肽的制备方法

专利名称：肽的制备方法
肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及肽和糖肽的制备方法。
背景技术：
作为肽的制备方法，适用的有连接法。其中，自然化学连接法(Native Chemical Ligation、NCL法)是可以制备在连接部位(Ligation部位)具有天然酰胺键(肽键)的 肽的方法。NCL法也可以在无保护的肽链之间进行，并且已知是用于在连接部位生成天然酰 胺键的有效的方法(例如，专利文献l)。 NCL法如下图所示，该方法是使第1肽与N末端上 具有半胱氨酸残基的第2肽进行化学选择反应，以便使得在C末端上具有a羧基硫代酯部 分，这时，半胱氨酸的侧链硫羟基(SH基，也称为巯基)选择性地与硫代酯基的羰基碳反应， 通过硫羟基交换反应，生成硫代酯键的初期中间体。该中间体自发地发生分子内转位，在连 接部位形成天然酰胺键，另一方面，使其再生半胱氨酸侧链硫醇。通过采用该反应，可以高 效地合成各种各样的多肽。
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h2n"~( peptide )-^N^( peptide )-~oh 自然化学连接法 典型的NCL法的主要缺点是，该方法中，所连接的2个肽断片中的一个必须在N末
端上具有半胱氨酸残基，连接后得到的肽也在连接部位具有半胱氨酸残基。因此，当在想要
通过合成获得的所希望的肽中不存在半胱氨酸残基时，就不能采用该方法。 另外，在典型的NCL法中，采用例如固相合成法等来准备想要连接的2个或者2个
以上的肽断片，但当象例如生物体内存在的肽那样，半胱氨酸含量非常少时(或者不存在半胱氨酸时)，为了供给NCL法，必须准备非常长的肽断片，因此不能说是有效率的。
另一方面，已知在生物体内存在各种各样的糖肽和糖蛋白质。这些糖肽或者糖蛋 白质的糖链可分为N键型和0键型这2种类型。N键型糖链一般是与天冬酰胺侧链的酰胺 氮形成N-糖苷键的糖链，通常在天然的状态下，常常与称为-Asn-X-Ser/Thr-(式中，X为 脯氨酸以外的氨基酸)。的共有序列(consensus sequence)中的Asn键合。0键型糖链为 在丝氨酸或者苏氨酸侧链的羟基中形成O-糖苷键的糖链。下面示出其一例(Gal :半乳糖、 GlcNAc :N-乙酰基葡糖胺、Man :甘露糖、Fuc :岩藻糖、GalNAc :N-乙酰基半乳糖胺)。已知 具有0键型糖链的天然糖肽中，脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸的含有率高(非专利文献1和2)。
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N键型糖链和0键型糖链的例子专利文献1国际公开W096/34878号非专利文献1TRENDS in biochemical sciences, Vol. 27， No. 3， March 200非专利文献2Cancer Biology & Therapy 6 :4， 481-486， April 200
发明内容发明所要解决的课题
本发明的课题是提供肽和糖肽的新的制备方法。 特别地，在以往典型的NCL法中，连接在一起的2个肽断片中的一个在N末端必须 具有半胱氨酸残基，而且，连接后获得的肽也在连接部位具有半胱氨酸残基，因此，想要将 最终得到的所希望的肽(或者糖肽)中的半胱氨酸残基作为连接部位，只能设计并使用NCL 法。因此，本发明提供一种可以设计连接法的肽和糖肽的新的制备方法，该方法除了能以想 要获得的所希望的肽中的半胱氨酸残基作为连接部位以外，还能以与丝氨酸残基或苏氨酸 残基相对应的部分作为连接部位。 更具体地，根据本发明的一个方案，可以将肽(或者糖肽)中的半胱氨酸残基转变 成丝氨酸残基。因此，可以通过采用NCL法将在N末端上具有半胱氨酸残基的肽与其他的 肽连接，然后，将该半胱氨酸残基转变成丝氨酸残基。因此，根据本发明，即使想要获得的 所希望的序列中不存在半胱氨酸残基，但是只要存在丝氨酸残基，也可以将该位置作为NCL 法中的连接部位来设计。
另外，根据本发明的一个方案，可以将在N末端上具有-SH基的苏氨酸衍生物(或 者该-SH基被二硫键等保护的苏氨酸衍生物)残基通过利用连接法将N末端上具有的肽与 其他的肽连接起来，然后，将获得的苏氨酸衍生物残基转变成苏氨酸残基。因此，根据本发 明，即使在想要获得的所希望的序列中不存在半胱氨酸残基，但是只要存在苏氨酸残基，也 可以将该位置作为连接法中的连接部位来设计。 这样，本发明提供一种能够将糖肽中丰富存在的丝氨酸或苏氨酸作为采用连接法
的连接部位来设计的、采用连接法的肽和糖肽的新型的制备方法。用于解决课题的手段
为了解决以上的课题，本发明可以具有以下的特征。 S卩，本发明可以提供肽的制备方法，其特征在于，在含有具有-SH基的氨基酸残基
的肽中，将上述-SH基转变成-OH基，该方法包括以下的工序(a) (c): (a)使肽中的-SH基与甲基化剂反应的工序； (b)使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应的工序；以及 (c)形成与工序(b)相比为碱性较强的条件的工序。 本发明还提供肽的制备方法，其特征在于，在含有具有-SH基的氨基酸残基的肽 中，将上述-SH基转变成-OH基，该方法包括以下的工序(a) (c): (a)通过使肽中的-SH基与甲基化剂反应，将上述_SH基转变成-SMe基的工序；
(b)通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以 及 (c)在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变 成含有具有-OH基的氨基酸残基的肽的工序。 本发明还提供肽的制备方法，其特征在于，在含有半胱氨酸残基的肽中，将上述半 胱氨酸残基转变成丝氨酸残基，该方法包括以下的工序(a) (c): (a)通过使肽中的半胱氨酸残基的-SH基与甲基化剂反应，将上述-SH基转变 成-SMe基的工序； (b)通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以 及 (c)在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变 成含有丝氨酸残基的肽的工序。 本发明还提供肽的制备方法，其特征在于，在含有由式(1)表示的苏氨酸衍生物A
作为氨基酸残基的肽中，将上述苏氨酸衍生物A残基转变成苏氨酸残基，该方法 包括以下的工序(a) (c): (a)通过使肽中的苏氨酸衍生物A残基的-SH基与甲基化剂反应，将上述_SH基转 变成-SMe基的工序；
H2N COOH
(b)通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以 及 (c)在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变 成含有苏氨酸残基的肽的工序。 本发明还提供肽的制备方法，其特征在于，在含有具有-SMe基的氨基酸残基的肽
中，将上述-SMe基转变成-OH基，该方法包括以下的工序(b)和(c): (b)通过使肽中的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以及 (c)在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变
成含有具有-OH基的氨基酸残基的肽的工序。 本发明还提供含有具有-OH基的氨基酸残基的肽的制备方法，该方法包括以下的 工序 (o)采用连接法将在C末端上含有羧基被由式-C(二O)-SR(式中，R选自苄基、 芳基或者烷基，它们也可以进一步被取代基取代)表示的a-羧基硫代酯基取代的氨基酸 残基的第1肽与在N末端上含有具有-SH基的氨基酸残基的第2肽连接起来，获得含有具 有-SH基的氨基酸残基的肽的工序； (a)通过使工序(o)中获得的肽中的-SH基与甲基化剂反应，将上述-SH基转变 成-SMe基的工序； (b)通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以 及 (c)在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变 成含有具有-OH基的氨基酸残基的肽的工序。 本发明还提供含有丝氨酸残基的肽的制备方法，该方法包括以下的工序
(o)采用连接法将在C末端上含有羧基被由式-C ( = 0) -SR (式中，R选自苄基、芳 基或者烷基，它们也可以进一步被取代基取代)表示的a-羧基硫代酯基取代的氨基酸残 基的第1肽与在N末端上含有半胱氨酸残基的第2肽连接起来，获得含有半胱氨酸残基的 肽的工序； (a)通过使工序(o)中获得的肽中的半胱氨酸残基的-SH基与甲基化剂反应，将上 述-SH基转变成-SMe基的工序； (b)通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以 及 (c)在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变 成含有丝氨酸残基的肽的工序。 本发明还提供含有苏氨酸残基的肽的制备方法，该方法包括以下的工序
(o)采用连接法将在C末端上含有羧基被由式-C ( = 0) -SR (式中，R选自苄基、芳 基或者烷基，它们也可以进一步被取代基取代)表示的a-羧基硫代酯基取代的氨基酸残 基的第1肽与在N末端上含有苏氨酸衍生物残基的第2肽连接起来，获得含有由上述式(1) 表示的苏氨酸衍生物A作为氨基酸残基的肽的工序； (a)通过使工序(o)中获得的肽中的苏氨酸衍生物A残基的-SH基与甲基化剂反 应，将上述-SH基转变成-SMe基的工序；
(b)通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以 及 (c)在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变 成含有苏氨酸残基的肽的工序。 本发明还提供糖肽的制备方法，其特征在于，在含有具有-SH基的氨基酸残基的
糖肽中，将上述-SH基转变成-OH基，该方法包括以下的工序(a) (c): (a)使糖肽中的-SH基与甲基化剂反应的工序； (b)使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应的工序；以及 (c)形成与工序(b)相比为碱性较强的条件的工序。 本发明还提供糖肽的制备方法，其特征在于，在含有具有-SH基的氨基酸残基的
糖肽中，将上述-SH基转变成-OH基，该方法包括以下的工序(a) (c): (a)通过使糖肽中的-SH基与甲基化剂反应，将上述-SH基转变成-SMe基的工序； (b)通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以
及 (c)在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变 成含有具有-OH基的氨基酸残基的糖肽的工序。 本发明还提供糖肽的制备方法，其特征在于，在含有半胱氨酸残基的糖肽中，将上 述半胱氨酸残基转变成丝氨酸残基，该方法包括以下的工序(a) (c):
(a)通过使糖肽中的半胱氨酸残基的-SH基与甲基化剂反应，将上述_SH基转变 成-SMe基的工序； (b)通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以 及 (c)在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变 成含有丝氨酸残基的糖肽的工序。 本发明还提供糖肽的制备方法，其特征在于，在含有由上述式(1)表示的苏氨酸 衍生物A作为氨基酸残基的糖肽中，将上述苏氨酸衍生物A残基转变成苏氨酸残基，该方法 包括以下的工序(a) (c): (a)通过使糖肽中的苏氨酸衍生物A残基的-SH基与甲基化剂反应，将上述_SH基 转变成-SMe基的工序； (b)通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以 及 (c)在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变 成含有苏氨酸残基的糖肽的工序。 本发明还提供含有具有-OH基的氨基酸残基的糖肽的制备方法，该方法包括以下 的工序 (o)采用连接法将在C末端上含有羧基被由式-C ( = 0) -SR (式中，R选自苄基、芳 基或者烷基，它们也可以进一步被取代基取代)。表示的a -羧基硫代酯基取代的氨基酸残 基的第1肽或者糖肽与在N末端上含有具有-SH基的氨基酸残基的第2肽或者糖肽(此处， 第1肽或者糖肽以及第2肽或者糖肽中的至少一方为糖肽)连接起来，获得含有具有-SH
11基的氨基酸残基的糖肽的工序； (a)通过使工序(o)中获得的糖肽中的-SH基与甲基化剂反应，将上述-SH基转变 成-SMe基的工序； (b)通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以 及 (c)在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变 成含有具有-OH基的氨基酸残基的糖肽的工序。 本发明还提供含有丝氨酸残基的糖肽的制备方法，该方法包括以下的工序
(o)采用连接法将C末端由以下式表示的第1糖肽
-糖Asn-X-C ( = 0) _SR
(式中， 糖Asn为加成了糖链的天冬酰胺， X为除脯氨酸以外的任意的氨基酸残基中除羧基以外的部分， R选自苄基、芳基或者烷基，它们也可以进一步被取代基取代)与在N末端上含有 半胱氨酸残基的第2肽连接起来，获得含有半胱氨酸残基的糖肽的工序；
(a)通过使工序(o)中获得的糖肽中的半胱氨酸残基的-SH基与甲基化剂反应，将 上述-SH基转变成-SMe基的工序； (b)通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以 及 (c)在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变 成含有丝氨酸残基的糖肽的工序。 本发明还提供含有苏氨酸残基的糖肽的制备方法，该方法包括以下的工序
(o)采用连接法将C末端由以下式表示的第1糖肽
-糖Asn-X-C ( = 0) _SR
(式中， 糖Asn为加成了糖链的天冬酰胺， X为除脯氨酸以外的任意的氨基酸残基中除羧基以外的部分， R选自苄基、芳基或者烷基，它们也可以进一步被取代基取代)与在N末端上含有 苏氨酸衍生物残基的第2肽连接起来，获得含有由上述式(1)表示的苏氨酸衍生物A作为 氨基酸残基的糖肽的工序； (a)通过使工序(o)中获得的糖肽中的苏氨酸衍生物A残基的-SH基与甲基化剂 反应，将上述-SH基转变成-SMe基的工序； (b)通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以 及 (c)在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变
成含有苏氨酸残基的糖肽的工序。 本发明还提供含有由以下式-糖Asn-X-Y- (式中，
12



糖Asn为加成了糖链的天冬酰胺，
X为除脯氨酸以外的任意的氨基酸残基，
Y为由式(2)表示的苏氨酸衍生物A残基
<formula>formula see original document page 13</formula> 表示的结构的糖肽。 在本发明中，根据实施方案，工序(a)或者工序(o)中的肽或者糖肽中的蛋氨酸残 基为保护蛋氨酸残基，进而，根据希望，优选在工序(b)或者(c)之后，特别是在工序(c)之 后包括以下的工序(d): (d)将保护蛋氨酸残基脱保护的工序。 在本发明中，根据实施方案，在工序(b)中获得的反应中间体优选为酯体。 在本发明中，根据实施方案，工序(b)优选在酸性条件下、特别是在pH2 3下进行。 在本发明中，根据实施方案，在工序(b)中使用的氰化剂优选为溴化氰。
