Rage融合蛋白的制作方法

专利名称：Rage融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明一般来说涉及晚期糖化终末产物(“AGE”)，更具体来说涉及含有晚期糖 化终末产物受体(“RAGE”)的一些融合蛋白。本发明的融合蛋白与AGE和其他RAGE配体 (例如S100和HMGB1)结合，包含本发明融合蛋白的组合物可用于治疗疾病。
背景技术：
晚期糖化终末产物(AGE)是蛋白非酶糖化和氧化的结果。它们出现在包括自身免 疫病相关性组织疾病在内的压力相关的环境下；并且可能在由氧化或髓过氧化物酶途径所 产生的炎症组织中形成。AGE与许多糖尿病相关的并发症有关。例如，糖尿病性肾病、肾小 球基膜增厚和肾小球系膜扩张的特征结构改变伴有AGE的积聚，这会导致肾小球硬化症和 间质纤维化。长期输注AGE给非糖尿病大鼠会导致类似的形态改变和显著的蛋白尿的发 展。已经显示诸如氨基胍等AGE抑制剂能够在糖尿病动物模型中防止糖尿病性肾病，最近 显示其在一个临床试验中对糖尿病患者会产生相同作用。而且，AGE是经充分验证的糖尿 病性视网膜病的治疗靶标。大量糖尿病小鼠和大鼠研究已经证明了抑制AGE形成在治疗此 疾病中的有益效果。动脉粥样硬化在糖尿病患者中显著加速，其与心血管和脑血管死亡率的更高风险 相关。动物和人的研究已经表明AGE在动脉硬化病变的形成和发展中起着重要的作用。糖 尿病血管组织中AGE积累的增加与内皮细胞、巨噬细胞、和平滑肌细胞功能的改变相关。AGE与单核细胞、巨噬细胞、微血管内皮细胞、平滑肌细胞、间质细胞和神经元上的 细胞表面受体相互作用。晚期糖化终末产物受体(RAGE)是细胞表面受体免疫球蛋白超家 族的成员。RAGE由三个胞外免疫球蛋白样结构域、跨膜结构域和参与信号传导的胞质结 构域构成。除AGE外，RAGE还结合多种配体，包括S100/钙粒蛋白、两性素(amphoterin)/ HMGB1和淀粉样纤维(amyloid fibril)。RAGE通过包括NF_ k B的信号级联起作用。RAGE 表达在RAGE配体存在下上调并且在患有类风湿性关节炎(RA)的患者的关节中升高。RAGE具有缺乏跨膜结构域的分泌型异构体，其称为可溶性RAGE(sRAGE)。已 经显示sRAGE的给药能修复创伤愈合(Goova等人(2001)Am. J. Pathol. 159，513-525) 并且抑制糖尿病性动脉粥样硬化(Park等人(1998)Nat Med. 4(9) 1025-31)。在TO 2004/016229A2 (ffyeth,Madison,NJ)和美国专利申请公布 2006/0057679A1 (0，Keefe，T.等 人)中公开了由RAGE配体结合元件和免疫球蛋白元件构成的融合蛋白。仍然需要治疗AGE介导的疾病(如与AGE的量增加相关的疾病)的新方法。本发 明满足了这种需求和其他的需求。

发明内容
本发明提供用于治疗与AGE的量增加相关的疾病的材料和方法。在一个实施方式中，本发明提供包含至少一个多肽的融合蛋白，所述多肽包含(a)第一氨基酸序列，其与 晚期糖化终末产物(RAGE)配体结合结构域的哺乳动物受体至少95%相同，该第一氨基酸 序列能够结合RAGE配体；和(b)第二氨基酸序列，其与人重链免疫球蛋白IgG4恒定结构 域或其片段至少95%相同；其中所述第一氨基酸序列包含至少一个相对于野生型RAGE配 体结合结构域的突变。在本发明的一个实施方式中，本发明的融合蛋白可以进一步包含在 所述第一氨基酸序列与所述第二氨基酸序列之间的连接子序列。在一些实施方式中，所述 RAGE配体结合结构域可以来自哺乳动物RAGE，例如人RAGE。适宜的哺乳动物RAGE配体结 合结构域可以包含SEQ ID NO 6的氨基酸1-344或SEQ ID NO 6的氨基酸24-344。在一 个实施方式中，本发明的融合蛋白可以包含选自下列的氨基酸序列SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ IDN0:6和SEQ ID NO :8。在一个实施方式中，本发明的分离的融合蛋白包含SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :8。在另一个实施方式中，本发明的分离的融合蛋白由SEQ ID NO 6 或SEQ ID N0:8组成。在本发明的一些实施方式中，本发明的融合蛋白还可以包含在RAGE 氨基酸序列和IgG4氨基酸序列之间的连接子。本发明还构思了编码本发明融合蛋白的核 酸分子(例如，DNA或RNA分子)以及表达编码本发明融合蛋白的核酸分子的宿主细胞。本发明还提供包含本发明融合蛋白和药物上可接受的赋形剂或稀释剂的药物组 合物。本发明提供治疗AGE介导的疾病的方法。此类疾病包括特征在于患者(例如，诸如 人等哺乳动物)中AGE量增加的任何疾病。治疗AGE介导的疾病的方法包括给予患有AGE 介导的疾病的患者治疗有效量的包含本发明融合蛋白的药物组合物。可以通过本发明方法 治疗的疾病的实例包括但不限于糖尿病性肾病；类风湿性关节炎；和自身免疫疾病，如皮 炎、肾小球肾炎、多发性硬化、葡萄膜炎性眼炎(uveitis ophthalmia)、自身免疫性肺炎、胰 岛素依赖性糖尿病、自身免疫性炎眼、系统性红斑狼疮、胰岛素耐受、类风湿性关节炎、糖尿 病性视网膜病和硬皮病。本发明的任何融合蛋白都可以用于实施本发明的方法。在一个实 施方式中，本发明的方法可以使用包含SEQ ID NO :6或SEQ IDN0 :8的融合蛋白来实施。在 另一个实施方式中，本发明的方法可以使用由SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 8组成的融合蛋 白来实施。在本发明的另一个实施方式中，本发明提供在有需要的哺乳动物(例如，人)中降 低RAGE结合的配体水平的方法。此类方法可以包括给予哺乳动物RAGE配体降低量的本发 明的融合蛋白。在其他实施方式中，本发明提供包含本发明DNA序列的重组表达载体；用载体转 化、转导或转染的宿主细胞；以及制备融合蛋白的方法，其包括在适于有效表达融合蛋白的 条件下培养用编码本发明融合蛋白的核酸转化、转导或转染的宿主细胞。本发明还提供包含本发明融合蛋白或其片段的组合物。在一些实施方式中，本发 明包括包含本发明融合蛋白或其片段的组合物，所述融合蛋白或其片段直接或间接与放射 性同位素、螯合剂、毒素、荧光染料、生物素、肽表位，如his-标签、myc-标签或糖连接。本 发明的其他实施方式包括为了改变融合蛋白的生物半衰期或功能和糖基化变体而与另一 蛋白融合的本发明融合蛋白。本发明的这些和其他方面将参考下列详细说明而显而易见。附图简述


图1是显示在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对白 细胞淤滞的影响的柱形图。图2A-2D是显示在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白 对各视网膜层视网膜血管透性的影响的柱形图。图3是显示在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对视 网膜蛋白硝化的影响的柱形图。图4是显示在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对 ICAM视网膜表达的影响的柱形图。图5A是显示在患糖尿病10个月后糖尿病小鼠中示例性RAGE-Ig融合蛋白对每平 方毫米视网膜组织所观察到的无细胞毛细血管数的影响的柱形图。图5B是显示在患糖尿 病10个月后示例性RAGE-Ig融合蛋白对糖尿病小鼠中所观察到的每1000个毛细血管细胞 中的周影细胞(pericyte ghost)数的影响的柱形图。图6是显示在患糖尿病10个月后糖尿病小鼠中示例性RAGE-Ig融合蛋白对50% 响应的接触阈值的影响的柱形图。图7提供显示实施例3的实验方案的流程图。图8是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对测 试动物体重的影响的线形图。图9是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对关 节炎发病率的影响的柱形图。图10是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对关 节炎发作的影响的柱形图。图11是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对关 节炎发病率与时间的函数的影响的线形图。图12是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对关 节炎严重程度与时间的函数的影响的线形图。图13是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对所 观察到的关节炎爪子数与时间的函数的影响的线形图。图14A-14D是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋 白对关节形态随融合蛋白量增加的变化的影响的显微照片。图15是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对滑 膜炎(黑柱)和关节翳(灰柱)的影响的柱形图。图16是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对边 缘糜烂(marginal erosion)(黑柱)和结构改变(architectural change)(灰柱)的影响 的柱形图。图17是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对整 体组织学关节炎评分的影响的柱形图。图18是显示在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对关 节基质蛋白丢失的影响的柱形图。图19A-19D是甲苯胺蓝染色切片的显微照片，其显示在II型胶原诱导的关节炎小
