专利名称：：一种具有血管紧张素转移酶抑制活性的寡肽及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种具有血管紧张素转移酶抑制活性的寡肽及其制备方法。
背景技术：
：高血压病是一种全球性常见多发病，对人类健康危害极大。据国家高血压研究中心的最新统计，我国高血压患者已达1.2亿人，其危害仅次于肿瘤。由于药物治疗高血压病会引起多种不良反应，因而从天然蛋白质中提取具有抗高血压活性的多肽，具有食物安全性高、无副作用等优点而将成为今后高血压非药物治疗的重要部分。血管紧张素转移酶(AngiotensinI-convertingEnzyme,ACE,EC3.4.15.1)是作用于血管紧张素I的一种酶，血管紧张素I是通过利用血管紧张肽原酶消化血管紧张素原生成的，并通过释放其C-末端的两个氨基酸将其转化为血管紧张素II。血管紧张素转移酶的作用不仅能产生具有增强血压作用的血管紧张素II，还能使具有降血压效果的缓激肽失活。由于这些作用，一直将血管紧张素转移酶抑制剂用作高血压的治疗剂。自1970年以来发现第一个自然产生的从毒蛇的毒液中分离得到的ACE抑制物以来，不断有新的抗高血压活性肽被研究和发现。目前很多ACE抑制剂已上市销售，尽管这类合成药物对降低高血压的作用显著，但长期使用出现的不良反应表明无副作用的降血压治疗剂或非药物辅助治疗制剂亟待研究与开发。但从毒蛇的毒液中分离得到ACE抑制物，其来源有限、成本高、分子量大和活性低。
发明内容为了克服上述制备血管紧张素转移酶抑制物来源有限、成本高、分子量大和活性低的问题，本发明通过从廉价来源丰富的海洋贝类或淡水贝类为原料，采用复合酶体系催化技术分步水解后，经过分离纯化后得到具有较低的分子量和较高抑制ACE活性的寡肽。本发明提供了一种具有血管紧张素转移酶抑制活性的寡肽，其中，该寡肽来源于贝类。本发明还提供了一种具有血管紧张素转移酶抑制活性的寡肽的制备方法，其中，该方法包括(a)初极水解将含有贝和肽酶G、肽酶R和蛋白酶R中的一种或几种的混合物在30-40°C的条件下反应16-24小时，终止酶促反应；(b)二级水解将上述得到的混合物与PH为2-4的缓冲液和胃蛋白酶混合物，在30-40°C的条件下反应16-24小时，或者将上述得到的混合物与pH为7-9的缓冲液和胰蛋白酶混合物在30-40°C的条件下反应16-24小时；终止酶促反应，然后在10000_20000g下离心20-30分钟，得到上清液；(C)将该上清液进行纯化，获得所述具有血管紧张素转移酶抑制活性的寡肽。本发明采用贝类或者这些贝类的下脚料外套膜为原料制备具有血管紧张素转移酶抑制活性的寡肽，原料来源丰富，成本低廉；尤其是当采用贝类的外套膜为原料时，大大增加了贝类产品的附加值。此外，本发明制备的具有血管紧张素转移酶抑制活性的寡肽的分子量较低，极易被人体吸收和利用，不易被人体中的胃蛋白酶和胰蛋白酶降解，因此半衰期较长，活性比较稳定。而且，本发明提供的制备具有血管紧张素转移酶抑制活性的寡肽的方法，原料易得、方法简单、易于操作。图1A、图IB为实施例1中高效液相色谱分离扫描图谱。图2为实施例1制备的级分III的质谱分析图。图3为实施例1制备的高活性寡肽的质谱分析图。具体实施例方式本发明提供了一种具有血管紧张素转移酶抑制活性的寡肽，其中，该寡肽来源于贝类。所述贝类可以为海洋贝类或淡水贝类。为了进一步降低成本，所述寡肽可以来源于贝类的外套膜组织。贝类的外套膜组织通常在贝类产品加工过程中作为下脚料用于生产鱼粉，从而造成大量优质蛋白质资源的浪费。尽管本发明从所述贝类中分离出许多具有血管紧张素转移酶抑制活性的寡肽，但从这些寡肽抑制血管紧张素转移酶活性的效率来考虑，在本发明的一个优选的实施方式中，所述寡肽的分子量优选为400-900Da，最优选为500Da。