在本发明中，根据实施方案，优选在弱碱性条件下，例如，在pH7 9、特别是pH 7 8下进行工序(c)。当在弱碱性条件下进行工序(c)时，根据实施方案，优选将工序(c) 进行约10分钟以上、特别是约15分钟以上(例如，约10分钟 30小时左右、特别是约15 分钟 30小时左右)。 在本发明中，根据实施方案，优选在强碱性条件下，例如，在pH9 13、特别是 pH10 11下进行工序(c)。当在强碱性条件下进行工序(c)时，根据实施方案，优选将工 序(c)进行约1小时以下、特别是约10分钟以下(例如，约5分钟 1小时左右、特别是约 5分钟 10分钟左右)。 在本发明中，当在第2肽的N末端上含有苏氨酸衍生物残基时，根据实施方案，上
述苏氨酸衍生物残基为由式(3):
<formula>formula see original document page 13</formula>
(3)(式中，R为H或者在连接反应的条件下容易被脱保护的硫羟基的保护基，优选为 H或者二硫基)。 表示的苏氨酸衍生物的N末端氨基酸残基。 在本发明中，根据实施方案，第l肽(或者糖肽)和第2肽(或者糖肽)中的任一 个，在特定情况下为二者，优选为不含半胱氨酸或是半胱氨酸为保护半胱氨酸的肽(或者糖肽)。 在本发明中，根据实施方案，第l肽(或者糖肽)和第2肽(或者糖肽)中的任 一个优选为具有80个以下、优选50个以下、更优选30个以下的氨基酸残基的肽(或者糖 肽)。 在本发明中，根据实施方案，糖肽中的糖链优选为N键型糖链或者0键型糖链。 在本发明中，根据实施方案，糖链优选为由以下式(4)表示的糖链。[式中，W和f各自独立地为氢原子或者由式(5) (8)表示的基团]
在本发明中，根据实施方案，工序(c)或者工序(d)之后，优选还包括加成了糖链 的工序。 采用本发明的制备方法获得的肽或者糖肽，根据实施方案，全部的酰胺键优选为 天然酰胺键。 采用本发明的制备方法获得的肽或者糖肽，根据实施方案，全部的构成氨基酸优选为在生物体内作为肽或者糖肽的构成氨基酸而存在的氨基酸。
发明的效果
根据本发明的肽的制备方法，可以将具有-SH基的肽的-SH基转变成-OH基。另 外，本发明的方法还可以把通过连接法将在C末端上具有由-C( = O)-SR表示的ci-羧基 硫代酯部分的第1肽与在N末端上含有具有-SH基的氨基酸残基的第2肽连接起来而获得 的、含有具有-SH基的氨基酸残基的肽的-SH基转变成-OH基。这些方法也可以应用于糖 肽。 因此，根据本发明的肽的制备方法，可以将肽中的半胱氨酸残基转变成丝氨酸残 基，即使在想要获得的所希望的序列中不存在半胱氨酸残基，但是只要存在丝氨酸残基，就 可以适用于NCL法。 另外，本发明还提供将具有-SH基的苏氨酸衍生物作为连接部位的连接法，由于
能够将采用该连接法获得的肽中具有-SH基的苏氨酸衍生物残基转变成苏氨酸残基，因此
在制备具有苏氨酸的肽时，将苏氨酸残基作为连接部位，可以适用连接法。 以往的自然化学连接法中作为连接部位的半胱氨酸，在生物体内的肽中的含有率
低，但根据本发明的方法，可以将生物体内的肽、特别是糖肽中含有率高的丝氨酸和苏氨酸
作为连接法中新的连接部位来设计。 进而，通过将上迷的方法适用于糖肽、特别是丝氨酸和苏氨酸的含有率高的0键 型糖链和具有作为共有序列的具有_糖Asn-X-Ser-或者-糖Asn-X-Thr-(式中，糖Asn为 加成了糖链的天冬酰胺，X为除脯氨酸以外的任意的氨基酸残基)的序列的N键型糖链的 糖肽，利用连接法，可以制备与自然结构相同的、具有N键型糖链或者0键型糖链的糖肽。
具体实施方式

本发明的第1方面为，对于含有具有-SH基的氨基酸残基的肽，使其通过包括下述
工序(a) (c)的工序，获得含有具有-OH基的氨基酸残基的肽 (a)使肽中的-SH基与甲基化剂反应的工序； (b)使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应的工序；以及 (c)形成与工序(b)相比为碱性较强的条件的工序。 上述工序(a) (c)在较特定的情况下为 (a)通过使肽中的-SH基与甲基化剂反应，将上述-SH基转变成-SMe基的工序；
(b)通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以 及 (c)在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变 成含有具有-OH基的氨基酸残基的肽的工序。
本发明的第2方面为，通过以下的工序 采用连接法将在C末端上含有羧基被由式-C ( = 0) -SR (式中，R选自苄基、芳基 或者烷基，它们也可以进一步被取代基取代)表示的a-羧基硫代酯基取代的氨基酸残基 的第1肽与在N末端上含有具有-SH基的氨基酸残基的第2肽连接起来，获得含有具有-SH 基的氨基酸残基的肽的工序； 以及包括上述工序(a) (c)的工序；获得含有具有_0H基的氨基酸残基的肽。
本发明的第3方面是，对于含有具有-SH基的氨基酸残基的糖肽，通过包括上述工
序(a) (c)的工序，获得含有具有-OH基的氨基酸残基的糖肽。 本发明的第4方面是，通过以下的工序 采用连接法将C末端由以下式表示的第1糖肽-糖Asn-X-C ( = 0) _SR(式中，糖Asn为加成了糖链的天冬酰胺，X为除脯氨酸以外的任意的氨基酸残基 中除羧基以外的部分，R选自苄基、芳基或者烷基，它们也可以进一步被取代基取代)。
与在N末端上含有具有-SH基的氨基酸残基的第2肽连接起来，获得含有具有-SH 基的氨基酸残基的糖肽的工序； 以及包括上述工序(a) (c)的工序；获得含有具有-OH基的氨基酸残基的糖肽。
在本说明书中，"肽"只要是由2个以上的氨基酸通过酰胺键键合而成的，就没有特 殊限定，包含公知的肽和新型的肽以及肽的变体。 一般被称为蛋白质的成分也包含在本发 明的肽中。在优选的方案中，采用本发明的制备方法获得的肽(或者糖肽)，与天然产物相 同，2个以上的氨基酸通过酰胺键(肽键)而键合在一起。 在本说明书中，"肽变体"是指由肽天然地或者人工地改变而成的化合物，作为这 种改变，可举出例如，肽的1个或者多个氨基酸残基的、烷基化、酰基化(例如乙酰基化)、酰 胺化(例如，肽的C末端的酰胺化)、羧基化、酯形成、二硫键形成、糖基化、脂质化、磷酸化、 羟基化、标识成分的结合等。 在本说明书中，"氨基酸"是按照其最广泛的含义来使用，不仅包含天然的氨基酸， 例如丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(11e)、丙氨酸 (Ala)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸 (Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、苯基 丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)，此外还包含被称为氨基酸变异体和衍生物等 非天然的氨基酸。如果是本领域技术人员，考虑到该广泛的定义，作为本说明书中的氨基
酸，可举出例如L-氨基酸；D-氨基酸；氨基酸变异体和衍生物等被化学修饰的氨基酸；正 亮氨酸、e-丙氨酸、鸟氨酸等不属于生物体内蛋白质的构成材料的氨基酸；以及本领域技 术人员公知的具有氨基酸特性的化学合成的化合物等，这是可以理解的。作为非天然氨基 酸的例子，除了以下详述的苏氨酸衍生物A以外，还可举出a-甲基氨基酸(a-甲基丙氨 酸等)、D-氨基酸、组氨酸之类的氨基酸(2-氨基-组氨酸、13 _羟基_组氨酸、高组氨酸、 a _氟甲基_组氨酸以及a _甲基_组氨酸等)、侧链上具有多余的亚甲基的氨基酸("高" 氨基酸)以及侧链中的羧酸官能团氨基酸被磺酸基取代的氨基酸(磺基丙氨酸等)。
在本说明书中，"苏氨酸衍生物"是指由以下式(3)表示的化合物
犯
<formula>formula see original document page 16</formula>(3) 式(3)中，R为H或者在连接反应的条件下容易被脱保护的硫羟基的保护基，优选为H或者二硫基。特别地，在上述式(3)中，将R为H的以下式(1)的化合物称为苏氨酸衍
生物A。<formula>formula see original document page 17</formula> 式(3)的苏氨酸衍生物是苏氨酸的-OH基部位为-SR基的化合物，也包含具有任 何立体构型的化合物。在本发明的制备方法中，由于认为当肽中的氨基酸残基的-SH基转 变成-OH基时会引起立体反转，因此，特别是当想要获得天然存在的苏氨酸时，优选使用天 然存在的苏氨酸的-OH基和具有立体反转的-SR基的苏氨酸衍生物。 上述的苏氨酸衍生物也可以参照例如后述的实施例和合成例，按照以下的方法来获得。 首先，准备将氨基和羧基保护起来的苏氨酸。各自的保护基只要在以后的反应中 可以获得目标的肽，就没有特别的限定，例如，可以使用将氨基用Boc基保护起来并将羧基 用TMSE(三甲基甲硅烷基乙基)基保护起来的苏氨酸。其次，使用公知的方法，将13位的羟 基进行甲磺酰基化。接着，使用例如DBU和硫代乙酸，将该甲磺酰基取代为硫代乙酰基(参 见D.Crich et al， J. Am. Chem. Soc. ， 129， 10064 (2007))。 采用公知的方法，将该硫代乙酰基转变成一种被二硫基、乙酰胺甲基、硝基苄基、 三苯甲基等为本领域技术人员公知的保护基保护起来的硫羟基。例如，在形成被二硫基保 护的硫羟基的情况下，可以参照后述的合成例1。二硫基在随后的连接法的反应条件下很容 易被脱保护。 在优选的方案中，采用本发明的制备方法获得的肽(或者糖肽)全部由在生物体 内作为肽(或者糖肽)的构成氨基酸而存在的氨基酸构成。另外，在本发明的一个方案中， 采用本发明的制备方法获得的肽优选为不含半胱氨酸残基或者在构成氨基酸中的半胱氨 酸含量少的肽。进而，在本发明的一个方案中，采用本发明的制备方法获得的肽，在从任意 的丝氨酸残基或者苏氨酸残基至下一个丝氨酸残基或者苏氨酸残基或者N末端或者C末端 的任意二者之间，具有80个以下、优选50个以下、更优选30个以下的氨基酸残基。例如，在 本发明的一个方案中，采用本发明的制备方法获得的肽在5 40氨基酸残基中、优选20 30氨基酸残基中具有1个以上的丝氨酸残基或者苏氨酸残基。 在本说明书中，"反应中间体"按照广泛的含义，是指在使肽中的-SMe基与氰化剂 反应之后转变成-OH基而成的各化合物中的任一种。认为本发明的反应流程为以下的流程

图1那样，以下的流程图1中，由C表示的酯体也是本发明中的反应中间体之1。予以说明， 在本说明书中，例如在以下的流程图1中记载为"肽-0H"，只要没有恃意指明，该-0H均表 示肽的C末端羧基的-0H。
17々
浙！
ra， 流程图1 在本说明书中，"糖肽"只要是在上述的肽中至少加成l个糖链的化合物，就没有特 殊限定，包括公知的糖肽以及新型的糖肽。 一般被称为糖蛋白质的化合物也包含在本发明 中的糖肽的定义中。 在优选的方案中，采用本发明的制备方法获得的糖肽为具有N键型糖链或者0键
型糖链的肽，可举出例如，红细胞生成素、白介素、干扰素-P、抗体、单核细胞向化性因子蛋
白质-3(MCP-3、monocytechemotactic protein-3)等的肽的一部分或者全部。 在本发明的一个方案中，采用本发明的制备方法获得的糖肽在从没有加成了糖链
的任意的丝氨酸残基或者苏氨酸残基至下一个丝氨酸残基或者苏氨酸残基或者N末端或
者C末端的任意二者之间，具有80个以下、优选50个以下、更优选30个以下的氨基酸残基。
例如，在本发明的一个方案中，采用本发明的制备方法获得的糖肽在5 40氨基酸残基中、
优选20 30氨基酸残基中具有1个以上的丝氨酸残基或者苏氨酸残基。 在糖肽中，糖链与肽中的氨基酸残基可以直接键合，也可以借助连接基来键合。糖
链与氨基酸的键合部位没有特殊限制，优选氨基酸键合到糖链的还原末端。 与糖链键合的氨基酸的种类没有特殊限定，可以与天然氨基酸、非天然氨基酸中
的任一种键合。从糖肽具有与生物体内存在的糖肽(糖蛋白质)相同或者类似结构的观点
考虑，糖链优选象N键型糖链那样键合到Asn上，或者象0键型糖链那样键合到Ser或者
Thr上。特别地，在N键型糖链的情况下，采用本发明的制备方法获得的糖肽，是具有这样一
种结构的糖肽，即，糖链键合到Asn上，除了脯氨酸以外的氨基酸(X)在该Asn的C末端侧
上形成酰胺键(肽键)，进而Thr或者Ser在该X的C末端侧形成酰胺键(肽键)的结构
(-糖Asn-X-Thr/Ser-)。 在糖链与氨基酸借助连接基而键合的情况下，从与连接基容易键合的观点考虑， 与糖链键合的氨基酸优选为天冬氨酸或谷氨酸等在分子内具有2个以上羧基的氨基酸； 赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸等在分子内具有2个以上的氨基的氨基酸；丝氨酸、苏氨 酸、酪氨酸等在分子内具有羟基的氨基酸；半胱氨酸等在分子内具有硫羟基的氨基酸；或 者天冬酰胺、谷氨酰胺等在分子内具有酰胺基的氨基酸。特别地，从反应性的观点考虑，优 选天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或者谷氨酰胺。
在糖肽中，在糖链与氨基酸借助连接基而键合的情况下，作为连接基，可以广泛使 用该领域中所使用的连接基，可举出例如
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-NH- (CO) - (CH2) a_CH2-(式中，a为整数，只要不抑制作为目标的连接基功能就没有限定，优选为0 4的 整数)。； (Vw聚亚甲基；
-CH2_R3-(式中，R3为从选自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基、 取代的芳基、碳环基、取代的碳环基、杂环基以及取代的杂环基中的基团脱离1个氢原子而 生成的基团)；等。 在本说明书中，"糖链"除了 2个以上的单位糖(单糖和/或其衍生物)连接而成 的化合物以外，也包含由l个单位糖(单糖和/或其衍生物)构成的化合物。作为这种糖 链，可举出例如，生物体中含有的单糖类和多糖类(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、 N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、脱唾液酸(asialo acid)以及它们的复合物和衍生 物)，除此之外，还可举出分解的多糖、糖蛋白质、蛋白多糖、葡糖胺多糖、糖脂质等由复合生 物体分子分解或者衍生的糖链等广范围的糖，但不限定于这些。在2个以上单位糖连接的 情况下，各个单位糖之间，通过糖苷键脱水縮合而键合在一起。糖链可以是直链型，也可以 是支链型。 另外，在本说明书中，"糖链"也包含糖链的衍生物，作为糖链的衍生物，可举出例 如，构成糖链的糖为具有羧基的糖(例如，c-i位被氧化而形成羧酸的醛糖糖酸(例如， D-葡萄糖被氧化而成的D-葡糖酸)、末端的C原子形成羧酸的糖醛酸(D-葡萄糖被氧化的 D-葡糖醛酸))、具有氨基或者氨基衍生物(例如，被乙酰基化的氨基)的糖(例如，N-乙 酰基-D-葡糖胺J-乙酰基-D-半乳糖胺等)、具有氨基和羧基二者的糖(例如，N-乙酰基 神经氨酸(脱唾液酸)、N-乙酰基胞壁酸等)、脱氧化的糖(例如，2-脱氧-D-核糖)、含有 硫酸基的硫酸化糖、含有磷酸基的磷酸化糖等的糖链，但不限定于这些。
本发明的糖链优选为在生物体内作为复合糖质(糖肽(或者糖蛋白质)、蛋白多 糖、糖脂质等)而存在的糖链，优选为那些属于在生物体内作为糖肽(或者糖蛋白质)而与 肽(或者蛋白质)键合的糖链的N-键型糖链、0-键型糖链等。在由O-键型糖链键合而成 的糖肽中，N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc) 、 N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、木糖、岩藻糖等通过 O-糖苷键键合到肽的Ser或者Thr上，从而向其中进一步加成了糖链。作为N键型糖链，可 举出例如，高甘露糖(高甘露糖)型、复合(complex)型、杂合(hybrid)型，优选为复合型。
本发明中，作为优选的糖链，为例如，由下述式(4)表示的糖链。
[式中，W和f各自独立地为氢原子或者由式(5) (8)表示的基团]