6鼠模型中示例性RAGE-Ig融合蛋白对关节基质蛋白丢失的影响。实施方式定义如本文所用的术语“晚期糖化终末产物受体”或RAGE是指氨基酸序列基本上类似 于天然哺乳动物RAGE氨基酸序列且以配体-受体特异性方式结合一种或多种RAGE配体的 蛋白。术语“晚期糖化终末产物”和“AGE”是指还原糖与蛋白的游离氨基、脂和上述核酸的 非酶反应而形成的异源分子群。如本文所用“RAGE配体结合结构域”或“RAGE-LBD”是指保持着以配体-受体特 异性方式结合RAGE配体的能力的任何哺乳动物RAGE蛋白或哺乳动物RAGE蛋白的任何部 分。具体地，不受限制，RAGE配体结合结构域包括具有一个或多个跨膜RAGE蛋白胞外结构 域的多肽。参见表6，适宜的RAGE-LBD可以包含至少SEQ IDN0 :6的氨基酸1_99、或氨基 酸24-99、或氨基酸1-208、或氨基酸24-208、或氨基酸1_301、或氨基酸24-301、或氨基酸 1-344、或氨基酸 24-344。如本说明书内容中用于定义融合蛋白纯度的术语“分离的”是指所述蛋白基本上 不含在制备期间与其相关的其他蛋白，包括但不限于基本上没有在细胞培养基中融合蛋白 表达期间存在的其他蛋白。例如，本发明的分离的蛋白可以含有1-25 %、20-25 %、15-20 %、 10-15%、5-10%、1-5%或少于约2%质量的制备过程的蛋白污染物残余物。然而，包含本发 明的分离的蛋白的组合物可以含有作为稳定剂、载体、赋形剂或联合治疗剂添加的其他蛋 白。 如本文所用，“蛋白”和“多肽”可互换。如本文所用“治疗”疾病或病症是指改善患者疾病或病症的至少一个体症或症状。术语“核酸”是指多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)和(适当时)核糖核酸(RNA)。 该术语还应理解为包括如由核苷酸类似物制备的RNA或DNA的等同物、类似物；和如所述 实施方式所应用的单链(正义和反义)和双链多核苷酸。本文所用的术语“或”意思可以与术语“和/或”互换使用，除非上下文中清楚指 明并非如此。术语“％相同”是指两种氨基酸序列之间或两种核苷酸序列之间的序列同一 性。％同一性可以通过比较为比较的目的而进行比对的各序列中的位置来确定。百分 比同一性的表示是指所比较的序列共有位置的相同氨基酸或核酸数目的函数。可以使 用多种比对算法和/或程序，包括FASTA、BLAST或ENTREZ。FASTA和BLAST作为GCG 序列分析包(University of Wisconsin, Madison, Wis.)的一部分而获得，其可以例如 默认设置使用。ENTREZ可以通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnologylnformation)、美国国家医学图书馆(National Library of Medicine)、美 国国立健康研究院(National Institutes of Health,Bethesda,Md)获得。在一个实施方 式中，两个序列之间的％同一性可以通过用空格重为1的GCG程序(例如，称重各氨基酸空 格如同其为单一氨基酸一样)或两个序列之间的核苷酸错配确定。序列同一性可以通过比较参考序列或参考序列的亚序列与测试序列(例如，核苷 酸序列、氨基酸序列等)来确定。最佳地，在任意数目残基所限定的比较窗口内比对参考序 列和测试序列。为了获得最佳的比对，可以将增加或缺失(如空格)引入测试序列。本发明的％序列同一性通过如下方法来测定测定两个序列上存在相同残基的位置数，用匹配 位置的数除以比较窗口内序列的总长度，再乘以100得出百分数。除了匹配位置数之外，在 计算百分比序列同一性时还要考虑空格数和大小。序列同一性通常使用计算机程序来确定。代表性程序是可在美国国家生物技术 信息中心(NCBI，http //www, ncbi. nlm. nih. gov/)公开获得的BLAST (基本局部比对搜 索工具(Basic Local Alignment Search Tool))程序。此程序比较测试序列链段与数据 库中的序列以测定匹配的统计学显著性，然后鉴别并仅报告显著性高于阈值的那些匹配。 适宜的BLAST程序版本是容许空格的版本，例如2. X版(Altschul等人，Nucleic Acids Res 25(17) =3389-402,1997) 鉴别与本发明蛋白具有序列同一性的蛋白的其他适宜程 序包括但不限于PHI-BLAST (Pattern Hit Initiated BLAST，Zhang 等人，Nucleic Acids Res 26(17) =3986-90,1998)和 PSI-BLAST (位置特异性叠加 BLAST (Position-Specific IteratedBLAST)，Altschul 等人，Nucleic Acids Res 25(17) :3389_402，1997)。这些程序 可以在上述NCBI网站公开获得，可以默认设置使用以确定根据本发明的序列同一性。融合蛋白本发明提供一种分离的融合蛋白，该分离的融合蛋白包含至少一种多肽，所述多 肽包含(a)第一氨基酸序列，其与晚期糖化终末产物(RAGE)配体结合结构域的哺乳动物 受体至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%相同，该第一氨基酸 序列能够结合RAGE配体；和(b)第二氨基酸序列，其与人重链免疫球蛋白IgG4恒定结构域 或其片段至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同；其中所述 第一氨基酸序列包含相对于野生型RAGE配体结合结构域的至少一个突变、或至少两个突 变、或至少三个突变、或1至4个突变、或1至10个突变。可以在第一氨基酸序列中发生的 突变的实例是通过(例如)使RAGE配体结合结构域更加耐受蛋白水解降解来增加融合蛋 白稳定性的那些突变，如使融合蛋白更加耐受弗林蛋白酶(furin)样蛋白酶的那些。适宜 的第二氨基酸序列片段包括保持着增加融合蛋白血清半衰期的能力的片段，其与相同的仅 第一氨基酸序列的血清半衰期部分相关。优选地，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列衍生 自人RAGE配体结合结构域和人IgG4。本发明的融合蛋白还可以包含除RAGE配体结合结构域和IgG4恒定结构域或其片 段之外的一个或多个氨基酸序列。例如，本发明的融合蛋白可以包含连接子序列，该连接子 序列可插入RAGE配体结合结构域和IgG序列之间。本发明的融合蛋白可以包含一种或多 种标签序列，例如，诸如6-组氨酸等纯化标签序列。本发明的融合蛋白可以包含一个或多 个市售抗体所识别的表位，例如，c-myc (EQKLISEEDL，SEQ ID NO 9)和自流感血细胞凝集素 蛋白的表位标签衍生的血细胞凝集素(YPYDVPDYA，SEQ ID NO: 10)。可以使用本领域的那些技术人员所熟知的任何哺乳动物RAGE蛋白来实施本发 明。优选地，使用RAGE蛋白的胞外结构域来鉴别可以突变并用作融合蛋白第一氨基酸序 列的配体结合结构域。哺乳动物RAGE蛋白的适宜实例包括但不限于灵长类、人(例如， GenBank 登录号 NP_001127 和 NP_751947)、鼠(例如，GenBank 登录号 NP_031451)、犬(例 如，GenBank登录号AAQ81297)、大鼠(例如，GenBank登录号NP_445788)、猫、牛(例如， GenBank登录号AAI20128)、羊、马和猪(例如，GenBank登录号AAQ73283) RAGE结构域。包含对野生型序列的一种或多种改变或修饰的RAGE氨基酸序列可以用于本发明。这种改变或修饰包括但不限于点突变、自N末端的缺失、自C末端的缺失、内部缺失、 以及它们的组合。可以将任何改变或修饰引入RAGE序列来用于本发明，只要所得蛋白保 留生物活性即可，例如，保留结合一个或多个RAGE配体的能力。本发明的融合蛋白还包括 具有或不具有内源糖基化模式的那些，包括但不限于其中第一氨基酸序列衍生自哺乳动物 RAGE配体结合结构域的融合蛋白，该哺乳动物RAGE配体结合结构域伴有或不伴有相关的 结合结构域的天然模式糖基化。可以使用任何适宜的IgG Fc区域来实施本发明，优选地，该区域来自IgG4分子， 例如GenBank登录号AAH25985的氨基酸残基149-473。用于本发明的IgG区域可以是 IgG4Fc区域，并且可以包含IgG4分子的一个或多个CH2和CH3区域。适宜的融合蛋白实例在下列表中提供。表1提供人RAGE_IgG4Fc融合蛋白基因序列的核苷酸序列。表1 人 RAGE_IgG4Fc 融合基因序列(SEQ ID NO :1)。
ATGGCAGCCGGAACAGCAGTTGGAGCCTGGGTGCTGGTCCTCAGTctgtggggggcagtagtaggtgct caaaacatcacagcccggattgGCGAGCCACTGGTGCTGAAGTGTAAGGGGGCCCCCAAGAAACCACCCCAGCGGCTGGAATGGAAACTGAACACAGGCCGGACAGAAGCCTGGAAGGTCCTGTCTCCCCAGGGAGGAGGCCCCTGGGACAGTGTGGCTCGTGTCCTTCCCAACGGCTCCCTCTTCCTTCCGGCTGTCGGGATCCAGGATGAGGGGATTTTCCGGTGCCAGGCAATGAACAGGAATGGAAAGGAGACCAAGTCCAACTACCGAGTCCGTGTCTACCAGATTCCTGGGAAGCCAGAAATTGTAGATTCTGCCTCTGAACTCACGGCTGGTGTTCCCAATAAGGTGGGGACATGTGTGTCAGAGGGAAGCTACCCTGCAGGGACTCTTAGCTGGCACTTGGATGGGAAGCCCCTGGTGCCGAATGAGAAGGGAGTATCTGTGAAGGAACAGACCAGGAGACACCCTGAGACAGGGCTCTTCACACTGCAGTCGGAGCTAATGGTGACCCCAGCCCGGGGAGGAGATCCCCGTCCCACCTTCTCCTGTAGCTTCAGCCCAGGCCTTCCCCGACACCGGGCCTTGCGCACAGCCCCCATCCAGCCCCGTGTCTGGGAGCCTGTGCCTCTGGAGGAGGTCCAATTGGTGGTGGAGCCAGAAGGTGGAGCAGTAGCTCCTGGTGGAACCGTAACCCTGACCTGTGAAGTCCCTGCCCAGCCCTCTCCTCAAATCCACTGGATGAAGGATGGTGTGCCCTTGCCCCTTCCCCCCAGCCCTGTGCTGATCCTCCCTGAGATAGGGCCTCAGGACCAGGGAACCTACAGCTGTGTGGCCACCCATTCCAGCCACGGGCCCCAGGAAAGCCGTGCTGTCAGCATCAGCATCATCGAACCAGGCGAGGAGGGGCCAACTGCAGGCTCTGTGGGAGGATCAGGGCTGGGAACTCTAGCCCTGGCCGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGAC GGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGT
GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCLAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTCGGGAAATGA黑体文本为RAGE信号序列的编码序列，正常文本为人RAGE的编码序列，下划线文 本为IgG4Fc区域的编码序列。表2 人RAGE-IgG4Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。maagtavgaw vlvlslwgav vgaqnitari geplvlkckg apkkppqrle 50WKLNTGRTEA WKVLSPQGGG PWDSVARVLP NGSLFLPAVG IQDEGIFRCQ 100AMNRNGKETK SNYRVRVYQI PGKPEIVDSA SELTAGVPNK VGTCVSEGSY 150PAGTLSWHLD GKPLVPNEKG VSVKEQTRRH PETGLFTLQS ELMVTPARGG 200DPRPTFSCSF SPGLPRHRAL RTAPIQPRVff EPVPLEEVQL VVEPEGGAVA 250PGGTVTLTCE VPAQPSPQIH WMKDGVPLPL PPSPVLILPE IGPQDQGTYS 300CVATHSSHGP QESRAVSISI IEPGEEGPTA GSVGGSGLGT LALAASTKGP 350SVFPLAPCSR STSESTMLG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV 400LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTKTYTCNYD HKPSNTKVDK RVESKYGPPC 450PSCPAPEFLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVWDV SQEDPEVQFN 500ffYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTYRWSVL TVLHQDffLNG KEYKCKVSNK 550GLPSSIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSQE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD 600IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSRLTVDKSR ffQEGNYFSCS 650VMHEALHNHY TQKSLSLSLG K671黑体文本为RAGE信号序列的氨基酸序列，正常文本为人RAGE的氨基酸序列，下划 线文本为IgG4Fc区域的氨基酸序列。
表3 人RAGE-连接子_IgG4Fc融合基因序列(SEQ ID NO 3)。
ctgtggggggcagtagtaggtgct caaaacatcacagcccggattgGCGAGCCACTGGTGCTGAAGTGTAAGGGGGCCCCCAAGAAACCACCCCAGCGGCTGGAATGGAAACTGAACACAGGCCGGACAGAAGCCTGGAAGGTCCTGTCTCCCCAGGGAGGAGGCCCCTGGGACAGTGTGGCTCGTGTCCTTCCCAACGGCTCCCTCTTCCTTCCGGCTGTCGGGATCCAGGATGAGGGGATTTTCCGGTGCCAGGCAATGAACAGGAATGGAAAGGAGACCAAGTCCAACTACCGAGTCCGTGTCTACCAGATTCCTGGGAAGCCAGAAATTGTAGATTCTGCCTCTGAACTCACGGCTGGTGTTCCCAATAAGGTGGGGACATGTGTGTCAGAGGGAAGCTACCCTGCAGGGACTCTTAGCTGGCACTTGGATGGGAAGCCCCTGGTGCCGAATGAGAAGGGAGTATCTGTGAAGGAACAGACCAGGAGACACCCTGAGACAGGGCTCTTCACACTGCAGTCGGAGCTAATGGTGACCCCAGCCCGGGGAGGAGATCCCCGTCCCACCTTCTCCTGTAGCTTCAGCCCAGGCCTTCCCCGACACCGGGCCTTGCGCA
典 TEQGGAQSCGISMMXSOTMGfETOGAOEGMjGOTGCTGGTCCTCAGTTCCAATTGGTGGTGGAGCCAGAAGGTGGAGCAGTAGCTCCTGGTGGAACCGTAACCCTGACCTGTGAAGTCCCTGCCCAGCCCTCTCCTCAAATCCACTGGATGAAGGATGGTGTGCCCTTGCCCCTTCCCCCCAGCCCTGTGCTGATCCTCCCTGAGATAGGGCCTCAGGACCAGGGAACCTACAGCTGTGTGGCCACCCATTCCAGCCACGGGCCCCAGGAAAGCCGTGCTGTCAGCATCAGCATCATCGAACCAGGCGAGGAGGGGCCAACTGCAGGCTCTGTGGGAGGATCAGGGCTGGGAACTCTAGCCCTGGCC GGTAGCGGCTCCG
GAAGTGGG GCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG
GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACtacacacagaagagcctctccctgtctctcgggaaatga黑体文本为RAGE信号序列的编码序列，正常文本为人RAGE的编码序列，双下划线 文本为肽连接子的编码序列，单下划线文本为IgG4Fc区域的编码序列。表4 人RAGE-连接子_IgG4Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :4)。MAAGTAVGAW VLVLSLWGAV VGA QNITARI GEPLVLKCKG APKKPPQRLE 50WKLNTGRTEA WKVLSPQGGG PffDSVARVLP NGSLFLPAVG IQDEGIFRCQ 100AMNRNGKETK SNYRVRVYQI PGKPEIVDSA SELTAGVPNK VGTCVSEGSY 150PAGTLSffHLD GKPLVPNEKG VSVKEQTRRH PETGLFTLQS ELMVTPARGG 200DPRPTFSCSF SPGLPRHRAL RTAPIQPRVff EPVPLEEVQL VVEPEGGAVA 250PGGTVTLTCE VPAQPSPQIH WMKDGVPLPL PPSPVLILPE IGPQDQGTYS 300CVATHSSHGP QESRAVSISI IEPGEEGPTA GSVGGSGLGT LALA GSGSGS 350Gastkgpsvf plapcsrsts estaalgcly kdyfpepvtv swnsgaltsg 400VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTK TYTCNVDHKP SNTKVDKRVE 450SKYGPPCPSC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE 500DPEVQFNffYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDffLNGKEY 550KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV 600KGFYPSDIAV EffESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRffQE 650GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK678黑体文本为RAGE信号序列的氨基酸序列，正常文本为人RAGE的氨基酸序列，双下 划线文本为肽连接子的氨基酸序列，单下划线文本为IgG4Fc区域的氨基酸序列。
表5 人 RAGE 变体 _IgG4Fc 融合基因序列(SEQ ID NO 5)。
ATGGCAGCCGGAACAGCAGTTGGAGCCTGGGTGCTGGTCCTCA
GTCTGTGGGGGGCAGTAGTAGGTGCT caaaacatcacagcccggattggcgagccactggtgctgaagtgtaagggggcccccaagaaaccaccccagcggctggaatggaaactgaacacaggccggacagaagcttggaaggtcctgtctccccagggaggaggcccctgggacagtgtggctcgtgtccttcccaacggctccctcttccttccggctgtcgggatccaggatgaggggattttccggtgccaggcaatgaacaggaatggaaaggagaccaagtccaactaccgagtccgtgtctaccagattcctgggaagccagaaattgtagattctgcctctgaactcacggctggtgttcccaataaggtggggacatgtgtgtcagagggaagctaccctgcagggactcttagctggcacttggatgggaagcccctggtgccgaatgagaagggagtatctgtgaaggaacagaccaggagacaccctgagacagggctcttcacactgcagtcggagctaatggtgaccccagcccggggaggagatccccgtcccaccttctcctgtagcttcagcccaggccttccccgacgccgggccttgcacacagcccccatccagccccgtgtctgggagcctgtgcctctggaggaggtccaattggtggtggagccagaaggtggagcagtagctcctggtggaaccgtaaccctgacctgtgaagtccctgcccagccctctcctcaaatccactggatgaaggatggtgtgcccttgccccttccccccagccctgtgctgatcctccctgagatagggcctcaggaccagggaacctacagctgtgtggccacccattccagccacgggccccaggaaagccgtgctgtcagcatcagcatcatcgaaccaggcgaggaggggccaactgcaggctctgtggga
ggatcagggctgggaactctagccctggccgcttccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgg
GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTCGGGAAATGA
黑体文本为RAGE信号序列的编码序列，正常内容为人RAGE变体的编码序列，黑体 下划曲线字母为引入变体hRAGE序列中的点突变位点，下划线文本为IgG4Fc区域的编码序 列。表6 人RAGE变体_IgG4Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :6)。1 MAAGTAVGAW VLVLSLWGAV VGA QNITARI GEPLVLKCKG APKKPPQRLE51 WKLNTGRTEA WKVLSPQGGG PffDSVARVLP NGSLFLPAVG IQDEGIFRCQ101 AMNRNGKETK SNYRVRVYQI PGKPEIVDSA SELTAGVPNK VGTCVSEGSY151 PAGTLSffHLD GKPLVPNEKG VSVKEQTRRH PETGLFTLQS ELMVTPARGG201 DPRPTFSCSF SPGLPR R RAL H TAPIQPRVff EPVPLEEVQL VVEPEGGAVA251 PGGTVTLTCE VPAQPSPQIH WMKDGVPLPL PPSPVLILPE IGPQDQGTYS301 CVATHSSHGP QESRAVSISI IEPGEEGPTA GSVGGSGLGT LALAASTKGP351 SVFPLAPCSR STSESTAALG CLVKDYFPEP VTVSffNSGAL TSGVHTFPAV401 LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTKTYTCNVD HKPSNTKVDK RVESKYGPPC451 PSCPAPEFLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SQEDPEVQFN501 ffYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTYRVVSVL TVLHQDffLNG KEYKCKVSNK551 GLPSSIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSQE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD601 IAVEffESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSRLTVDKSR ffQEGNVFSCS651 VMHEALHNHY TQKSLSLSLG K黑体文本为RAGE信号序列的氨基酸序列，正常文本为人RAGE变体的氨基酸序列， 黑体下划曲线字母为引入变体hRAGE序列中的点突变位点，下划线文本为IgG4Fc区域的氨 基酸序列。表7 人RAGE变体-连接子_IgG4Fc融合基因序列(SEQ ID NO 7)。