本发明还提供了一种具有血管紧张素转移酶抑制活性的寡肽的制备方法，其中，该方法包括(a)初极水解将含有贝和肽酶G、肽酶R和蛋白酶R中的一种或几种的混合物在30-40°C的条件下反应16-24小时，终止酶促反应；(b)二级水解将上述得到的混合物与PH为2-4的缓冲液和胃蛋白酶混合物，在30-40°C的条件下反应16-24小时，或者将上述得到的混合物与与pH为7-9的缓冲液和胰蛋白酶混合物在30-40°C的条件下反应16-24小时；终止酶促反应，然后在10000_20000g下离心20-30分钟，得到上清液；(c)将该上清液进行纯化，获得所述具有血管紧张素转移酶抑制活性的寡肽。上述步骤中的酶均可以通过商购获得。在步骤(a)中，优选情况下，所述贝事先采用研磨仪粉碎均质化。在优选的实施方式中，向所述均质化的贝中加入一定量的水，煮沸约15-25分钟，冷却至室温；煮沸的目的有两个一是可以杀死一些微生物，二是煮熟后的外套膜组织更易被水解，有利于提高回收率。为了尽可能减少在步骤(a)中获得的混合物中的其它组分对二次水解的影响，在一种优选的实施方式中，在所述终止酶促反应后，在10000-20000g下离心20-30分钟，得到上清液，即初级水解物。在本发明中，所述终止酶促反应可以通过本领域普通技术人员公知的各种方法终止酶促反应；但为了便于操作，在本发明的一个优选的实施方式中，通过沸水处理8-12分钟使酶失活从而终止所述酶促反应。在本发明中，所述pH为2-4的缓冲液可以为本领域公知的各种pH为2-4的缓冲液，但从成本上和操作上考虑，优选为醋酸-醋酸钠缓冲液；所述PH为7-9的缓冲液可以为本领域公知的各种pH为7-9的缓冲液，但从成本上和操作上考虑，优选为磷酸盐缓冲液。对上述缓冲液的用量没有特别限定，只要能将混合物和酶溶解即可。为了获得较高收率的所述具有血管紧张素转移酶抑制活性的寡肽，在优选的实施方式中，所述(a)步骤中肽酶G、肽酶R和蛋白酶R的总重量贝的重量=11250-1500。为了便于操作，可以将所述(a)步骤中获得的上清液进行冷冻干燥，然后在低温，如-20°C下保存，直到需要使用时取出。在一个优选的实施方式中，所述方法还包括在进行所述(b)步骤前对所述(a)步骤中获得的初极水解产物进行冷冻干燥；当采用冷冻干燥的初极水解产物进行所述(b)步骤时，在所述(b)步骤中，胃蛋白酶或胰蛋白酶的总重量初级水解物的重量=150-200。所述纯化可以采用本领域普通技术人员公知的各种方法，但为了分离得到较纯的本发明的寡肽，所述(C)步骤中的纯化包括凝胶过滤层析和高效液相色谱分离。在一种优选的实施方式中，所述凝胶过滤层析的流动相为MilliQ。所述高效液相色谱分离的条件可以包括本领域普通技术人员公知的公知条件，例如，采用等度洗脱，梯度洗脱。在一种优选的实施方式中，所述高效液相色谱分离的条件包括采用含有0.1体积％的三氟乙酸和1.6-36体积％的乙腈的水进行梯度洗脱，洗脱速度为0.6-1毫升/分钟。下面的实施例将对本发明做进一步的说明。实施例11、首先将新鲜的河蛘洗净、去壳，取出肉体，煮沸后收集脱落的外套膜，用研磨仪粉碎并均质化；2、加入5倍外套膜湿重的水，煮沸20分钟，然后冷却至室温；样品分三组，第一组不加酶作为对照，第二组加两种肽酶，第三组加两种肽酶一种蛋白酶；3、按照外套膜湿重酶=11500(重量/重量)加入肽酶G(来自Aspergillusoryzae)、肽酶R(来自Rhizopusoryzae)、蛋白酶R(来自Aspergillusoryzae)；4、将三组样品在37°C反应18小时，反应结束后，沸水浴处理