在考虑将本发明的糖肽的制备方法用于药品等的制造领域的情况下，从能够避免 抗原性等问题的观点考虑，作为优选的糖链，可举出例如，在人体内，作为与蛋白质结合的 糖蛋白质而存在的糖链(例如，FEBS LETTERS Vol. 50， No. 3， Feb. 1975中记载的糖链)以 及具有相同结构的糖链(构成糖的种类以及它们的结合样式相同的糖链)或者从它们的非 还原末端失去1个或多个糖而形成的糖链。 糖肽中的糖链的加成数，只要是1链以上，就没有特殊的限定，从提供与生物体内 存在的糖肽类似结构的糖肽的观点考虑，更优选是与体内存在的糖肽具有同等程度的加成 数。 在本发明的一个优选方案中，本发明的糖肽中的糖链结构是均匀的。在本说明书 中，所谓糖肽中的糖链结构是均匀的是指，在糖肽之间进行比较的情况下，肽中的糖链加成 部位、构成糖链的各糖的种类、结合顺序、以及糖间的键合样式是相同的，或者是指，至少 90%以上、优选95%以上、更优选99%以上的糖链结构是均匀的。糖链均匀的糖肽，其品质 是一定的，特别是在药品的制造和分析等领域是优选的。 在本发明的制备方法中作为原料使用的肽，可以采用例如，固相合成、液相合成、 利用细胞的合成、分离提取天然存在的肽的方法等本领域技术人员公知的肽制备方法来制 备。另外，在使用糖肽作为原料时，可以通过在上述公知的肽的制备方法中组合加入糖链加 成工序来制备。关于糖链加成工序中使用的糖链的制备方法，可以参照例如，国际公开编号 W0 03/008431、W02004/058984、W02004/058824、W02004/070046、W02007/011055等。
作为具体例，以下示出采用固相合成法制备含有具有-SH基的氨基酸残基的肽或 者糖肽的方法。在以下所示的方法中，也可以参照国际公开编号W02004/005330。
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首先，(1)使具有羟基的树脂(树脂)的羟基与由脂溶性保护基将氨基保护起来的
氨基酸的羧基进行酯化反应。这时，由于用脂溶性保护基将氨基酸的氨基保护起来，因此，
可以防止氨基酸之间的自縮合，从而使树脂的羟基与氨基酸的羧基进行反应，引起酯化。
其次，(2)使上述获得的酯的脂溶性保护基脱离，形成游离氨基； (3)使该游离氨基与由脂溶性保护基将氨基保护起来的所希望的氨基酸的羧基进
行酰胺化反应； (4)使上述脂溶性保护基脱离，形成游离氨基； (5)根据需要重复进行上述(3)和(4)的工序，获得由希望数目的希望氨基酸连接 而成的、在末端上键合树脂并在另一端具有游离氨基的肽。 在上述(1) (5)的工序中，通过使用具有-SH基(-SH基也可以被保护)的氨基 酸作为氨基酸(例如，半胱氨酸或上述的式(3)的苏氨酸衍生物)，可以获得含有具有-SH 基的氨基酸残基的肽。予以说明，当在上述(1) (5)的工序中使用时，具有-SH基的氨 基酸的-SH基可以被本领域技术人员公知的保护基，例如，二硫基、乙酰胺甲基、硝基苄基、 三苯甲基等保护基保护起来，然后，根据需要进行脱保护。另外，在上述(1) (5)的工序 中，通过使用加成了糖链的氨基酸(例如，在天冬酰胺中加成了糖链的糖链天冬酰胺、在丝 氨酸或者苏氨酸中加成了糖链的糖链丝氨酸或者糖链苏氨酸等)作为氨基酸，也可以获得 在所希望的位置具有1个或者2个以上糖链的N键型和/或0键型糖肽。如上所述，这种 N键型或者0键型的糖肽可以在所希望的位置含有具有-SH基的氨基酸残基。
(6)另外，通过用酸将树脂(树脂)与(1)的氨基酸之间的酯键切断，可以制备所 希望的肽(或者糖肽)。 作为固相树脂(树脂)，通常，只要是在固相合成中使用的树脂(树脂)即可，可 以使用例如，Amino-PEGA树脂(Merck公司制)、王氏树脂(Wang resin， Merck公司制)、 HMPA-PEGA树月旨(Merck公司制)、Trt Chloride树月旨(Merck公司制)等。
另外，在Amino-PEGA树脂(树脂)与氨基酸之间也可以存在连接基，作为这种连 接基，可举出例如，4-羟基甲基苯氧基乙酸(HMPA)、4-(4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基)-丁基 乙酸(HMPB)等。 作为脂溶性保护基，可举出例如，9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基、叔丁氧基羰基 (Boc)基、烯丙氧基羰基(Alloc)基等含羰基的基团；乙酰基(Ac)基等酰基；烯丙基、节基 等保护基，对它们没有特殊限定。 为了引入脂溶性保护基，在引入例如Fmoc基的情况下，可以通过加入9-芴基甲 基-N-琥珀酰重胺基(succinimidyl)碳酸酯和碳酸氢钠进行反应来引入。反应可以在0 5(TC、优选在室温下进行约1 5小时左右。 作为被脂溶性保护基保护的氨基酸，可以使用按照上述的方法将上述的氨基酸保 护起来的氨基酸。另外，也可以使用市售品。可举出例如，Fmoc-Ser、Fmoc-Asn、Fmoc-Val、 Fmoc—Leu、 Fmoc—Ile、 Fmoc—Ala、 Fmoc—Tyr、 Fmoc—Gly、 Fmoc—Lys、 Fmoc_Arg、 Fmoc—His、 Fmoc—Asp、 Fmoc—Glu、 Fmoc—Gln、 Fmoc—Thr、 Fmoc—Cys、 Fmoc—Met、 Fmoc—Phe、 Fmoc_Trp、 Fmoc-Pro。 作为酯化催化剂，可以使用例如1-均三甲苯磺酰基-3-硝基-1 ， 2 ， 4-三唑 (MSNT)、二环己基碳化二亚胺(DCC)、l，3-二异丙基碳化二亚胺(DIPCDI)等公知的脱水縮
21合剂。氨基酸与脱水縮合剂的使用比例，相对于前者1重量份，后者通常为1 10重量份， 优选为2 5重量份。 酯化反应优选通过例如，向固相柱子中加入树脂，将该树脂用溶剂洗涤，然后加入 氨基酸的溶液来进行。作为洗涤用溶齐U，可举出例如二甲基甲酰胺(DMF)、2-丙醇、二氯甲 烷等。作为用于溶解氨基酸的溶剂，可举出例如二甲亚砜(DMS0)、DMF、二氯甲烷等。酯化 反应可以在0 5(TC、优选在室温下进行约10分钟 30小时左右、优选15分钟 24小时左右。 优选将此时固相上的未反应官能团用乙酸酐等进行乙酰基化，由此将其封端。
脂溶性保护基的脱离，可以通过例如用碱处理来进行。作为碱，可举出例如哌啶、 吗啉等。此时，优选在溶剂的存在下进行。作为溶剂，可举出例如匿SO、DMF、甲醇等。
游离氨基与由脂溶性保护基将氨基氮保护起来的任意的氨基酸的羧基进行的酰 胺化反应，优选在活性化剂和溶剂的存在下进行。 作为活性化剂，可举出例如，二环己基碳化二亚胺(DCC)U-乙基-3-(3-二甲基 氨基丙基)碳化二亚胺 盐酸盐(WSC/HC1)、二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)、羰基二咪唑 (CDI)、二乙基氰基膦酸酯(DEPC)、l，3-二异丙基碳化二亚胺(DIPCI)、苯并三唑-l-基氧 基_三吡咯烷基六氟磷酸辚(PyB0P) 、3- 二乙氧基磷酰氧基-1， 2， 3-苯并三嗪-4 (3H)-酮 (DEPBT) 、 1-羟基苯并三唑(HOBt)、羟基琥珀酰亚胺(HOSu) 、二甲基氨基妣啶(DMAP) 、 1-羟 基_7-氮杂苯并三唑(HOAt) 、3-羟基-4-氧代-3，4- 二氢_5_氮杂苯并_1，2，3_三嗪 (HODhbt)、羟基邻苯二甲酰亚胺(HOPht)、五氟苯酚(Pfp-0H) 、2-(lH-苯并三唑-l-基)-l， 1 ， 3， 3-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU) 、 0- (7-氮杂苯并三唑-1-基)-1 ， 1 ， 3， 3-四甲基脲六 氟膦酸酯(HATU)、0-苯并三唑-l-基-l，l，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)等。
活性化剂的用量，相对于由脂溶性的保护基将氨基氮保护起来的任意的氨基酸， 为1 20当量，优选为1 10当量，更优选为1 5当量。 虽然仅用上述活性化剂也可以进行反应，但优选并用胺作为辅助剂。作为胺，可以 使用例如，二异丙基乙基胺(DIPEA) 、 N-乙基吗啉(NEM) 、 N-甲基吗啉(NMM) 、 N-甲基咪唑 (NMI)等。辅助剂的用量，相对于由脂溶性的保护基将氨基氮保护起来的任意的氨基酸，为 1 20当量，优选为1 10当量，更优选为1 5当量。 作为溶齐U，可举出例如匿SO、DMF、二氯甲烷等。反应可以在0 50。C、优选在室温 下进行约10 30小时左右、优选15分钟 24小时左右。此时优选使用乙酸酐等将固相 上的未反应氨基进行乙酰基化以将其封端。脂溶性保护基的脱离可以与上述同样地进行。
为了将肽链与树脂(resin)切断，优选用酸进行处理。作为酸，可举出例如三氟乙 酸(TFA)、氟化氢(HF)等。此时，由于可能从用于氨基酸的脂溶性保护基和树脂(树脂)上 的连接基生成反应性高的阳离子种类，优选添加用于捕获该类阳离子的亲核性试剂。作为 亲核性试剂，可举出三异丙基硅烷(TIS)、苯酚、茴香硫醚、乙二硫醇(EDT)等。
这样就可以获得含有具有-SH基的氨基酸残基的肽(或者糖肽)。
另外，通过采用利用以反式谷氨酰胺酶为代表的酶的逆反应的方法，向上述那样 获得的含有具有-SH基的氨基酸残基的肽或者糖肽加成了糖链，也可以获得含有具有-SH 基的氨基酸的糖肽。 进而，也可以在上述的方法中组合利用转移酶的糖链伸长反应。
在上述那样获得的、肽或者糖肽中，可以采用连接法将在N末端上含有具有-SH基 的氨基酸残基的肽(或者糖肽)与在C末端上具有a-羧基硫代酯部分的肽(或者糖肽) 连接起来。 予以说明，在本说明书中，"连接法"不仅是指专利文献1记载的自然化学连接法 (Native Chemical Ligation、 NCL法)，而且也包含如后述实施例所记载那样，对于包含非 天然氨基酸、氨基酸衍生物(例如，式(1)的苏氨酸衍生物A、保护蛋氨酸、糖链加成氨基酸 等)的肽应用上述自然化学连接法的情况。采用连接法可以制备在连接部位具有天然酰胺 键(肽键)的肽。 采用连接法的连接，也可以在肽_肽间、肽_糖肽间、糖肽_糖肽间之中的任何二 者之间进行。 连接法中使用的、在C末端上具有a-羧基硫代酯部分的肽(或者糖肽)，如专利 文献1所记载的那样，可以采用本领域技术人员公知的方法来制备。 例如，如后述实施例所记载的那样，采用固相合成法，获得氨基酸侧链和N末端的 氨基被保护起来的保护肽(或者糖肽)，使用PyB0P (苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷 基_六氟磷酸辚)/DIPEA作为縮合剂，使该C末端侧的羧基在液相中与苄基硫醇縮合，然 后，通过使用95% TFA溶液将氨基酸的链脱保护，由此可以获得在C末端上具有a -羧基硫 代酯部分的肽(或者糖肽)。 连接法可以采用专利文献1所记载的本领域技术人员公知的方法，并参照后述实 施例的记载来实施。例如，参照上述的记载，准备在C末端上具有由-C( = O)-SR表示的 a _羧基硫代酯部分的第1肽和具有在N末端上具有-SH基的氨基酸残基的第2肽。予以说 明，在第l肽中，R只要不妨碍硫醇交换反应，并且在向羰基碳的亲核取代反应中成为脱离 基的基团，就没有特殊限定，优选从苄基硫醇等苄基型；苯硫酚、4-(羧基甲基)_苯硫酚等 芳基型；2-巯基乙磺酸盐、3-巯基丙酰胺等烷基型等中选择。另外，第2肽的N末端的-SH 基也可以根据希望被保护基保护起来，该保护基在直到以下的连接反应之前的希望时间点 进行脱保护，在N末端上具有-SH基的第2肽与第l肽进行反应。例如二硫基等，只要是在 引起连接的条件下自然脱保护的保护基，被保护基保护的第2肽也可以直接用于以下的连 接反应。 根据需要，在4-巯基苯基乙酸、苄基硫醇、苯硫酚等催化剂硫醇的存在下，将这2 个肽在lOOmM磷酸缓冲溶液等溶液中混合。优选地，相对于1当量的第1肽，按照0. 5 2 当量的比例使用第2肽，以及按照5当量左右的比例使用催化剂硫醇，进行反应。反应希望 在pH 6. 5 7. 5左右、在20 40。C左右的条件下进行约1 30小时左右。反应的进行可 以采用将HPLC、MS等组合的公知方法来确认。 通过向其中加入、二硫代苏糖醇(DTT)、三2-羧乙基膦盐酸盐(TCEP)之类的还原
剂来抑制副反应，根据希望进行精制，由此可以将第1肽与第2肽连接起来。 予以说明，当在C末端上具有羧基硫代酯部分(-C = O-SR)的肽中存在R基不同
的肽时，可以按照连接反应的顺序进行操作(参照Protein Science (2007) ， 16 :2056-2064
等)，有时可以考虑进行多次的连接操作。例如，当存在芳基、苄基和烷基作为R时， 一般地，
按照该顺序进行连接反应。 在本发明中，具体地示出肽(或者糖肽)的制备方法，其特征在于，将含有具有-SH基的氨基酸残基的肽(或者糖肽)的-SH基转变成-OH基。作为原料，使用采用上述方法 获得的肽或者糖肽。在本发明的一个方案中，优选使用采用连接法获得的肽或者糖肽。然 后，进行以下的工序(a) (c): (a)通过使肽中的-SH基与甲基化剂反应，将上述_SH基转变成_SMe基的工序；
(b)通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以 及 (c)在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变 成含有具有-OH基的氨基酸残基的肽的工序。
以下示出使用肽作为原料的情况。
工序(a) 在工序(a)的甲基化中使用的甲基化剂只要是能够将肽中的-SH基转变成_SMe 基，就没有特殊的限定，可举出例如，碘甲烷、甲基_4-硝基苯磺酸酯等。
甲基化剂的用量，相对于原料肽的-SH基l残基，可以为1 1000当量，优选为 10 100当量，更优选为15 30当量。甲基化反应希望在0 50。C、优选在20 3(TC下 进行约10分钟 30小时左右、更优选15分钟 1小时左右。 作为进行甲基化反应时的溶剂，优选缓冲溶液，优选可以使用其pH值7 9、特别 是8 9的缓冲溶液。例如，可以使用0. 25M三盐酸缓冲溶液(含有6M盐酸胍液、3. 3mM EDTA， pH 8. 6)等。 予以说明，在肽中，当作为氨基酸含有半胱氨酸残基，并且不希望将其转变成丝氨 酸残基，而是使其在按照本发明的制备方法获得的肽中作为半胱氨酸残基存在时，可以采 用公知的方法将其以一种把半胱氨酸保护起来的保护半胱氨酸的形态引入肽中，这样可以 防止半胱氨酸的-SH基在工序(a)中被甲基化。作为半胱氨酸的保护基，考虑到本发明的制 备方法的各工序中的硫醇交换反应、酸处理、碱处理等，可以使用适当的保护基，例如，可以 使用乙酰胺甲基(Acm)、苄基、乙酰胺基、三苯甲基等，优选使用Acm基。在工序(a) (c) 之后，根据希望，采用公知的方法将保护半胱氨酸残基脱保护。例如，在将Acm基、硝基苄 基、三苯甲基等作为保护基引入保护半胱氨酸的情况下，通过追加利用乙酸银乙酸水溶液
的脱保护法、利用光的脱保护法、利用酸处理的脱保护法等的工序，将其转变成半胱氨酸残
基。这样，可以使半胱氨酸残基存在于采用本发明的制备方法获得的肽中。 予以说明，根据本发明的一个方案，也可以由具有-SMe基的肽通过将-SMe基转变
成-OH基来获得具有-OH基的肽，这样就可以省略上述工序(a)。 工序(b) 作为在工序(b)中使用的氰化剂，例如，从稳定性等观点考虑，可以使用溴化氰、 氰酸苯酯等，优选可以使用容易获得的溴化氰。 氰化剂的用量，相对于-SMe基l，可以为1 1000当量，优选为10 100当量，更 优选为15 30当量。与氰化剂的反应希望在0 5(TC下、优选在30 4(TC下进行约30 分钟 100小时左右、优选12小时 50小时左右。 与氰化剂的反应，在酸性条件下进行，特别优选在pH值2 3的条件下进行。可 以通过使用酸性水溶性物质、具体为甲酸、三氟乙酸、甲磺酸等，在酸性条件下进行反应。此 时，作为使用的酸性水溶性物质，为了防止硫原子氧化，特别优选使用经过脱气的物质。另外，从氰化剂的稳定性的观点考虑，反应优选在遮光下进行。 作为溶剂，优选使用上述的pH值为2 3的水溶性溶剂，例如，80%甲酸溶液、
70%甲酸溶液、含有2%三氟乙酸/39%乙腈的水溶液等。 在工序(b)中获得的反应中间体的一例为由以下结构表示的酯体。