ATGGCAGCCGGAACAGCAGTTGGAGCCTGGGTGCTGGTCCTCAgtctgtggggggcagtagtaggtgct caaaacatcacagcccggATTGGCGAGCCACTGGTGCTGAAGTGTAAGGGGGCCCCCAAGAAACCACCCCAGCGGCTGGAATGGAAACTGAACACAGGCCGGACAGAAGCTTGGAAGGTCCTGTCTCCCCAGGGAGGAGGCCCCTGGGACAGTGTGGCTCGTGTCCTTCCCAACGGCTCCCTCTTCCTTCCGGCTGTCGGGATCCAGGATGAGGGGATTTTCCGGTGCCAGGCAATGAACAGGAATGGAAAGGAGACCAAGTCCAACTACCGAGTCCGTGTCTACCAGATTCCTGGGAAGCCAGAAATTGTAGATTCTGCCTCTGAACTCACGGCTGG
TGTTCCCAATAAGGTGGGGACATGTGTGTCAGAGGGAAGCTACCCT
GCAGGGACTCTTAGCTGGCACTTGGATGGGAAGCCCCTGGTGCCGA
ATGAGAAGGGAGTATCTGTGAAGGAACAGACCAGGAGACACCCTGAGACAGGGCTCTTCACACTGCAGTCGGAGCTAATGGTGACCCCAGCCCGGGGAGGAGATCCCCGTCCCACCTTCTCCTGTAGCTTCAGCCCAGGCCTTCCCCGACGCCGGGCCTTGCACACAGCCCCCATCCAGCCCCGTGTCTGGGAGCCTGTGCCTCTGGAGGAGGTCCAATTGGTGGTGGAGCCAGAAGGTGGAGCAGTAGCTCCTGGTGGAACCGTAACCCTGACCTGTGAAGTCCCTGCCCAGCCCTCTCCTCAAATCCACTGGATGAAGGATGGTGTGCCCTTGCCCCTTCCCCCCAGCCCTGTGCTGATCCTCCCTGAGATAGGGCCTCAGGACCAGGGAACCTACAGCTGTGTGGCCACCCATTCCAGCCACGGGCCCCAGGAAAGCCGTGCTGTCAGCATCAGCATCATCGAACCAGGCGAGGAGGGGCCAACTGCAGGCTCTGTGGGAGGATCAGGGCTGGGAACTCTAGCCCTGGCC GGTAGCGGCTCCGGAAGTGGG GCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTCGGGAAATGA黑体文本为RAGE信号序列的编码序列，正常文本为人RAGE变体的编码序列，黑体下划曲线字母为引入变体hRAGE序列中的点突变位点，双下划线文本为编码肽连接子的序 列，下划线文本为IgG4Fc区域的编码序列。表8 人RAGE变体-连接子_IgG4Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO 8)。1 MAAGTAVGAW VLVLSLWGAV VGA QNITARI GEPLVLKCKG APKKPPQRLE
51 WKLNTGRTEA WKVLSPQGGG PffDSVARVLP NGSLFLPAVG IQDEGIFRCQ101 AMNRNGKETK SNYRVRVYQI PGKPEIVDSA SELTAGVPNK VGTCVSEGSY151 PAGTLSffHLD GKPLVPNEKG VSVKEQTRRH PETGLFTLQS ELMVTPARGG201 DPRPTFSCSF SPGLPR .R RAL H TAPIQPRVff EPVPLEEVQL VVEPEGGAVA251 PGGTVTLTCE VPAQPSPQIH WMKDGVPLPL PPSPVLILPE IGPQDQGTYS
301 CVATHSSHGP QESRAVSISI IEPGEEGPTA GSVGGSGLGT T AT A .GSGSGS351gASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV KDYFPEPVTV SffNSGALTSG401 VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTK TYTCNVDHKP SNTKVDKRVE451 SKYGPPCPSC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE501 DPEVQFNffYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDffLNGKEY551 KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV601 KGFYPSDIAV EffESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRffQE651 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK黑体文本为RAGE信号序列的氨基酸序列，正常文本为人RAGE变体的氨基酸序列， 黑体下划曲线字母为引入变体hRAGE中的点突变位点，双下划线文本为肽连接子的氨基酸 序列，下划线文本为IgG4Fc区域的氨基酸序列。RAGE融合蛋白的表达本发明的融合蛋白可以通过本领域的那些技术人员所已知的任何蛋白表达系统 来制备，例如，真核表达系统、细菌表达系统和病毒表达系统。可以使用多种宿主表达载体 系统来表达本发明的融合蛋白。这类宿主系统代表了本发明融合蛋白可以在其中制备的溶 媒，随后融合蛋白可以从其中纯化。此类系统包括但不限于诸如细菌、酵母等微生物、昆虫 细胞或植物细胞。视表达系统而定，酵母或哺乳动物表达系统(例如，C0S-7细胞)中表达的 RAGE可与天然分子的分子量和糖基化模式类似或轻微不同。细菌(如大肠杆菌(E. coli)) 中RAGE DNA表达提供非糖基化的分子。可以使用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中获得不 同的糖基化模式。具有灭活的N-糖基化位点的哺乳动物RAGE功能突变体类似物可以通过 寡核苷酸合成和连接或通过定点突变技术来制备。可以使用酵母表达系统以均勻的还原碳 水化合物形式以好的产率制备这些类似蛋白。可以通过本领域内任何已知的方法获得编码本发明融合蛋白的核酸分子，并测定 多核苷酸的核苷酸序列。根据本文的教导和已知的RAGE多肽序列及其鉴别的或可鉴别的 配体结合元件、以及重链IgG恒定结构域的已知序列，可以使用本领域内熟知的方法确定 编码这些多肽的核苷酸序列，即，可以将已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子以能够产生 编码本发明融合蛋白的核酸的方式组装。可以根据所用的表达系统来选择核苷酸密码子， 例如通过选择对应于表达系统中所存在的较高丰度tRNA分子的密码子，则可以表达较高 水平的融合蛋白。编码融合蛋白的这种多核苷酸可以由化学合成的多核苷酸组装(例如， 如Kutmeier等人，Biotechniques 17:242(1994)中所述)，简言之，其包括合成含有编码 融合蛋白的序列部分的重叠寡核苷酸；退火和连接这些寡核苷酸；然后通过聚合酶链式反 应(PCR)扩增经连接的寡核苷酸。本发明融合蛋白(包括含有融合蛋白片段或其变体或者由融合蛋白片段或其变 体组成的其他分子)的重组表达可能需要构建含有编码融合蛋白的多核苷酸的表达载体。一旦得到了编码本发明融合蛋白的多核苷酸，便可以通过重组DNA技术使用该领域内所熟 知的技术来制备产生融合蛋白的载体。这类含有RAGE-Fc编码序列的表达载体还可以含有 适当的转录和翻译控制信号/序列，例如核糖体结合位点(即，Kozak序列)、内部核糖体进 入位点(IRES)、和多腺苷酸化位点等。编码本发明融合蛋白的核酸分子可以如下转移到哺乳动物细胞中使用复制缺陷 型逆转录病毒载体(例如，源自莫洛尼鼠类白血病病毒(MLV)或HIV的载体)和水泡性口 膜炎病毒G蛋白(VSV-G)制成假性病毒以稳定插入到编码本发明融合蛋白的单拷 贝核酸分 子中进入分裂的细胞。逆转录病毒以RNA形式传递编码的基因，进入细胞后将其反转录成 DNA，稳定整合到宿主细胞基因组中。在单个细胞中多个基因的插入可能增加融合蛋白的表 达和分泌。多次感染也可以增加整合的基因拷贝数从而增加表达的融合蛋白量。编码融合 蛋白的整合的基因由于它们存在于基因组中而通过细胞分裂保持在细胞中。在一些实施方式中，本发明提供表达本发明融合蛋白的稳定细胞系。快速制备 稳定的蛋白高度表达的哺乳动物细胞系的一个适宜的方法是使用GPEx 表达系统(Gala Biotech, a business unit of Catalent Pharma Solutions, Middleton, WI. , Bleck, Gregory Τ. , Bioprocessingjournal. com 9 月 /10 月 2005 第 1—7 页)。此方法可能必须制 备基于MMLV的复制缺陷型的假型逆转录病毒载体并用载体转导哺乳动物细胞(例如，CHO 细胞)。该载体可以整合到细胞的基因组中，从而产生稳定的细胞系。分离的融合蛋白的纯化本发明的分离的融合蛋白可以如下制备培养适宜的宿主/载体系统以表达本发 明DNA序列的重组翻译产物，然后使用本领域内熟知的技术将其从培养基或细胞提取物中纯化。例如，首先可以使用市售蛋白浓缩过滤器(例如，Ami con或Mi 11 iporePe 11 i con超 纯过滤单元)浓缩上清液，该上清液来自将重组蛋白分泌到培养基的系统。浓缩步骤之后， 将浓缩物应用到适宜的纯化基质上。例如，适宜的亲和基质可以包含例如，结合在适宜支 架上的AGE或凝集素或蛋白A或蛋白G或抗体分子。