], 3.19 [q, 2H, CH2N]， 3.66 [q， 1H， CHN], 4.05 [t， 2H, CH細]， 4.14 [t, 2H， CH20C0]. ESI—MS: m/z=429. 6 (100%， M+， C24H4 N204=428 . 65). 采用芘荧光探针光谱法测定LHLN的临界胶束浓度(CMC)为O. 11ramol/L。 实施例2.十四垸酸6— (2， 6 — 二氨基一己酰氧基)己酯的合成
称取赖氨酸(Lys) 15g (约0. lmol)，加入1图1/L的氢氧化钠200mL (0. 2m。1)溶解， 冰浴下滴加四氢呋喃溶解的氨基保护剂二碳酸二叔丁酯(Boc)，控制pH值8 — 9，室温下搅 拌反应24小时。萃取后减压蒸干水，得二碳酸二叔丁酯保护的赖氨酸(Boc — Lys)。称取一 碳酸二叔丁酯保护的赖氨酸(Boc-Lys) 35g (约0. lmol)和己二醇11. 8g (0. lmol)混合， 无水二氯甲垸溶解，冰浴下加入催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP) 2.44g (0.02mol)和脱水剂 N，N'-二环己基碳二亚胺(DCC) 22.66g (0. llmol)，室温下搅拌反应24小时。萃取后减压 蒸干水。再加入肉豆蔻酸22. 8g (0. lmol)，无水二氯甲烷溶解，同上加入4-二甲氨基吡啶 (DMAP) 2.44g和N，N'-二环己基碳二亚胺(DCC) 22. 66g，室温下搅拌反应24小时，过硅 胶柱分离纯化，加入适量浓盐酸，冰浴下搅拌IO小时脱去二碳酸二叔丁酯(Boc)保护基， 所得溶液经二氯甲烷洗涤后，用氢氧化钠溶液调节pH至10，用二氯甲烷萃取，所得二氯甲 烷萃取液真空干燥后得白色粉末状产物37.2g。产率81.4%。产物在干燥器中放置6个月， 性状未发生任何变化。
对目标化合物以质谱进行结构确证ESI-MS: m/z=457.8 (100°/。， M+' C26H52N204=456.7).
采用芘荧光探针光谱法测定目标化合物的临界胶束浓度(CMC)为O. 17mmol/L。 实施例3.十六垸酸8— (2, 6 — 二氨基一己酰氧基)辛酯的合成
称取赖氨酸(Lys) 15g (约O. lmol)，加入lmol/L的氢氧化钠200mL (0.2,1)溶解， 冰浴下滴加四氢呋喃溶解的氨基保护剂二碳酸二叔丁酯(Boc)，控制pH值8 — 9，室温下搅 拌反应24小时。萃取后减压蒸干水，得二碳酸二叔丁酯(Boc)保护的赖氨酸(Boc — Lys)。 称取二碳酸二叔丁酯保护的赖氨酸(Boc — Lys) 35g (约0. lmol)和辛二醇14. 6g (0. lmol) 混合，无水二氯甲垸溶解，冰浴下加入催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP) 2.44g (0.02mol)和 脱水剂N，N'-二环己基碳二亚胺(DCC) ".66g (0. llmol)，室温下搅拌反应24小时。萃取 后减压蒸干水。再加入棕榈酸25. 6g (0. lraol)，无水二氯甲垸溶解，同上加入4-二甲氨基 吡啶(DMAP) 2. 44g和N，N'-二环己基碳二亚胺(DCC) 22. 66g，室温下搅拌反应24小时， 过硅胶柱分离纯化，加入适量浓盐酸，冰浴下搅拌10小时脱去二碳酸二叔丁酯(Boc)保护 基，所得溶液经二氯甲烷洗涤后，用氢氧化钠溶液调节PH至10，用二氯甲烷萃取，所得二氯甲垸萃取液真空干燥后得白色粉末状产物40.2g。产率78.4%。产物在干燥器中放置6个 月，性状未发生任何变化。 对目标化合物以质谱进行结构确证ESI-MS: m/z=514. 1 (100%, M+, C3。H6。N204=512. 8).