<formula>formula see original document page 25</formula> 予以说明，在肽中，当作为氨基酸含有蛋氨酸残基时，优选将蛋氨酸残基 的-SMe基与工序(a)中获得的-SMe基区分开。在本说明书中，保护蛋氨酸只要是在 工序(b)中不与氰化剂反应的化合物，就没有特殊限定，可举出例如，亚砜型蛋氨酸 (Met(O) :-CH2-CH2-S( = 0)_CH3)。如后述的实施例5所记载的那样，通过采用公知的方法 将保护蛋氨酸(例如Met(O))引入到肽中，可将蛋氨酸残基与工序(a)中获得的-SMe基区 分开，使得蛋氨酸残基相对于与工序(b)的氰化剂的反应，成为惰性的。然后，采用适宜的 公知方法，将保护蛋氨酸残基转变成蛋氨酸残基(后述的工序(e))。这样，具有蛋氨酸残基 的肽也可以采用本发明的制备方法来获得。 另外，根据需要，可以除去作为在与工序(b)的氰化剂的反应时所形成的副生成 物的半胱氨酸的氧化体。这种除去工序可以通过例如，使含有工序(b)中获得的反应中 间体的混合物在碘化铵和二甲硫醚的存在下、在室温下反应30分钟左右，然后进行分液洗 涤。除去工序只要是在工序(b)之后，在任何时点进行均可，优选可以在工序(c)之后进行。
工序(c) 在工序(c)中，在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，通过由工序(b)中获得的 反应中间体的0-向N-的分子内酰基转移，获得含有具有-OH基的氨基酸残基的肽。
工序(c)中的碱性条件只要是与工序(b)相比为碱性较强的条件即可，可以是酸 性或者中性，更具体地说，只要是与工序(b)中获得的反应中间体的酯键相邻的C原子上 的_NH2基不被质子化的条件即可。从高效地进行由反应中间体向具有-0H基的肽的转变 的观点考虑，可以使用弱碱性条件或者强碱性条件。 当工序(c)中的碱性条件为弱碱性时，其pH值为pH7 9，优选为pH7 8。例 如，通过将胍、磷酸二钠、磷酸三钠、碳酸氢钠等属于本领域技术人员公知的pH调节剂的碱 性化合物添加到溶液中，可以形成弱碱性条件。此时，碱性化合物的用量，相对于原料肽，可 以为1 1000当量，优选为10 100当量，更优选为15 30当量。 当工序(c)中的碱性条件为弱碱性时，反应希望在0 5(TC、优选在20 4(TC下 进行约10分钟 30小时左右、优选15分钟 30小时左右，希望在pH7 9、优选pH7 8 的缓冲溶液中进行。例如，可以在0. 2M磷酸缓冲液(含有6M盐酸胍液、pH7. 2)中进行工 序(c)。 当工序(c)中的碱性条件为弱碱性时，可以通过将pH值进一步降低来结束工序(c)，但是在原有的pH值保持不变的条件下，也可利用HPLC等使工序转变为精制工序。
当工序(c)中的碱性条件为强碱性时，其pH值为pH9 13，优选为pHIO 11。强 碱性条件优选为可以通过水解将羟基过量反应的化合物除去的条件，将碱性水溶性物质， 例如，肼含水物、50mM氢氧化钠水溶液等添加到溶液中，形成强碱性条件。此时，碱性水溶性 物质的用量，相对于原料肽，可以为0. 5 100当量，优选为0. 1 10当量，更优选为0. 5 1当量。例如，可以在pH10 11的5%肼水溶液中进行工序(c)。 当工序(c)中的碱性条件为强碱性时，通过由工序(b)中获得的反应中间体的 0-向N-的分子内酰基转移，获得含有具有-OH基的氨基酸残基的肽，同时，对于在工序 (a) (b)中过量反应的-OH基，会引起脱氰基化(通过水解将过量反应的氰化剂除去的脱 氰基化反应)、脱甲酰基化(过量反应的甲酸的脱甲酰基化反应)等。 当工序(c)中的碱性条件为强碱性时，工序(c)希望在0 5(TC、优选20 30°C 下进行约5分钟 3小时左右、优选5分钟 1小时、更优选5分钟 10分钟左右。当工 序(c)中的碱性条件为强碱性时，如果长时间进行工序(c)，则会引起外消旋化、肽键的切 断等副反应。 当工序(c)中的碱性条件为强碱性时，工序(c)可以通过将pH值降低至pH4 9、 优选5 9、例如pH7附近和pH8 9等来使其结束。 予以说明，在工序(c)中，获得的具有-OH基的氨基酸残基的13位的立体预想由 工序(b)中获得的反应中间体进行反转。
工序(d) 在以含有保护蛋氨酸残基的肽作为原料的情况下，根据希望，进一步在工序(b) 或者(c)之后进行以下的工序(d):
(d)将保护蛋氨酸脱保护的工序。 脱保护可以根据所使用的保护蛋氨酸，采用本领域技术人员公知的方法来进行。 例如，当用亚砜型(Met(O))引入蛋氨酸作为保护蛋氨酸时，通过追加使用碘化铵/二甲硫 醚/TFA混合液等的还原工序，将保护蛋氨酸转变成蛋氨酸。从避免副反应的观点考虑，优 选在工序(c)之后进行工序(d)。 这样，对于获得具有蛋氨酸残基的肽的情况，也可以使用本发明的制备方法。
生成物的精制优选采用在数种高效液相色谱条件下获得97%以上的精制物的方 法。具体地可举出，结晶化、交流分配法、分配色谱法、凝胶过滤法、离子交换色谱法、高效液 相色谱法等。优选可以使用高效液相色谱法等。 除了上述的工序以外，可以进一步进行糖链的加成工序。糖链的加成也可以对肽 和糖肽中的任一个来进行，只要获得目标的糖肽，在任何时间点进行都可以，优选在工序 (c)之后进行。 糖链的加成可以利用以反式谷氨酰胺酶为代表的、酶的逆反应的方法、和参照以 下那些国际公开编号W02005/010053的记载的方法来进行。 首先，通过使卤代乙酰胺化复合型糖链衍生物与上述获得的肽(特别是包含天冬 氨酸和谷氨酸等在分子内具有2个以上羧基的氨基酸；赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸等 在分子内具有2个以上氨基的氨基酸；丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等在分子内具有羟基的氨基 酸；半胱氨酸等在分子内具有硫羟基的氨基酸；天冬酰胺、谷氨酰胺等在分子内具有酰胺
26基的氨基酸等的肽。特别是包含天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨
酸、天冬酰胺或者谷氨酰胺的肽)反应来制备。上述反应通常可以在0 8(TC、优选10
6(TC、更优选15 35t:下进行。反应时间优选通常为30分钟 5小时左右。反应结束后
也可以采用适宜的、公知方法(例如，高效液相柱色谱法(HPLC))进行精制。 卤代乙酰胺化复合型糖链衍生物为例如，通过使用-NH- (CO) - (CH2) a_CH2X (式中，X
为卤原子，a为整数，只要不抑制目标的连接基功能就没有限定，优选为0 4的整数)。将
在复合型天冬酰胺键型糖链的1位碳上键合的羟基取代而获得的化合物。 具体地，使卤代乙酰胺化复合型糖链衍生物与上述获得的肽在磷酸缓冲液中、在
室温下进行反应。反应结束后，用HPLC精制，可以获得加成了糖链的糖肽。 除了上述的方法以外，也可以组合利用转移酶的糖链伸长反应。这样获得的糖肽
也包含在本发明的范围内。实施例
以下基于实施例，具体地说明本发明，但本发明不受它们的任何限定。
实施例1 Ac-Ala-Ser-Gly-Leu的制备 向固相合成用柱子中加入王氏树脂(Merck公司制)(100 iimo )，用二氯甲烷 (DCM) 、 DMF充分洗涤后，用DCM使其充分溶胀。使Fmoc-Leu (0. 50mmo1) 、 MSNT (0. 50mmo1) 和N-甲基咪唑(0.375mmo1)溶解于DCM(2mL)中，将其加入到固相合成用柱子中，在25°C 下搅拌1小时。予以说明，DCM也可以为1. 5mL。搅拌后，将树脂用DCM和DMF充分洗涤，将 Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。予以说明，本脱保护处理 也可以进行10分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的伸长采用以下所示的方法，依次使氨基 酸縮合。 把用Fmoc基将氨基保护起来的氨基酸和HOBt (67. 6mg、0. 50mmo1)、 DIPCI (77. 0 ii L、63. lmg、0. 50mmo1)溶解于DMF(lmL)，活化15分钟后，将其加入到固相合成 用柱子中。予以说明，DMF也可以为2mL。在25。C下搅拌1小时后，将Fmoc基用20%哌啶/ DMF溶液(2mL)处理20分钟，进行脱保护。予以说明，本脱保护处理也可以进行10分钟。重 复该操作，依次使氨基酸縮合。作为被Fmoc基保护起来的氨基酸，使用Fmoc-Gly(148. 7mg、 0. 50mmo1) 、Fmoc-Cys(Trt) (292. 9mg、0. 50mmo1) 、 Fmoc—Ala (155. 7mg、0. 50mmo1)，获得固相 树脂中具有Fmoc-Ala-Cys(Trt)-Gly-Leu的保护基的4残基肽(序列编号1)。然后，在 树脂上，将Fmoc基用20 %哌啶/DMF溶液(2mL处理20分钟，进行脱保护，使用20 %乙酸 酐/DMF溶液(2mL)，对游离氨基进行乙酰基保护。予以说明，20 %乙酸酐/DMF溶液也可以 为1. 7mL。使用DMF、 DCM洗涤后，将预先准备的试剂(TFA/水/苯酚/茴香硫醚/EDT (1， 2-乙二硫酚)/TIPS = 81.5/5/5/5/2. 5/1)加入到足以充分浸没树脂的程度，在25。C下 搅拌2小时。过滤除去树脂，将反应溶液减压浓縮。将获得的残留物用HPLC(Vydac柱C8 250X10mm ;展开溶剂A :0. 1% TFA水溶液、B :0. 08% TFA、乙腈水=90 : IO;梯度A : B =85 : 15->50 : 50、60分钟；流速3. Oml/min)精制，获得具有Ac-Ala-Cys-Gly-Leu的保 护基的4残基肽(序列编号2)。 将获得的4残基的肽(序列编号2)30mg(73ymo1)加入到茄型烧瓶中，使其溶解 于0. 25M三盐酸缓冲溶液73mL(pH8. 6、含有6M盐酸胍液、3. 3mM EDTA)禾P乙腈24mL中，然 后，在25。C下加入甲基-4-硝基苯磺酸酯(316mg) 。 30分钟后，加入10% TFA溶液(7. 3mL)，调节至pH4后，加入乙醚，进行萃取操作。浓縮后，将获得的残留物用0DS柱子进行精制，获 得具有Ac-Ala-Cys (Me) -Gly-Leu的半胱氨酸残基的硫原子被甲基化的保护基的4残基肽 (序列编号3)25mg。 ESI-MS :Calcd for C17H30N406S : [M+1H]1+ 419. 2、 found、419. 1
将获得的半胱氨酸残基的硫原子被甲基化的4残基肽(序列编号 3) 6. 5mg (15 li mol) 力口 入 至lj 离 心 管 (Eppendorf tube, microcentrifugetube， microfuge tube)中，使其溶解于80 %甲酸溶液(6. 5mL)中，然后，在25 °C下加入溴化 氰159. Omg(l. 5mmo1)。将反应容器遮光，然后，在37 °C下进行反应，28. 5小时后，将反 应溶液冷冻以使反应停止。将该反应产物冻干后，将获得的残留物用HPLC(Vydac柱C4 250X4. 6mm ;展开溶剂A :0. 1% TFA水溶液、B :0. 08% TFA、乙腈水=90 : 10 ;梯度A : B =100 : 0->60 : 40、30分钟；流速1. 0ml/min)进行精制，获得作为反应中间体的酯体 3. 8mg。ESI-MS :Calcd for C16H28N407 : [M+1H]1+ 389. 4、 found、389. 2 将同样获得的反应中间体5mg加入到离心管中，用磷酸缓冲溶液(pH7. 2、含有6M 盐酸胍)0.6mL使其溶解后，在37t:下使其反应。1小时后，用HPLC确认反应结束，然后用 HPLC(Vydac柱C4 250X4. 6mm ;展开溶剂A :0. 1% TFA水溶液、B :0. 08% TFA、乙月青:水= 90 : 10;梯度A : B = 100 : 0->60 : 40、30分钟；流速l. 0ml/min)进行精制，获得具有 目的保护基的4残基肽Ac-Ala-Ser-Gly-Leu (序列编号4) 3. 5mg。予以说明，反应结束时间 也可以定在30分钟后。ESI-MS :Calcd for C16H28N407 : [M+1H]1+ 389. 4、 found、389. 1
实施例2 Val-Asp-Lys-Ala-Val-Ser-Gly-Leu的制备 向固相合成用柱子中加入王氏树脂(Merck公司制)(100iimol)，用二氯甲烷 (DCM) 、 DMF充分洗涤后，用DCM使其充分溶胀。使Fmoc-Leu (0. 50mmo1) 、 MSNT (0. 50mmo1) 和N-甲基咪唑(0. 375mmo1)溶解于DCM(2mL)中，将其加入到固相合成用柱子中，在25°C 下搅拌1小时。予以说明，DCM也可以为1. 5mL。搅拌后，将树脂用DCM和DMF充分洗涤，将 Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。予以说明，本脱保护处理 也可以进行10分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的伸长采用以下所示的方法，依次使氨基 酸縮合。 把用Fmoc基将氨基保护起来的氨基酸和H0Bt (67. 6mg、0. 50mmo1)、 DIPCI(77. 0ii L、63. lmg、0. 50mmo1)溶解于DMF(lmL)中，活化15分钟后，将其加入到固相合 成用柱子中。予以说明，DMF也可以为2mL。在25。C下搅拌1小时后，将Fmoc基用20%哌啶 /DMF溶液(2mL)处理20分钟，进行脱保护。予以说明，本脱保护处理也可以进行10分钟。重 复该操作，依次使氨基酸縮合。作为被Fmoc基保护起来的氨基酸，使用Fmoc-Gly (148. 7mg、 0. 50mmo1) 、 Fmoc-Cys (Trt) (292. 9mg、0. 50mmo1) 、 Fmoc-Val (169. 7mg、0. 50mmo1)、 Fmoc-Ala (155. 7mg、0. 50mmo1) 、 Fmoc-Lys (Boc) (234. 3mg、0. 50mmo1) 、 Fmoc-Asp (OtBu) (205. 8mg、0. 50mmo1) 、Fmoc-Val (169. 7mg、0. 50mmo1)，获得固相树脂中具有Fmoc-Val-Asp ( OtBu) -Lys (Boc) -Ala-Val-Cys (Trt) -Gly-Leu的保护基的8残基月太(序列编号5)。然后， 在树脂上，将Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2mL)处理20分钟，进行脱保护，使用DMF、DCM 洗涤后，将预先准备的试剂K(TFA/水/苯酚/茴香硫醚/EDT = 82. 5/5/5/5/2. 5)加入到足以充分浸没树脂的程度，在25t:下搅拌2小时。予以说明，也可以使用TFA/水/苯酚/ 茴香硫醚/EDT/TIPS = 81. 5/5/5/5/2. 5/1. 0代替试剂K。过滤除去树脂，将反应溶液减压 浓縮。将获得的残留物用HPLC(Vydac柱C18 250X10mm ;展开溶剂A :0. 1% TFA水溶液、B : 0. 08% TFA、乙腈水=90 : IO;梯度A : B = 85 : 15->50 : 50、15分钟；流速2. 5ml/ min)精制，获得8残基的肽、Val-Asp-Lys-Ala-Val-Cys-Gly-Leu (序列编号6)。
将获得的8残基的肽(序列编号6)32mg(40ymo1)加入到茄型烧瓶中，使其溶解 于0. 25M三盐酸缓冲溶液40mL(pH8. 6、含有6M盐酸胍液、3. 3mM EDTA)和乙腈13mL中，然 后，在25t:下加入甲基-4-硝基苯磺酸酯(261mg)。 1小时后，加入10% TFA溶液(3. 8mL)， 调节至pH4后，加入乙醚，进行萃取操作。浓縮后，将获得的残留物用ODS柱子进行精制，获 得Val-Asp-Lys-Ala-Val-Cys (Me) -Gly-Leu的半胱氨酸残基的硫原子被甲基化的8残基肽 (序列编号7)30mg。 ESI-MS :Calcd for C35H64N9OnS : [M+1H]1+ 819. 0、 found、818. 8
将获得的半胱氨酸残基的硫原子被甲基化的8残基肽(序列编号 7) 29mg (36 y mol)加入到茄型烧瓶中，使其溶解于80 %甲酸溶液15mL中，然后，在25°C下 加入溴化氰381mg(3.6mmo1)。将反应容器遮光，然后，在25°C下进行反应，32小时后，将 反应溶液冷冻以使反应停止。将该反应产物冻干后，将获得的残留物用HPLC(Vydac柱C8 250X10mm ;展开溶剂A :0. 1% TFA水溶液、B :0. 08% TFA、乙腈水=90 : IO;梯度A : B =90 : 10->70 : 30、60分钟；流速4.0ml/min)进行精制，获得作为反应中间体的酯体 18mg。 ESI-MS :Calcd for C34H62N9012 : [M+1H]1+ 788. 9、 found、788. 5