或者，可以采用阴离子交换树脂，例如 具有二乙基氨基乙基(DEAE)侧基的基质或基底。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤 维素或蛋白纯化中常用的其他类型。或者，可以采用阳离子交换步骤。适宜的阳离子交换 剂包括含有磺丙基或羧甲基的各种不溶性基质。优选磺丙基。细菌培养所制备的重组蛋白通常如下分离首先从细胞团提取，然后是一次或多 次浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻层析步骤。最后，可以使用高效液相色谱(HPLC)进 行最后的纯化步骤。重组哺乳动物RAGE表达中所采用的微生物细胞可以通过任何方便的 方法破碎，其包括冻融循环、超声波、机械破碎或使用细胞裂解剂。以分泌蛋白形式表达本发明融合蛋白的酵母发酵很大程度上简化了纯化。得自大 规模发酵的分泌的重组蛋白可以通过由Urdal等人(J. Chromatog. 296 :171，1984)所公开 的那些类似的方法进行纯化。此参考文献描述了在制备性HPLC柱子上纯化重组人GMCSF 的两个连续的、反相HPLC步骤。药物组合物本发明的融合蛋白可以适于给予有需要的患者的方式配制，例如可以配制成药物 组合物。本发明的组合物可以包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。如本文所用“药学上可接受的载体”包括任何和所有的生理上适应的溶剂、分散介质、涂剂、抗 菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在一个实施方式中，所述载体适于肠胃外给药。 载体可适合于给药到中枢神经系统(例如，以脊柱内或脑内方式)。或者，所述载体可适合 于静脉内、皮下、腹腔或肌内给药。在另一实施方式中，所述载体适于口服给药。药学上可 接受的载体包括无菌水溶液或分散剂(dispersion)和无菌可注射溶液或或分散剂的临时 制剂的无菌粉末。药学上活性物质的这类介质和药剂的用途在本领域中是熟知的。任何常 规的介质或药剂除非与本发明的融合蛋白不相容，否则其在本发明药物组合物中的用途也 涵盖在本发明内。还可以将辅助活性化合物掺入组合物中。适宜的载体通常在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的。通常本发明药物组 合物的制备必须将本发明融合蛋白与下列物质的一种或多种混合缓冲剂、抗氧化剂(如 抗坏血酸)、低分子量(小于约10个残基)多肽、蛋白、氨基酸、碳水化合物(包括葡萄糖、 海藻糖、蔗糖或糊精)、螯合剂(如，EDTA)、谷胱甘肽以及其他稳定剂和赋形剂。中性缓冲 盐或与同种血清白蛋白混合的盐水是示例性的合适稀释剂。本发明融合蛋白的治疗性给药本发明包括将本发明融合蛋白以药物组合物形式给予有需要的患者(例如，哺乳 动物，尤其是人)，所述药物组合物包含本发明的融合蛋白和药物上可接受的稀释剂或载 体。本发明还提供用此类组合物治疗人类疾病的方法。通常，本发明的方法包括给予包含药学上有效量的本发明融合蛋白的药物组合 物。所采用的药学上的有效量可以根据诸如个体的疾病状况、年龄、性别和体重等因素而改变。本发明融合蛋白的药学上的有效量可以为约1 μ g融合蛋白/Ikg患者体重至约 500mg融合蛋白/Ikg患者体重、或约10 μ g融合蛋白/Ikg患者体重至约500mg融合蛋白 /Ikg患者体重、或约100 μ g融合蛋白/Ikg患者体重至约500mg融合蛋白/Ikg患者体重、 或约Img融合蛋白/Ikg患者体重至约500mg融合蛋白/Ikg患者体重、或约IOmg融合蛋白 /Ikg患者体重至约500mg融合蛋白/Ikg患者体重、或约IOOmg融合蛋白/Ikg患者体重至 约500mg融合蛋白/Ikg患者体重、或约100 μ g融合蛋白/Ikg患者体重至约25mg融合蛋白 /Ikg患者体重、或约Img融合蛋白/Ikg患者体重至约25mg融合蛋白/Ikg患者体重、或约 5mg融合蛋白/Ikg患者体重至约25mg融合蛋白/Ikg患者体重、或约IOmg融合蛋白/Ikg 患者体重至约25mg融合蛋白/Ikg患者体重、或约15mg融合蛋白/Ikg患者体重至约25mg 融合蛋白/Ikg患者体重、或约100 μ g融合蛋白/Ikg患者体重至约IOmg融合蛋白/Ikg患 者体重、或约Img融合蛋白/Ikg患者体重至约IOmg融合蛋白/Ikg患者体重、或约2. 5mg 融合蛋白/Ikg患者体重至约IOmg融合蛋白/Ikg患者体重、或约5mg融合蛋白/Ikg患者 体重至约IOmg融合蛋白/Ikg患者体重、或约7. 5mg融合蛋白/Ikg患者体重至约IOmg融 合蛋白/Ikg患者体重。在一些实施方式中，本发明融合蛋白的药学上的有效量可以为0.5mg融合蛋白 /Ikg患者体重、Img融合蛋白/Ikg患者体重、2mg融合蛋白/Ikg患者体重、3mg融合蛋白 /Ikg患者体重、4mg融合蛋白/Ikg患者体重、5mg融合蛋白/Ikg患者体重、6mg融合蛋白 /Ikg患者体重、7mg融合蛋白/Ikg患者体重、8mg融合蛋白/Ikg患者体重、9mg融合蛋白 /Ikg患者体重、或IOmg融合蛋白/Ikg患者体重。
单位剂型是指适合用作待治疗的哺乳动物患者的单位剂量的物质离散单位；每个单位含有预定量的本发明融合蛋白，该预定量经计算能与所需的药物载体结合产生所需的 治疗效果。本发明融合蛋白的单位剂型可以为约Img至约lOOOmg、约25mg至约lOOOmg、 约 50mg 至约 lOOOmg、约 IOOmg 至约 lOOOmg、约 250mg 至约 lOOOmg、约 500mg 至约 lOOOmg、 约IOOmg至约500mg、约200mg至约500mg、约300至约500mg、或约400mg至约500mg。本 发明融合蛋白的单位剂量可以为约100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg或700mg。本发明组合物可以以下水平包含本发明融合蛋白组合物总重量的约0. 1重量％ 至约20重量％、约0. 1重量％至约18重量％、约0. 1重量％至约16重量％、约0. 1重量％ 至约14重量％、约0. 1重量％至约12重量％、约0. 1重量％至约10重量％、约0. 1重量％ 至约8重量％、约0. 1重量％至约6重量％、约0. 1重量％至约4重量％、约0. 1重量％至 约2重量％、约0. 1重量％至约1重量％、约0. 1重量％至约0.9重量％、约0. 1重量％至约 0.8重量％、约0. 1重量％至约0. 7重量％、约0. 1重量％至约0.6重量％、约0. 1重量％至 约0.5重量％、约0. 1重量％至约0.4重量％、约0. 1重量％至约0.3重量％、或约0. 1重 量％至约0. 2重量％。本发明的药物组合物可以以下水平包含一种或多种本发明融合蛋白组合物总重 量的约1重量％至约20重量％、约1重量％至约18重量％、约1重量％至约16重量％、 约1重量％至约14重量％、约1重量％至约12重量％、约1重量％至约10重量％、约1重 量％至约9重量％、约1重量％至约8重量％、约1重量％至约7重量％、约1重量％至约 6重量％、约1重量％至约5重量％、约1重量％至约4重量％、约1重量％至约3重量％、 或约1重量％至约2重量％。本发明药物组合物可以以下水平包含一种或多种本发明融合 蛋白以组合物的总重量计约0. 1重量％、约0.2重量％、约0.3重量％、约0.4重量％、约 0. 5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％、约1重量％、约2 重量％、约3重量％、约4重量％、约5重量％、约6重量％、约7重量％、约8重量％、或约 9重量％。可以调节剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，可以给予单次推注，可以随时间 分几次给予剂量，或者可以根据治疗情况的紧迫性按比例减少或增加剂量。特别有利的是 以单位剂型配制肠胃外组合物以方便药剂的给药和均一性。可以配制本发明的组合物，并 通过静脉内、肌内或皮下注射方式给予。在一些实施方式中，本发明的组合物可以皮下或肌 内方式给予。在一些实施方式中，剂量方案可能要求给予重复剂量，例如，给予每周一次的剂 量。治疗方案可能要求一段时间(例如，四周)的每周剂量，然后进行次数较少的“维持”剂 量方案(例如，一月一次或两月一次)。可以调节剂量方案以取得期望的治疗结果。本发明方法包括抑制人的AGE依赖性炎症反应的方法，该方法包括给予有效量的 药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本发明的融合蛋白。本发明的方法包括抑制AGE介导的生物活性的方法，该方法包括给予包含一种或 多种本发明的融合蛋白的药物组合物。如上文所讨论，AGE参与了多种疾病或病况，如自 身免疫病。可以使用本发明的融合蛋白治疗、改善、检测、诊断、预测或监控的自身免疫紊 乱疾病或病况包括但不限于皮炎、肾小球肾炎、多发性硬化、葡萄膜炎性眼炎、自身免疫性 肺炎、胰岛素依赖性糖尿病、自身免疫性炎眼、系统性红斑狼疮、胰岛素耐受、类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病和硬皮病。可以使用本发明方法治疗或预防的其他病症一般可以具有如下的特征包括其中 受影响的细胞显示RAGE或一种或多种RAGE配体表达升高的任何病症；或者可以通过降低 RAGE功能治疗(即，可以消除或改善一个或多个症状)的任何病症。例如，RAGE功能可以 通过给予破坏RAGE和RAGE配体之间相互作用的药剂来降低。RAGE表达的增加与几种病理状态有关如糖 尿病性血管病变、肾病、视网膜病、神 经病、以及其他病症，包括阿尔茨海默氏(Alzheimer)病和血管壁的免疫/炎性反应。RAGE 配体在受包括关节炎(如类风湿性关节炎)在内的许多炎性病症影响的组织中产生。淀 粉状蛋白在组织中的沉积引起对细胞的多种毒性效应，其是被称为淀粉样病变的疾病的特 征。RAGE与β折叠纤维状材料结合，如在β淀粉样肽、Abeta、支链淀粉、血清淀粉样蛋白 A和朊病毒源肽中所发现的。RAGE还以升高的水平在具有淀粉样蛋白结构的组织中表达。 因此，RAGE参与了淀粉样蛋白病症。RAGE-淀粉样蛋白相互作用被认为能导致氧化应激，该 氧化应激会导致神经元退化。多种RAGE配体，尤其是SlOO/钙粒蛋白、两性素(HMGBl)家族的那些在发炎的组 织中产生。这种观察现象在急性炎症(如对脂多糖刺激(如在脓毒中)的反应中所看到 的)和慢性炎症(如在各种形式的关节炎、溃疡性结肠炎、炎性肠病等中所看到的)中都是 确定的。心血管疾病，且尤其是从动脉粥样硬化斑块产生的那些也被认为是具有实质的炎 性组分。此类疾病包括闭塞性疾病、血栓性疾病和栓塞性疾病，分别如咽峡炎、脆性斑块病 症(fragile plaquedisorder)和脑栓塞。肿瘤细胞还显示出RAGE配体(尤其是两性素) 的表达增高，这表明癌症也是RAGE相关的病症。此外，慢性炎症的氧化作用和其他方面可 能对某些肿瘤的发生起作用。AGE是类风湿性关节炎和其他炎性疾病的治疗靶标。因此，可以用本发明组合物治疗的RAGE相关病症除了上述自身免疫性疾病之外 还包括淀粉样病变(例如阿尔茨海默氏病)、克隆氏(Crohn)病、急性炎性疾病(例如， 脓毒)、休克(例如，败血性休克、出血性休克)、心血管疾病(例如，动脉粥样硬化、中风、 脆性斑块病症、咽峡炎和再狭窄)、糖尿病(尤其是糖尿病中的心血管疾病)、糖尿病并发 症、朊病毒相关病症、癌症、血管炎和其他血管炎综合征，如坏死性血管炎(necrotizing vasculitide)、肾病、视网膜病和神经病。下列实例仅为示例目的提供，其不以任何方式限制本发明的范围。 实施例下列实施例中，小鼠实验使用融合蛋白进行，该融合蛋白包含与铰链区融合的小 鼠RAGE的胞外结构域(氨基酸残基1-342)、小鼠IgG2a重链FC区域的CH2和CH3结构域。 构建体使用GPEx 表达系统在CHO细胞中表达。所用的小鼠RAGE序列在下表中提供。表9 (SEQ ID NO 11)小鼠 RAGE 序列MPAGTAARAff VLVLALffGAV AGGQNITARI GEPLVLSCKG APKKPPQQLE WKLNTGRTEAWKVLSPQGGP WDSVARILPN GSLLLPATGI VDEGTFRCRA TNRRGKEVKS NYRVRVYQIPGKPEIVDPAS ELTASVPNKV GTCVSEGSYP AGTLSffHLDG KLLIPDGKET LVKEETRRHPETGLFTLRSE LTVIPTQGGT HPTFSCSFSL GLPRRRPLNT APIQLRVREP GPPEGIQLLV