采用芘荧光探针光谱法测定目标化合物的临界胶束浓度(CMC)为0.20mmol/L。
实施例4.固体脂质纳米粒混悬液的制备 称取单硬脂酸甘油酯20mg,卵磷脂15mg，混合后加入3mL丙酮超声溶解，作为有机相。称取 20mg实施例l中的十二烷酸6— (2， 6 —二氨基一己酰氧基)己酯(LHLN)溶解于20mL双蒸 水中，作为水相。将有机相以12mL/h的速度匀速注入600r/min搅拌的水相中。继续以400r/tnin 搅拌6小时将有机溶剂挥发完全，调节pH值为7. 2 — 7. 4，得到阳离子固体脂质纳米粒混悬液。
实施例5:固体脂质纳米粒混悬液理化性质的研究
取实施例4中的固体脂质纳米粒混悬液滴至铺有碳膜的铜网上，静置2min，用滤纸吸十 混悬液，再滴加质量浓度为^磷钨酸负染2mm，于透射电镜下观察纳米粒的形态并拍照。另 取纳米粒的混悬液适量，经适当稀释后用Zetasizer 3000 HS纳米粒度分析仪测定平均粒径 和多分散度。再取纳米粒混悬液适量，适当稀释后用纳米粒度分析仪测定zeta电位。
透射电镜下观察的纳米粒形态为球形或类球形实体颗粒，分布均匀，无聚集粘联现象， 见图l。粒径52. 6±6. 5nm，粒度分布O. 12±0. 03， Zeta电位36. 47± 1. 48mV。
实施例6:用固体脂质纳米粒混悬液制备荷基因固体脂质纳米粒
取适量增强型绿色荧光蛋白基因(pEGFP)和实施例4中的固体脂质纳米粒混悬液涡旋混 合均匀，室温放置孵育30min,得荷基因固体脂质纳米粒混悬液。
实施例7:采用实施例6中的荷基因固体脂质纳米粒混悬液进行理化性质的研究 方法同实施例5。纳米粒形态为球形或类球形颗粒，分布均匀，无聚集粘联现象，见图2。 粒径75. 8±9. 3歷，粒度分布O. 15±0. 02， Zeta电位18. 27±0. 96mV。
实施例8:采用实施例6中的荷基因固体脂质纳米粒混悬液进行基因结合率研究 用琼脂糖凝胶电泳阻滞实验验证荷基因固体脂质纳米粒的形成及电荷性质。取纳米粒/ 绿色荧光蛋白基因(pEGFP)质量比(固定绿色荧光蛋白基因(pEGFP)的量为0.5y g)分别为l:l; 5:1; 10:l的复合物和绿色荧光蛋白基因(pEGFP)溶液适量(相当于pEGFPO. 5u g)，用O. 8%琼 脂糖凝胶进行电泳分析(9V/cm， 20min)， 245nm紫外灯下观察。另取荷基因纳米复合物离心 后，取上清，用PicoGreen荧光法测定上清液中游离基因的浓度，按公式"DNA结合率二 (总 的DNA量-游离DNA量)/总的DNA量X100。/。"计算DNA结合率。
结果显示纳米粒/绿色荧光蛋白基因(pEGFP)为10: l时，复合物结合后滞留在加样孔中， 泳道前方几乎没有游离绿色荧光蛋白基因(pEGFP)。定量测定载基因率为90. 36%，由此可知制 备的阳离子纳米粒能够较为完全的结合绿色荧光蛋白基因(pEGFP)并形成较为稳定的荷基因
固体脂质纳米复合物。
实施例9:采用实施例6中的荷基因固体脂质纳米粒混悬液进行体外释放研究 采用恒温振荡摇床法进行荷基闲固体脂质纳米粒混悬液的体外释放实验，用O. lmol/L的 磷酸盐缓冲液(pH7.4)和150mmol/L的氯化钠组成的混合溶液为释放介质。精密量取荷基因 固体脂质纳米粒混悬液150y 1，加入等体积的释放介质，37。C水浴恒温振荡(100iVmin)。 在预设时间点取样，15000r/min离心20min，取上清100ul，测定DNA含量，并计算释放百分 含量，绘制释放曲线。
9结果表明在该复合物释放pEGEP在10小时内为一个相对速释的过程，之后直到72小时内 缓慢释放达到完全，见图3。曲线可以拟合为Weibull方程lnln[1/(1-Q%)]=0.6241nt-1.9625， R2=0.9969。其中t为时间，QX为释放百分率。
实施例10:采用实施例6中的荷基因固体脂质纳米粒混悬液进行抗核酸酶能力考察 精密量取100ul荷基因固体脂质纳米粒混悬液3等份(含质粒DNA 0.5yg)，加入脱氧 核糖核酸酶I (DNase I )形成不同的酶终浓度(0.1、 0.2、 0.4U/ygDNA)，混匀。另取裸绿 色荧光蛋白基因(pEGFP)lPg加入脱氧核糖核酸酶I (DNaseI) (0. 1U/y g DNA)，混匀。将各 混合体系置于37。C水浴恒温振荡器上孵育120min后加EDTA终止反应，纳米粒组使用终浓度为 1X的肝素抽提体系中的绿色荧光蛋白基因(pEGFP)，与未经处理的裸绿色荧光蛋白基因(pEGFP) 同时进行琼脂糖凝胶电泳阻滞分析(9V./cm， 20min)。