将获得的反应中间体5mg加入到离心管中，用磷酸缓冲溶液(pH7. 2、含有6M盐 酸胍)0. 63mL使其溶解后，在37t:下使其反应。9. 25小时后，确认反应结束，然后，用 HPLC(Vydac柱C4 250X4. 6mm ;展开溶剂A :0. 1% TFA水溶液、B :0. 08% TFA、乙月青:水= 90 : IO;梯度A : B = 100 : 0->40 : 60、30分钟；流速1. Oml/min)进行精制，获得目标 的8残基肽Val-Asp-Lys-Ala-Val-Ser-Gly-Leu(序列编号8)4. lmg。予以说明，反应结束 时间也可以定在7. 25小时后。ESI-MS :Calcd for C34H62N9012 : [M+1H]1+ 788. 9、 found、788. 7 实施例3 Leu-Phe-Arg-Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg-Gly的击'l备 向固相合成用柱子中加入王氏树脂(Merck公司制)(100iimol)，用二氯甲烷
(DCM) 、 DMF充分洗涤后，用DCM使其充分溶胀。使Fmoc-Gly (0. 50mmo1) 、 MSNT (0. 50mmo1)
和N-甲基咪唑(0. 375mmo1)溶解于DCM(2mL)中，将其加入到固相合成用柱子中，在25°C
下搅拌1小时。予以说明，DCM也可以为1. 5mL。搅拌后，将树脂用DCM和DMF充分洗涤，将
Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。予以说明，本脱保护处理
也可以进行10分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的伸长采用以下所示的方法，依次使氨基
酸縮合。 把用Fmoc基将氨基酸保护起来的氨基酸和H0Bt (67. 6mg、0. 50mmo1)、 DIPCI(77. Oii L、63. lmg、0. 50mmo1)溶解于DMF(lmL)中，活化15分钟后，将其加入到固相 合成用柱子中。在25t:下搅拌1小时后，将Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2mL)处理20 分钟，进行脱保护。予以说明，本脱保护处理也可以进行10分钟。重复该操作，依次使氨基酸縮合。作为被Fmoc基保护起来的氨基酸，使用Fmoc-Arg(Pbf) (324. 4mg、0. 50mmol)、 Fmoc-Leu (176. 7mg、0. 50mmol) 、 Fmoc-Phe (193. 7mg、0. 50mmol) 、 Fmoc-Asn (177. 2mg、 0. 50mmol) 、 Fmoc-Cys (Trt) (292. 9mg、0. 50mmol) 、 Fmoc-Tyr (tBu) (229. 8mg、0. 50mmol)、 Fmoc-Val (169. 7mg、0. 50翻1) 、 Fmoc-Arg (Pbf) (324. 4mg、0. 50,1) 、 Fmoc-Phe (193. 7mg、 0. 50mmol) 、 Fmoc-Leu (176. 7mg、0. 50mmol)，获得固相树脂中具有Fmoc-Leu-Phe-Arg(Pbf) -Val-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Asn-Phe-Leu-Arg(Pbf)-Gly的保护基的11残基肽(序列编号 9)。然后，在树脂上，将Fmoc基用20 %哌啶/DMF溶液2mL处理20分钟，进行脱保护。予以说 明，本脱保护处理也可以进行10分钟。使用DMF、DCM洗涤后，将预先准备的试剂K (TFA/水/ 苯酚/茴香硫醚/EDT = 82. 5/5/5/5/2. 5)加入到足以充分浸没树脂的程度，在25。C下搅拌 2小时。予以说明，也可以使用TFA/水/苯酚/茴香硫醚/EDT/TIPS = 81. 5/5/5/5/2. 5/1.0 代替试剂K。过滤除去树脂，将反应溶液减压浓縮。将获得的残留物用HPLC(Vydac柱C18 250X10mm ;展开溶剂A :0. 1% TFA水溶液、B :0. 08% TFA、乙腈水=90 : 10;梯度A : B =70 : 30->40 : 60、15分钟；流速2. 0ml/min)精制，获得Leu-Phe-Arg-Val-Tyr-Cys-As n-Phe-Leu-Arg-Gly的11残基的肽(序列编号10)。 将获得的11残基的肽(序列编号10)21mg(15践o1)加入到茄型烧瓶中，使其溶 解于0. 25M三盐酸缓冲溶液15mL(pH8. 6、含有6M盐酸胍液、3. 3mM EDTA)和乙腈(5mL)中， 然后，在25t:下加入甲基-4-硝基苯磺酸酯(66mg) 。 30分钟后，加入10% TFA溶液(1. 5mL)， 调节至pH4后，加入乙醚，进行萃取操作。浓縮后，将获得的残留物用0DS柱子进行精制，获 得Leu-Phe-Arg-Val-Tyr-Cys (Me) -Asn-Phe-Leu-Arg-Gly的半胱氨酸残基的硫原子被甲 基化的11残基肽(序列编号11) 19mg。 ESI-MS :Calcd for C^H^NwOmS : [M+2H]2+ 701. 4、 found、701. 5
将获得的半胱氨酸残基的硫原子被甲基化的11残基肽(序列编号 11) 18mg(13 ii mol)加入到茄型烧瓶中，使其溶解于2. 4mM 80%甲酸溶液5. 4mL中，然后，在 25t:下加入溴化氰136mg(l. 3mmo1)。将反应容器遮光，然后，在25。C下进行反应，约50小 时后，将反应溶液冷冻以使反应停止。将该反应产物冻干后，将获得的残留物用HPLC(Vydac 柱C8 250X10mm ;展开溶剂A :0. 1% TFA水溶液、B :0. 08% TFA、乙腈水=90 : 10 ;梯度 A : B = 85 : 15->50 : 50、60分钟；流速3. 0ml/min)进行精制，获得作为反应中间体的 酯体7. 5mg。ESI-MS :Calcd for C65H1(I。N18015 : [M+2H]2+ 686. 4、 found、686. 5 将获得的反应中间体7mg加入到离心管中，用磷酸缓冲溶液(pH7. 2、含有6M盐酸
胍)0.50mL使其溶解后，在37t:下使其反应。1小时后，确认反应结束后，用HPLC (Vydac柱
C4 250X4. 6mm ;展开溶剂A :0. 1% TFA水溶液、B :0. 08% TFA、乙腈水=90 : 10 ;梯度
A : B = 80 : 20->40 : 60、30分钟；流速1. 0ml/min)进行精制，获得目标的Leu-Phe-Ar
g-Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg-Gly的11残基肽(序列编号12)5. 4mg。ESI-MS :Calcd for C65H1(I。N18015 : [M+2H]2+ 686. 4、 found、686. 4 实施例4 Ala-Leu-Leu-Val-Asn (寡糖链)-Ser-Ser-Gln-Pro-Trp-Glu-Pro-Leu-
Gln-Leu-His-Val-Asp-Lys-Ala的制备 向固相合成用柱子中加入氨基-PEGA树脂(Merck公司制)(100iimol)，用二氯 甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF使其充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB) (0. 25,1) 、TBT緣25,1)和N_乙基吗啉(0. 25,1)溶解于DMF (2ml)中，将其 加入到柱子中，在25t:下搅拌4小时。将树脂用DMF和DCM充分洗涤，获得HMPB-PEGA树 脂，将其用作固相合成用的固相载体。 使Fmoc-Ser (tBu) (0. 50mmol) 、MSNT (0. 50mmol)和N_甲基咪唑(0. 375mmol)溶解 于DCM(2ml)中，将其加入到固相合成用柱子中，在25t:下搅拌3小时。予以说明，DCM也可 以为2. 5mL。搅拌后，将树脂用DCM、DMF洗涤，将Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2mL)处理 15分钟，进行脱保护。予以说明，本脱保护处理也可以进行10分钟。 用DMF洗涤后，将与l残基的肽2ymol相当的树脂转移至离心管中。使下述式 (9)表示的糖链天冬酰胺(10mg，3. 6iimo1)和DEPBT (2mg， 6 y mol)溶解于DMF(O. 12mL)中， 将其加入到离心管中，加入DIPEA(O. 68iil，4iimo1)，在25"下搅拌18小时。
(9) 搅拌后，将树脂用DCM、DMF洗涤。将Fmoc基用20 %哌啶/DMF溶液(lml)处理15 分钟，进行脱保护。用DMF洗涤后，其后的糖肽链的伸长采用以下所示的方法，依次使氨基 酸縮合。 把用Fmoc基将氨基酸保护起来的氨基酸和HOBt (1. 35mg、0. Olmmol)、 DIPCI (1. 53ii L、l. 26mg、0. Olmmol)溶解于DMF(O. 02mL)中，活化15分钟后，将其加入到固 相合成用柱子中。在25t:下搅拌1小时后，将Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(lmL)处理 20分钟，进行脱保护。重复该操作，依次使氨基酸縮合。作为氨基被保护起来的氨基酸，使 用Fmoc-Val(3. 4mg、0. Olmmol)、Fmoc-Leu(3. 5mg、0. Olmmol)、Fmoc-Leu(3. 5mg、0. Olmmol)、 Fmoc-Ala(3. lmg、0. 01,1)，获得固相树脂中具有Fmoc-Ala-Leu-Leu-Val-Asn (寡糖 链)-Ser (tBu)的保护基的6残基糖加成肽(序列编号13)。将所获产物加入到乙酸三氟 乙醇(=1 : 1)中以便达到树脂被充分浸没的程度，4小时后，过滤除去树脂，将滤液部分 加入到另外准备的乙醚中，进行晶析，将溶液部分用膜式过滤器除去，获得含有具有保护基 的6残基的糖链加成肽(序列编号13)的残留物。 将获得的具有保护基的6残基的糖链加成肽(序列编号13)2mg(0.55ymo1)和 分子筛(MS)4A(10mg)、苄基硫醇(2iil，16.4iimo1)在DMF溶剂中(85 yl)、在氩气流中、 在-2(TC下搅拌1小时，然后，加入PyBOP (1. 4mg， 2. 7 ii mol) 、DIPEA (0. 46 yl， 2. 7 y mol)，搅 拌2. 5小时。然后，向反应溶液中加入乙醚(5ml)，使化合物沉淀，过滤后，将沉淀物用乙腈 50%水溶液回收。将其冻干，向获得的冻干品中加入95% TFA水溶液，在25t:下搅拌2小 时。过滤除去树脂，将反应溶液浓縮后，将其溶解于50%乙腈水溶液中，冻干。将冻干品用 HPLC(Vydac柱C4 250X4. 6mm ;展开溶剂A :0. 1% TFA水溶液、B :0. 08% TFA、乙月青:水= 90 : IO;梯度A : B = 80 : 20->40 : 60、60分钟；流速l. Oml/min)进行精制，获得C末
31端为苄基硫代酯的Ala-Leu-Leu-Val-Asn(寡糖链)-Ser-SBn的6残基的糖链加成肽(序 列编号15)。 予以说明，作为通过与离心管内的糖链天冬酰胺的反应而获得序列编号15的6残 基的糖链加成肽的上述工序，也可以采用以下的方法 用DMF洗涤后，将与l残基的肽4. 3ymol相当的树脂转移至离心管中。使式(9)表 示的糖链天冬酰胺(17mg， 8. 6 ii mol)和DEPBT (6mg， 8. 6 ii mol)溶解于DMF :匿S0 = 4:1 的混合液O. 29mL中，将其加入到离心管中，加入DIPEA(l. 5iU，8. 6iimol)，在25。C下搅拌 18小时。 搅拌后，将树脂用DCM、DMF洗涤。将Fmoc基用20 %哌啶/DMF溶液(lml)处理10 分钟，进行脱保护。用DMF洗涤后，其后的糖肽链的伸长采用以下所示的方法，依次使氨基 酸縮合。 把用Fmoc基将氨基酸保护起来的氨基酸和H0Bt (2. 9mg、0. 022mmo1)、 DIPCI (3. 3 ii L、0. 022mmo1)溶解于DMF(O. 54mL)中，活化15分钟后，将其加入到固 相合成用柱子中。在25t:下搅拌1小时后，将Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(lmL) 处理20分钟，进行脱保护。重复该操作，依次使氨基酸縮合。作为氨基被保护起 来的氨基酸，使用Fmoc-Val (7. 3mg、0. 022mmo1) 、 Fmoc-Leu(7. 6mg、0. 022mmo1)、 Fmoc-Leu(7. 6mg、0. 022mmo1) 、 Boc-Ala(4. Omg、0. 022mmo1)，获得固相树脂中具有 Boc-Ala-Leu-Leu-Val-Asn(寡糖链)-Ser(tBu)的保护基的6残基糖加成肽(序列编号 14)。将所获产物加入到乙酸三氟乙醇(=1:1)中以便达到树脂被充分浸没的程度， 24小时后，过滤除去树脂，将滤液部分加入到另外准备的乙醚中，进行晶析，将溶液部分用 膜式过滤器除去，获得含有具有保护基的6残基的糖链加成肽(序列编号14)的残留物。
将获得的具有保护基的6残基的糖链加成肽(序列编号14) 18mg (7. 5 y mol)和分 子筛(MS)4A(190mg)、苄基硫醇(26 yl， 37. 5 y mol)在DMF溶剂中(1. 9mL)、在氩气流中、 在-20。C下搅拌1小时，然后，加入PyB0P(20mg，37. 5iimo1) 、 DIPEA(6. 7ii 1，37. 5iimo1)， 搅拌2小时。然后，向反应溶液中加入乙醚(10ml)，使化合物沉淀，过滤后，将沉淀物用DMF 溶解。将其减压浓縮，向获得的残留物中加入95% TFA水溶液，在25t:下搅拌2小时。将 反应液浓縮后，用HPLC(Vydac柱C4 250X4. 6mm ;展开溶剂A :0. 1% TFA水溶液、B :0. 08% TFA、乙腈水=90 : 10 ;梯度A : B = 100 : 0->40 : 60、60分钟；流速l. Oml/min)精 制，获得C末端为苄基硫代酯的Ala-Leu-Leu-Val-Asn (寡糖链)-Ser-SBn的6残基的糖链 加成肽(序列编号15)。 另一方面，向固相合成用柱子中加入王氏树脂(Merck公司制)(100 iimol)， 用二氯甲烷(DCM)、 DMF充分洗涤后，用DCM使其充分溶胀。使Fmoc-Ala(0. 50mmol)、 MSNT(O. 50mmo1)和N-甲基咪唑(0. 375mmo1)溶解于DCM(2mL)中，将其加入到固相合成用 柱子中，在25t:下搅拌1小时。予以说明，DCM也可以为1. 5mL。搅拌后，将树脂用DCM和 DMF充分洗涤，将Fmoc基用20 %哌啶/DMF溶液(2mL)处理15分钟，进行脱保护。予以说 明，本脱保护处理也可以进行10分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的伸长采用以下所示的 方法，依次使氨基酸縮合。 把用Fmoc基将氨基保护起来的氨基酸和H0Bt(67. 6mg、0. 50mmo1)、 DIPCI(77. Oii L、63. lmg、0. 50mmo1)溶解于DMF(lmL)中，活化15分钟后，将其加入到固相合成用柱子中。予以说明，DMF也可以为2mL。在25。C下搅拌1小时后，将Fmoc基用20%哌啶 /DMF溶液(2mL)处理20分钟，进行脱保护。重复该操作，依次使氨基酸縮合。作为被Fmoc基 保护起来的氨基酸，使用Fmoc-Lys (Boc) (234. 3mg、0. 50mmo1) 、 Fmoc-Asp (OtBu) (205. 8mg、 0. 50mmo1) 、 Fmoc-Val (169. 7mg、0. 50mmo1) 、 Fmoc-His (Trt) (309. 9mg、0. 50mmo1)、 Fmoc-Leu (176. 7mg、0. 