EPEGGIVAPG GTVTLTCAIS AQPPPQVHWI KDGAPLPLAP SPVLLLPEVG HEDEGTYSCVATHPSHGPQE SPPVSIRVTE TCDEGPAEGS VGP.srj GTT A LAEPRGPTIK PCPPCKCPAP
NLLGGPSVFI _ FPPKIKDVLM ISLSPIVTCV VVDy_sEDDPD__VQ_I SWFVNNV__EVHTAQTQTHREDYN S T LRV VSALPIQHQD WMS GKΕ FKCK VNN KP.I.S KPK GS VRAPQVYVLPPPEEEMTKKQ VTLTCMVTDF MPEDIYVEffT NNGKTELNYK NTEPVLDSDG SYFMYSKLRVEKKNffVERNS YSCSVVHEGL HNHHTTKSFS RTPGK 其中RAGE信号肽=下划盲线；RAGE胞外结构域=无下划线；小鼠 IgG2a铰链区=双下划线;小鼠IgG2aCH2区域處工.划.线；和小鼠
IgG2aCH3区域=下划曲线。实施例1 在小鼠中本发明的RAGE融合蛋白对链脲佐菌素诱导的糖尿病的影响。小鼠中链脲佐菌素诱导的糖尿病是本领域内公认的用于糖尿病诱导的视网膜 改变的模型(参见 IG, Drel VR, Kumagai AK, Szabo C, Pacher P, Stevens MJ. Early diabetes-induced biochemical changes in the retina comparison of ratand mouse models.Diabetologia. 2006 Oct 49(10) :2525_33·)。本实验包括5个处理组，每组有15只C57BL/6小鼠1)非糖尿病对照；2)含有糖 尿病对照的小鼠，在研究前连续5天以45mg/kg的链脲佐菌素处理开始诱导糖尿病；3)还 接受10 μ g/天的mRAGE-IgG2aFC腹腔注射的链脲佐菌素处理的小鼠，3次注射/周；4)还 接受100 μ g/天的mRAGE-IgG2aFC腹腔注射的链脲佐菌素处理的小鼠，3次注射/周；以及 5)还接受300 μ g/天的mRAGE-IgG2aFC腹腔注射的链脲佐菌素处理的小鼠，3次注射/周。在研究期间，评估小鼠的体重、血糖、糖血红蛋白(GHb)、蛋白尿和触觉敏感性(作 为感觉神经功能的量度)。在研究最后将小鼠处死，使用荧光探针评估视网膜血管透性、白 细胞对视网膜毛细血管的粘附和NF- κ B-调节的蛋白表达(COX、ICAM、iNOS)。来自历时两个月的研究的结果研究了在C57BL/6J小鼠中RAGE-Ig融合蛋白对糖尿病诱导的视网膜生理和代谢 改变的发展的影响。以3种不同的浓度(10yg、100yg和300yg)腹腔给予融合蛋白，每 周3次。没有看到任何剂量的药物对糖尿病小鼠的体重增益或总体健康有不利影响。在非 糖尿病对照、糖尿病对照、糖尿病+10μ gRAGE-Ig融合蛋白、糖尿病+100 μ g RAGE-Ig融合 蛋白和糖尿病+300 μ gRAGE-Ig融合蛋白组中的非禁食血糖水平分别为155士24mg/dl (均 值 士 SD)、358 士 38、417 士 36、376 士 36 和 370 士 55。在短期研究中测量的视网膜病相关的参数为(1)白细胞淤滞、(2)视网膜血管对 内源性白蛋白的透性、⑶视网膜蛋白的硝化、以及⑷视网膜ICAM和C0X-2的表达。1.白细胞游滞方法在糖尿病2个月时，通过经由心脏导管完全灌注PBS从麻醉的动物的脉管 系统去除血液。然后按之前所述用荧光素偶联的伴刀豆球蛋白A凝集素(20yg/ml，在PBS 中；Vector Laboratories, Burlingame, CA)灌注动物(参见 Joussen 等人，FASEB J. 2004 S印；18(12) 1450-2) 0通过荧光显微镜使平铺视网膜成像，对粘附到血管壁的白细胞数进 行计数。
结果在糖尿病2个月的小鼠中显示出与非糖尿病小鼠相比显著增加的白细胞淤 滞(P < 0. 05)。白细胞淤滞在用RAGE-Ig融合蛋白处理的任何组织都没有受到抑制(参见 图1)。2.血管透性 方法在糖尿病2个月时，将眼睛进行冰冻切片(10 μ m)，在甲醇中固定10分钟， 在PBS中洗涤4次。将各切片在山羊抗小鼠血清白蛋白(Abcam，Cambridge MA ；AB8940 ； 1 2000稀释)中孵育2小时。洗涤，然后将切片在FITC标记的二抗(AB 6743 ； 1 1000 稀释)中孵育90分钟。在荧光显微镜下，测定4个视网膜层(内网层、内核层、外网层、夕卜 核层)中的每层在3个不同位置的平均荧光量。各位置的荧光量是10次随机测量的平均 值，各视网膜层的荧光量是该层内3个不同位置的荧光平均值。结果在所研究的4个视网膜层的每个中糖尿病都引起非血管性视网膜中荧光强度显 著增加(即，由于白蛋白泄漏到血管外)。该结果显示在图2中(2A内网层、2B内核层、2C 外网层、2D外核层)。为了评估内核层和外核层中的白蛋白，我们有意地测量了核之间的薄 间距，所以这些数字可能不如来自网层的那些有力，在网层中没有核破坏我们的测量。3.视网膜蛋白的硝化方法在糖尿病2个月时，分离视网膜并将其勻浆化。进行斑点印迹，将来自每只 动物的50 μ g蛋白勻浆点印到硝酸纤维素膜上。将膜用牛奶(5%)封闭、洗涤、用抗硝基酪 氨酸(Upstate Biotechnology, Inc. #05-233 ； 1 500 稀释)免疫染色 2 小时，然后用二 抗(Bio-Rad山羊抗小鼠IgG-HRP结合物；1 1000稀释)染色1小时。充分洗涤，然后通 过增强化学发光法(ECL，Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)使通过抗体检测的 免疫染色显像。免疫染色依赖性的化学发光记录在膜上，对免疫染色的点的密度进行定量。 结果表示为非糖尿病对照中检测的值的百分比。结果结果显示在图3中。来自糖尿病小鼠的视网膜勻浆显示了预期的蛋白硝化增加。 治疗以剂量依赖方式抑制了这种翻译后修饰。蛋白的硝化被认为是氧化应激和硝化应激的参数。4.视网膜ICAM和C0X-2的表达方法分离视网膜并对其进行超声处理，将上清液用作全视网膜提取物。通 过SDS-PAGE将样品(50 μ g)分馏，电转染到硝酸纤维素膜上，在含有0. 02 %吐温20和 5%脱脂牛奶的Tris缓冲盐中封闭膜。使用ICAM-I抗体(1 200稀释；Santa Cruz Biotechnology)和C0X-2抗体，然后用二抗1小时。洗涤，然后通过增强化学发光法使结果 可视化。结果结果显示在图4中，由于ICAM-I在内皮细胞上的表达在白细胞向血管壁的粘附 (白细胞淤滞)中起着关键的作用，我们测量了糖尿病和治疗对视网膜中ICAM-I表达的影 响。两个月的糖尿病确实引起了视网膜ICAM-I表达的显著增加。RAGE-Ig融合蛋白的给药 导致了 ICAM表达剂量依赖性的降低，最高剂量显著抑制了这种表达。与C0X-2分子量一致的免疫染色条带的表达在糖尿病中没有增加，在得到治疗的动物中也没有改变(未显示)。在RAGE-Ig融合蛋白作用的这种短期研究中选择了终点用途，因为发现所有都与 早期(退行)糖尿病性视网膜病的发展有关，即，已发现抑制糖尿病诱导的视网膜毛细血管 退化的各种治疗也抑制这些缺陷。RAGE的抑制并不抑制与视网膜中血管透性和硝化应激相关的异常现象。硝化应激 还被认为是氧化应激的标记。然而，RAGE抑制剂不抑制与白细胞淤滞相关的异常现象。实施例2 在小鼠中本发明的RAGE融合蛋白对长期链脲佐菌素诱导的糖尿病的影响。小鼠中链脲佐菌素诱导的糖尿病是本领域内公认的用于糖尿病诱导的视网膜 改变的模型(参见 IG, Drel VR, Kumagai AK, Szabo C, Pacher P, StevensMJ)。Early diabetes-induced biochemical changes in the retina comparison ofrat and mouse models.Diabetologia. 2006 Oct 49(10) :2525_33·)本长期实验包括5个处理组，每组有25只C57BL/6小鼠1)非糖尿病对照；2)含 有糖尿病对照的小鼠，研究前连续5天以45mg/kg的链脲佐菌素处理开始诱导糖尿病；3) 还接受10 μ g/天的mRAGE-IgG2aFC腹腔注射的链脲佐菌素处理的小鼠，3次注射/周；4) 还接受100 μ g/天的mRAGE-IgG2aFC腹腔注射的链脲佐菌素处理的小鼠，3次注射/周；以 及5)还接受300 μ g/天的mRAGE-IgG2aFC腹腔注射的链脲佐菌素处理的小鼠，3次注射/ 周。在研究期间，评估小鼠的体重、血糖、糖血红蛋白(GHb)、蛋白尿和触觉敏感性(作 为感觉神经功能的量度)。在研究最后将小鼠处死，定量评估视网膜中的组织病理和神经退 行性变。在长期研究中测量的视网膜病相关的参数为(1)无细胞毛细血管、(2)周影细胞 和(3)神经节细胞。还在长期研究中测量了作为外周神经病变标记的爪子对轻触的敏感 性。糖尿病诱导的视网膜组织病理在糖尿病10个月后，将眼睛固定在福尔马林中，从每只动物中分离一个视网膜， 在流动的自来水中洗涤过夜，在粗制胰岛素溶液中消化2小时，如我们之前所报道的那样。 通过用单根头发制成的“刷子”轻轻移去神经细胞分离视网膜脉管系统。当神经细胞全部 清除后，将所分离的脉管系统展放在显微镜载玻片上，干燥过夜，用苏木精和高碘酸-希夫 (Schiff)染色，脱水并盖上盖玻片。退行性(无细胞)毛细血管在对应于遮蔽形式的中间 视网膜(200X放大倍率)的6-7个视野里定量。无细胞毛细血管鉴定为在沿其长度上任 何地方都没有核的毛细血管大小的血管，以每平方毫米视网膜面积的值报告。周影细胞由 周细胞消失的毛细血管基膜中伸出的“肿块”的普遍性来估计。至少检测了遮蔽形式的中间 视网膜(400 X放大倍率)的5个视野内的1，000个毛细血管细胞(内皮细胞和周细胞)。 排除任何已经是无细胞血管的影细胞。为了研究糖尿病对视网膜神经退行性变的影响，对神经节细胞层的细胞进行计 数。