10分钟，终止反应；5、将水解液20000g离心20分钟，将得到的上清液冻干得到初级水解物；6、得到的初级水解物加入胃蛋白酶或胰蛋白酶进一步水解；水解条件如下(1)用pH为2.2的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解初级水解物，酶底物=1100(重量/重量)加入胃蛋白酶，37°C反应3小时，反应结束后，沸水浴处理10分钟，终止反应；(2)用pH为8.0的磷酸盐缓冲液溶解初级水解物，酶底物=1100(重量/重量)加入胰蛋白酶，37°C反应3小时，反应结束后，沸水浴处理10分钟，终止反应；7、将水解液20000g离心20分钟，得到的上清液采用凝胶过滤层析，层析条件如下(1)采用GEhealthcareAKTAexplorer快速蛋白纯化系统，SephadexG-25(16mmX25mm)柱；(2)样品先用0.22Um滤膜过滤(Millipore)；(3)上样0.5mL，其蛋白含量10mg/mL，用MilliQ水作为流动相洗脱，洗脱速率lmL/min；(4)分别在280nm和215nm处检测洗脱液的吸收率，并收集不同峰的洗脱液；(5)不同峰的洗脱液各取lmL，真空浓缩干燥后分别检测ACE活性；8、将得到的高抑制ACE活性的多肽用RP-HPLC进行进一步纯化，纯化条件如下(1)采用Jascointelligent2080型高效液相色谱，TSK-gel0DS-80TS柱(5μm，4.6mmX250mm)；(2)上样含0·1体积％三氟乙酸(TFA)的样品150μL；(3)先用含0.1体积％TFA和1.6体积％乙腈的水洗脱5min，再用0.1体积％TFA和1.6%-36体积％的乙腈的水梯度洗脱45min，流速0.8mL/min；(4)220nm处检测洗脱液的吸收率，并收集不同峰的洗脱液；(5)不同峰的洗脱液各取lmL，真空浓缩干燥后分别检测ACE活性；(6)将得到的高抑制ACE活性的寡肽重新上样纯化，然后用1630体积％乙腈的水梯度洗脱30min。经过上述步骤的分离纯化，首先在采用凝胶过滤层析分离中得到三个不同峰(级分I、级分II和级分III)，经分析级分III含有具有较高抑制ACE活性的寡肽；级分III的样品经RP-HPLC分离，得到P-19，P-20具有高活性的样本，进一步经RP-HPLC纯化，得到分子量在500-900Da高活性寡肽。对得到的不同的寡肽进行分析检测1)寡肽含量测定采用Lowry法和OPA(o-phthaldialdehyde)法，BSA和甘氨酸作为标准物测定水解液中寡肽含量；2)抑制ACE活性的测定采用分光光度法，Captopril作为标准样品进行测定；3)Mie^vIiT:MALDI-T0F/MS(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry)分析寡妝的分子量。各项检测结果如下表1和图1-3所示1、外套膜组织水解结果及水解物的性质表1.外套膜组织水解结果及水解物的性质才羊。Iffi回收率I蛋白含量I多肽含量I水解度Hc^ff口口(o/,w/W)(mg/g)__(mM/mg/mL)(HP,%)(mg/mL)一组_3.40±0.13307.77士18.900.43±0.01->5二组，D42.65士2.17468.57士17.043.66士0.1393.51±1.400.23土0.02G+R肽酶:“G+R三组和蛋46.50±1.82374.06±20.314.83±0.0896.94±2.310.70±0.06白酶G_____2、外套膜组织水解物中ACE-I抑制物的性质表2水解物中ACE-I抑制物的性质<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>通过上述表1-2以及图1-3的结果可以看出，通过利用复合酶催化技术体系制备的寡肽，其中氨基酸组成<9，平均分子量只有500Da，分子量小易被人体吸收和利用，具有极强的ACE抑制活性；同时在体外模拟胃蛋白酶和胰蛋白酶消化实验，其结果表明该寡肽的ACE抑制作用没有降低，反而有所提高，因此制备的寡肽在人体内能发挥的其重要生物学功能。