50mmo1) 、 Fmoc-Gln (184. 2mg、0. 50mmo1) 、 Fmoc-Leu (176. 7mg、 0. 50mmo1) 、 Fmoc-Pro (168. 7mg、0. 50mmo1) 、 Fmoc-Glu (0tBu) (212. 8mg、0. 50mmo1)、 Fmoc-Trp (Boc) (263. 3mg、0. 50mmo1) 、 Fmoc-Pro (168. 7mg、0. 50mmo1) 、 Fmoc-Gln (184. 2mg、 0. 50mmo1) 、Fmoc-Cys (Trt) (292. 9mg、0. 50mmo1)，获得固相树脂中具有Fmoc-Cys (Trt) -Gln -Pro-Trp (Boc)-Glu(0tBu)-Pro-Leu-Gln-Leu-His(Trt)-Val-Asp(0tBu)-Lys (Boc)-Ala的 保护基的14残基肽(序列编号16)。然后，将Fmoc基用20 %哌啶/DMF溶液(2mL)处理20分 钟，进行脱保护，使用DMF、DCM洗涤后，将预先准备的试剂K (TFA/水/苯酚/茴香硫醚/EDT =82. 5/5/5/5/2. 5)加入到足以充分浸没树脂的程度，在25。C下搅拌2小时。予以说明，也 可以使用TFA/水/苯酚/茴香硫醚/EDT/TIPS = 81. 5/5/5/5/2. 5/1. 0代替试剂K。过滤除 去树脂，将反应溶液减压浓縮。将获得的残留物用HPLC(Vydac柱C8 250X 10mm ;展开溶剂 A :0. 1% TFA水溶液、B :0. 08% TFA、乙腈水=90 : IO;梯度A : B = 80 : 20_>40 : 60、 30分钟；流速4. Oml/min)精制，获得Cys-Gln-Pro-Trp-Glu-Pro-Leu-Gln-Leu-His-Val-A sp-Lys-Ala的14残基肽(序列编号17)。 将这样制备的14残基肽(序列编号17)1. lmg和事先合成的C末端为苄基硫代 酯的6残基的糖加成肽(序列编号15)1.3mg这两种成分加入到相同的离心管中，使其溶 解于磷酸缓冲溶液(pH7. 2、含有6M盐酸胍)275iiL中后，在25t:下加入苯硫酚(1 y L)和 苄基硫醇(1 P L)，在37t:下进行反应。26小时后，用HPLC确认反应结束后，将反应溶液用 HPLC(Vydac柱C18 250X4. 6mm ;展开溶剂A :0. 1% TFA水溶液、B :0. 08% TFA、乙月青:水 =90 : 10;梯度A : B = 80 : 20->50 : 50、60分钟；流速l. 0ml/min)进行精制，获得 Ala-Leu-Leu-Val-Asn(寡糖链)-Ser-Cys-Gln-Pro-Trp-Glu-Pro-Leu-Gln-Leu-His-Val-A sp-Lys-Ala的20残基糖链加成肽(序列编号18) 1. 5mg。 将获得的20残基糖链加成肽(序列编号18) 1. 5mg(0. 39 y mol)加入到茄型烧瓶 中，使其溶解于O. 25M三盐酸缓冲溶液0. 39mL(pH8. 6、含有6M盐酸胍液、3. 3mM EDTA)和乙 腈O. 13mL中，然后，在25t:下加入甲基-4-硝基苯磺酸酯(1. 7mg) 。 40分钟后，加入10% TFA溶液(1.5mL)，调节至pH4后，加入乙醚，进行萃取操作。将水层浓縮后，将获得的残留 物用HPLC (Vydac柱C4 250X4. 6mm ;展开溶剂A :0. 1% TFA水溶液、B :0. 08% TFA、乙腈 水=90 : 10 ;梯度A : B = 80 : 20->55 : 45、60分钟；流速1. Oml/min)进行精制(予 以说明，精制也可以使用C18柱代替上述C4柱)，获得Ala-Leu-Leu-Val-Asn (寡糖链)_Se r_Cys (Me) -Gln-Pro-Trp-Glu-Pro-Leu-Gln-Leu-His-Val-Asp-Lys-Ala的半胱氨酸残基的 硫原子被甲基化的20残基的糖链加成肽(序列编号19) 1. 6mg。
ESI-MS :Calcd for C165H265N31074S : [M+2H]2+ 1300. 7、 found、 1300. 4
将获得的半胱氨酸残基的硫原子被甲基化的20残基糖链加成肽(序列编号 19) 1. 6mg(0. 4ii mol)加入到离心管中，用80%甲酸溶液0. 4mL使其溶解后，在25。C下加 入溴化氰4. 3mg(0. 04mmol)。将反应容器遮光，然后，在37°C下进行反应，35小时后，将反 应溶液冷冻以使反应停止。将所获产物冻干后，向获得的残留物中加入含5%肼的水合物(200iiL)，将反应体系内调节至pH10 11。 5分钟后，加入乙酸(5iiL)，将反应体系内调 节至pH8 9。将所获产物用HPLC(Vydac柱C4 250X4. 6mm ;展开溶剂A :0. 1 % TFA水溶 液、B :0. 08% TFA、乙腈水=90 : IO;梯度A : B = 80 : 20->50 : 50、30分钟；流速 1. Oml/min)进行精制，获得作为目的物的糖肽Ala-Leu-Leu-Val-Asn (寡糖链)-Ser-Ser-G ln-Pro-Trp-Glu-Pro-Leu-Gln-Leu-His-Val-Asp-Lys-Ala的20残基的糖链加成肽(序列 编号20)0. 7mg。 予以说明，在与溴化氰的反应结束34小时后，将反应溶液减压浓縮，向获得的残 留物中加入含5%肼的水合物(200iiL)，搅拌IO分钟后，向反应液中加入乙酸5iiL，用 HPLC进行精制，同样可以获得20残基的糖链加成肽(序列编号20)。
ESI-MS :Calcd for C164H263N31075 : [M+2H]2+ 1290. 6、 found、 1290. 7
实施例5 Ac-Gly-Ser-Gly-Met-Ala的制备 向固相合成用柱子中加入王氏树脂(Merck公司制)(100iimol)，用二氯甲烷 (DCM)、 DMF充分洗涤后，用DCM使其充分溶胀。使Fmoc-Ala(O. 50mmol) 、 MSNT(O. 50mmol) 和N-甲基咪唑(0. 375mmol)溶解于DCM(l. 5mL)中，将其加入到固相合成用柱子中，在25°C 下搅拌2小时。搅拌后，将树脂用DCM和DMF充分洗涤，将Fmoc基用20 %哌啶/DMF溶液 (2mL)处理15分钟，进行脱保护。用DMF洗涤后，其后的肽链的伸长采用以下所示的方法， 依次使氨基酸縮合。 把用Fmoc基将氨基酸保护起来的氨基酸和HOBt (67. 6mg、0. 50mmol)、 DIPCI(77. Oil L、63. lmg、0. 50mmol)溶解于DMF(2mL)中，活化15分钟后，将其加入到 固相合成用柱子中。在25t:下搅拌1小时后，将Fmoc基用20X哌啶/DMF溶液(2mL) 处理10分钟，进行脱保护。重复该操作，依次使氨基酸縮合。作为被Fmoc基保护起 来的氨基酸，使用Fmoc-Met(O) (193. 8mg、0. 50mmol) 、 Fmoc-Gly (148. 9mg、0. 50mmo1)、 Fmoc-Cys (Trt) (292. 9mg、0. 50mmo1) 、 Fmoc-Gly (148. 9mg、0. 50mmo1)，获得在固相树脂上具 有Fmoc-Gly-Cys (Trt) -Gly-Met (0) -Ala的保护基的5残基肽(序列编号21)。然后，在树 脂上，将Fmoc基用20X哌啶/DMF溶液(2mL)处理10分钟，进行脱保护，使用20%乙酸酐 /DMF溶液(1. 25mL)，对于游离氨基，进行乙酰基保护。使用DMF、DCM洗涤后，将预先准备的 试剂(TFA/水/TIPS = 95/2. 5/2. 5)加入到足以充分浸没树脂的程度，在25。C下搅拌2小 时。过滤除去树脂，向滤液中加入乙醚20mL，使其沉淀。将沉淀过滤后，用0. 1% TFA水溶 液使其溶解。将该溶液减压浓縮后，进行冻干，获得含有为Ac-Gly-Cys-Gly-Met (0) -Ala的 4位的蛋氨酸的硫原子被氧化的5残基肽(序列编号22)的混合物。 将获得的4位的蛋氨酸的硫原子被氧化的5残基肽(序列编号22)混合物5mg加 入到茄型烧瓶中，用0. 25M三盐酸缓冲溶液(pH8. 6、含有6M盐酸胍液、3. 3mM EDTA) 10mL将 其溶解。向所获溶液中加入2-巯基乙醇(7iiL)，搅拌IO分钟后，向反应液中加入含有甲 基-4-硝基苯磺酸酯(66mg)的乙腈溶液3. 3mL。 25分钟后，加入10% TFA溶液(1. OmL)， 中和后，加入乙醚，进行3次萃取操作。将水层减压浓縮后，将获得的残留物用HPLC(Vydac 柱C-18 250X10mm ;展开溶剂A :0. 1% TFA水溶液、B :0. 09% TFA、乙腈水=90 : 10 ;梯 度A : B = 100 : 0 — 100 : 0 — 60 : 40、0分钟一5分钟一35分钟；流速4. OmL/min) 精制，获得为Ac-Gly-Cys (Me)-Gly-Met (0)-Ala的2位半胱氨酸残基的硫原子被甲基化、4 位蛋氨酸残基被氧化的5残基肽(序列编号23)4mg。
将获得的2位的半胱氨酸残基的硫原子被甲基化、4位的蛋氨酸残基被氧化的5残 基肽(序列编号23)3. 8mg加入到离心管中，使其溶解于80%甲酸溶液3. lmL中后，加入溴 化氰79. Omg，将其遮光后，在氩置换下、在37t:下，搅拌39小时。反应后，进行减压浓縮，获 得含有作为反应中间体的酯体的残留物。 将获得的残留物加入到离心管中，用pH7.2的磷酸钠缓冲溶液1.25mL(含有 6M盐酸胍)使其溶解后，搅拌45分钟。然后，向反应液中，加入三氟乙酸3.6mL、碘化 铵22mg、二甲硫醚lly L，在室温下搅拌。30分钟后，向反应液中加入水10mL，用四氯化 碳进行分液洗涤。将水层减压浓縮，将获得的残留物用HPLC(Vydac柱C18 250X4. 6mm; 展开溶剂A :0. 1 % TFA水溶液、B :0. 09 % TFA、乙腈水=90 : 10 ;梯度A : B = 100 : 0 — 100 : O — 60 : 40、0分钟一5分钟一65分钟、流速1. OmL/min)进行精制，获 得作为目的物的具有Ac-Gly-Ser-Gly-Met-Ala的保护基的5残基肽(序列编号24) 2. 6mg。
ESI-MS :Calcd for C16H28N407 : [M+1H]1+ 464. 2、 found、464. 5 实施例6 Ser-Thr (GalNAc) -Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-A sp_Thr_Arg_Pro_Ala_Pro_Gly_Ser_Thr(GalNAc)_Ala_Pro_Pro_Ala_His_Gly_Val_Thr_Se r-Ala-Pro-AsD-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly的制备 向固相合成用柱子中加入氨基-PEGA树脂(Merck公司制)(100iimol)，用二氯 甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF使其充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸 (HMPB) (0. 25,1) 、TBT緣25,1)和N-乙基吗啉(0. 25,1)溶解于DMF(2mL)中，加入 到柱子中，在25t:下搅拌2小时。将树脂用DMF和DCM充分洗涤，获得HMPB-PEGA树脂，将 其用作固相合成用的固相载体。 将Fmoc-Gly (0. 50mmo1) 、 MSNT (0. 50mmo1)和N-甲基咪唑(0. 375mmo1)溶解于 DCM(4. 5mL)中，将其加入到固相合成用柱子中，在25。C下搅拌3小时。搅拌后，用DCM、DMF 将树脂洗涤，将Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2mL)处理10分钟，进行脱保护。用DMF洗 涤后，其后的肽链的伸长采用以下所示的方法，依次使氨基酸縮合。 把用Fmoc基将氨基保护起来的氨基酸和H0Bt (67. 6mg、0. 50mmo1)、 DIPCI(77. Oii L、63. lmg、0. 50mmo1)溶解于DMF(4mL)中，活化15分钟后，将其加入到 固相合成用柱子中。在25t:下搅拌1小时后，将Fmoc基用20X哌啶/DMF溶液(2mL) 处理10分钟，进行脱保护。重复该操作，依次使氨基酸縮合。作为被Fmoc基保护起 来的氨基酸，使用Fmoc-Pro、 Fmoc-Ala、 Fmoc-Pro、 Fmoc-Arg (Pbf) 、 Fmoc-Thr (tBu)、 Fmoc-Asp (0tBu) 、 Fmoc-Pro、 Fmoc-Ala、 Fmoc-Ser (tBu) 、 Fmoc-Thr (tBu) 、 Fmoc-Val、 Fmoc—Gly、Fmoc—His (Trt) 、Fmoc_Ala、Fmoc_Pro、Fmoc_Pro、Fmoc_Ala，获得在固相丰对月旨上具 有Fmoc-Ala-Pro-Pro-Ala-His(Trt)-Gly-Val-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Pro-Asp(0tBu)_T hr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Ala-Pro-Gly的保护基的18残基肽(序列编号25)。
将具有该保护基的18残基肽(序列编号25)固定在树脂上、将Fmoc基用20X哌啶 /DMF溶液(2mL)处理10分钟，进行脱保护。用DMF、DCM将其洗涤后，使Fmoc-Thr (GalNAc) (0. 20mmo1) 、 H0Bt (0. 50mmo1) 、 DIPCI (0. 50mmo1)溶解于DMF(3. 6mL)中，活化15分钟后将 其加到树脂上。反应5小时后，将Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2mL)处理20分钟，进行 脱保护，获得在固相树脂上具有Thr (GalNAc) -Ala-Pro-Pro-Ala-His (Trt) -Gly-Val-Thr (t Bu) -Ser (tBu) -Ala—Pro—Asp (0tBu) -Thr (tBu) -Arg (Pbf) -Pro-Ala—Pro—Gly的保护基的19
35残基糖加成肽(序列编号26)。 准备一支与获得的在固相树脂上具有保护基的19残基糖加成肽(序列编号 26)0. 02,1相当的另外的固相合成用柱子，向其中加入由Boc-Ser (tBu) (0. 1,1)、 DIPCI(O. lmmol)、H0Bt(0. 1,1)溶解于DMF 0. 5mL中并活化15分钟后的溶液，进行1小时
反应。将反应液过滤后，将乙酸三氟乙醇=i : i的混合液加入到足以充分浸没树脂的
程度，14小时后，过滤除去树脂，将滤液减压浓縮，获得含有具有Boc-Ser (tBu) -Thr (GalNA c)-Ala-Pro-Pro-Ala-His(Trt)-Gly-Val-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Pro-Asp(0tBu)-Thr(t Bu)-Arg(Pbf)-Pro-Ala-Pro-Gly的保护基的20残基糖加成肽(序列编号27)的残留物。
将获得的20残基的具有保护基的糖加成肽(序列编号27)75mg(35ymo1)和苄基 硫醇123iil(105iimo1)加入到DMF 3. 5ml中，在氩气流中、在-2(TC下搅拌1小时后，加入 PyB0P (91mg， 175 y mol) 、DIPEA(30 yl， 175 y mol)，搅拌2. 5小时。向反应液中加入乙醚，使 结晶沉淀后，过滤，向获得的残留物中加入TFA/水/TIPS = 95/2. 5/2. 5以便达到足以充分 浸没树脂的程度，在25t:下搅拌2小时。将树脂过滤除去后，将滤液浓縮，回收残留物。将 获得的残留物用HPLC(Vydac柱C8 250X 10mm ;展开溶剂A :0. 1 % TFA水溶液、B :0. 09% TFA、乙腈水二90 : 10;梯度A : B = 90 : 10->60 : 40、30分钟；流速4. 0mL/min)精 制，获得C末端为苄基硫代酯的、Ser-Thr(GalNAc)-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-S er-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-SBn的20残基糖加成肽(序列编号28)。