将经福尔马林固定的眼睛包埋在石蜡中，通过视网膜穿过视神经纵向切片，用苏木 精-伊红染色。神经节细胞层中的细胞数在视神经两 侧的两个区域内(中间视网膜和临近 视神经的后部视网膜)进行计数。对视神经两侧的相当的区域取平均值，表示为每单位长度的数。结果如根据前面的工作所预期的，长期糖尿病导致了视网膜中退行性无细胞毛 细血管数显著增加(图5A)。RAGE-Ig融合蛋白的所有剂量都显著地抑制这种毛细血管退 行，而对高血糖的严重程度没有任何影响。糖尿病还倾向于增加周细胞退化(周影细胞)， 但是其结果没有达到统计学显著性的程度(图5B)。我们之前发现在糖尿病C57BL/6小鼠 中检测周细胞丢失比糖尿病大鼠或更大的物种中要难得多，我们现在认为它在此模型中是 血管疾病的不可靠参数。可能结果在对照糖尿病中没有检测到显著的周细胞丢失，我们在 这些小鼠中没有检测到RAGE-Ig融合蛋白对周细胞丢失的任何影响。在这些C57BI/6小鼠中糖尿病并不诱导视网膜神经节细胞层中细胞数目的减少 (即，神经退行性变)。此结果与此小鼠模型之前的研究一致。在不存在糖尿病对视网膜神 经退行性变影响的情况下，我们不能估计抑制剂是否会对神经退行性变有影响。对轻触的敏感性(外周神经病的标记)患有糖尿病性神经病的患者可能表现出多种异常的感觉，包括自发疼痛，轻触引 起的疼痛以及感觉过敏。不断增加的数据表明糖尿病啮齿动物会再现这种感觉过敏并发展 触觉异常痛敏(tactile allodynia)。在啮齿动物中，将这测量成爪子触觉反应阈值。方法将小鼠(糖尿病8个月)转移到钢丝网底的测试笼中，使其适应10至15分 钟。使用测痛丝(Von Frey filaments)测定缩足反射的50%机械缩足反射阈值。将一系 列硬度呈对数增加的细丝(以屈曲重为0.6g的那根开始)以能引起细丝屈曲的压力顺次 施加到右后爪的脚底面上。将爪子抬起记录为阳性反应，选择较轻的细丝用于下一个测量。 如果5秒后没有反应，则在之后选择接下来最重的细丝使用。继续此方法，直到在最初的行 为改变后进行了 4次测量或直到发生了 5次连续的阴性(6g)或4次连续阳性(0.4g)反应。 使用所得的阳性和阴性评分顺序计算50%缩足反应阈值。结果糖尿病显著增加了爪子对轻触的敏感性，这表明糖尿病动物与非糖尿病动 物相比需要较低量的压力来缩回它们的爪子(图6)。这种糖尿病诱导的缺陷能被各剂量的 sRAGE-Ig融合蛋白显著抑制。视网膜病使用RAGE-Ig融合蛋白的研究采用2种持续时间的糖尿病进行。(1) 长期(10个月)研究以评估治疗对小鼠中发展的糖尿病性视网膜病的长期组织病理的影 响；以及(2) 2-3个月的研究以评估可能对长期组织病理产生影响的治疗的生理和分子效 应。选择了关于RAGE-Ig融合蛋白影响的生理和分子终点研究是因为在其他研究中发现它 们均与早期(退行)糖尿病性视网膜病的发展有关(很可能有原因地相关)。所有三个剂 量的治疗均清楚且显著地抑制糖尿病诱导的视网膜脉管系统退化。同样，所有三个剂量的 药剂似乎也都抑制这些小鼠中糖尿病诱导的视网膜透性增加。这些结果具有重要的临床意 义，因为早期(非增殖阶段)糖尿病性视网膜病仍然是基于血管病理(血管阻塞和退化以 及透性增加)定义的。治疗对来自糖尿病小鼠的视网膜中测量的分子和生理终点的影响是混合的。RAGE 的抑制确实抑制与硝化应激相关的异常现象，硝化应激是视网膜中氧化应激的标记。然而， RAGE抑制剂不抑制与白细胞淤滞相关的异常现象。 所述治疗缺乏对白细胞淤滞的影响是 令人吃惊的，因为另一研究小组最近报导了他们的sRAGE确实能抑制糖尿病中白细胞淤滞 的增加。然而我们使用RAGE-Ig融合蛋白开始研究时产生的证据(Diabetes 57:1387-93，2008)表明药物治疗对糖尿病中视网膜白细胞淤滞的效应并不预示所述治疗对糖尿病中视 网膜毛细血管退化的效应。因此，所述治疗缺乏对视网膜白细胞淤滞的效应也决不会削弱 所观察到的药物效应的意义。令人惊奇地，药物对糖尿病动物视网膜中ICAM-I的表达和蛋白的硝化的影响似 乎具有剂量效应，然而此剂量效应对于视网膜毛细血管透性和退化则不明显。这似乎表明 ICAM和硝化均不参与糖尿病中视网膜血管的缺陷，尽管我们使用ICAM-I敲除动物的数据与此结论矛盾。很清楚的是所述药物确实到达了视网膜，确实施加了生物效应，并且确实显示了 至少抑制糖尿病性视网膜病的早期血管病变的显著药物能力。感觉神经病其他人员已经假定晚期糖化终末产物(AGE)和这些AGE与RAGE的相 互作用能诱导氧化应激，上调神经中的NF-kB和各种NF-kB介导的促炎基因，并促进神经功 能障碍，包括改变的痛觉。本发明的数据与RAGE介导的信号传导促进糖尿病性神经病至少 一些方面的发展的证据相一致，并且提供了 sRAGE-Ig融合蛋白在长期研究中抑制此过程 的证据。实施例3 使用II型胶原诱导的关节炎小鼠模型的RAGE-Ig融合蛋白评定用II型胶原免疫敏感性小鼠品系，II型胶原是关节软骨的主要组分，其诱导进行 性炎性关节炎(Wooley 等人 Journal of Experimental Medicine 1981;154:688-700)。 胶原诱导的关节炎(CIA)在临床上的表征为红斑和水肿，受影响的爪子宽度增加通常为 100%。已经开发出一种临床评分指数来评估关节变形和脊椎炎的疾病进展(Wooley， Methods In Enzymology 1988;162:361-373)。受影响的关节的组织病理表现出滑膜炎、 关节翳形成、以及软骨和骨质糜烂，它们还可以用指数来表示。免疫实验室的结果包括高的 II型胶原抗体水平和高丙球蛋白血症。现在已经很好地建立了此模型以测试关节疾病的 免疫治疗方法(Staines 等人 British Journal of Rheumatology 1994 ；33 (9) :798_807)， 并且已经将其成功地用于生物和药理学药剂治疗类风湿性关节炎(RA)的研究(Wooley等 入Arthritis Rheum 1993 ；36 1305-1314 ；Wooley^AJournal oflmmunology 1993 ；151 6602-6607)。gAGE受体的拮抗被认为是RA的潜在治疗靶标。在患有胶原诱导的关节炎的小 鼠中阻断gAGE会导致关节炎的临床和组织学迹象降低，疾病改善与关节炎爪子组织中 TNFa、IL-6和基质金属蛋白酶MMP-3、MMP-9和MMP-13水平降低有关(Hofmann等人。Genes Immun 2002 ；3 (3) :123_135)。这表明胶原诱导的关节炎对RAGE靶向的治疗是敏感的。此试验将评估在用II型胶原免疫时开始给予的三个剂量的RAGE-Ig融合蛋白对 CIA的影响。实验设计显示在图7中。自Jackson实验室获得40只8-10周龄的DBA/lLacJ小鼠，实验之前让它们在实验 室中适应至少10天。在实验开始时所有动物重量均大于16克。将小鼠分在以下4个处理 组之一中1)每天腹腔注射100 μ 1无菌PBS ；2)每天腹腔注射100 μ 1含有10 μ g RAGE-Ig 融合蛋白的无菌PBS ；3)每天腹腔注射100 μ 1含有100 μ g RAGE-Ig融合蛋白的无菌PBS ； 和4)每天腹腔注射100 μ 1含有300 μ g RAGE-Ig融合蛋白的无菌PBS。初次给药3天后，在所有小鼠尾巴基部皮内注射在弗氏(Freimd)完全佐剂(FCA)中的 οομ g牛II型胶原。通过每天检测疾病的发作(其被记录下来)来监控小鼠。每周 称重小鼠，并记录总体健康状况。对受关节炎影响的动物进行临床估计，每周5次直到免疫 后10周，爪子测量每周进行3次。在免疫后10周没有关节炎体症的小鼠被认为是疾病阴 性的。结果总体健康和毒性在试验期间没有急性中毒事件发生，实验持续期间所有动物都存 活。治疗耐受良好，没有观察到不利的体症，如毛发缠结或刺激。小鼠重量(图8)表明在 试验过程中重量轻微改变，其通常由于各动物对应于疾病发作的短暂重量损失。这些变化 在组间都没有达到统计学显著的程度。关节炎的发病率和发作试验中胶原关节炎的最终发病率显示在图9中。对照小组 达到100%发作，这在经典的胶原关节炎模型中是不常见的，经典的胶原关节炎模型中通常 发病率介于80 % -100 %。用10 μ g/天RAGE处理小鼠达到了 80 %的发病率，发病率没有显 著降低。用IOOyg/天RAGE处理的小鼠显示出60%的关节炎发病率，该发病率显著低于对 照组(ρ < 0. 05)。令人惊奇的是用300 μ gRAGE处理的小鼠中关节炎发病率为100%，因此 与对照发病率类似。疾病发作的天数的平均值(和SEM)显示在图10中。疾病发作在对照组中是典型 的，第一次出现关节炎的平均天数是38. 6。用IOyg或IOOyg RAGE处理的小鼠中疾病发 作表面上延迟到42. 5，其并没有达到统计学显著的程度。然而，疾病发作在用300yg RAGE 处理的小鼠中则显著延迟(p<0. 05)。因此，尽管高剂量的小鼠不显示疾病发病率的降低， 但是临床上明显的关节炎发展的时间则明显增加。通过RAGE处理对疾病发作的调控可以容易地通过疾病发病率与时间的曲线来估 计(图11)。对照组中观察到了典型的CIA的快速疾病发作特征，用IOyg或IOOyg RAGE 处理的小鼠的结果是疾病发作延迟，关节炎最终发病率降低。约8周后，用300yg RAGE处 理的小鼠以类似的模式发展疾病，但是一系列晚期的关节炎动物导致疾病发病率高但疾病 发作延缓。疾病严重程度和进展处理动物和对照动物中累积关节评分的分析表现出RAGE治 疗对胶原诱导的关节炎严重程度的显著影响(图12)。对照小鼠发展为典型的慢性进行 性疾病，累积的关节炎指数显著增加。相反，用任何剂量的RAGE处理的小鼠都显示出显著 的关节炎评分降低。自免疫后43天开始对照和处理组之间的差异达到了统计学显著(ρ <0. 001)的高水平，而且这种差异在整个试验中都保持着。尽管IOOyg/天的RAGE治疗 取得最低的关节炎累积评分，但是在RAGE组之间的关节炎评分没有显著差异，这表明取得 了阈值”效应，而不是经典的剂量依赖效应。对RAGE治疗对关节炎爪子数的影响的分析(图13)显示出对疾病进展的显著影 响。再次，从43天开始观察到了对所涉及的爪子数目的显著影响。显著性水平在ρ < 0. 001 至ρ < 0. 025内变化，这可能反映了 RAGE对疾病严重程度的影响比对关节炎进展的影响更 为显著；然而，所涉及的爪子的最大数量(40)则比最大的累积疾病评分(120)更为有限。 同样，在RAGE处理组之间没有显著变化，尽管100 μ g RAGE组显示出最高水平的关节炎延迟。结果表明RAGE蛋白的给药在使用预防性方案给予时对胶原诱导的关节炎产生了明显的影响。任何剂量的RAGE注射都没有明显的毒性作用，并且处理似乎是良好耐受的。在每天接受IOOyg的小鼠中总体疾病发病率显著降低，在用300 μ g/天处理的小鼠中观察 到疾病发作的延迟。然而，临床活性最明显的指征是在疾病评分和关节炎爪子计数的降低 中所观察到的，其中自免疫后43天开始检测到了 RAGE处理的小鼠与对照动物之间的明显 区别。在此方面，对照小鼠经受了典型的重度关节炎进展，而所有剂量的RAGE处理都会延 迟疾病进展。组织病理学评估在完成临床评估研究时取出所有小鼠的四肢，储存在福尔马林中 性缓冲溶液中。在10%甲酸中将关节脱钙18天，脱水，包埋在石蜡块中。沿纵轴切片，固 定，并用苏木精和伊红或甲苯胺蓝染色。将样本切至约中线，然后固定径向中心的样品进行 评定。