权利要求一种具有血管紧张素转移酶抑制活性的寡肽，其特征在于，该寡肽来源于贝类。2.根据权利要求1所述的寡肽，其中，该寡肽来源于贝类的外套膜组织。3.根据权利要求1或2所述的寡肽，其中，该寡肽的分子量为400-900Da。4.根据权利要求1-3中的任意一项所述的寡肽的制备方法，其特征在于，该方法包括(a)初极水解将含有贝和肽酶G、肽酶R和蛋白酶R中的一种或几种的混合物在30-40°C的条件下反应16-24小时，终止酶促反应；(b)二级水解将上述得到的混合物与pH为2-4的缓冲液和胃蛋白酶混合物，在30-40°C的条件下反应16-24小时，或者将上述得到的混合物与与pH为7-9的缓冲液和胰蛋白酶混合物在30-40°C的条件下反应16-24小时；终止酶促反应，然后在10000-20000g下离心20-30分钟，得到上清液；(c)将该上清液进行纯化，获得权利要求1-4中的任意一项所述的寡肽。5.根据权利要求4所述的方法，其中，该方法还包括在步骤(a)中的终止酶促反应后，在10000-20000g下离心20-30分钟，得到上清液，然后将该上清液作为初级水解物进行二级水解。6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述终止酶促反应是通过沸水处理8-12分钟实现的。7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述pH为2-4的缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，所述PH为7-9的缓冲液为磷酸盐缓冲液。8.根据权利要求4所述的方法，其中，所述(a)步骤中贝和肽酶G、肽酶R和蛋白酶R的总重量贝的重量=11250-1500。9.根据权利要求4所述的方法，其中，该方法还包括在进行所述(b)步骤前对所述(a)步骤中获得的初极水解产物进行冷冻干燥，所述(b)步骤中胃蛋白酶或胰蛋白酶的重量所述初级水解产物的重量=150-200。10.根据权利要求4所述的方法，其中，所述(c)步骤中的纯化包括凝胶过滤层析和/或高效液相色谱分离，所述凝胶过滤层析的流动相为MilliQ，所述高效液相色谱分离的条件包括采用含有0.1体积％的三氟乙酸和1.6-36体积％的乙腈的水进行梯度洗脱，洗脱速度为0.6-1毫升/分钟。全文摘要本发明提供了一种具有血管紧张素转移酶抑制活性的寡肽，其中，该寡肽来源于贝类。本发明采用贝类或者这些贝类的下脚料外套膜为原料制备具有血管紧张素转移酶抑制活性的寡肽，原料来源丰富，成本低廉；尤其是当采用贝类的外套膜为原料时，大大增加了贝类产品的附加值。此外，本发明制备的具有血管紧张素转移酶抑制活性的寡肽的分子量较低，极易被人体吸收和利用，不易被人体中的胃蛋白酶和胰蛋白酶降解，因此半衰期较长，活性比较稳定。而且，本发明提供的制备具有血管紧张素转移酶抑制活性的寡肽的方法，原料易得、方法简单、易于操作。文档编号C07K5/10GK101830967SQ20091011895公开日2010年9月15日申请日期2009年3月9日优先权日2009年3月9日发明者孙媛霞,管于平申请人:天津工业生物技术研究与发展中心