另一方面，准备一支与原先获得的固相树脂上的19残基的具有保护基的 糖加成肽(序列编号26)0.02rnmo1相当的另外的固相合成用柱子，向其中加入由 Boc-Thia(O. 04mmo1) 、 DIPCI (0. lmmol) 、 H0Bt (0. lmmol)溶解于DMF 1. 5mL中并活化15分 钟后的溶液，进行20分钟反应。将反应液过滤后，将试剂(TFA/水/TIPS = 95/2. 5/2. 5) 加入到足以充分浸没树脂的程度，在25t:下搅拌2小时。将树脂过滤除去后，将滤液浓縮。 将获得的残留物溶解于0. 2M甲氧基胺和0. 1M磷酸钠缓冲液(pH4、含有6M盐酸胍)2. lml 中，将N末端的噻唑啉开环后，用HPLC(Vydac柱C8 250X10mm ;展开溶剂A :0. 1 % TFA水 溶液、B :0. 08% TFA、乙腈水=90 : 10 ;梯度A : B = 90 : 10->60 : 40、30分钟；流速 4. OmL/min)精制，获得Cys-Thr (GalNAc)-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-P ro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly的20残基的糖加成肽(序列编号29)。
将这样获得的、20残基的糖加成肽(序列编号29) 13mg与事先获得的C末端为苄 基硫代酯的20残基的肽(序列编号28)12mg溶解于磷酸缓冲溶液(pH7. 2、含有6M盐酸 胍)2. 9mL中，向其中加入4-巯基苯基乙酸30mg、三(2-羧乙基)膦17mg，使其反应3小 时。将反应液用HPLC(Vydac柱C8 250 X 10mm ;展开溶剂A :0. 1 % TFA水溶液、B :0. 09 % TFA、乙腈水二90 : IO;梯度A : B = 90 : 10 — 60 : 40、30分钟；流速4. OmL/min) 精制，获得Ser-Thr(GalNAc)-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr -Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Cys-Thr(GalNAc)-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly的40残基糖加成肽(序列编号30) 18mg。
将获得的40残基的糖加成肽(序列编号30) 16mg加入到茄型烧瓶中，用0. 25M三 盐酸缓冲溶液(pH8. 6、含有6M盐酸胍液、3. 3mMEDTA) 3. 8mL将其溶解。向其中加入2-巯基 乙醇(3 y L)，搅拌10分钟后，加入含有甲基-4-硝基苯磺酸酯25mg的乙腈1. 27mL。 25分钟 后，加入10% TFA溶液0. 45mL，中和，然后加入乙醚2mL，进行3次分液洗涤。将水层减压浓縮后，将获得的残留物用HPLC(Vydac柱C-4250X4. 6mm ;展开溶剂A :0. 1% TFA水溶液、B :
o. 08% tfa、乙月青水=90 : io ;梯度a : b = ioo : o — ioo : o — 90 : io — 60 : 40、
0分钟一10分钟一40分钟流速1. 2ml/min)精制，获得含有Ser-Thr (GalNAc)-Ala-Pro-P ro_Ala_His_Gly_Val_Thr_Ser_Ala_Pro_Asp_Thr_Arg_Pro_Ala_Pro_Gly_Cys(Me)_Thr(Ga 皿c)-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gl y的21位的半胱氨酸残基的硫原子被甲基化的40残基糖加成肽(序列编号31)的混合物 13mg。 将获得的含有21位的半胱氨酸残基的硫原子被甲基化的40残基糖加成肽(序 列编号31)的混合物12mg加入到茄型烧瓶中，使其溶解于80%甲酸水溶液2. 9mL中后，在 25t:下加入溴化氰152mg。将反应容器遮光，然后在37t:下进行反应，36小时后，将反应溶 液减压浓縮。将残留物溶解于三氟乙酸2. 9mL中，加入碘化铵2. 4mg、二甲硫醚24y L，在室 温下使其反应30分钟。30分钟后，向反应体系中加入水6mL，然后，用四氯化碳进行分液洗 涤。将水层减压浓縮后，将残留物溶解于5%肼水溶液1. 4mL中，在室温下使其反应10分钟。 IO分钟后，向反应液中加入乙酸O. 14mL，然后用HPLC(Vydac柱C-4 250X4. 6mm ;展开溶剂 A :50mM AcONH4水溶液、B :乙腈；梯度A : B = 90 : 10 — 70 : 30、60分钟、流速1. OmL/ min)精制，获得Ser-Thr(GalNAc)-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp -Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr(GalNAc)-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly的作为目的产物的40残基糖加成肽(序列编号 32)2. 3mg。ESI-MS :Calcd for : [M+3H]3+ 1388. 5、 found、 1388. 6
实施例7 Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu的制备 向固相合成用柱子中加入Trt chloride resin (Merck公司制)(100 y mol)，用二 氯甲烷(DCM)、 DMF充分洗涤后，用DCM使其充分溶胀。过滤后，将Fmoc-Gly (0. 20mmol)、 DIPEA(0.4mmo1)溶解于DCM(O. 66mL)中，再将其加入到固相合成用柱子中，在25。C下搅拌 2小时。搅拌后，将树脂用DCM : Me0H : DIPEA = 17 : 2 : 1、DCM和DMF充分洗涤后，将 Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(lmL)处理20分钟，进行脱保护。用DMF洗涤后，其后的肽 链的伸长采用以下所示的方法，依次使氨基酸縮合。 将氨基被保护起来的氨基酸和H0Bt (67. 6mg、0. 50mmo1) 、DIPCI (77. 0 y L、63. lmg、 0. 50mmo1)溶解于DMF(2mL)中，活化15分钟后，将其加入到固相合成用柱子中。在25°C 下搅拌1小时后，将Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2mL)处理20分钟，进行脱保护。重复 该操作，依次使氨基酸縮合。作为被保护的氨基酸，使用Fmoc-Asn(177. 2mg、0. 50mmo1)、 Fmoc-Ser (tBu) (191. 6mg、0. 50mmo1) 、 Boc-Glu(0tBu) (151. 6mg、0. 50mmo1)，获得在固相树 脂上具有Boc-Glu (0tBu) -Ser (tBu) -Asn-Gly的保护基的4残基肽(序列编号33)。
用DMF、DCM洗涤后，加入AcOH : Me0H : DCM = 5 : 4 : l的混合液2mL，在室温 下使其反应2小时。2小时后，将反应液过滤回收，减压浓縮，获得残留物。向该残留物中 加入苯lmL，进行2次共沸操作后，使其溶解于DMF 0. 81mL中。在氩气流中、在0t:下向该 溶液中加入PyB0P 42. lmg、DIPEA 14 iU、苄基硫醇57 y L，搅拌30分钟。反应后，用饱和氯 化铵水溶液中和后，用水和饱和食盐水进行分液洗涤。将有机层用硫酸镁干燥后，过滤，接 着将滤液减压浓縮。将获得的残留物用硅胶柱色谱法(展开溶剂；乙酸乙酯Me0H :水=
3720 : 2 : i)精制，收集含有作为目的产物的肽的级分，减压下进行浓縮。将获得的残留物
用95% TFA水溶液溶解，使其反应10分钟。将反应液减压浓縮，获得在C末端上具有苄基 硫代酯的Glu-Ser-Asn-Gly-SBn的4残基肽(序列编号34)。 另一方面，向固相合成用柱子中加入王氏树脂(Merck公司制)(0. lmmol)， 用二氯甲烷(DCM)、 DMF充分洗涤后，用DCM使其充分溶胀。将Fmoc-Leu(0. 50mmol)、 MSNT(O. 50mmol)和N_甲基咪唑(0. 375mmol)溶解于DCM(2mL)中，再将其加入到固相合成 用柱子中，在25t:下搅拌2小时。2小时后，将树脂用DCM和DMF充分洗涤，将Fmoc基用 20X哌啶/DMF溶液(2mL)处理20分钟，进行脱保护。用DMF、DCM洗涤后，其后的肽链的伸 长采用以下所示的方法，依次使氨基酸縮合。 将氨基被保护起来的氨基酸和H0Bt (67. 6mg、0. 50mmo1) 、 DIPCI (77. 0 y L、 0. 50mmo1)溶解于DMF 2mL中，活化15分钟后，将其加入到固相合成用柱子中。在25。C下 搅拌1小时后，将Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2mL)处理20分钟，进行脱保护。重复该 操作，依次使氨基酸縮合。作为被保护的氨基酸，使用Fmoc-Thr (tBu) (198. 8mg、0. 50mmo1)、 Fmoc-Leu(176. 8mg、0. 50mmo1)，获得在固相树脂上具有Fmoc-Leu-Thr (tBu)-Leu的保护基 的3残基肽。然后，将Fmoc基用20%哌啶/DMF溶液(2mL)处理20分钟，进行脱保护后，向 其中加入由另外在合成例1中合成的具有Boc-Thr(S-SsecBu)的保护基的苏氨酸衍生物以 及H0Bt(67. 6mg、0. 50mmo1) 、 DIPCI (77. 0 ii L、0. 50mmo1)溶解于DMF 2mL中并使其活化15 分钟的溶液，使其反应3小时，获得在固相树脂上具有Boc-Thr (S-SsecBu) -Leu-Thr (tBu)-Leu的保护基的4残基肽(序列编号35)。向该反应产物中加入95% TFA水溶液，在室温下 反应2小时后，过滤除去树脂，将滤液减压浓縮，获得具有Thr (S-SsecBu) -Leu-Thr-Leu的 保护基的4残基肽(序列编号36)。 将这样获得的具有保护基的4残基肽(序列编号36) 2. 2mg和事先获得的具有硫 代酯的4残基肽(序列编号34) 2. 2mg溶解于0. 2M磷酸钠缓冲液(pH7. 3、含有6M盐酸胍、 4-巯基苯基乙酸20mg) xxmL，使其反应3. 5小时。反应后，加入二硫代苏糖醇，搅拌10分钟 后，将反应液用HPLC(Cadenza柱C18 75X4. 6mm ;展开溶剂A :0. 1% TFA水溶液、B :0. 1% TFA、乙腈水二90 : IO;梯度A : B = 90 : 10 — 35 : 65、15分钟；流速l. OmL/min)精 制，获得5位的苏氨酸残基的侧链羟基被硫羟基取代的、作为Glu-Ser-Asn-Gly-Thr(SH)-L eu-Thr-Leu的8残基的肽(序列编号37)。可以认为，获得的肽中所含的苏氨酸衍生物残 基主要具有由下式表示的立体构型。 将获得的5位的苏氨酸残基的侧链羟基被硫羟基取代的8残基的肽(序列编 号37)3. 5mg加入到茄型烧瓶中，用0. 25M三盐酸缓冲溶液(pH8. 6、含有6M盐酸胍液、 3.3mM EDTA)4. lmL将其溶解。向该溶液中加入2-巯基乙醇(2. 9 y L)，搅拌15分钟后， 加入由甲基-4-硝基苯磺酸酯(26. 2mg)溶解于乙腈1.37mL而形成的溶液，使其反应50 分钟。反应后，加入10% TFA溶液(l.OmL)，中和后，将反应液用HPLC (Cadenza柱C18 75X4. 6mm ;展开溶剂A :0. 1% TFA水溶液、B :0. 1% TFA、乙腈水=90 : IO;梯度A : B
38=90 : 10 — 35 : 65、15分钟；流速1.0mL/min)精制，获得5位的苏氨酸残基被取代的硫 羟基的硫原子被甲基化的、作为Glu-Ser-Asn-Gly-Thr (SMe) -Leu-Thr-Leu的8残基肽(序 列编号38)。 将获得的5位的苏氨酸残基的被取代的硫羟基的硫原子被甲基化的8残基 肽(序列编号38)4mg加入到茄型烧瓶中，使其溶解于70X甲酸溶液4.63mL中后，加 入溴化氰49. Omg，遮光，在氩置换下、在37t:下搅拌。48小时后，减压浓縮后，加入5 % 肼水溶液0. 93mL，使其反应15分钟。向该反应产物中加入乙酸60 y L后，将反应液用 HPLC(Cadenza柱C18 75X4. 6mm ;展开溶剂A :0. 1 % TFA水溶液、B :0. 1 % TFA、乙月青: 水=90 : IO;梯度A : B = 85 : 15 — 45 : 55、15分钟；流速1. Oml/min)精制，获得 Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu的作为目的产物的8残基肽(序列编号39)。根据反 应机理，可以推测，获得的肽中所含的苏氨酸残基的立体构型与天然产物相同。
ESI-MS :Calcd for C34H59N9015 : [M+1H]1+ 834. 41、 found、835. 1
合成例1 Boc-Thr(S-SsecBu)的合成 将Boc-Thr (300mg， 1. 37mmol)溶解于经过蒸馏的DMF (6. 85mL， 200mM)中，然 后向其中加入N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳化二亚胺氯化氢(786mg，4. lmmol)和 HOBt (370mg， 2. 74mmo1)，在(TC下搅拌15分钟后，加入TMSEtOH(l. 95mL， 13. 7mmo1)，在0°C 下搅拌20小时，用TLC确认反应结束后，将反应溶液用乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钠水溶 液中和，用水分液洗涤2次，用饱和食盐水分液洗涤1次。将有机层用硫酸镁干燥后，过滤，
将滤液减压浓縮。将残留物用硅胶柱色谱法(展开溶剂乙酸乙酯己烷=i : 3)精制，
获得Boc-Thr-TMS酯(收量342mg，收率78% )。 将获得的Boc-Thr-TMS酯在苯中共沸2次后，将残留物溶解于DCM20. 8mL。加入甲 烷磺酰氯322mL(4. 16,1)和三乙胺1. 16mL(8. 32mmo1)，在(TC下搅拌10分钟，用TLC确 认反应结束后，将反应溶液用DCM稀释，用饱和氯化铵水溶液中和后，用水分液洗涤2次，用 饱和食盐水分液洗涤l次。将有机层用硫酸镁干燥后，过滤，将滤液减压浓縮。将残留物用 硅胶柱色谱法(展开溶剂乙酸乙酯己烷=1 : 4)精制，获得Boc-Thr(OMs)-TMS酯(收 量724. 6mg，收率88% )。 将获得的Boc-Thr(OMs)-TMS酯1. 06g在苯中共沸2次后，在干燥器中使其干燥 一夜。将该干燥产物溶解于DMF 8.9mL中后，加入由硫代乙酸0. 57mL(7.95mmo1)和DBU 0. 79mL(5. 3mmo1)溶解于DMF 4. 4mL中并使其反应20分钟而成的溶液，在45。C下搅拌18 小时，用TLC确认反应结束后，用饱和氯化铵水溶液中和后，用水分液洗涤2次，用饱和食 盐水分液洗涤l次。将有机层用硫酸镁干燥后，过滤，将滤液减压浓縮。将残留物用硅胶 柱色谱法(展开溶剂乙酸乙酯己烷=1 : 20)精制，获得Boc-Thr(SAc)-TMS酯(收量 536. 8mg、收率53. 7% )。 将获得的Boc-Thr (SAc)-TMS酯1. lg溶解于甲醇100mL中后，加入二吡啶基二硫 化物(3. 21g、14. 6mmo1) 、Sec-BuSH 1.75mL(16. lmmol)溶解于甲醇5. 5mL中而成的溶液。然 后，加入氢氧化钠的甲醇溶液(500mM)11.7mL。 18小时后，用TLC确认反应结束后，用1%乙 酸水溶液中和，减压浓縮后，用乙酸乙酯稀释。将该稀释液用水分液洗涤2次，用饱和食盐 水分液洗涤l次。将有机层用硫酸镁干燥后，进行过滤，将滤液减压浓縮。将残留物用硅胶 柱色谱法(展开溶剂乙酸乙酯己烷=1 : 40)精制。将获得的混合物在苯中共沸2次后，使其溶解于DMF 29mL(100mM)中。向其中加入四丁基氟化铵*3水合物2. 28mg(7. 3mmo1)， 在0t:下搅拌。搅拌15分钟后，用TLC确认反应结束，接着用饱和氯化铵水溶液进行中和。 将该反应液用水洗涤2次，用饱和食盐水洗涤1次，然后，将有机层用硫酸镁进行干燥，过滤