结果显示，裸绿色荧光蛋白基因(pEGFP)与低浓度的脱氧核糖核酸酶I (DNa化I) (0. lU/ug DNA)孵育后几乎完全降解，指示了核酸酶的生物活性，而荷基因固体脂质纳米 粒混悬液在37'C与不同浓度的脱氧核糖核酸酶I (DNase I )孵育120min后，随着酶浓度的增 加，绿色荧光蛋白基因(pEGFP)发生降解情况略有增加，其超螺旋结构明显减少，但仍能保持 较完整的结构，表明在一定的核酸酶浓度范围内，该纳米粒能够保护所载绿色荧光蛋白基因 (pEGFP)，具有抵抗核酸酶降解的能力。
实施例ll:采用实施例6中的荷基因固体脂质纳米粒混悬液进血浆稳定性考察 分别取裸绿色荧光蛋白基因(pEGFP)l份，荷基因固体脂质纳米粒混悬液2等份，其中裸 绿色荧光蛋白基因(pEGFP)和l份混悬液分别加入等体积2(^的人血浆，涡旋混匀，37。C孵育2h， 加入3 yl 0. 5M乙二胺四乙酸(FJ)TA) (pH 8.0)室温放置IO min终止反应，与未处理的另l 份纳米粒和裸绿色荧光蛋白基因(pEGFP)同时进行琼脂糖凝胶电泳阻滞分析。 实施例12:采用实施例4中的固体脂质纳米粒混悬液进细胞毒性实验 采用MTT法测定固体脂质纳米粒的细胞毒性。将人肺腺癌细胞系A549细胞接种于96孔 培养板中，密度约为8乂103个/孔，过夜，分别加入200 yl由不含血清的RPMI 1640培养 基稀释而成的不同浓度的固体脂质纳米粒混悬液；宫颈癌细胞系Heia细胞接种于96孔培养 板中，密度约为1Xl(T个/孔，过夜，分别加入200 P 1由不含血清的DMEM培养基稀释而成 的不同浓度的固体脂质纳米粒混悬液。以转染剂量的商品化阳离子脂质体Lipofectamine 2000作为阳性对照，同时设空白对照和阴性对照孔，每组重复3次，孵育24小时，加入噻 唑蓝(MTT)终止培养，吸弃孔内培养上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)，振荡使结晶物充分溶 解。用酶标仪在570 nm处测定其吸光度，按下式计算细胞存活率 细胞存活率(％) = (A样品-A空白)/ (A对照-A空白)X 100%
其中A样品为加入纳米粒或Lipofect柳ine 2000后细胞的吸光度；A对照为阴性对照孔细胞 的吸光度；A扣为空白对照孔细胞的吸光度。
结果表明，与Lipofectamine 2000相比，在所考査浓度范围内，纳米粒组的细胞平均 存活率均在80 120%之间，纳米粒基本无毒，细胞存活率较高，显著高于商品化的阳离子脂 质体Lipofectamine 2000 (p<0. 05)。
实施例13:采用实施例6中的荷基因固体脂质纳米粒混悬液进行体外细胞转染实验
A549细胞用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基进行常规培养，转染前24小时，在 24孔培养板上接种细胞数为8X IOV孔；Ilela细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基进行
10常规培养，转染前24小时，在24孔培养板上接种细胞数为1X107 L。 PBS冲洗细胞2次， 分别加入0.5ml培养基稀释的荷基因固体脂质纳米粒混悬液(含有质粒lug)。两者于37°C， 5%0)2孵箱中培养4小时，移去介质，加入培养基培养至转染开始后的48小时为止，利用 倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。同时采用裸pEGFP作为阴性对照(lug pEGFP/孔)，以Lipofectamine 2000作为阳性对照(1 H g pEGFP/孔)，操作按试剂盒说明书 进行。每个试验组设定三个复孔，所有试验平行操作三次。
体外转染实验结果如图4和图5所示。与裸绿色荧光蛋白基因(pEGFP)相比，荷基因固体 脂质纳米粒混悬液在A549细胞和Hela细胞中的转染效果显著提高。24小时荷基因固体脂 质纳米粒组的绿色荧光蛋白表达量略低于阳离子脂质体Lipofectamine 2000。这有可能是由 于荷基因固体脂质纳米粒具有一定的缓释能力，延缓了绿色荧光蛋白基因(pEGFP)的释放，从 而短期内绿色荧光蛋白表达量偏低。然而，48小时基因固体脂质纳米粒组的绿色荧光蛋白 表达量显示出与阳离子脂质体Lipofectamine 2000相当的绿色荧光蛋白表达量。从而证明 达到了良好的转染效果。
实施例14:采用实施例6中的荷基因固体脂质纳米粒混悬液进行冻干制剂研究 取荷基因固体脂质纳米粒混悬液用4000rpra离心20min，弃上清液，所得沉淀加入等体 积双蒸水涡旋分散，将得到的荷基因固体脂质纳米粒混悬液梯度通过0. 8, 0. 45和0. 22微 孔滤膜过滤后，加入5%甘露醇作为冻干保护剂在在-8(TC超低温冰箱预冻12h，再在-60'C 下冷冻干燥48h即可。