这使得能够进行一致的形貌评定。固定5至10个样品(通常为每个载玻片4至6 个样品)。染色后，用盖玻片永久性地粘合载玻片。以盲态方式评定至少每个样本的3个独 立切片，评定者不知道组的分配。在前肢，对所有肘、腕和掌关节进行评分，而所有的膝、踝、 跖关节则用后瓜评分。不评价趾，因为切片步骤除去了大部分的PIP关节。对载玻片进行 滑膜炎、关节翳形成、边缘糜烂和结构改变(大部分是半脱位)和破坏的存在的评定。然后 将基于这些收集点的总体评分赋值给各切片。评分系统基于如下滑膜炎通过滑膜厚度来判断，如下评分小于3个细胞厚为0 ;3至5个细胞厚为 1 ;6至10个细胞厚为2 ； 10-20个细胞厚为3 ；20-30个细胞厚为4。关节翳形成如下评分无关节翳为0 ；存在微绒毛为1 ；清楚的关节翳附着为2 ；明 显的关节翳附着为3 ；关节空间被关节翳填充为4。边缘糜烂如下评分无可见的糜烂为0 ；囊连接区域内微小的凹痕为1 ；清楚的软 骨糜烂为2 ；糜烂延伸到软骨下骨为3 ；骨和软骨严重糜烂为4。结构改变如下评分正常关节结构为0 ；水肿性改变为1 ；关节面轻微半脱位为2 ； 关节面严重半脱位为3 ；完全纤维化和胶原桥连为4。总体评分反映如下经典的正常关节外观为0 ；微小变化为1，与缓解期一致，可为 临床正常；确定的炎性关节炎为2 ；严重的炎性糜烂性疾病为3 ；损坏的糜烂性关节炎为4。软骨和骨基质降解使用甲苯胺蓝组织化学染色对连续切片进行软骨基质组分染 色。评定了甲苯胺蓝切片的蛋白聚糖丢失。将关节面的染色与生长板染色相比较，如下评 分无蛋白聚糖丢失为0，正常甲苯胺蓝染色；微量蛋白聚糖丢失为1，表面软骨染色有些丢 失；中度蛋白聚糖丢失为2，表面软骨有弱染色；显著的蛋白聚糖丢失为3，表面软骨无甲苯 胺蓝染色；严重蛋白聚糖丢失为4，软骨深处无甲苯胺蓝染色。结果胶原诱导的关节炎的组织病理学结果。评估切片的疾病炎性参数和糜烂参数。关 节炎的外观(图14)表明了在对照(PBS处理)组中此时间点有典型的炎性糜烂性病理学， 具有滑膜肥大和滑膜增生的典型关节炎特征，具有显著的关节翳附着和边缘糜烂。10 μ g/ml RAGE-Ig融合蛋白的处理(图14B)导致了炎性参数和糜烂性参数的适 度改变，糜烂和受损软骨表面的外观总体改善。用100 μ g/ml RAGE-Ig融合蛋白的处理(图 14C)导致关节翳形成和糜烂与对照相比较减少，并且总体差异相当明显。然而，300μ g/ml RAGE-Ig融合蛋白的给药(图14D)则导致了比盐水对照中所看到的病理状况严重程度似乎 略低的关节炎，但是还相当严重，具有滑膜肥大和滑膜增生，具有显著的关节翳附着和边缘糜烂。炎性评分的分析(图15)表明所有剂量的RAGE-Ig融合蛋白处理的小鼠与对照 (盐水处理)动物相比炎症减少。然而，仅在100 μ g/ml组中滑膜炎显著减少P < 0. 05)，关 节翳形成显示出与评分中类似的减少(P < 0. 03)。使用10 μ g/ml或300 μ g/ml的RAGE-Ig 融合蛋白观察到的炎性疾病参数的减少没有达到统计学显著的程度。胶原诱导的关节炎的糜烂性特征(关节结构中的糜烂和改变)改变的评估显示了 类似的影响模式。观察到用100 μ g/ml RAGE-Ig融合蛋白处理的组与对照(盐水处理)的 动物相比关节糜烂显著减少(ρ <0.01) 16)，而在用10 μ g/ml和300 μ g/ml RAGE-Ig 融合蛋白处理的小鼠中观察到的减少则没有达到显著程度。组织病理学参数与总体组织学关节炎评分的组合(图17)反映了个体病理参数的 结果。对照(盐水)处理的动物与100 μ g/ml RAGE-Ig融合蛋白处理的小鼠之间观察到了 的显著的差异(P < 0. 02)，10 μ g/ml处理的小鼠中总体评分刚达到显著程度(ρ = 0. 05)， 而使用300 μ g/ml RAGE-Ig融合蛋白则没有观察到总体疾病评分的显著减少。检测甲苯胺蓝染色的切片以测定RAGE-Ig融合蛋白是否对关节炎性关节的基质 蛋白丢失有影响。数据(显示在图18和19中)表明RAGE-Ig融合蛋白确实能防止蛋白聚 糖丢失，但是这种影响仅在100 μ g/ml剂量下是统计学显著的(ρ <0.05)。PBS对照组显 示了严重的软骨基质(蛋白聚糖和胶原)丢失，在用300μ g/ml RAGE-Ig融合蛋白处理的 小鼠中看到了在近侧关节面染色的显著丢失。相反，给予10 μ g/ml或100 μ g/ml RAGE-Ig 融合蛋白则很好地保存了基质蛋白。组织学结果证明了表明下列现象的临床数据用RAGE-Ig融合蛋白处理胶原诱导 的关节炎导致了对疾病发病率和严重程度的影响。组织学参数在100 μ g/ml处理的小鼠中 达到了统计学上显著的高水平，并且在用10μ g/ml处理的小鼠中总体的病理情况达到了 统计学显著的程度。根据评定，100 μ g/ml的RAGE-Ig融合蛋白良好保持了关节结构，并且 所有关节炎参数显著降低。总体印象是RAGE-Ig融合蛋白阻断了关节炎的糜烂期，因为炎 症改变程度所受的影响比次级疾病参数要小。用300yg/ml RAGE-Ig融合蛋白处理的小 鼠没有受到与低剂量相同程度的保护，再次得出了对此水平蛋白给药的抑制性反应的可能 性。总体上，这些结果与研究中进行的临床观察一致，证明了 RAGE-Ig融合蛋白可以起到抗 关节炎的作用。尽管本发明参考其具体实施方式
进行了详细描述，但是对本领域的普通技术人员 显而易见的是可以在不背离本文的精神和范围的情况下对本文进行各种修改和变型，这些 修改和变型可以在随附权利要求书的范围内进行。本 文所有的专利和公开物都以引用方式 并入本文，引用的程度如同各单独的公开物全文特别且单独地以引用方式并入一般。
权利要求
一种分离的融合蛋白，其包含至少一种多肽，所述多肽包括(a)第一氨基酸序列，其与晚期糖化终末产物(RAGE)配体结合结构域的哺乳动物受体至少95％相同，所述第一氨基酸序列能够结合RAGE配体；和(b)第二氨基酸序列，其与人重链免疫球蛋白IgG4恒定结构域或其片段至少95％相同；其中所述第一氨基酸序列包含至少一个相对于野生型RAGE配体结合结构域的突变。
2.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其中所述哺乳动物RAGE配体结合结构域来 自人RAGE。
3.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其中所述第一氨基酸序列包含SEQID NO 6的氨基酸1-344。
4.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其中所述第一氨基酸序列包含选自下列的 氨基酸序列SEQ ID NO 6的氨基酸1-99、氨基酸24-99、氨基酸1-208、氨基酸24-208、氨 基酸1-301、氨基酸24-301、氨基酸1-344、或氨基酸24-344。
5.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含选自SEQID NO :2、 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 8 的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQIDN0:6的氨 基酸序列。
7.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白的氨基酸序列由SEQID NO :6组成。
8.根据权利要求1所述的分离的融合蛋白，还包含在所述第一氨基酸序列和所述第二 氨基酸序列之间的连接子。
9.一种编码融合蛋白的分离的核酸，所述融合蛋白包含至少一种多肽，所述多肽包括(a)第一氨基酸序列，其与晚期糖化终末产物(RAGE)配体结合结构域的哺乳动物受体 至少95%相同，所述第一氨基酸序列能够结合RAGE配体；和(b)第二氨基酸序列，其与人重链免疫球蛋白IgG4恒定结构域或其片段至少95%相 同，其中所述第一氨基酸序列包含至少一个相对于野生型RAGE配体结合结构域的突变。
10.根据权利要求9所述的分离的核酸，其中所述哺乳动物RAGE配体结合结构域来自 人 RAGE。
11.根据权利要求9所述的分离的核酸，其中所述第一氨基酸序列包含SEQID N0:6的 氨基酸1-344。
12.根据权利要求9所述的分离的核酸，其中所述第一氨基酸序列包含选自下列的氨 基酸序列SEQ ID NO 6的氨基酸1-99、氨基酸24-99、氨基酸1-208、氨基酸24-208、氨基 酸1-301、氨基酸24-301、氨基酸1-344、或氨基酸24-344。
13.根据权利要求9所述的分离的核酸，其中所述融合蛋白包含选自SEQID N0:2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 8 的氨基酸序列。
14.根据权利要求9所述的分离的核酸，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO :6。
15.根据权利要求9所述的分离的核酸，其中所述融合蛋白具有由SEQIDN0:6组成的 氨基酸序列。
16.根据权利要求9所述的分离的核酸，还包含编码连接子的序列，所述连接子在所述 第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列之间。
17.重组宿主细胞，其包含根据权利要求9所述的核酸。
18.药物组合物，其包含根据权利要求1所述的分离的融合蛋白和药物上可接受的载体。
19.药物组合物，其包含根据权利要求7所述的分离的融合蛋白和药物上可接受的载体。
20.一种治疗AGE介导的疾病的方法，其包括给予患有AGE介导的疾病的哺乳动物治疗有效量的根据权利要求18所述的药物组合 物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述疾病为糖尿病性肾病。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述疾病为类风湿性关节炎。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述疾病为自身免疫疾病。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述疾病选自皮炎、肾小球肾炎、多发性硬化、 葡萄膜炎性眼炎、自身免疫性肺炎、胰岛素依赖性糖尿病、自身免疫性炎眼、系统性红斑狼 疮、胰岛素耐受、类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病和硬皮病。
25.根据权利要求20所述的方法，其中所述融合蛋白包含SEQID NO :6的氨基酸序列。
26.根据权利要求20所述的方法，其中所述融合蛋白的氨基酸序列由SEQID NO :6组成。
27.一种降低有需要的哺乳动物中RAGE结合的配体水平的方法，其包括给予哺乳动物 RAGE配体降低的量的根据权利要求1所述的融合蛋白。
全文摘要
本发明提供新的治疗法和治疗与晚期糖化终末产物受体(RAGE)活化相关的疾病的方法。
文档编号C07K14/00GK101842382SQ200880102246
公开日2010年9月22日 申请日期2008年6月13日 优先权日2007年6月14日
发明者D·M·希尔伯特, G·T·布莱克 申请人:卡拉狄加制药公司