后，将滤液减压浓縮。将残留物用硅胶柱(展开溶剂乙酸乙酯己烷=i : 4—乙酸乙
酯甲醇水=20 : 2 : l)精制，获得作为目的产物的Boc-Thr(S-SsecBu)(收量650mg、
收率69% )。 序列表文本 序列编号1为实施例1的、具有保护基的氨基酸序列。 序列编号2为实施例1的、被乙酰基化的氨基酸序列。 序列编号3为实施例1的、具有被甲基化的半胱氨酸的氨基酸序列。 序列编号4为实施例1的、被乙酰基化的氨基酸序列。 序列编号5为实施例2的、具有保护基的氨基酸序列。 序列编号6为实施例2的、氨基酸序列。 序列编号7为实施例2的、具有被甲基化的半胱氨酸的氨基酸序列。 序列编号8为实施例2的、氨基酸序列。 序列编号9为实施例3的、具有保护基的氨基酸序列。 序列编号10为实施例3的、氨基酸序列。 序列编号11为实施例3的、具有被甲基化的半胱氨酸的氨基酸序列。 序列编号12为实施例3的、氨基酸序列。 序列编号13为实施例4的、加成了糖链的、具有保护基的氨基酸序列。 序列编号14为实施例4的、加成了糖链的、具有保护基的氨基酸序列。 序列编号15为实施例4的、加成了糖链的、具有苄基硫代酯基的氨基酸序列。 序列编号16为实施例4的、具有保护基的氨基酸序列。 序列编号17为实施例4的、氨基酸序列。 序列编号18为实施例4的、加成了糖链的氨基酸序列。 序列编号19为实施例4的、加成了糖链的、具有被甲基化的半胱氨酸的氨基酸序 列。 序列编号20为实施例4的、加成了糖链的氨基酸序列。 序列编号21为实施例5的、具有保护基和蛋氨酸亚砜的氨基酸序列。 序列编号22为实施例5的、具有蛋氨酸亚砜的、被乙酰基化的氨基酸序列。 序列编号23为实施例5的、具有被甲基化的半胱氨酸和蛋氨酸亚砜的、被乙酰基
化的氨基酸序列。 序列编号24为实施例5的、被乙酰基化的氨基酸序列。 序列编号25为实施例6的、具有保护基的氨基酸序列。 序列编号26为实施例6的、加成了糖链的、具有保护基的氨基酸序列。 序列编号27为实施例6的、加成了糖链的、具有保护基的氨基酸序列。 序列编号28为实施例6的、加成了糖链的、具有苄基硫代酯基的氨基酸序列。 序列编号29为实施例6的、加成了糖链的氨基酸序列。 序列编号30为实施例6的、加成了糖链的氨基酸序列。
序列编号31为实施例6的、加成了糖链的、具有被甲基化的半胱氨酸的氨基酸序 列。 序列编号32为实施例6的、加成了糖链的氨基酸序列。 序列编号33为实施例7的、具有保护基的氨基酸序列。 序列编号34为实施例7的、具有苄基硫代酯基的氨基酸序列。 序列编号35为实施例7的、具有保护基和苏氨酸衍生物的氨基酸序列。 序列编号36为实施例7的、具有苏氨酸衍生物的氨基酸序列。 序列编号37为实施例7的、具有苏氨酸衍生物的氨基酸序列。 序列编号38为实施例7的、具有苏氨酸衍生物的氨基酸序列。 序列编号39为实施例7的、氨基酸序列。产业上的可利用性
本发明提供肽和糖肽的制备方法。根据本发明，在想要获得不含半胱氨酸的肽的 情况下，可以采用连接法。本发明还适用于制备N键型糖肽和0键型糖肽。序列表
PCT肽的制备方法20080730 115403 21.txt
4权利要求
肽的制备方法，其特征在于，在含有具有-SH基的氨基酸残基的肽中，将上述-SH基转变成-OH基，该方法包括以下的工序(a)～(c)(a)使肽中的-SH基与甲基化剂反应的工序；(b)使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应的工序；以及(c)形成与工序(b)相比为碱性较强的条件的工序。
2. 肽的制备方法，其特征在于，在含有具有-SH基的氨基酸残基的肽中，将上述-SH基 转变成-OH基，该方法包括以下的工序(a) (c):(a) 通过使肽中的-SH基与甲基化剂反应，将上述-SH基转变成-SMe基的工序；(b) 通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以及(c) 在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变成含 有具有-OH基的氨基酸残基的肽的工序。
3. 肽的制备方法，其特征在于，在含有半胱氨酸残基的肽中，将上述半胱氨酸残基转变 成丝氨酸残基，该方法包括以下的工序(a) (c):(a) 通过使肽中的半胱氨酸残基的-SH基与甲基化剂反应，将上述-SH基转变成-SMe 基的工序；(b) 通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以及(c) 在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变成含 有丝氨酸残基的肽的工序。
4. 肽的制备方法，其特征在于，在含有由式(1)表示的苏氨酸衍生物A作为氨基酸残基的肽中，将上述苏氨酸衍生物A残基转变成苏氨酸残基，该方法包括 以下的工序(a) (c):(a) 通过使肽中的苏氨酸衍生物A残基的-SH基与甲基化剂反应，将上述-SH基转变 成-SMe基的工序；(b) 通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以及(c) 在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变成含 有苏氨酸残基的肽的工序。
5. 肽的制备方法，其特征在于，在含有具有-SMe基的氨基酸残基的肽中，将上述-SMe 基转变成-OH基，该方法包括以下的工序(b)和(c):(b) 通过使肽中的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以及(c) 在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变成含 有具有-OH基的氨基酸残基的肽的工序。
6. 权利要求2 5中任1项所述的肽的制备方法，其中，上述反应中间体为酯体。
7. 权利要求1 6中任1项所述的肽的制备方法，其中，工序(c)的碱性条件为弱碱性 条件。
8. 权利要求1 6中任1项所述的肽的制备方法，其中，工序(c)的碱性条件为强碱性COOH条件。
9. 权利要求1 8中任1项所述的肽的制备方法，其中，工序(a)中的肽中的蛋氨酸残 基为保护蛋氨酸残基，进而，根据希望，在工序(b)或者(c)之后包括以下的工序(d):(d)将保护蛋氨酸残基脱保护的工序。
10. 含有具有-OH基的氨基酸残基的肽的制备方法，该方法包括以下的工序(o)采用连接法将在C末端上含有羧基被由式-C ( = 0) -SR (式中，R选自苄基、芳基或 者烷基，它们也可以进一步被取代基取代)表示的a-羧基硫代酯基取代的氨基酸残基的 第1肽与在N末端上含有具有-SH基的氨基酸残基的第2肽连接起来，获得含有具有-SH 基的氨基酸残基的肽的工序；(a) 通过使工序(o)中获得的肽中的-SH基与甲基化剂反应，将上述-SH基转变成-SMe 基的工序；(b) 通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以及(c) 在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变成含 有具有-0H基的氨基酸残基的肽的工序。
11. 含有丝氨酸残基的肽的制备方法，该方法包括以下的工序(o)采用连接法将在C末端上含有羧基被由式-C ( = 0) -SR (式中，R选自苄基、芳基或 者烷基，它们也可以进一步被取代基取代)表示的a-羧基硫代酯基取代的氨基酸残基的 第1肽与在N末端上含有半胱氨酸残基的第2肽连接起来，获得含有半胱氨酸残基的肽的 工序；(a) 通过使工序(o)中获得的肽中的半胱氨酸残基的-SH基与甲基化剂反应，将上 述-SH基转变成-SMe基的工序；(b) 通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以及(c) 在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变成含 有丝氨酸残基的肽的工序。
12. 含有苏氨酸残基的肽的制备方法，该方法包括以下的工序(o)采用连接法将在C末端上含有羧基被由式-C ( = 0) -SR (式中，R选自苄基、芳基或 者烷基，它们也可以进一步被取代基取代)表示的a-羧基硫代酯基取代的氨基酸残基的 第1肽与在N末端上含有苏氨酸衍生物残基的第2肽连接起来，获得含有由式(1)表示的 苏氨酸衍生物A作为氨基酸残基的肽的工序；、SHH2N COOH(i)(a) 通过使工序(o)中获得的肽中的苏氨酸衍生物A残基的-SH基与甲基化剂反应，将 上述-SH基转变成-SMe基的工序；(b) 通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以及(c) 在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变成含 有苏氨酸残基的肽的工序。
13.权利要求10 12中任1项所述的肽的制备方法，其中，上述反应中间体为酯体。
14. 权利要求10 13中任1项所述的肽的制备方法，其中，工序(c)的碱性条件为弱 碱性条件。
15. 权利要求10 13中任1项所述的肽的制备方法，其中，工序(c)的碱性条件为强 碱性条件。
16. 权利要求10 15中任1项所述的肽的制备方法，其中，工序(a)中的肽中的蛋氨 酸残基为保护蛋氨酸残基，进而，根据希望，在工序(b)或者(c)之后包括以下的工序(d):(d)将保护蛋氨酸残基脱保护的工序。
17. 权利要求10 16中任1项所述的肽的制备方法，其中，上述第1肽为不含半胱氨 酸残基的肽或者半胱氨酸残基为保护半胱氨酸残基的肽，上述第2肽为在N末端以外不含半胱氨酸残基的肽或者在N末端以外的肽的半胱氨酸 残基为保护半胱氨酸残基的肽。
18. 糖肽的制备方法，其特征在于，在含有具有-SH基的氨基酸残基的糖肽中，将上 述-SH基转变成-OH基，该方法包括以下的工序(a) (c):(a) 使糖肽中的-SH基与甲基化剂反应的工序；(b) 使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应的工序；以及(c) 形成与工序(b)相比为碱性较强的条件的工序。
19. 糖肽的制备方法，其特征在于，在含有具有-SH基的氨基酸残基的糖肽中，将上 述-SH基转变成-OH基，该方法包括以下的工序(a) (c):(a) 通过使糖肽中的-SH基与甲基化剂反应，将上述-SH基转变成-SMe基的工序；(b) 通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以及(c) 在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变成含 有具有-OH基的氨基酸残基的糖肽的工序。
20. 糖肽的制备方法，其特征在于，在含有半胱氨酸残基的糖肽中，将上述半胱氨酸残 基转变成丝氨酸残基，该方法包括以下的工序(a) (c):(a) 通过使糖肽中的半胱氨酸残基的-SH基与甲基化剂反应，将上述-SH基转变 成-SMe基的工序；(b) 通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以及(c) 在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变成含 有丝氨酸残基的糖肽的工序。
21. 糖肽的制备方法，其特征在于，在含有由式(1)表示的苏氨酸衍生物A作为氨基 酸残基的糖肽中，将上述苏氨酸衍生物A残基转变成苏氨酸残基，该方法包括以下的工序<formula>formula see original document page 4</formula>(a) 通过使糖肽中的苏氨酸衍生物A残基的-SH基与甲基化剂反应，将上述-SH基转变 成-SMe基的工序；(b) 通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以及(c)在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变成含 有苏氨酸残基的糖肽的工序。
22. 权利要求19 21中任1项所述的糖肽的制备方法，其中，上述反应中间体为酯体。
23. 权利要求18 22中任1项所述的糖肽的制备方法，其中，工序(c)的碱性条件为 弱碱性条件。
24. 权利要求18 22中任1项所述的糖肽的制备方法，其中，工序(c)的碱性条件为 强碱性条件。
25. 权利要求18 24中任1项所述的糖肽的制备方法，其中，上述糖肽具有N键型糖链。
26. 权利要求18 24中任1项所述的糖肽的制备方法其中，上述糖肽具有O键型糖链。
27. 含有丝氨酸残基的糖肽的制备方法，该方法包括以下的工序 (o)采用连接法将C末端由以下式表示的第1糖肽-糖Asn-X-C ( = 0) -SR (式中，糖Asn为加成了糖链的天冬酰胺，X为除脯氨酸以外的任意的氨基酸残基中除羧基以外的部分，R选自苄基、芳基或者烷基，它们也可以进一步被取代基取代)与在N末端上含有半胱 氨酸残基的第2肽连接起来，获得含有半胱氨酸残基的糖肽的工序；(a) 通过使工序(o)中获得的糖肽中的半胱氨酸残基的-SH基与甲基化剂反应，将上 述-SH基转变成-SMe基的工序；(b) 通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以及(c) 在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变成含 有丝氨酸残基的糖肽的工序。
28. 含有苏氨酸残基的糖肽的制备方法，该方法包括以下的工序 (o)采用连接法将C末端由以下式表示的第1糖肽-糖Asn-X-C ( = 0) -SR (式中，糖Asn为加成了糖链的天冬酰胺，X为除脯氨酸以外的任意的氨基酸残基中除羧基以外的部分，R选自苄基、芳基或者烷基，它们也可以进一步被取代基取代)与在N末端上含有苏氨 酸衍生物残基的第2肽连接起来，获得含有由式(1)表示的苏氨酸衍生物A作为氨基酸残 基的糖肽的工序；(a)通过使工序(o)中获得的糖肽中的苏氨酸衍生物A残基的-SH基与甲基化剂反应， 瞎上述-SH基转变成-SMe基的工序；H2N COOH(b) 通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以及(c) 在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变成含有苏氨酸残基的糖肽的工序。
29. 权利要求27或28所述的糖肽的制备方法，其中，上述反应中间体为酯体。
30. 权利要求27 29中任1项所述的糖肽的制备方法，其中，工序(c)的碱性条件为弱碱性条件。
31. 权利要求27 29中任1项所述的糖肽的制备方法，其中，工序(c)的碱性条件为强碱性条件。
32. 含有由以下式-糖Asn-X-Y-(式中，糖Asn为加成了糖链的天冬酰胺，X为除脯氨酸以外的任意的氨基酸残基，Y为由式(2)表示的苏氨酸衍生物A残基表示的结构的糖肽。
全文摘要
本发明提供肽的制备方法，其特征在于，在含有具有-SH基的氨基酸残基的肽中，将上述-SH基转变成-OH基，该方法包括以下的工序(a)～(c)(a)通过使肽中的-SH基与甲基化剂反应，将上述-SH基转变成-SMe基的工序；(b)通过使工序(a)中获得的-SMe基与氰化剂反应，生成反应中间体的工序；以及(c)在与工序(b)相比为碱性较强的条件下，将工序(b)中获得的反应中间体转变成含有具有-OH基的氨基酸残基的肽的工序。
文档编号C07K14/46GK101796064SQ20088010104
公开日2010年8月4日 申请日期2008年7月30日 优先权日2007年7月31日
发明者南部由利, 坂本泉, 朝井洋明, 梶原康宏, 深江一博 申请人:大塚化学株式会社