权利要求
1. 一种单链阳离子类脂，其为具有如下结构式(IV)的化合物式(IV)其中n为4—12的整数，R为碳原子数为8—20的直链烷烃基团；优选的，n为5—8，R为10—14的直链烷烃基团；更优选地，n为6，R为12的直链烷烃基团。
2. 如权利要求1所述的单链阳离子类脂的制备方法，其特征在于该类化合物的制备包括以下的步骤(1) 赖氨酸在碱性条件下加入二碳酸二叔丁酯(Boc)保护氨基，得式(I)所示二碳酸二叔丁酯(Boc)保护的赖氨酸；于二碳酸二叔丁酯(Boc)保护的赖氨酸中加入直链垸烃的二醇混合用无水二氯甲垸溶解，在催化剂4-二甲氨基吡啶，脱水剂l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和三乙胺或者N， N' -二环己基碳二亚胺的混合物作用下反应，形成第一个酯键，得到式(n)的产物；(2) 于甘氨酸垸基二醇酯中加入烷酸用无水二氯甲垸溶解，在催化剂4-二甲氨基吡啶，脱水剂l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和三乙胺或者N， N' -二环己基碳二亚胺的混合物作用下反应，形成第二个酯键，得式(III)中的产物；之后用硅胶柱分离纯化，加入饱和浓盐酸反应脱去二碳酸二叔丁酯(Boc)保护基得式(IV)中最终的产物。
3. 如权利要求1中所述的单链阳离子类脂在制备纳米载体中的应用。
4. 一种纳米载体，其特征在于该纳米载体包括固体脂质或多聚物，乳化剂以及用做助乳化剂的权利要求1的单链阳离子类脂。
5. 如权利要求4所述的纳米载体，其特征在于其中的固体脂质选自硬脂酸、棕榈酸、胆固醇、单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、山榆酸甘油酯或三月桂酸甘油酯中的一种或几种；其中的多聚物选自聚乳酸、聚己内酯、多聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚乙二醇或聚乳酸乙醇酸共聚物中的一种或他们的组合或者嵌段共聚物；其中的乳化剂选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、羊脑卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰乙醇胺以及合成磷脂二棕榈酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱，泊洛沙姆或泰洛沙姆。
6. 如权利要求4所述的纳米载体，其特征在于其为脂质体、固体脂质纳米粒、聚乳酸纳米粒、聚乳酸/乙醇酸共聚物纳米粒、聚乳酸一聚乙二醇纳米粒、聚乙烯亚胺—聚乙二醇纳米粒、多聚赖氨酸纳米粒或者聚乙二醇一聚己内酯嵌段共聚物纳米粒。
7. 如权利要求4一6任一项所述的纳米载体，其特征在于其中各成分用量如下如权利要求l的单链阳离子类脂10 — 30mg，固体脂质或者多聚物15 — 30mg，乳化剂5 — 25mg。
8. 如权利要求4一6任一项所述的纳米载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤使 用将固体脂质或多聚物和乳化剂溶解于有机溶剂构成有机相，将单链阳离子类脂溶于双蒸水 中构成水相，采用薄膜分散法、乳化-溶剂挥发法或者溶剂扩散法混合有机相和水相，挥发 有机溶剂后得纳米载体混悬液。
9. 如权利要求8所述的纳米载体的制备方法，其特征在于其中构成有机相的溶剂选自 丙酮、二氯甲垸、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇或乙醚中的一种或几种。
10. 如权利要求4_6任一项所述的纳米载体在荷载基因(DNA/RNA)中的应用。
全文摘要
本发明设计并合成了一种新型的单链的阳离子类脂，并将其作为表面活性剂应用于荷基因纳米载体的制备。属于化学技术领域。特点是用化学合成的方法制备了易溶、高效、低毒的单链阳离子类脂，合成方法简单，产物收率较高。并将作为表面活性剂其应用于各种载体材料，用各种方法制备了粒径均匀、载药量高、稳定性好、易进行表面修饰的荷基因纳米载体。制备的荷基因纳米载体作用于多种肿瘤细胞，均表现出较低的细胞毒性和较高的转染效率。该类脂稳定性好，表面活性高，生物降解性好，可用于制备各种荷基因阳离子纳米载体。
文档编号C07C229/26GK101475503SQ20081023835
公开日2009年7月8日 申请日期2008年12月15日 优先权日2008年12月15日
发明者余汪洋, 娜 张, 徐文方 申请人:山东大学